一种用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物及试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于二代测序技术的能快速、全面、准确地检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物及试剂盒。使用本发明所述引物及试剂盒，可以同时检测RET基因外显子上的全部突变以及2种在甲状腺癌中最常见的RET基因融合，包括CCDC6‑RET融合和NCOA4‑RET融合，大大提高了RET基因变异检测结果的准确性和完整性，缩短了临床检测周期，降低了检测成本，为甲状腺癌的临床诊断和靶向药物的选择提供更加全面的参考信息。此外，使用本发明还可以发现RET基因上的未知突变，为更进一步的临床研究提供帮助。

权利要求

1.一种用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括以下特异性多重PCR引物对：（1）正向引物序列5'-3'：

RET-Pool1-1：GCTCTTCCGATCTCAGCCAGAGCAAGCACTGGAG；

RET-Pool1-2：GCTCTTCCGATCTACAACACACATCTGGTCCACCTATG；

RET-Pool1-3：GCTCTTCCGATCTGAATCTCTACCCTCAGGCCATTACA；

RET-Pool1-4：GCTCTTCCGATCTGACCCTGCTTGTCTGCCACCT；

RET-Pool1-5：GCTCTTCCGATCTCTAGAGGGGCAGGATCTGCCTAG；

RET-Pool1-6：GCTCTTCCGATCTGAGTTTTGCCAAGGCCTTACTGTC；

RET-Pool1-7：GCTCTTCCGATCTGACAGGCTAGCTAGCTGTGTTAGAAGTAG；

RET-Pool1-8：GCTCTTCCGATCTTTGTCCTTGAAGAAGCCTTATTCTCAC；

RET-Pool1-9：GCTCTTCCGATCTCCGACTGCCTGGCAGATGTG；

RET-Pool1-10：GCTCTTCCGATCTTCCCGAGGAAAGCGGCTG；

RET-Pool1-11：GCTCTTCCGATCTGCTACACATGAGGAAGCAGCCAG；

RET-Pool1-12：GCTCTTCCGATCTAGCATACGCAGCCTGTACCCAG；

RET-Pool1-13：GCTCTTCCGATCTTCAGCTGAGATGACCTTCCGGAG；

RET-Pool1-14：GCTCTTCCGATCTAAGGCGAATTTGGAAAAGTGGTC；

RET-Pool1-15：GCTCTTCCGATCTGGAAGACCCAAGCTGCCTGAC；

RET-Pool1-16：GCTCTTCCGATCTTGAGCCAGTGACCGCTGCTG；

RET-Pool1-17：GCTCTTCCGATCTCAGGTGGAGCCACTCACTGGTC；

RET-Pool1-18：GCTCTTCCGATCTTGTGGCACATGGCTTGGAGTG；

RET-Pool1-19：GCTCTTCCGATCTCTAGCACCGCTGTCCCCTTTG；

RET-Pool1-20：GCTCTTCCGATCTGTTGAGAAAGGAGCCACCAGCAC；

RET-Pool1-21：GCTCTTCCGATCTCTACCGGCCCTTTCTTTGTGAAC；

RET-Pool1-22：GCTCTTCCGATCTCCTGGTGTATGAAATTGGACCTGAAC；

RET-Pool1-23：GCTCTTCCGATCTATCATGATTAAGATGATTCCTAGATTTAGCAC；

RET-Pool1-24：GCTCTTCCGATCTTGTTGTCAGCACTGTAACTTCGCAG；

RET-Pool1-25：GCTCTTCCGATCTGGACACGTAACCTGGCTCTAATTTG；

RET-Pool1-26：GCTCTTCCGATCTAAAGTCCCCATCCTTATTAGCTCTACTG；

RET-Pool2-27：GCTCTTCCGATCTGCAGCAGCGCTGAGTGCC；

RET-Pool2-28：GCTCTTCCGATCTGACACTGCCCTGGAAATATGGG；

RET-Pool2-29：GCTCTTCCGATCTGTCCATGGGGCCTCCTTTAAG；

RET-Pool2-30：GCTCTTCCGATCTAAGAAAGGGGGCTGTTGGAGTC；

RET-Pool2-31：GCTCTTCCGATCTTGTTTGTAATTTAATGCTGCTACAAGATGT；

RET-Pool2-32：GCTCTTCCGATCTTTGCTGTACGTCCATGCCCTG；

RET-Pool2-33：GCTCTTCCGATCTTCAACACCTCCTTTCCAGCCTG；

RET-Pool2-34：GCTCTTCCGATCTGCCGTGTGCACCGTGCAC；

RET-Pool2-35：GCTCTTCCGATCTAGCTGGTGAGGCGGTACACAAG；

RET-Pool2-36：GCTCTTCCGATCTGCTGGTCAATGACTCAGACTTCCAG；

RET-Pool2-37：GCTCTTCCGATCTCGCTAGGGGTGGTCACCTCAG；

RET-Pool2-38：GCTCTTCCGATCTAGATCCACTGTGCGACGAGCTG；

RET-Pool2-39：GCTCTTCCGATCTGGAGCGATCGTTTGCAACCTG；

RET-Pool2-40：GCTCTTCCGATCTAAGTGGGGCCTGGCTACCTG；

RET-Pool2-41：GCTCTTCCGATCTGAAAGCTCAGGGATAGGGCCTG；

