一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途

摘要

本发明公开了一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。所述双信号肽来源于芽孢杆菌Sec途径中不同的信号肽的组合。本发明通过从枯草芽孢杆菌信号肽库中，构建双信号肽组合与目的蛋白即蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶基因相结合的表达载体，实现了外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的表达元件及其组合方法。

权利要求

1.一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，其特征在于：所述双信号肽组合是由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的信号肽SPDacB和氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的信号肽SPamyE依次连接合成的双信号肽，或，由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的信号肽SPamyE和氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的信号肽SPDacB依次连接合成的双信号肽，或，由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的信号肽SPamyE和氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的信号肽SPL依次连接合成的双信号肽。

2.编码权利要求1所述双信号肽组合的基因。

3.权利要求1所述双信号肽组合的用途，其特征在于：由信号肽SPDacB和SPamyE依次连接合成的双信号肽能够提高角蛋白酶的表达量，或，由信号肽SPamyE和SPDacB依次连接合成的双信号肽能够提高蔗糖异构酶的表达量，或，由信号肽SPamyE和SPL依次连接合成的双信号肽能够提高果聚糖蔗糖酶的表达量。

4.如权利要求3所述双信号肽组合的用途，其特征在于：所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

5.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述双信号肽组合的编码基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求1所述双信号肽组合的编码基因或权利要求5所述的重组载体。

7.一种包含权利要求1所述双信号肽组合的编码基因的宿主细胞的构建方法，其特征在于：构建包含所述双信号肽组合的编码基因和外源蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

8.一种外源蛋白的生产方法，其特征在于：将含有所述权利要求1的双信号肽组合的基因工程菌经活化后，以1.5‑2.5％的接种量转接于发酵培养基中，于35‑40℃、215‑225r/min发酵培养15‑50h。

说明书

一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种提高外源蛋白表达量的双信号肽及其构建方法与用途。

背景技术

[0002] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)是原核生物研究领域中的重要模式菌，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌(Escherichia coli)。枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较
理想的宿主。该宿主的优点是：公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码偏爱性；生长快，
易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作简单的特点，且适合进行工程菌株改造等显
著优势。

[0003] 基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其与成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前提蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白
的折叠，对在蛋白分泌过程中起着重要作用。信号肽是一类具有15‑60个氨基酸的多肽，一
般定位于分泌蛋白的N端。一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆至信号肽的C端，从而在
宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与
胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点相结合，进而跨膜转运至胞外。因此，研究不同类型的
信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明以Sec途径的信号肽为主，进行随机组合，以蔗糖异构酶、角蛋白酶和果聚糖蔗糖酶为目的蛋白进行表达。

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，本发明的第一个目的是提供一种提高外源蛋白表达量的双信号肽组合，所述双信号肽来源于芽孢杆菌Sec途径中不同
的信号肽的串联组合。

[0006] 优选地，所述来源于芽孢杆菌的Sec途径的信号肽为SPDacB、SPamyE或SPL。

[0007] 优选地，所述信号肽SPDacB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于枯草芽孢杆菌1A747。

[0008] 优选地，所述信号肽SPamyE的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，来源于枯草芽孢杆菌168，其Gene ID:938356GenBank:NC_000964.3(327618..329597)。

[0009] 优选地，所述信号肽SPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1，SPL是来源于果聚糖蔗糖酶自身的信号肽。

[0010] 本发明的第二个目的是提供编码所述信号肽突变体的基因。

[0011] 优选地，编码所述信号肽SPDacB基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0012] 优选地，编码所述信号肽SPamyE基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0013] 优选地，编码所述信号肽SPL基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0014] 本发明的第三个目的是提供所述双信号肽在提高外源蛋白表达量中的用途。

[0015] 优选地，所述外源蛋白为蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶。

[0016] 优选地，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

[0017] 优选地，所述角蛋白酶的编码基因为kerK，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0018] 优选地，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，来源于分散泛菌。

[0019] 优选地，所述蔗糖异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID  NO.11所示，其GenBank：AY223549.1。

[0020] 优选地，所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，来源于地衣芽孢杆菌。

[0021] 优选地，所述果聚糖蔗糖酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其GenBank:CP034569.1。

