一种抗菌肽及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种抗菌肽及其制备方法与应用，所述的抗菌肽包括氨基酸序列：RRWQWRGSGRWQWRR。它解决了以下几个问题：(1)现有抗生素类药物大都产生耐药性，不能有效杀灭病原菌；(2)抗菌肽天然资源有限且抗菌谱不广、产量有限、制备成本高；(3)提高了蛋白样品的抗菌活性。(4)和其它抗菌制剂联合使用，可以明显提高其抗菌活性解决了现有多肽制备技术成本高或者或者存在污染环境问题。本发明包括抗菌肽氨基酸序列及其应用，本发明制得产品可用于制备抗革兰氏阴性、阳性菌的产品以及用于生产兽药、饲料添加剂、防腐剂。

权利要求

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽氨基酸序列为HHHHHHSSSSGSSSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSS。

2.权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，其采用固相多肽合成法，按其氨基酸序列合成所述抗菌肽的线性肽。

3.根据权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，该制备方法是基因工程方法，其包括如下步骤：

（1）按抗菌肽的氨基酸序列合成基因序列，并将其克隆至大肠杆菌中，构建重组大肠杆菌表达载体；

（2）将步骤（1）构建的重组大肠杆菌表达载体再转化至宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集菌体，超声波裂解，离心收集包涵体沉淀；

（3）将步骤（2）收集的包涵体沉淀进行纯化，即得。

4.权利要求1所述抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽在制备抑菌剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗菌肽在制备革兰氏阳性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗菌肽在制备革兰氏阴性菌引起的感染性疾病的药物中的应用。

7.一种多肽，其特征在于，其包括权利要求1所述的抗菌肽的氨基酸序列。

8.一种蛋白质，其特征在于，其包括权利要求1所述的抗菌肽的氨基酸序列。

9.一种组合物，其特征在于，其包括权利要求1所述的抗菌肽及药学上可接受的载体。

说明书

一种抗菌肽及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种抗菌肽及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)又称为宿主防御肽，这是一类天然或者人工合成的分子量较小的具有一定抗菌与免疫作用的多肽物质。其特殊的氨基酸组成使它
具有合适的疏水性和带电荷性，因此能与病原微生物表面带负电荷的物质结合进而破坏细
胞膜结构，或能进入细胞内部与核酸、蛋白质等大分子物质结合，最终扰乱细胞的正常生理
功能并导致其死亡。抗菌肽的作用机制可分为两类：膜损伤和胞内损伤。其中，氨基酸序列、
脂膜、肽浓度等多种因素控制着AMPs的生物活性。

[0003] 对抗生素的长期滥用导致超级细菌、病毒、真菌以及寄生虫等耐药病原体的大量出现，以至于缺乏有效的抗生素用于这些耐药菌的治疗。抗菌肽的特殊作用机制与抗生素
不同，不易导致耐药性病原菌的产生，因而在作为新型的抗菌药物方面取得快速发展。

[0004] 抗菌肽，具有热稳定、水溶性好、无残留、不易产生抗药性的特点，不同抗菌肽对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、念珠球菌、绿脓杆菌、肠细菌、沙雷氏菌、变形杆菌、粪链球等革兰
氏阴、阳性菌表现出不同的抑菌效果。因此，抗菌肽在新型抑菌药物、食品天然防腐剂及动
物饲料添加剂等产品开发领域具有广阔的应用前景。

[0005] 许多膳食蛋白质分子中含有大量的生理活性肽，这些多肽分子在原蛋白序列中并不表现出功能，但是可以通过在胃肠道消化或在食品加工的过程中被释放。食物蛋白质来
源的抗菌肽具有安全性高、人体吸收性好的特点，可以直接添加到食物中并同时具备体内
体外抗菌的功效。