RET-Pool2-42：GCTCTTCCGATCTTGGCCCTGCTTGGATCATATTG；

RET-Pool2-43：GCTCTTCCGATCTGGAGACACCGCTGGTGGACTG；

RET-Pool2-44：GCTCTTCCGATCTATTACCACATTGCCCAGCAACTTAG；

RET-Pool2-45：GCTCTTCCGATCTTCAGGGGTAGCGAGGTTGCAG；

RET-Pool2-46：GCTCTTCCGATCTGGGTTTCCAAGATATCCAAATGATAGTG；

RET-Pool2-47：GCTCTTCCGATCTGAGCTCTGAGTCTTAGTGGTTAAGCATTC；

RET-Pool2-48：GCTCTTCCGATCTGACCTGTCCTTATTCAGAATGAGAGACTG；

RET-Pool2-49：GCTCTTCCGATCTACAGCAAAATTGTGGCATTTTGTG；

RET-Pool2-50：GCTCTTCCGATCTCAGGTTTGTTCTCAGGAGGGTAAGAAC；

CCDC6-RET：GCTCTTCCGATCTGCATTGTCATCTCGCCGTTCC；

NCOA4-RET：GCTCTTCCGATCTAAGTCAGCATCCGGTATTGTAGCTG；

（2）反向引物序列5'-3'：

RET-Pool1-1：GCTCTTCCGATCTGGTGCGGCGCTCAGTCTG；

RET-Pool1-2：GCTCTTCCGATCTGGTCTCGTTGGGCCAGTGTTC；

RET-Pool1-3：GCTCTTCCGATCTCCTAGAGGTCTGCTGGTCGGTG；

RET-Pool1-4：GCTCTTCCGATCTCCTGCAGGCCTCCCTTGG；

RET-Pool1-5：GCTCTTCCGATCTTGAAGTGCCTGTGGGATCCAG；

RET-Pool1-6：GCTCTTCCGATCTCGTGTCCATTAATTTTGCCGC；

RET-Pool1-7：GCTCTTCCGATCTAATGACAAGAAGCTTATGAGTCATGGTC；

RET-Pool1-8：GCTCTTCCGATCTGGAAGCTGGGCACCTCCTCAG；

RET-Pool1-9：GCTCTTCCGATCTAGAGCTCCCGGGGCTTGAG；

RET-Pool1-10：GCTCTTCCGATCTGAAGGGCACCATCACCACCTC；

RET-Pool1-11：GCTCTTCCGATCTGCAGCACCGACACGTTGAAGTG；

RET-Pool1-12：GCTCTTCCGATCTCAGCACCGAGACGATGAAGGAG；

RET-Pool1-13：GCTCTTCCGATCTCTGGCCTCCCTCCCTGGAAG；

RET-Pool1-14：GCTCTTCCGATCTGCTCTTCAGGGTCCCATGCTG；

RET-Pool1-15：GCTCTTCCGATCTTGGTCCAGGGAGCTGGAGTTG；

RET-Pool1-16：GCTCTTCCGATCTCCCATGGTGCACCTGGGATC；

RET-Pool1-17：GCTCTTCCGATCTTCCCCTCCCTTCCCAAGTGAG；

RET-Pool1-18：GCTCTTCCGATCTAGAGTTTGTTTTCAATCCATGTGGAAG；

RET-Pool1-19：GCTCTTCCGATCTCTGAGAGTTCCGCCCTGATCTG；

RET-Pool1-20：GCTCTTCCGATCTCAACCGTCCTGAAGGTGGGTAAG；

RET-Pool1-21：GCTCTTCCGATCTGGTGCTGCTGGGCACTGAAG；

RET-Pool1-22：GCTCTTCCGATCTCCCTGGAGGGGCATTGACAC；

RET-Pool1-23：GCTCTTCCGATCTGCAGCAAAGCCTCTGCTGTCAG；

RET-Pool1-24：GCTCTTCCGATCTAGGCTCTATTACACACGCATCCAAG；

RET-Pool1-25：GCTCTTCCGATCTCCATCACTGGGTCAGCTGTTTAGAC；

RET-Pool1-26：GCTCTTCCGATCTTCAGAAATCTGTTGTTTCCAACTAGAATG；

RET-Pool2-27：GCTCTTCCGATCTCTGCTCGGCGCCAACTTC；

RET-Pool2-28：GCTCTTCCGATCTCCCTTGTTGGGACCTCAGATGT；

RET-Pool2-29：GCTCTTCCGATCTCCACCGTGGTGTACCCTGCT；

RET-Pool2-30：GCTCTTCCGATCTCATCAGAATTGTAATCAGAGGTGTAGCA；

RET-Pool2-31：GCTCTTCCGATCTAAGAGCAGGCAGTGTTTTGGTAATC；

RET-Pool2-32：GCTCTTCCGATCTGGCACGGGGTGGGTGTTG；

RET-Pool2-33：GCTCTTCCGATCTCCCACAAGGTCGGCACTCAC；

RET-Pool2-34：GCTCTTCCGATCTACGAACTGTGGCCGGAGACAG；

RET-Pool2-35：GCTCTTCCGATCTCCTCATTTCCTGGGGGCCTAG；

RET-Pool2-36：GCTCTTCCGATCTCTGTGCCCCCATGTCCCTTG；

RET-Pool2-37：GCTCTTCCGATCTACCCTCCCTCCCTGGAGCAG；

RET-Pool2-38：GCTCTTCCGATCTGCACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC；