[0022] 本发明的第四个目的是提供一种含有所述双信号肽的编码基因的重组载体。

[0023] 优选地，所述重组载体所用的表达载体为pWB980。

[0024] 本发明的第五个目的是提供一种含有所述重组载体或所述双信号肽编码基因的宿主细胞。

[0025] 优选地，所述宿主细胞枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)。

[0026] 更优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。所述菌株来源于文献(史超硕、李登科等。两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响[J].中国生物工程杂
志.2019,39(10)：17‑23。

[0027] 本发明的第六个目的是提供一种基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞，通过载体表达连接有所述双信号肽编码基因和外源蛋白基因。

[0028] 本发明的第七个目的是提供双信号肽的构建方法，步骤如下：构建包含所述双信号肽的编码基因和蛋白基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到
阳性转化子。

[0029] 优选地，所述双信号肽的构建方法，步骤如下：

[0030] 将双信号肽的编码基因与含有外源蛋白基因的载体用相同的限制性内切酶进行双酶切，切胶回收，通过构建包含所述双信号肽的编码基因和蛋白基因的重组载体，将所述
重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

[0031] 本发明的第八个目的是提供所述蛋白的生产方法，步骤如下：

[0032] 将连接有所述双信号肽的基因工程菌经活化后，以1.5‑2.5％的接种量转接于发酵培养基中，于35‑40℃、215‑225r/min发酵培养15‑50h。

[0033] 所述发酵产角蛋白酶的发酵培养基组成为：玉米粉60‑70g/L，豆饼粉30‑50g/L，磷酸氢二钠2‑8g/L，磷酸二氢钾0.1‑0.6g/L，高温淀粉酶0.5‑1.0g/L，余量为水。

[0034] 所述发酵产蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶的发酵培养基组成为：酵母粉4‑6g/L，蛋白胨8‑12g/L，氯化钠4‑6g/L，余量为水。

[0035] 优选地，所述基因工程菌的活化步骤为：将所述基因工程菌接种于种子培养基中，35‑40℃、215‑225r/min振荡培养10‑14h。

[0036] 所述种子培养基组成为：卡那霉素45‑55mg/L，酵母粉4‑6g/L，蛋白胨8‑12g/L，氯化钠4‑6g/L，余量为水。

[0037] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0038] 1、本发明通过从枯草芽孢杆菌信号肽库中，构建双信号肽串联组合与目的蛋白即蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶基因相结合的表达载体，实现了外源基因的高表达，
特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的表达元件及其组合方法。

[0039] 2、本发明通过双信号肽串联组合，可以使蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶或角蛋白酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。

附图说明

[0040] 图1是角蛋白酶的PCR产物电泳图；

[0041] 图2是合成的果聚糖蔗糖酶基因双酶切示意图；

[0042] 图3是合成的蔗糖异构酶基因双酶切示意图；

[0043] 图4是外源蛋白的目的基因构建示意图；

[0044] 图5是信号肽构建示意图，其中SPN代表单、双、三信号肽串联组合；

[0045] 图6是中B.subtilis WB600表达角蛋白酶的SDS‑PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SPD为利用单信号肽表达的角蛋白酶、SP‑D‑A为利用双信号肽串联组合表达
的角蛋白酶；

[0046] 图7是角蛋白酶单双信号肽酶活示意图，其中SPD为利用单信号肽表达的角蛋白酶、SP‑D‑A为利用双信号肽串联组合表达的角蛋白酶；

[0047] 图8是B.subtilis WB600表达蔗糖异构酶的SDS‑PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SP‑D2为利用单信号肽表达的蔗糖异构酶、SP‑A‑D2为利用双信号肽串联组
合表达的蔗糖异构酶；

[0048] 图9是蔗糖异构酶单双信号肽酶活示意图，其中SP‑D2为利用单信号肽表达的蔗糖异构酶、SP‑A‑D2为利用双信号肽串联组合表达的蔗糖异构酶；

[0049] 图10是B.subtilis WB600表达果聚糖蔗糖酶的SDS‑PAGE电泳胶图；箭头表示目的蛋白的位置，其中SPL为利用单信号肽表达的果聚糖蔗糖酶、SP‑A‑L为利用双信号肽串联组
合表达的果聚糖蔗糖酶、SP‑A‑D‑L为利用三个信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶；