[0006] 天然抗菌肽资源有限，由于其天然结构上的限制，因氨基酸序列和分子结构的不同表现出不同抑菌效果，有效活性剂量较高，并且以化学合成获得的抗菌肽成本又较高。利
用生物技术方法合成制备多肽具有活性高、生产对环境影响小的优点。但以酵母和大肠杆
菌作为基因工程菌进行表达，现有技术存在得率低、成本高等问题。因此其在实际应用上受
到了极大限制。因此，如何利用基因工程技术在微生物中方便、有效及低成本的生产抗菌肽
成为其实际应用的关键。

发明内容

[0007] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗菌肽。

[0008] 本发明还要解决的技术问题是提供上述抗菌肽的制备方法。

[0009] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述抗菌肽的应用，从而提供新型、高效、无毒、无公害、稳定性好的抗菌制剂，改变当前抗生素和防腐剂滥用状况。

[0010] 发明思路：通过生物信息学的方法，在抗菌肽数据库(APD)中选择若干具有抗菌活性的抗菌肽，利用BLAST程序对溶菌酶，乳铁蛋白及其它食源性蛋白进行比对，在食品蛋白
质核酸数据库中搜寻相似的同源性较高多肽序列。在分析其序列同源性基础上依据抗菌肽
结构功能的关系，找出潜在的具有抗菌活性的多肽序列，并进一步通过人工设计出抗菌肽
序列。

[0011] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抗菌肽，所述的抗菌肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；SEQ ID NO.1：RRWQWRGSGRWQWRR。

[0012] 优选地，在SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的两侧分别连接亲水性氨基酸、疏水性氨基酸、正电荷氨基酸和负电荷氨基酸中的任意一种或两种组合。

[0013] 更优选地，如式I所示中的任意一种：

[0014] (Y)a(N)b‑RRWQWRGSGRWQWRR‑(X)a(M)b

[0015] (X)a(N)b‑RRWQWRGSGRWQWRR‑(Y)a(M)b

[0016] (Y)a(M)b‑RRWQWRGSGRWQWRR‑(X)a(N)b

[0017] (X)a(M)b‑RRWQWRGSGRWQWRR‑(Y)a(N)b

[0018] Ⅰ；

[0019] 其中，X为疏水性氨基酸，如F、I、W、L、A等；Y为亲水性氨基酸，如S、G、Y、T等；M为正电荷氨基酸，如R或K；N为负电荷氨基酸，如D或E；a和b分别代表为5‑15不同长度。

[0020] 所述的抗菌肽列两侧加入由长度不等的带正负电荷、亲疏水性氨基酸序列，这是为了更好的适应抗菌制剂、饲料、食品防腐添加剂在油性、水性环境中使用，增强其抗菌活
性和有效吸收使用率。

[0021] 上述的抗菌肽的制备方法也在本发明的保护范围之内。

[0022] 其中，所述的制备方法为固相多肽合成法，按其氨基酸序列合成所述抗菌肽的线性肽。

[0023] 其中，所述的制备方法也可以是基因工程方法，其包括如下步骤：

[0024] (1)按抗菌肽的氨基酸序列合成基因序列，并将其克隆至大肠杆菌中，转入大肠杆菌宿主菌细胞内，构建重组大肠杆菌表达载体；

[0025] (2)将步骤(1)构建的重组大肠杆菌表达载体再转化至宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集菌体，超声波裂解，离心收集包涵体沉淀；

[0026] 将步骤(2)收集的包涵体沉淀进行纯化，即得。

[0027] 其中，所述的基因工程方法以多拷贝形式插入大肠杆菌的表达载体中，其最终得率可达20g/L发酵液以上，蛋白回收率为70％。

[0028] 其中，所述的基因工程方法具体的为，将溶菌酶，乳铁蛋白及其它食源性蛋白肽链序列经人工设计产生抗菌肽链，其包括如下步骤：

[0029] (1)设计编码多肽的基因序列：

[0030] HHHHHHSSSSGSSSS(DDDKBRRWQWRGSGRWQWRRORSSGSS)P

[0031] 其中，HHHHHH为镍螯合柱纯化标签；SSSSGSSSS、SSGSS为过渡肽，B、O分别代表(Y)a(N)b、(X)a(M)b、(X)a(N)b和(Y)a(M)b的任何一种，DDDK为肠激酶酶切位点，p为2‑20的任意数
字，代表为p数目的重复序列，a和b分别代表为5‑15不同长度。