RET-Pool2-39：GCTCTTCCGATCTTGTATGGAGCCCCCAGCCTG；

RET-Pool2-40：GCTCTTCCGATCTGGCTGGGTGCAGAGCCATATG；

RET-Pool2-41：GCTCTTCCGATCTGTCGTGGCCCCACTACATGTATAAG；

RET-Pool2-42：GCTCTTCCGATCTGAGTCTCCCCAAGCCACTTTCAG；

RET-Pool2-43：GCTCTTCCGATCTAGACCAGAAACATTTTTAAAAAGCATCAC；

RET-Pool2-44：GCTCTTCCGATCTTGTGCTCCCAGTGCAGGCTG；

RET-Pool2-45：GCTCTTCCGATCTCAAACAATCAATGATGAAGTTAGGAAACAG；

RET-Pool2-46：GCTCTTCCGATCTCTGCCACCTGGGAACTGAACAC；

RET-Pool2-47：GCTCTTCCGATCTTCATGTTTAAATTTTTTTGCCTTGTTTG；

RET-Pool2-48：GCTCTTCCGATCTTCCACATAGTAAAGATGGCATGGAATC；

RET-Pool2-49：GCTCTTCCGATCTATGTCTATAGATATTTGTAAAAGAACTTATCACAGTG；

RET-Pool2-50：GCTCTTCCGATCTATACTCAGTAATACTTAATACTTAGTAACTTCTGCATTTAC；

CCDC6-RET：GCTCTTCCGATCTCTGCTCTGCCTTTCAGATGGAAG；

NCOA4-RET：GCTCTTCCGATCTGTGTACCCTGCTCTGCCTTTCAG。

2.根据权利要求1所述的引物组合在制备用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒能够用于检测RET基因外显子上的全部突变以及CCDC6-RET融合和NCOA4-RET融合。

4.一种用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括RNA逆转录试剂、随机引物、dNTP、DNA聚合酶、NGS建库试剂、阳性对照和阴性对照。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测流程包括以下步骤：（1） 样本提取：使用DNA样本抽提试剂盒抽提样本中的DNA，使用RNA样本抽提试剂盒抽提样本中的RNA；

（2） RNA逆转录：用RNA逆转录试剂将步骤（1）获得的RNA逆转录为cDNA；

（3） 多重PCR扩增：用特异性多重PCR引物与NGS建库试剂中的扩增试剂，对从步骤（1）中获得的DNA和步骤（2）中获得的cDNA分别进行扩增；

（4） 产物纯化：在步骤（3）获得的PCR扩增产物中加入定量的磁珠，进行纯化，去除基因组DNA和残余扩增引物；

（5） 接头连接：在步骤（4）获得的纯化产物中加入NGS建库试剂中的特异性标签和接头试剂，进行反应；

（6） 文库纯化：在步骤（5）所获得的已加上标签序列的小片段文库中加入磁珠，进行纯化，去除大片段和残余接头；

（7）  文库检测：将步骤（6）制备好的文库用Qubit进行定量，并用Agilient Bioanalyzer 2100进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在

300bp左右；

（8） 上机测序：将步骤（7）检测合格的文库用Illumina测序平台进行高通量测序；

（9） 生信分析：对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。

说明书

一种用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物及试剂盒。

背景技术

[0002] RET基因变异与肿瘤关系密切。根据变异类型不同，RET基因变异可以分成两种，一种是RET基因突变，一种是RET基因融合。这两种变异情况都和甲状腺癌密切相关，临床上准
确区分RET基因变异的类型，对甲状腺癌的诊断和治疗至关重要。

[0003] 美国甲状腺协会（ATA）发布的《甲状腺髓样癌诊疗指南（2015版）》，将遗传性甲状腺髓样癌（MTC）中常见的RET基因突变按照危险度进行分级，分别定义了中危、高危和最高
危3个等级（见表1），其中最高危包括M918T密码子突变，高危包括C634R（G/F/S/W/Y）和
A883F密码子突变，中危包括除M918T，C634R（G/F/S/W/Y）及A883F密码子突变以外的其他常
见RET基因突变。指南中明确提出，在遗传性甲状腺髓样癌患者的治疗方案和散发性甲状腺
髓样癌患者的预后诊疗方案中，推荐对RET基因突变进行检测从而指导疾病的危险度分级。

[0004] 表1 2015 ATA指南常见RET突变与MTC风险等级

[0005] RET突变 外显子 MTC风险等级G533C 8 中
C609F/G/R/S/Y 10 中
C611F/G/S/Y/W 10 中
C618F/R/S 10 中
C620F/R/S 10 中
C630R/Y 11 中
D631Y 11 中
C634F/G/R/S/W/Y 11 高
K666E 11 中
E768D 13 中
L790F 13 中
V804L 14 中
V804M 14 中
A883F 15 高
S891A 15 中
R912P 16 中
M918T 16 最高

[0006] 除了RET基因突变以外，RET基因融合也是甲状腺乳头状癌（PTC）中的一种特征性的分子标志物，可作为甲状腺乳头状癌（PTC）鉴别诊断的依据。国内外多个甲状腺癌诊疗指
南和专家共识指出，RET基因融合可作为甲状腺肿瘤良恶性区分的分子标记物，应该将RET
基因融合的检测纳入到相应的诊疗规范中，例如美国国家综合癌症网络（NCCN）发布的《甲
状腺肿瘤NCCN指南》（2019.V2），中国抗癌协会甲状腺癌专业委员会(CATO)发布的《甲状腺
微小乳头状癌诊断与治疗专家共识》（2016版）等。根据COSMIC数据库统计，甲状腺癌中RET
基因融合的类型有19种， 但94.4％的甲状腺癌RET基因融合是CCDC6-RET（也称为RET/
PTC1）融合和NCOA4-RET（也称为RET/PTC3）融合。

