一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用转让专利
申请号 : CN201911421820.7
文献号 : CN111088258B
文献日 : 2021-12-24
发明人 : 龙湍 , 唐杰 , 李佳林 , 韩晓斌 , 刘昊 , 曾翔 , 吴永忠 , 黄培劲
申请人 : 海南波莲水稻基因科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种分子标记的以下任一所述的应用:(1)在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或该基因的基因型中的应用;
(2)筛选或检测具有光温敏核雄性不育表型水稻中的应用;
(3)在鉴定水稻光温敏雄性核不育性状中的应用;
(4)在制备光温敏核雄性不育转基因水稻中的应用;
(5)在光温敏核雄性不育水稻制种中的应用;
所述分子标记为与水稻光温敏核雄性不育基因tms3650紧密连锁的RM15915、RM15937或与水稻光温敏核雄性不育基因tms3650共分离的RM15931。
2.一种引物组的以下任一所述的应用:(1)在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms3650、或该基因的基因型中的应用;
(2)筛选或检测具有光温敏核雄性不育表型水稻中的应用;
(3)在鉴定水稻光温敏雄性核不育性状中的应用;
(4)在制备光温敏核雄性不育转基因水稻中的应用;
(5)在光温敏核雄性不育水稻制种中的应用;
所述引物组含有以下任一或多个引物组:引物组1:SEQ ID NO.1‑2所示引物、引物组2:SEQ ID NO.3‑4所示引物、引物组3:SEQ ID NO.5‑6所示引物。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,当使用引物组1对待测水稻模板进行扩增时,如果只出现200 bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650纯合基因型,具有光温敏雄性不育表型;如果只出现191 bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;如果同时出现200bp和
191bp,的条带,说明待测水稻材料是tms3650杂合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;
当使用引物组2对待测水稻模板进行扩增时,如果只出现156bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650纯合基因型,具有光温敏雄性不育表型;如果只出现150bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;如果同时出现156bp和150bp条带,说明待测水稻材料是tms3650杂合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;
当使用引物组3进行扩增时,如果只出现171bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650纯合基因型,具有光温敏雄性不育表型;如果只出现151bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;如果同时出现171bp和151bp的条带,说明待测水稻材料是tms3650杂合基因型,不具有光温敏雄性不育表型。
说明书 :
一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和
应用
技术领域
背景技术
从上世纪60年代袁隆平先生提出利用水稻的雄性不育性生产杂交水稻开始,中国的杂交水
稻经历了从三系到两系杂交稻的发展。三系杂交稻利用核质互作不育系进行杂交稻育制
种,而两系杂交稻利用光温敏不育系进行杂交稻育制种。相对于三系不育系,两系不育系恢
复系广、配组更为自由,大大简化了生产和繁殖过程,应用潜力巨大。
敏不育系,在短日照下不育,长日照下可育;3)温敏不育系,在高温下不育,低温下可育;4)
反温敏不育系,在低温下不育,高温下可育。一般而言,光敏不育系的育性也受到温度的影
响,而温敏不育系的育性并不受光照的影响。粳稻品种农垦58s和籼稻品种安农s‑1是研究
和应用最广泛的光温敏雄性不育系,目前生产上应用的光温敏不育系大部分都是这两个品
种的衍生系。
tms5、csa、tms9‑1、ugp1和ugp2等6个基因已被克隆,tms‑1、rpms‑1和rtms‑1等15个基因已
完成了定位。虽然众多的水稻光温敏核不育基因被定位或克隆,但对于调控水稻光温敏核
不育性状的分子基础依然知之甚少。目前生产上使用的光温敏不育系多带有tms5和pms3基
因。
发明内容