[0050] 图11是果聚糖蔗糖酶单/双/三信号肽酶活示意图，其中SPL为利用单信号肽表达的果聚糖蔗糖酶、SP‑A‑L为利用双信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶、SP‑A‑D‑L为利用
三个信号肽串联组合表达的果聚糖蔗糖酶。

具体实施方式

[0051] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0052] 以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW,
Janssen K,Argentine J.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社)。

[0053] 本发明所用培养基及酶活测定方法：

[0054] 种子培养基组成为：卡那霉素45‑55mg/L，酵母粉4‑6g/L，蛋白胨8‑12g/L，氯化钠4‑6g/L，余量为水。

[0055] 所述发酵产角蛋白酶的发酵培养基组成为：玉米粉60‑70g/L，豆饼粉30‑50g/L，磷酸氢二钠2‑8g/L，磷酸二氢钾0.1‑0.6g/L，高温淀粉酶0.5‑1.0g/L，余量为水。

[0056] 所述发酵产蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶的发酵培养基组成为：酵母粉4‑6g/L，蛋白胨8‑12g/L，氯化钠4‑6g/L，余量为水。

[0057] 枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

[0058] SP‑A盐溶液：(NH4)2SO4 4g/L，K2HPO4·3H2O 28g/L，KH2PO4 12g/L，柠檬酸钠2g/L，余量为水；

[0059] SP‑B盐溶液：MgSO4·7H2O 0.4g/L，余量为水；

[0060] 100×CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L，余量为水；

[0061] SPI(200mL)：SP‑A盐溶液98mL，SP‑B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100×CAYE 2mL；

[0062] SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl2 6mL，250mmol/L MgCl2 6mL；

[0063] 100×EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。

[0064] 实施例1蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因的获得与构建

[0065] 根据实验室筛选出来的解淀粉芽孢杆菌菌株的基因组，通过PCR扩增得到角蛋白酶基因，扩增的到目的基因产物测序结果与B.amyloliquefaciens K11角蛋白酶基因
(GenBank：KR868996.1)相似性达到了97.63％，将该扩增的角蛋白酶基因命名为角蛋白酶
基因kerK，角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，角蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ 
ID NO.10所示。

[0066] 上述扩增所用引物为：

[0067] 引物F：5'‑CGCGGATCCAATTTAAATATTTCGGGTTCCTATTAAAC‑3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.13)；

[0068] 引物‑R：5'‑CATGCATGCTAAAAAAACCGGCGGGGC‑3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.14)。

[0069] 其中，蔗糖异构酶来源于分散泛菌的蔗糖异构酶，蔗糖异构酶的GenBank：AY223549.1，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，蔗糖异构酶基因核苷酸序
列如SEQ ID NO.11所示。由苏州金维智公司合成。

[0070] 其中，果聚糖蔗糖酶来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1，所述果聚糖蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12
所示。由苏州金维智公司合成。

[0071] 分别以蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因为报告基因，获得一种能够提高外分泌蛋白的信号肽的突变体，以实现蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因在枯
草芽孢杆菌宿主中的高效异源表达。

[0072] 具体包括以下步骤：

[0073] (1)分别构建角蛋白酶、蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶载体：

[0074] 角蛋白酶经过PCR扩增带有酶切位点Hind III和Sph I，用限制性内切酶Hind III和Sph I将角蛋白酶进行双酶切并纯化，得到1278bp大小的角蛋白酶PCR产物(如图1)，扩增
的PCR片段碱基序列由苏州金维智测序确认。

[0075] 蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶通过人工合成片段SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12经过双酶切(Hind III和Sph I)，切胶回收分别获得2207bp(如图2)、1449bp大小的目的片段(如
图3)。

[0076] 将上述经过双酶切角蛋白酶、蔗糖异构酶和果聚糖蔗糖酶分别与经过HindIII和Sph I双酶切，切胶回收的载体pWB980进行连接，得到分别含有蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶
和角蛋白酶的质粒(如图4)(该构件方法详见于申请号为201910332253.1的发明专利《高效
异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》。