[0007] 准确检测患者RET基因的变异信息除了有助于甲状腺肿瘤的明确诊断之外，对那些针对RET基因变异进行靶向治疗的药物选择也具有非常重要的临床价值。例如刚被美国
礼来公司（Lilly）收购的药物LOXO-292（selpercatinib），是一种口服RET抑制剂，目前已被
FDA批准用于包括甲状腺癌在内的三种适应症，但该药物能否有效发挥作用，需以患者是否
存在RET基因变异为前提。因此准确检测RET基因的变异情况（分别包括突变和融合），成为
选择这类靶向药物的重要前提。

[0008] 因此，如何能够快速、全面、准确地检测患者RET基因的变异情况就变得非常重要。现有的很多技术方案中，大多数只检测少量的已知的RET基因突变，例如，一项检测人类RET
基因7种突变的试剂盒（专利号CN201610025142.2），只检测了RET基因的7种突变情况
（M918T和C634R（G/F/S/W/Y）），而且还没有包括A883F位点（该位点属于ATA指南中明确的高
危位点），因此给予的检测信息并不全面，临床使用受限。还有一些技术方案仅能够检测RET
基因融合（例如，专利号CN201810956110.3、CN201410727044.4、CN201310166832.6），而并
不能同时检测RET基因突变。因此临床上若想全面了解RET基因的变异情况，往往需要同时
使用多种检测方法或检测试剂盒，不但费时费钱费力，而且还浪费宝贵的临床样本。另外，
RET基因的突变类型很多，除了已经明确的50余种已知的突变外，还存在一些未知的但对疾
病的发生发展可能有影响的突变位点，临床同样需要关注，但目前临床上经常采用的qPCR
检测方法，无法满足未知突变位点的检测要求，存在一定的临床应用局限性，如果使用
Sanger测序法，又存在检测灵敏度低，耗时长，样本量要求高等缺点。

[0009] 因此，本发明提供了一种基于二代测序技术的能快速、全面、准确地检测甲状腺癌RET基因突变及2种甲状腺癌中最常见的RET基因融合的引物及试剂盒。使用本发明所述引
物及试剂盒，可以同时检测RET基因外显子上的全部突变以及2种在甲状腺癌中最常见的
RET基因融合，包括CCDC6-RET（也称为RET/PTC1）融合和NCOA4-RET（也称为RET/PTC3）融合，
大大提高了RET基因变异检测结果的准确性和完整性，为甲状腺癌的临床诊断和治疗提供
更加全面的参考信息。此外，使用本发明还可以发现RET基因上的未知突变，对更进一步的
临床研究提供了帮助。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种基于二代测序技术的能快速、全面、准确地检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物及试剂盒，解决目前检测方法无法实现甲状腺癌RET基因突
变及融合同时检测的问题。使用本发明方法，可以同时检测出RET基因外显子上的全部突变
以及2种在甲状腺癌中最常见的RET基因融合，包括CCDC6-RET（也称为RET/PTC1）和NCOA4-
RET（也称为RET/PTC3）。

[0011] 本发明还提供了一种能够特异性扩增甲状腺癌RET基因突变和融合的引物组合，采用特异性多重PCR引物扩增的方法，所述特异性多重PCR引物组合用于扩增RET基因的全
部21个外显子以及2种RET基因融合，其特异性多重PCR引物序列见表2所示：