的3617个M1代材料种植成株系,每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花
期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体,并收种保存。在其中3650号家系
中发现一种突变体表现为雄性不育,被命名为tms3650。该突变体呈现长日高温不育,短日
低温可育的光温敏雄性不育表型,该表型由突变后的TMS3650单基因控制。
RM15931共分离,与标记RM15915和RM15937紧密连锁。
光温敏核雄性不育基因tms3650。
为模板时能扩增出一条156bp的条带,在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条150bp
的条带。
密连锁。
引物与如SEQ ID NO.2所示反向引物共同扩增得到。扩增RM15915的引物在以93‑11或
TMS3193突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条200bp的条带,在以明恢63基因组DNA为模
板时能扩增出一条191bp的条带。
ID NO.5所示正向引物和如SEQ ID NO.6所示反向引物扩增得到。RM15937的引物在以93‑11
或TMS3193突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条171bp的条带,在以明恢63基因组DNA为
模板时能扩增出一条151bp的条带。
雄性不育基因tms3650、或该基因的基因型中的应用。
良育种、制种中的应用。
基因植物中的应用。
如果只出现191bp的条带,说明被检测材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏雄性不育
表型;如果同时出现200bp和191bp,的条带,说明被检测材料是tms3650杂合基因型,不具有
光温敏雄性不育表型;
材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;如果同时出现156bp和150bp,的
条带,说明被检测材料是tms3650杂合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;
材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏雄性不育表型;如果同时出现171bp和151bp的条
带,说明被检测材料是tms3650杂合基因型,不具有光温敏雄性不育表型。
中,当使用RM15915、RM15931和/或RM15937标记引物进行扩增时,如果只出现200bp、156bp
或171bp的条带,说明被检测材料带是tms3650纯合基因型,具有光温敏雄性不育表型;如果
只出现191bp、150bp或151bp的条带,说明被检测材料是tms3650纯合基因型,不具有光温敏
雄性不育表型;如果同时出现200bp和191bp,或156bp和150bp,或171bp和151bp的条带,说
明被检测材料是tms3650杂合基因型,不具有光温敏雄性不育表型。
tms3650的鉴定为两系不育系的选育提供了新的基因资源,RM15915、RM15931和RM15937等
标记的开发可以高效准确的对tms3650进行筛选,从而提高以tms3650为不育基因的两系不
育系的选育效率。
附图说明
染色结果。
体不育单株。
体不育单株。
育单株。
H28B、R51084、M3650,泳道13‑22为F1杂交种tms3650/野香B、tms3650/9311、tms3650/明恢
63、tms3650/中花11、tms3650/GD‑7S、tms3650/隆科638S、tms3650/特B、tms3650/博II B、
tms3650/H28B、tms3650/R51084。
R51084,B图中泳道1‑7为F1杂交种tms3650/野香B、tms3650/明恢63、tms3650/GD‑7S、
tms3650/隆科638S、tms3650/博II B、tms3650/H28B、tms3650/R51084。
R51084,B图中泳道1‑7为F1杂交种tms3650/野香B、tms3650/明恢63、tms3650/GD‑7S、
tms3650/隆科638S、tms3650/博II B、tms3650/H28B、tms3650/R51084。
具体实施方式
3617个M1代材料种植成株系,每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花
期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体,并收种保存。在其中3650号家系
中发现一种突变体表现为雄性不育,被命名为tms3650。
成蓝黑色。而tms3650突变体的花粉粒小而皱缩,并且不能被染色(如图1的b)。此外,可育植
株套袋自交后正常结实,而tms3650突变体套袋自交后不结实。而以水稻品种93‑11为父本