[0077] 实施例2双信号肽的获得与构建

[0078] 构建重组载体pWB980‑SP(signal peptide)(以芽孢杆菌的Sec途径的信号肽SPDacB、SPamyE和SPL为例)：以再上面给出氨基酸序列和碱基序列

[0079] 利用NCBI数据库并通过在线分析软件SignalP 5.0Server和TatP 1.0Server预测获得芽孢杆菌来源的信号肽，启动子Ply‑2(核苷酸序列如SEQ ID NO.15)(启动子来源于枯
草芽孢杆菌淀粉酶，构建方法来源于专利申请号为201910332240.4的发明专利《一种生产
重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》。序列与单、双信号肽基因由苏州金维智公司
合成。

[0080] 其中信号肽SPDacB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4.实施案例2中的SPDacB,
的质粒)其GenBank:JQ302239.1。

[0081] 其中信号肽SPamyE的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，来源于枯草芽孢杆菌168，其NCBI Reference Sequence:NC_000964.3。

[0082] 其中，信号肽SPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，来源于地衣芽孢杆菌，其GenBank:CP034569.1。

[0083] 其中信号肽SPDacB和SPamyE的酶切位点为均为EcoRI和HindII I。将信号肽SPDacB和SPamyE分别经过EcoRI和HindII I的双酶切，经过切胶回收，将回收以后的条带分别连接到
上述构建好的含有蔗糖异构酶、果聚糖蔗糖酶和角蛋白酶基因的重组载体中，详细步骤如
下：

[0084] 分别将构建不同的信号肽载体进行以下分组：

[0085] 对照组：

[0086] (1)构建单信号肽载体的方法：

[0087] 通过实验室的筛选选择出表达碱性蛋白酶效果比较好的信号肽进行串联组合，并作为单信号肽的对照实验。SPamyE表达碱性蛋白酶酶活在10000U/mL.SPDacB表达碱性蛋白酶
酶活在18000U/mL，在相同的载体和宿主菌中，上述两种信号肽在表达碱性蛋白酶酶活时更
为显著，由此说明上述信号肽在提高蛋白表达量上具有显著的功能，因此以此作为单信号
肽的对照实验

[0088] 分别将Ply‑2启动子和信号肽SPDacB的碱基序列进行依次连接，合成含由Ply‑2启动子和信号肽SPDacB的串联基因，经过EcoRI和HindII I的双酶切后，共同连接到与同样经过
EcoRI和HindII I酶切的含有角蛋白酶的重组载体中，获得重组载体SPD；

[0089] 分别将Ply‑2启动子和信号肽SPDacB的碱基序列进行依次连接，合成含由Ply‑2启动子和信号肽SPDacB的串联基因，经过EcoRI和HindII I的双酶切后，共同连接到与同样经过
EcoRI和HindII I酶切的含有蔗糖异构酶的重组载体中，获得重组载体SPD2；

[0090] 分别将Ply‑2启动子和信号肽SPamyE的碱基序列进行依次连接，合成含有Ply‑2启动子和信号肽SPamyE的串联基因，经过EcoRI和HindII I的双酶切后，共同连接到与同样经过
EcoRI和HindII I酶切的含有果聚糖蔗糖酶的重组载体中，获得重组载体SPL；

[0091] (2)构建三信号肽载体的方法：

[0092] 将Ply‑2启动子、信号肽SPamyE、SPDacB、SPL的核苷酸序列依次连接，合成一条含有三个信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，经过EcoRI和HindII I的双酶切
后，共同连接到与同样经过EcoRI和HindII I酶切的含有果聚糖蔗糖酶的重组载体中，获得
重组载体SP‑A‑D‑L。

[0093] 实验组：

[0094] 构建双信号肽载体的方法：

[0095] 将Ply‑2启动子、信号肽SPDacB、SPamyE的核苷酸序列依次连接，合成一条含有双信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，在经过EcoRI和HindII I的双酶切后，共
同连接到与同样经过EcoRI和HindII I酶切的含有角蛋白酶的重组载体中，获得重组载体
SP‑D‑A；