[0012] 表2 检测RET基因突变及融合的引物序列

[0013] 引物对 正向引物序列（5'-3'） 反向引物序列（5'-3'）RET-Pool1-1 GCTCTTCCGATCTCAGCCAGAGCAAGCACTGGAG GCTCTTCCGATCTGGTGCGGCGCTCAGTCTG
RET-Pool1-2 GCTCTTCCGATCTACAACACACATCTGGTCCACCTATG GCTCTTCCGATCTGGTCTCGTTGGGCCAGTGTTCRET-Pool1-3 GCTCTTCCGATCTGAATCTCTACCCTCAGGCCATTACA GCTCTTCCGATCTCCTAGAGGTCTGCTGGTCGGTGRET-Pool1-4 GCTCTTCCGATCTGACCCTGCTTGTCTGCCACCT GCTCTTCCGATCTCCTGCAGGCCTCCCTTGG
RET-Pool1-5 GCTCTTCCGATCTCTAGAGGGGCAGGATCTGCCTAG GCTCTTCCGATCTTGAAGTGCCTGTGGGATCCAG
RET-Pool1-6 GCTCTTCCGATCTGAGTTTTGCCAAGGCCTTACTGTC GCTCTTCCGATCTCGTGTCCATTAATTTTGCCGC
RET-Pool1-7 GCTCTTCCGATCTGACAGGCTAGCTAGCTGTGTTAGAAGTAG GCTCTTCCGATCTAATGACAAGAAGCTTATGAGTCATGGTCRET-Pool1-8 GCTCTTCCGATCTTTGTCCTTGAAGAAGCCTTATTCTCAC GCTCTTCCGATCTGGAAGCTGGGCACCTCCTCAGRET-Pool1-9 GCTCTTCCGATCTCCGACTGCCTGGCAGATGTG GCTCTTCCGATCTAGAGCTCCCGGGGCTTGAG
RET-Pool1-10 GCTCTTCCGATCTTCCCGAGGAAAGCGGCTG GCTCTTCCGATCTGAAGGGCACCATCACCACCTC
RET-Pool1-11 GCTCTTCCGATCTGCTACACATGAGGAAGCAGCCAG GCTCTTCCGATCTGCAGCACCGACACGTTGAAGTGRET-Pool1-12 GCTCTTCCGATCTAGCATACGCAGCCTGTACCCAG GCTCTTCCGATCTCAGCACCGAGACGATGAAGGAG
RET-Pool1-13 GCTCTTCCGATCTTCAGCTGAGATGACCTTCCGGAG GCTCTTCCGATCTCTGGCCTCCCTCCCTGGAAG
RET-Pool1-14 GCTCTTCCGATCTAAGGCGAATTTGGAAAAGTGGTC GCTCTTCCGATCTGCTCTTCAGGGTCCCATGCTG
RET-Pool1-15 GCTCTTCCGATCTGGAAGACCCAAGCTGCCTGAC GCTCTTCCGATCTTGGTCCAGGGAGCTGGAGTTG
RET-Pool1-16 GCTCTTCCGATCTTGAGCCAGTGACCGCTGCTG GCTCTTCCGATCTCCCATGGTGCACCTGGGATC
RET-Pool1-17 GCTCTTCCGATCTCAGGTGGAGCCACTCACTGGTC GCTCTTCCGATCTTCCCCTCCCTTCCCAAGTGAG
RET-Pool1-18 GCTCTTCCGATCTTGTGGCACATGGCTTGGAGTG GCTCTTCCGATCTAGAGTTTGTTTTCAATCCATGTGGAAGRET-Pool1-19 GCTCTTCCGATCTCTAGCACCGCTGTCCCCTTTG GCTCTTCCGATCTCTGAGAGTTCCGCCCTGATCTG
RET-Pool1-20 GCTCTTCCGATCTGTTGAGAAAGGAGCCACCAGCAC GCTCTTCCGATCTCAACCGTCCTGAAGGTGGGTAAGRET-Pool1-21 GCTCTTCCGATCTCTACCGGCCCTTTCTTTGTGAAC GCTCTTCCGATCTGGTGCTGCTGGGCACTGAAG
RET-Pool1-22 GCTCTTCCGATCTCCTGGTGTATGAAATTGGACCTGAAC GCTCTTCCGATCTCCCTGGAGGGGCATTGACACRET-Pool1-23 GCTCTTCCGATCTATCATGATTAAGATGATTCCTAGATTTAGCAC GCTCTTCCGATCTGCAGCAAAGCCTCTGCTGTCAGRET-Pool1-24 GCTCTTCCGATCTTGTTGTCAGCACTGTAACTTCGCAG GCTCTTCCGATCTAGGCTCTATTACACACGCATCCAAGRET-Pool1-25 GCTCTTCCGATCTGGACACGTAACCTGGCTCTAATTTG GCTCTTCCGATCTCCATCACTGGGTCAGCTGTTTAGACRET-Pool1-26 GCTCTTCCGATCTAAAGTCCCCATCCTTATTAGCTCTACTG GCTCTTCCGATCTTCAGAAATCTGTTGTTTCCAACTAGAATGRET-Pool2-27 GCTCTTCCGATCTGCAGCAGCGCTGAGTGCC GCTCTTCCGATCTCTGCTCGGCGCCAACTTC
RET-Pool2-28 GCTCTTCCGATCTGACACTGCCCTGGAAATATGGG GCTCTTCCGATCTCCCTTGTTGGGACCTCAGATGT
RET-Pool2-29 GCTCTTCCGATCTGTCCATGGGGCCTCCTTTAAG GCTCTTCCGATCTCCACCGTGGTGTACCCTGCT
RET-Pool2-30 GCTCTTCCGATCTAAGAAAGGGGGCTGTTGGAGTC GCTCTTCCGATCTCATCAGAATTGTAATCAGAGGTGTAGCARET-Pool2-31 GCTCTTCCGATCTTGTTTGTAATTTAATGCTGCTACAAGATGT GCTCTTCCGATCTAAGAGCAGGCAGTGTTTTGGTAATCRET-Pool2-32 GCTCTTCCGATCTTTGCTGTACGTCCATGCCCTG GCTCTTCCGATCTGGCACGGGGTGGGTGTTG
RET-Pool2-33 GCTCTTCCGATCTTCAACACCTCCTTTCCAGCCTG GCTCTTCCGATCTCCCACAAGGTCGGCACTCAC
RET-Pool2-34 GCTCTTCCGATCTGCCGTGTGCACCGTGCAC GCTCTTCCGATCTACGAACTGTGGCCGGAGACAG
RET-Pool2-35 GCTCTTCCGATCTAGCTGGTGAGGCGGTACACAAG GCTCTTCCGATCTCCTCATTTCCTGGGGGCCTAG
RET-Pool2-36 GCTCTTCCGATCTGCTGGTCAATGACTCAGACTTCCAG GCTCTTCCGATCTCTGTGCCCCCATGTCCCTTGRET-Pool2-37 GCTCTTCCGATCTCGCTAGGGGTGGTCACCTCAG GCTCTTCCGATCTACCCTCCCTCCCTGGAGCAG
RET-Pool2-38 GCTCTTCCGATCTAGATCCACTGTGCGACGAGCTG GCTCTTCCGATCTGCACCGGAAGAGGAGTAGCTGACRET-Pool2-39 GCTCTTCCGATCTGGAGCGATCGTTTGCAACCTG GCTCTTCCGATCTTGTATGGAGCCCCCAGCCTG
RET-Pool2-40 GCTCTTCCGATCTAAGTGGGGCCTGGCTACCTG GCTCTTCCGATCTGGCTGGGTGCAGAGCCATATG
RET-Pool2-41 GCTCTTCCGATCTGAAAGCTCAGGGATAGGGCCTG GCTCTTCCGATCTGTCGTGGCCCCACTACATGTATAAGRET-Pool2-42 GCTCTTCCGATCTTGGCCCTGCTTGGATCATATTG GCTCTTCCGATCTGAGTCTCCCCAAGCCACTTTCAGRET-Pool2-43 GCTCTTCCGATCTGGAGACACCGCTGGTGGACTG GCTCTTCCGATCTAGACCAGAAACATTTTTAAAAAGCATCACRET-Pool2-44 GCTCTTCCGATCTATTACCACATTGCCCAGCAACTTAG GCTCTTCCGATCTTGTGCTCCCAGTGCAGGCTGRET-Pool2-45 GCTCTTCCGATCTTCAGGGGTAGCGAGGTTGCAG GCTCTTCCGATCTCAAACAATCAATGATGAAGTTAGGAAACAGRET-Pool2-46 GCTCTTCCGATCTGGGTTTCCAAGATATCCAAATGATAGTG GCTCTTCCGATCTCTGCCACCTGGGAACTGAACACRET-Pool2-47 GCTCTTCCGATCTGAGCTCTGAGTCTTAGTGGTTAAGCATTC GCTCTTCCGATCTTCATGTTTAAATTTTTTTGCCTTGTTTGRET-Pool2-48 GCTCTTCCGATCTGACCTGTCCTTATTCAGAATGAGAGACTG GCTCTTCCGATCTTCCACATAGTAAAGATGGCATGGAATCRET-Pool2-49 GCTCTTCCGATCTACAGCAAAATTGTGGCATTTTGTG GCTCTTCCGATCTATGTCTATAGATATTTGTAAAAGAACTTATCACAGTGRET-Pool2-50 GCTCTTCCGATCTCAGGTTTGTTCTCAGGAGGGTAAGAAC GCTCTTCCGATCTATACTCAGTAATACTTAATACTTAGTAACTTCTGCATTTACCCDC6-RET GCTCTTCCGATCTGCATTGTCATCTCGCCGTTCC GCTCTTCCGATCTCTGCTCTGCCTTTCAGATGGAAG
NCOA4-RET GCTCTTCCGATCTAAGTCAGCATCCGGTATTGTAGCTG GCTCTTCCGATCTGTGTACCCTGCTCTGCCTTTCAG[0014] 本发明还提供了一种检测甲状腺癌RET基因突变及融合的试剂盒，所述的试剂盒
包含：用于扩增RET基因外显子以及2种RET基因融合的特异性多重PCR引物、RNA逆转录试
剂、随机引物、dNTP、DNA聚合酶、NGS建库试剂、阳性对照和阴性对照。RNA逆转录试剂和NGS
建库试剂均为本领域常规使用试剂，能够从市场购买。