给tms3650突变体授粉则可以结实。这些结果表明该tms3650突变体在长日高温条件下表现
出雄性不育表型。将tms3650突变体的稻兜在2015年冬季种植于海南省陵水县提蒙镇,安排
稻蔸在1‑2月抽穗(经查询当时平均温度为17‑24℃)。对抽穗后的花粉粒进行碘‑碘化钾溶
液(0.6%kI,0.3%I2,w/w)染色,结果表明花粉粒大而饱满,并被染成蓝黑色(图1的c),说
明tms3650突变体的雄性育性在短日低温条件下发生了转育,是一个光温敏雄性不育突变
体。
现雄性不育,可育与不育株分离比符合3:1(χ=0.54,p>0.05)。用tms3650突变体与93‑11
回交,在回交后代一个110株的F3分离群体中,79株育性正常,31株不育,可育与不育株分离
2
比也符合3:1(χ=0.44,p>0.05)。上述结果表明tms3650的雄性不育性状受由一对隐性单
基因控制。
杂交构建了一个F2群体,分离出了61个不育株。利用301对均匀分布于12条染色体上的SSR
标记筛选93‑11与明恢63之间具有多态性的标记,筛选得到64对具有多态性的SSR标记,多
态性较低,表明明恢63与93‑11在基因组序列上差异较小。分别构建所述F2群体的可育株和
不育株的混合基因池,利用所述64对多态性标记对所述可育基因池与不育基因池进行分
析。结果表明3号染色体上的SSR标记RM055和RM293与tms3650的突变表型存在连锁关系。进
一步利用上述连锁标记逐个分析明恢63和tms3650的F2群体中的不育株的基因型,最终确
定目标基因初步定位于SSR标记RM055和RM293之间,由此将tms3650初定位于3号染色体上
(图2的A)。通过在SSR标记RM055和RM293之间继续筛选多态性标记,得到RM15900、RM15915、
RM15947。tms3650基因与RM055、RM15900、RM15915、RM15947和RM293标记之间的交换单株分
别为18个,2个,1个,0个,5个(图2的B)。
1112个单株,其中分离出不育株260株。同时,在标记RM15915和RM15947之间进一步开发了3
个多态性标记(图2的C)。其中,用于检测分子标记RM15915的引物如SEQ ID NO.1‑2所示;用
于检测分子标记RM15931的引物如SEQ ID NO.3‑4所示;用于检测RM15937的引物如SEQ ID
NO.5‑6所示。利用这些标记逐个检测F3群体中分离出不育株的基因型,发现在RM15915标记
处只有2个不育株扩出了200bp和191bp的条带,而其它不育株都只扩出了200bp的条带(图
3)。这说明在260个不育单株中,有258个单株只扩增出了200bp条带,即具有200bp纯合带型
时,有99.2%(258/260)的植株都表现出光温敏雄性不育表型。
都表现出光温敏雄性不育表型。
RM15937之间470.39kb的染色体片段内并且与标记RM15931共分离。
不育系GD‑7S、隆科638S,三系保持系野香B、特B、博II B、H28B,恢复系9311、明恢63、
R51084,常规品种中花11。tms3650与这些品种的杂种F1均没有光温敏不育表型。图6显示,
RM15915除了在tms4430和9311中扩增出200bp条带外,在其它亲本中只扩增出了207bp条带
或不同于200bp和207bp的多态性条带,在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了
200bp和包含双亲另一亲本的条带,说明RM15915可以在不同品种中特异性标记tms4430的
光温敏雄性不育表型。图7显示,RM15937除了在tms3650和9311中扩增出171bp条带外,在其
它亲本中只扩增出了151bp条带,在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了171bp和
151bp条带,说明RM15937可以在不同品种中特异性标记tms3650的光温敏雄性不育表型。图
8显示,RM15931除了在tms3650和9311中扩增出156bp条带外,在其它亲本中只扩增出了
150bp条带,在tms3650与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了156bp和150bp条带,说明
RM15931可以在不同品种中特异性标记tms3650的光温敏雄性不育表型。
带有纯合tms3650突变基因的隐性核不育系。具体实施步骤如下:
出现200bp和191bp条带,或同时出现156bp和150bp条带,或同时出现171bp和151bp条带。
记),对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定,选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于
88%相似度,或2%中选率等)的植株。
系。
也应视为本发明的保护范围。