[0032] 以食物蛋白质来源的抗菌肽为出发点，通过生物信息学的方法，在抗菌肽数据库(APD)中选择若干具有抗菌活性的抗菌肽，利用BLAST程序对溶菌酶，乳铁蛋白及其它食源
性蛋白进行比对，在此基础上设计出全新的抗菌肽及其组合。

[0033] (2)人工合成上述多肽蛋白编码基因的碱基序列，并克隆至大肠杆菌表达载体构建重组大肠杆菌表达载体。

[0034] 将表达载体转化宿主细胞E.Col1BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，经离心收集菌体，超声波裂解，离心收集包涵体沉淀；包涵体分别经洗涤后用2mmol/L DTT、8mol/L尿素、
pH7.8充分溶解后过超滤膜收集滤液备用。

[0035] 镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱用平衡缓冲液平衡至基线，用8M脲‑2mmol/L DTT‑平衡缓冲液平衡至基线。将上述超滤液上样，经洗涤液洗涤后用洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱峰，
洗脱样品用Sephadex G‑25在50mM Tris缓冲液pH7.5下条件脱盐并收集洗脱峰蛋白。

[0036] 将脱盐样品分别用肠激酶和胰蛋白酶进行酶切，酶切后样品用离子交换/脱盐柱、C‑18反相HPLC制备柱进行纯化即得目的多肽样品。

[0037] 上述抗菌肽的应用也在本发明的保护范围之内，其中，所述的抗菌肽用作抑菌剂。

[0038] 其中，抗菌肽在新型抑菌药物、食品天然防腐剂及动物饲料添加剂等产品开发领域具有广阔的应用前景。

[0039] 优选地，所述的抗菌肽对绿脓杆菌具有较好抑菌作用；其中，所述的绿脓杆菌为ATCC27853。

[0040] 一种含有上述抗菌肽的多肽或蛋白质也在本发明的保护范围之内。

[0041] 一种包括上述抗菌肽及药学上可接受的载体的组合物也在本发明的保护范围之内。

[0042] 上述组合物在抑菌剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

[0043] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优势在于：

[0044] (1)本发明提供了一种新的抗菌肽序列，除对普通大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌有相当的抑制效果，对一线耐药菌绿脓杆菌、金葡菌也显示出较好的抗菌效果，具有较
广的抗菌菌谱，在有效剂量下可替代防腐剂和抗生素。将其在医疗、食品保健、食品加工等
领域的进行应用，可有助于改变当前抗生素和防腐剂滥用状况。

[0045] (2)本发明还提供一种工艺简单、可大规模制备的生物合成工艺，为可实现其在医疗、食品生产、动物养殖等领域的广泛应用，保障人民的身体健康，减少抗生素等对环境污
染，实现促进社会的可持续发展。

具体实施方式

[0046] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本
发明。

[0047] 实施例1：发酵获得含有表达重组蛋白的菌体

[0048] 构建抗菌肽ABP‑1的重组基因工程菌BL pET30a ABP‑1：

[0049] 抗菌肽ABP‑1的氨基酸序列为：

[0050] HHHHHHSSSSGSSSS(DDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSS)10其中，HHHHHH为镍螯合柱纯化标签；SSSSGSSSS、SSGSS为过渡肽，DDDDK为肠激酶酶切位点。

[0051] 按照大肠杆菌密码子偏爱性，人工合成编码上述抗菌肽ABP‑1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其中catatg、ggtacc是限制性内切酶NdeI and KpnI的酶切位点。