[0015] 优选地，所述RNA逆转录试剂可以选择市售SuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher）和RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor
（Thermo Fisher）。

[0016] 优选地，所述NGS建库试剂可以选择市售二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）。

[0017] 优选地，所述阳性对照为试剂盒中的阳性突变样本和阳性融合样本，较优的为包含本发明所述RET基因变异的人类基因组DNA储存液，或包含本发明所述RET基因变异的合
成质粒。

[0018] 优选地，所述阴性对照为试剂盒中的阴性突变样本和阴性融合样本，较优的为经确认不包含本发明所述RET基因变异的健康人类基因组DNA储存液。

[0019] 所用的样本为检测对象的实体组织或含有检测对象基因组DNA的体液样本。

[0020] 优选地，所用的样本为可以是用Streck管采集的外周血、RNA保存液保存的新鲜手术组织和/或穿刺组织、冷冻手术组织和/或穿刺组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组
织样本中的一种或多种。更优选地，检测样本为用RNA保存液保存的新鲜手术组织和/或穿
刺组织。

[0021] 一种检测甲状腺癌RET基因突变及融合的试剂盒，其检测流程包括以下步骤：

[0022] (1) 样本提取：使用对应样本类型的提取试剂分别抽提样本中的DNA和RNA；

[0023] (2) RNA逆转录：用RNA逆转录试剂将步骤（1）获得的RNA逆转录为cDNA；

[0024] (3) 多重PCR扩增：用特异性多重PCR引物与NGS建库试剂中的扩增试剂，对从步骤（1）中获得的DNA和步骤（2）中获得的cDNA分别进行扩增；

[0025] (4) 产物纯化：在步骤（3）获得的PCR扩增产物中加入定量的磁珠，进行纯化，去除基因组DNA和残余扩增引物；

[0026] (5) 接头连接：在步骤（4）获得的纯化产物中加入NGS建库试剂中的特异性标签以及接头试剂，进行反应；

[0027] (6) 文库纯化：在步骤（5）所获得的已加上标签序列的小片段文库中加入定量的磁珠，进行纯化，去除大片段和残余接头的污染；

[0028] (7) 文库检测：将步骤（6）制备好的文库用Qubit进行定量，并用Agilient Bioanalyzer 2100进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在
300bp左右；