[0096] 将Ply‑2启动子、信号肽SPDacB、SPamyE的核苷酸序列依次连接，合成一条含有双信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，经过EcoRI和HindII I的双酶切后，连接
到与同样经过EcoRI和HindII I酶切的含有蔗糖异构酶重组载体中，获得重组载体SP‑D‑
A2。

[0097] 将Ply‑2启动子、信号肽SPamyE、SPL的核苷酸序列依次连接，合成一条含有双信号肽串联组合的基因(基因由苏州金维智公司合成)，经过EcoRI和HindII I的双酶切后，连接到
与同样经过EcoRI和HindII I酶切的含有果聚糖蔗糖酶的重组载体中，获得重组载体SP‑A‑
L。

[0098] 综上，使用酶切位点为EcoRI和HindII I，构建成单、双、三信号肽载体(如图4)分别命名为角蛋白酶重组载体(SPD、SP‑D‑A)和蔗糖异构酶重组载体(SPD2、SP‑A‑D2)、果聚糖
蔗糖酶(SPL、SP‑A‑L、SP‑A‑D‑L)。

[0099] 实施例3重组基因工程菌的表达

[0100] 将上述实施例2构建好的重组载体：角蛋白酶重组载体(SPD、SP‑D‑A)和蔗糖异构酶重组载体(SPD2、SP‑A‑D2)、果聚糖蔗糖酶重组载体(SPL、SP‑A‑L、SP‑A‑D‑L)通过化转到
枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，具体方法参考专利文献(申请号为201910332240.4的发
明专利《一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》，实施案例2的化转到枯草
芽孢杆菌B.subtilis WB600转步骤)，于抗性平板(卡那霉素50μg/mL)上获得克隆子，分别
为重组菌1(含角蛋白酶，单信号肽SPDacB)、重组菌2(含角蛋白酶，双信号肽SPDacB和SPamyE)、
重组菌3(含果聚糖蔗糖酶，单信号肽SPDacB)、重组菌4(含蔗糖异构酶，双信号肽SPamyE和
SPDacB)、重组菌5(含果聚糖蔗糖酶，单信号肽SPamyE)、重组菌6(含果聚糖蔗糖酶，双信号肽
SPamyE和SPL)、重组菌7(含有果聚糖蔗糖酶，三个信号肽的SPamyE、SPDacB和SPL)。

[0101] 将新鲜平板上的重组基因工程菌的单菌落分别接入种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h，以2％(v/v)的接种量转接于发酵产角蛋白酶的发酵培养基中，于37℃、
220r/min发酵培养，其中重组菌株1、2的培养时间为48h，重组菌株3、4、5、6、7单菌落分别接
入种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h，以2％(v/v)的接种量转接于发酵产蔗糖异
构酶和果聚糖蔗糖酶的发酵培养基中，培养时间为16h，测定酶活。

[0102] 其中角蛋白酶的酶活测定方法：

[0103] 取重组菌株1、2的发酵液，经过离心取上清液，进行角蛋白酶的酶活测定，角蛋白酶的测定方法：

[0104] 将发酵液4℃、12 000r/min，离心10min，取250μL粗酶液，加入250μL 0.05mol/L Gly‑NaOH缓冲液(pH 10.0)溶解1％的底物(角蛋白)，60℃反应10min，加入500μL 0.4mol/L
三氯乙酸溶液终止反应(对照组先加入三氯乙酸)。12 000r/min，离心5min，取上清500μL，
加入2.5mL 0.4mol/L Na2CO3溶液和500μL福林酚试剂(1∶2V/V)混合，60℃显色20min。在波
长680nm下检测吸光值。

[0105] 酶活力定义：1g固体酶粉(或者1mL液体酶)，在60℃，pH 10.0条件下，1min水解角蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

[0106] 酶活力的计算，得到测酶活的标准曲线的回归方程：y＝0.01x+0.0007，R2

[0107] ＝0.999 7酶活计算公式：X＝A×K×1/10×n×4

[0108] 式中：X为样品的酶活力，U/g(U/mL)；A为样品平行试验的平均吸光度；K为吸光常数；1为反应试剂的总体积(mL)；10为反应时间10min，以1min计；n为稀释倍数。