[0052] 将该核苷酸序列用限制性内切酶NdeI and KpnI酶切后，插入到大肠杆菌表达载体pET30a的多克隆位点的NdeI and KpnI处，构建成ABP‑1表达载体，将此载体用CaCl2转化
法转入大肠杆菌BL宿主菌细胞BL21中构建成BL21 ABP‑1重组菌，用甘油保存备用。

[0053] 挑取鉴定过的甘油冻存菌种(构建好的重组抗菌肽基因工程菌BL21‑ABP‑1)接种于100mL LB含100mg/L卡那霉素培养液中，220r/min，37℃培养过夜。取菌液按体积比为1/
100的比例加入5个1000mL含100mg/L卡那霉素培养液的摇瓶发酵培养基中，37℃培养至对
数生长期，当A600达到1.0时接入50L发酵罐进行发酵。

[0054] 具体工艺参数和工艺控制如下：

[0055] 1.BL21‑ABP‑1的接种量为15％，即初始OD值为＜0.3，温度为37℃，用氨水和30％磷酸控制pH在7.0～7.2。

[0056] 2.初始搅拌转速为150rpm，罐压0.01MPa，温度37℃，溶氧100％。1～3小时，发酵至OD值达到3。

[0057] 3.OD值达到3后流加补料，初始补料速度流加速度为0.1‑0.2mL/min/L培养基，搅拌转速200～900rpm和通气量0.5～3vvm，溶氧水平维持在20％～40％之间，控制比生长速
率<1，OD匀速上升，据此控制搅拌转速、通气量、溶氧。

[0058] 其采用的是连续补料发酵工艺，只要溶氧和比生长速率在设定范围之内，就保持补料，如果生长速度过快，则降低补料速度、转数甚至停止补料。

[0059] 4.发酵至OD值达到10～20，降温至25～30℃，恒定补料速度0.5mL/min/L培养基，进行IPTG诱导(终浓度为0.6～1mmol/L)直至发酵结束(4小时以上)。

[0060] 在发酵过程中，通过调节控制发酵罐内。培养至4h进行诱导温度为36℃。经此工艺，最终可获得100g/L以上的菌泥，重组蛋白表达量在30g/L以上。

[0061] 其中，所述的重组蛋白为抗菌肽ABP‑1，其氨基酸序列为：

[0062] HHHHHHSSSSGSSSS(DDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSS)10，即

[0063] HHHHHHSSSSGSSSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFF
FKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSG
SSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDK
YYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSSDDDDKYYEERRWQWRGSGRWQWRRFFFKKRSSGSS

[0064] 其中，HHHHHH为镍螯合柱纯化标签；SSSSGSSSS、SSGSS为过渡肽，DDDDK为肠激酶酶切位点，Y：Tyr，E：Glu，F：Phe，K：Lys，R：Arg平衡多肽两边的电荷性和疏水性，R还是胰蛋白
酶的酶切位点。

[0065] 各级发酵培养基配方如下：

[0066] (1)一代种子培养基同LB培养基

[0067] (2)罐内培养基：酵母膏10g/L；Typton15g/L；NaCl 4g/L；甘油2.5g/L；溶剂为水。

[0068] 高压灭菌后补加：经无菌过滤的无机盐母液至各组分终浓度为：K2HPO43 g/L；KH2PO41 g/L；MgSO4·7H2O 6g/L；CaC120.013 g/L；VB1 0.005g/L

[0069] 补料：Typton 150g/L；Yeast Extract 100g/L；甘油300g/L。

[0070] 实施例2：对目的蛋白的纯化

[0071] 将实施例1步骤4获得的菌体IPTG诱导表达后，经离心收集的菌体，超声波裂解，离心收集包涵体沉淀。包涵体分别经洗涤溶液(50mmol/L磷酸盐缓冲液，1％Triton 100，
2mol/L尿素，pH7.8)溶液洗涤后，10000r/min以上离心20min，收集包涵体沉淀，再以抽提溶
液(50mmol/L磷酸盐缓冲液，8mol/L尿素和2mmol/L DTT，pH7.8)溶解充分后过分子量5万的
超滤膜收集滤液备用。