[0029] (8) 上机测序：将步骤（7）检测合格的文库用Illumina测序平台进行高通量测序；

[0030] (9) 生信分析：对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。

[0031] 本发明的有益效果是：（1）本发明提供了一种可以同时检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物及试剂盒，可以对甲状腺癌RET基因变异的不同类型进行综合分析，降低检测
成本，缩短检测周期，提高检测效率；（2）本发明提供的一种检测甲状腺癌RET基因突变和融
合的引物及试剂盒，覆盖了RET基因全部21个外显子，以及甲状腺癌中2种临床最常见的RET
基因融合，能够检测所有已知的有临床指导意义的突变位点，还能发现未知的突变位点，有
助于临床上对甲状腺癌的准确诊断和靶向药物的准确选择；（3）本发明所提供的引物及试
剂盒适用于甲状腺癌患者外周血、新鲜组织、冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的
组织的检测。

附图说明

[0032] 图1为本发明试剂盒构建文库扩增子测序深度图。

[0033] 图2为本发明试剂盒的检测流程图。

[0034] 图3为本发明试剂盒构建文库片段分布图。

具体实施方式

[0035] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中所用的材
料、试剂等，如无特殊说明，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

[0036] 实施例1

[0037] 本实施例涉及一种能够用于检测甲状腺癌RET基因突变及融合的引物组合，其设计如下：

[0038] (1) RET基因突变检测引物设计：根据NCBI数据库RET基因序列信息，选择RET全外显子序列，利用Primer6.0软件，按照引物设计基本原则，设计扩增所需的多重PCR引物；

[0039] (2) RET基因融合检测引物设计：查找甲状腺癌中与RET基因发生融合的靶基因CCDC6、NCOA4的cDNA序列信息，确定所述CCDC6基因与RET基因发生断裂融合的DNA区域，以
及NCOA4基因与RET基因发生断裂融合的DNA区域，根据基因的相对位置关系，设计引物组
合；

[0040] (3) 引物合成：合成设计好的引物。

[0041] 本实施例对所获得的RET基因突变和融合引物组合进过十余轮的测试验证和优化，最终获得如表2所示序列。经过检测发现，所示引物组合测试数据覆盖度达到100%，均一
度达到95%，测序深度超过1000×的比例达到99%，实现了很好的技术效果（图1）。

[0042] 实施例2

[0043] 本实施例采用上述表2所述引物组合建立用于测序的扩增文库，具体建库流程如下（图2）：

[0044] （1）样本提取：提取患者样本中的DNA和RNA，选择AllPrep DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN）提取试剂盒操作，根据试剂盒提取说明书，最终获得DNA和RNA，测定样本浓度，将
DNA样本和RNA样本均稀释到20ng/uL；

[0045] （2）RNA逆转录：选择SuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher）和RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor（Thermo Fisher）试剂盒，根据表3
配制逆转录反应体系，根据表4设置逆转录反应程序。逆转录第一步反应65℃孵育5min结束
后，应立即冰上静置2min，逆转录第二步反应80℃孵育10min结束后，立即冰上静置2min。完
成本步骤后，步骤（1）中所获得的RNA样本将被逆转录成cDNA；

[0046] 表3 逆转录反应体系

[0047]

[0048] 表4 逆转录反应程序

[0049]

[0050] （3）多重PCR扩增：分别配制表2所述的特异性多重PCR引物，用上述引物和NGS建库试剂中的扩增试剂，对从步骤（1）中获得的DNA和步骤（2）中获得的cDNA分别进行扩增。根据
表5配制多重PCR扩增反应体系，根据表6设置多重PCR扩增反应程序；

[0051] 表5 多重PCR扩增反应体系

[0052] 试剂组分 体积uL2×HIFI PCR Mix 12.5
Primer Pool-1/2 4
DNA/cDNA(20ng/uL) 2
无核酸酶水 6.5
总体积 25

[0053] 表6 多重PCR扩增反应程序

[0054]

[0055] （4）产物纯化：将步骤（3）获得PCR扩增产物混合在一起，加入30uL磁珠，用枪头吹打混匀，室温孵育5min，将离心管放在磁力架上静置3min，转移上清至新离心管，加入35uL
磁珠枪头吹打混匀，室温孵育5min，将离心管放在磁力架上静置3min，去除上清，不要移动
离心管，直接加入200uL新鲜配制的80%乙醇，静置30s，去除上清，再直接加入200uL新鲜配
制的80%乙醇，静置30s，去除上清，开盖室温静置5min，去除残留乙醇，取下离心管，加入
20uL 无核酸酶水，用枪头吹打混匀，室温孵育5min，将离心管放在磁力架上静置3min，吸取
17uL上清至新的0.2ml离心管；

[0056] （5）接头连接：在步骤（4）获得的17uL纯化后的目的片段产物中，加入NGS建库试剂中的特异性标签及接头试剂，根据表7配制接头连接反应体系，根据表8配置接头连接反应
程序，进行反应；

[0057] 表7接头连接反应体系

[0058] 试剂组分 体积uL2×HIFI PCR Mix 25
Universal Primer 1
Index 1
步骤（4）产物 17
无核酸酶水 6
总体积 50

[0059] 表8 接头连接反应程序

[0060]