[0109] 通过测定角蛋白酶的酶活，结果如图7表明，重组菌株2，即通过双信号肽分泌的角蛋白酶表达，酶活在48h的表达最高，其中48h达到最高酶活为226.34U/mL,是重组菌株1，利
用单个信号肽表达的酶活(酶活为68.15U/mL)的3.32倍。

[0110] SDS‑PAGE：将重组菌株1、2分别培养了48h的发酵液离心取上清，上清液跑SDS‑PAGE电泳，从蛋白胶图(见图6)可以看出双信号肽的蛋白条带比单信号肽的条带粗，说明双
信号肽表达量明显多于单个信号肽。

[0111] SDS‑PAGE电泳缓冲液(5×)：每升含Tris 15.1g、Glycine 94g、SDS 5.0g，去离子水搅拌溶解，使用时稀释成1×；

[0112] 10％SDS：每升含100g SDS，去离子水中充分溶解，室温下保存备用；

[0113] 30％丙烯酰胺：称取30g丙烯酰胺、0.8g N，N’‑二甲基丙烯酰胺，加去离子水充分搅拌溶解，定容至100mL，用0.45μm滤膜滤去杂质，于棕色瓶中4℃保存。

[0114] 10％过硫酸铵(10mL)：称取1g过硫酸铵充分溶解于10mL去离子水中，4℃保存。注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存时可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。

[0115] 1.5M Tris‑HCl(pH 8.8)：称取18.15g Tris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH 8.8，让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH 8.8，加蒸馏水至100mL，高温高压
灭菌后4℃保存。

[0116] 0.5M Tris‑HCl(pH 6.8)：称取6.05g Tris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH 8.8，让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH 8.8，加蒸馏水至100mL，高温高压
灭菌后4℃保存。

[0117] 2×SDS‑PAGE上样缓冲液：1.25mL 0.5M Tris‑HCl(pH 6.8)，0.2g SDS，0.1mL巯基乙醇，0.5mg溴酚蓝，定容至5mL，室温存放。

[0118] 考马斯亮蓝R250染色液：取0.25g考马斯亮蓝(Coomassie blue)R250溶解于90mL的甲醇：水(1:1)和10mL冰醋酸混合液中，过滤除去颗粒杂质。

[0119] 考马斯亮蓝脱色液：醋酸:乙醇:水体积比为10:5:85。

[0120] 采用SDS‑PAGE法检测重组蛋白的表达，按照表2‑7配置聚丙烯酰胺凝胶，其中分离胶为浓度为12％的聚丙烯酰胺。

[0121] 表1 SDS‑PAGE凝胶配制方法

[0122]

[0123] (1)12％分离胶的配制

[0124] 按要求组装凝胶电泳模具，添加水测试胶板是否会出现漏胶现象；按照表2‑7所述12％胶配方配制SDS‑PAGE凝胶，首先配置下层分离胶，按从上到下依次添加各组分，震荡充
分混匀，缓慢加入到模具内，大约加整个胶板面积的2/3，用500μL异丙醇压实。常温下放置
至凝胶充分凝固聚合，大约40min；

[0125] (2)浓缩胶的配制

[0126] 倒掉分离胶上的异丙醇。按照表2‑7 5％浓缩胶的配方，按从上到下依次添加各组分，快速震荡充分混匀，用移液枪缓慢加到分离胶上，直至与玻璃板顶端平齐。立即将干净
的、厚度合适的梳子插入浓缩胶中。待浓缩胶充分凝固后(约30min)，拔出梳子，将配置好的
蛋白胶放入相对应的电泳槽中，倒入1×SDS蛋白电泳缓冲液浸没胶块；

[0127] (3)上样

[0128] 20μL样品，加入5μL 5×Loading buffer，沸水浴10min；快速离心后进行上样。

[0129] (4)电泳、染色和脱色

[0130] 上样完成后，连接电极，80V恒压电泳约15min，直至Loading buffer指示剂进入分离胶，换150V电压，直至Loading buffer指示剂前沿迁移至凝胶底部时，结束电泳。电泳完
毕，将胶放入考马斯亮蓝染色液中，染色30min。染色结束后，弃去染液，去离子水冲洗两次，
加入脱色液，进行脱色，直至脱色干净。然后观察蛋白电泳结果。