[0072] 将镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用平衡缓冲液平衡至基线，用8M脲‑2mmol/L DTT‑平衡缓冲液pH7.8平衡至基线。

[0073] 取上述超滤液以0.5mL/mL床体积*min上样，pH7.5的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，2mmol/L DTT含20mM咪唑平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1‑2mL/mL床体积*min。
用pH7.5的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑洗脱缓冲液洗脱至基线，流速1‑2mL/
mL床体积*min。Sephadex G‑25用50mM Tris缓冲液pH7.5下条件脱盐并收集洗脱峰蛋白。

[0074] 将脱盐样品，即收集洗脱的峰蛋白分别用肠激酶和胰蛋白酶进行酶切。根据样品蛋白浓度，样品预冷至4℃，以1:400～4000加入蛋白酶进行酶切。酶切结束后重新过镍琼脂
糖凝胶FF层析柱，滤出液即为抗菌肽目的蛋白。

[0075] 检测：(1)以牛血清白蛋白为对照标准品，用考马斯亮蓝法测产品蛋白浓度，按体积换算，最终获得目的蛋白为20g/L；(2)以每升包涵体蛋白浓度(考马斯亮蓝法)30g/L计
算，蛋白回收率约为70％。

[0076] 实施例3：

[0077] 将实施例2制备得到的抗菌肽ABP‑1样品接入LB培养基中过滤除菌，制成2000μg/mL的抗菌肽母液。然后将其稀释，分别得到1000μg/mL、200μg/mL的抗菌肽溶液。

[0078] 将上述制备的抗菌肽溶液转接培养后的大肠杆菌ATCC 25922、枯草芽孢杆菌ATCC9372、沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC27853、金葡菌ATCC25923。

[0079] 具体为，取PCR管按抗菌肽(ABP‑1)不同浓度、抑制目标菌、双乙酸钠对照和卡那对照进行分组，具体见表1。分别加入100μL配好的不同浓度抗菌肽ABP‑1以及100μL配好的大
肠杆菌ATCC 25922、枯草芽孢杆菌ATCC9372、沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC27853、金
葡菌ATCC25923，总体积200μL，OD值为0.05于37℃，200rpm振荡培养14～18h。

[0080] 培养结束的菌液各取150μL菌液分别加入96孔板中，用酶标仪测量其在630nm处的吸光值。以OD630值的减小程度来表示各自的抑菌率(计算公式：抑菌率＝(纯菌液的吸光
值‑各个样品的吸光值)/纯菌液的吸光值*100％)，抑菌率结果见下表1。

[0081] 表1

[0082]

[0083]

[0084] 由表1可知，相比于双乙酸钠，抗菌肽(ABP‑1)在低浓度下(100μg/mL)对大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、绿脓杆菌ATCC27853和金葡菌ATCC25923的抑菌效果提高；
抗菌蛋白(ABP‑1)在高浓度下(500μg/mL)对绿脓杆菌ATCC27853和金葡菌ATCC25923的抑菌
效果也有所提高；尤其是，双乙酸钠对绿脓杆菌ATCC27853不具备抑菌效果，而抗菌蛋白
(ABP‑1)在低浓度下，对其抑菌率达到57％，高浓度下更是达到98％。此外，相比于卡那霉
素，低浓度和高浓度的抗菌蛋白(ABP‑1)均对抗菌蛋白(ABP‑1)提升很高。总体而言，本发明
所制备的抗菌蛋白(ABP‑1)对上述菌株均有一定的抑菌效果，其中，对绿脓杆菌ATCC27853
的抑菌效果最高。并且，抗菌肽是多肽类物质，可在体内被降解且无毒无害，因此在替代防
腐剂和抗生素在医疗、食品保健、食品加工等领域的进行应用，具有很好的应用前景，可有
助于改变当前抗生素和防腐剂滥用状况。

[0085] 本发明提供了一种抗菌肽及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进
和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以
实现。