[0061] （6）文库纯化：在步骤（5）所获得的已加上标签序列的50uL小片段文库中加入27.5uL磁珠，用枪头吹打混匀，室温孵育5min，将离心管放在磁力架上静置3min，转移上清
至新离心管，再加入15uL磁珠，用枪头吹打混匀，室温孵育5min，将离心管放在磁力架上静
置3min，去除上清。不要移动离心管，直接加入200uL新鲜配制80%乙醇，静置30s，去除上清，
再直接加入200uL新鲜配制80%乙醇，静置30s，去除上清，开盖室温静置5min，去除残留乙
醇。取下离心管，加入20uL无核酸酶水，用枪头吹打混匀，室温孵育5min，将离心管放在磁力
架上静置3min，吸取17uL上清至新0.2ml离心管；

[0062] （7）文库检测：将步骤（6）制备好的文库用Qubit进行定量，并用Agilient Bioanalyzer 2100进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在
300bp左右（图3）；

[0063] （8）上机测序：将步骤（7）检测合格的文库用Illumina测序平台进行高通量测序；

[0064] （9）生信分析：对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。

[0065] 实施例3

[0066] 本实施例使用市售的RET基因突变DNA标准品和RET基因融合RNA标准品对本发明最终优化获得的引物组合和建库流程进行性能验证。同时收集30例临床样本，用市售的试
剂盒产品艾惠健和维惠健分别进行RET基因突变检测和RET基因融合检测，与本发明的检测
结果进行对比。

[0067] 市售RET基因突变DNA标准品和RET基因融合RNA标准品的检测结果见表9。每个标准品分别进行三次建库，标准品数据覆盖度达到100%，均一度达到95%，测序深度大于1000
×的比例达到99%。检测结果表明本发明能够稳定有效地检测出RET基因突变及融合。

[0068] 表9 标准品检测结果

[0069] 标准品 突变频率 样本类型 测序深度 均一度 大于1000× 检出频率RET C634W 50% DNA 3201.24 98.5% 100% 50.8%
RET C634W 50% DNA 3713.57 95.4% 100% 49.5%
RET C634W 50% DNA 3752.67 96.4% 100% 50.2%
RET V804M 25% DNA 3496.28 96.3% 100% 24.7%
RET V804M 25% DNA 3553.23 98.4% 100% 24.9%
RET V804M 25% DNA 3867.57 95.2% 100% 25.3%
RET M918T 30% DNA 4326.19 97.6% 100% 29.9%
RET M918T 30% DNA 3929.35 96.2% 100% 30.7%
RET M918T 30% DNA 4147.52 98.8% 100% 30.3%
阴性DNA 0% DNA 3385.29 95.6% 100% 未检出突变
阴性DNA 0% DNA 2976.88 88.3% 99.8% 未检出突变
阴性DNA 0% DNA 2744.52 89.2% 99.7% 未检出突变
CCDC6-RET 融合阳性 RNA 15624.32 95.4% 100% 检出CCDC6-RET
CCDC6-RET 融合阳性 RNA 8908.71 97.7% 100% 检出CCDC6-RET
CCDC6-RET 融合阳性 RNA 9657.86 98.6% 100% 检出CCDC6-RET
NCOA4-RET 融合阳性 RNA 12124.79 96.9% 100% 检出NCOA4-RET
NCOA4-RET 融合阳性 RNA 11094.41 95.5% 100% 检出NCOA4-RET
NCOA4-RET 融合阳性 RNA 9928.52 97.8% 100% 检出NCOA4-RET
阴性RNA 融合阴性 RNA 10451.22 96.2% 100% 未检出融合
阴性RNA 融合阴性 RNA 10233.44 97.3% 100% 未检出融合
阴性RNA 融合阴性 RNA 11542.91 96.5% 100% 未检出融合

[0070] 30例临床样本来自2019年10月至2020年1月从复旦大学附属肿瘤医院头颈外科收集的样本，分别用市售试剂盒产品艾惠健对这些样品进行RET基因突变检测，用市售试剂盒
产品维惠健对这些样品进行RET基因融合检测，并将上述两种市售试剂盒的检测结果与使
用本发明方法所获得的检测结果进行对比，两者检测结果的一致性达到了100%，具体结果
见表10。但因为本发明所述试剂盒具有能同时检测RET基因突变及融合，以及能发现RET基
因未知突变的优势，节约了检测成本，提高了检测效率，因此具有很好的替代效应和临床应
用的价值。

[0071] 表10 临床样本检测结果

[0072] 样本编号 病理信息 艾惠健 维惠健 本发明试剂盒突变变异 本发明试剂盒融合变异 一致性1 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
2 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
3 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
4 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
5 甲状腺髓样癌 RET M918T RET融合阴性 RET M918T 未检出 100%
6 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
7 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
8 甲状腺髓样癌 RET C618R RET融合阴性 RET C618R 未检出 100%
9 甲状腺髓样癌 RET L790F RET融合阴性 RET L790F 未检出 100%
10 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
11 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
12 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
13 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
14 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
15 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
16 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
17 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
18 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
19 甲状腺乳头状癌 RET突变阴性 检出CCDC6-RET 未检出 检出CCDC6-RET 100%
20 甲状腺髓样癌 RET C634W RET融合阴性 RET C634W 未检出 100%
21 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
22 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
23 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
24 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
25 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
26 甲状腺乳头状癌 RET M918T RET融合阴性 RET M918T 未检出 100%
27 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
28 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
29 甲状腺良性结节 RET突变阴性 RET融合阴性 未检出 未检出 100%
30 甲状腺乳头状癌 RET突变阴性 检出NCOA4-RET 未检出 检出NCOA4-RET 100%

[0073] 最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可
以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明
要求保护的范围。