[0131] 果聚糖蔗糖酶的测定方法：

[0132] 取重组菌株3、4的发酵液，经过离心取上清液，进行蔗糖异构酶的酶活测定，蔗糖异构酶的测定方法参照：DNS法：

[0133] DNS：①称10g 3，5‑二硝基水杨酸溶于600mL蒸馏水中，45℃水浴；②称10g NaOH，先将其溶于水，再加入上述溶液。③称取200g酒石酸钠，2g苯酚，5g亚硫酸钠，逐次溶于上述
溶液中(避光操作)。④溶液温度至室温后，定容至1L，混匀。分装在棕色瓶中，一周后使用。

[0134] 葡萄糖标准曲线的绘制

[0135] 取1.0mg/mL葡萄糖标准溶液，按表2‑8加入试剂。沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长下测定吸光度。

[0136] 表2 葡萄糖标准溶液的配制

[0137]

[0138]

[0139] ②还原糖的测定

[0140] 取适当稀释的糖液2mL，加入1.5mL DNS试剂，沸水浴中加热5min，冷水冷却后，定容至25mL摇匀，在520nm波长下测定其吸光度值。(数值在0.2‑0.7为可信区间)

[0141] 通过蔗糖异构酶的测定：结果表明重组菌株4，即通过双信号肽串联组合分泌的蔗糖异构酶表达，酶活在16h的表达最高，酶活为24U/mL，是重组菌株3，即是单信号肽(酶活为
12U/mL)表达量的2倍(参照附图7)。

[0142] SDS‑PAGE：将含有蔗糖异构酶重组菌株16h的发酵液离心取上清，上清液跑SDS‑PAGE电泳，与单信号肽作为对照，蛋白胶图显示(如图8)明显看出重组菌株4的双信号肽在
表达果聚糖蔗糖酶的条带明显粗于重组菌株3的单个信号肽.实验结果说明双信号肽能够
有效的高表达蔗糖异构酶。

[0143] 果聚糖蔗糖酶重组菌株发酵16h,通过果聚糖蔗糖酶的测定：结果表明重组菌株6，即通过双信号肽串联组合分泌的果聚糖蔗糖酶表达，酶活在16h的表达最高，酶活为
80.86U/mL，是重组菌株5，即通过单信号肽(酶活为57.39U/mL)表达量的1.4倍，参照附图
11。

[0144] SDS‑PAGE：将含有果聚糖蔗糖酶重组菌株经不同发酵时间(6h、8h、10h、13h、16h)的发酵液离心取上清，上清液跑SDS‑PAGE电泳，与单信号肽作为对照，蛋白胶图显示(参照
附图10)明显看出重组菌株4的双信号肽在表达果聚糖蔗糖酶的条带明显粗于重组菌株5的
单个信号肽.实验结果说明双信号肽能够有效的高表达果聚糖蔗糖酶。

[0145] 可见，通过信号肽的串联组合能够有效的提高异源蛋白的表达。

[0146] 此外，通过双信号肽串联组合和三信号肽串联组合的对比可以看出，通过双信号肽串联组合分泌的果聚糖蔗糖酶表达，酶活在16h的表达最高，酶活为80.86U/mL，是重组菌
株7(SP‑A‑D‑L)，即通过三信号肽(酶活为56U/mL)表达量的1.4倍，参照附图11。

[0147] SDS‑PAGE：将含有果聚糖蔗糖酶重组菌株经不同发酵时间(6h、8h、10h、13h、16h)的发酵液离心取上清，上清液跑SDS‑PAGE电泳，三信号肽与双信号肽串联组合相比，蛋白胶
图显示(参照附图10)明显看出重组菌株4的双信号肽在表达果聚糖蔗糖酶的条带明显粗于
重组菌株7的三信号肽.实验结果说明双信号肽能够有效的高表达果聚糖蔗糖酶，显著高于
单信号肽和三信号肽的表达。同理，在利用三信号肽SPDacB、SPamyE和SPL表达角蛋白酶和蔗糖
异构酶时，其表达的酶活同样低于上述利用双信号肽表达的酶活。