一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法转让专利
申请号 : CN201911179898.2
文献号 : CN111089916B
文献日 : 2021-08-10
发明人 : 魏秀丽 , 徐恩民 , 张传津 , 李有志 , 杨志昆 , 张会梅
申请人 : 山东省兽药质量检验所(山东省畜产品质量检测中心)
摘要 :
本发明涉及一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法，属于中兽药制剂的质量检测领域。本发明采用C18色谱柱，柱温：35℃；以乙腈‑0.4％磷酸水溶液，进行梯度洗脱；流速：0.35mL/min；进样量：1μL；检测波长为238nm。通过光谱图、保留时间和峰面积参数对芍药苷、甘草苷和甘草酸铵进行定性定量检测。三者在2～110μg/mL的范围内线性关系良好；方法检出限为1μg/mL，方法定量限为2μg/mL，完全满足检测需求。本发明色谱分离较好，分析速度较快，前处理简单，检测时间短，耗材流动相节约90％以上。
权利要求 :
1.一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法，其特征在于，检测方法的具体步骤如下：
（1）供试品溶液的的制备 精密量取本品1mL，置50mL容量瓶中，加10%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（2）标准储备液的制备 精密称取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加
10%乙腈溶液制成每1mL含0.11mg的溶液，即得标准储备液；
（3）标准工作液的制备 取标准储备液，倍比稀释配置成55 μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL；
（4）色谱操作条件及参数 色谱柱：C18色谱柱，2.1 mm×100 mm,1.7 μm；流动相A：乙腈；流动相B：0.4%磷酸水溶液，进行梯度洗脱；流速：0.35 mL/min；进样量：1 μL；柱温：35 ℃，进样室温度10 ℃；二极管阵列检测器，扫描范围：190‑400nm，检测波长为238 nm；液相色谱梯度洗脱程序如下：
0min，流动相A与流动相B的体积比为10%：90%；0 3min，流动相A与流动相B的体积比为~
10%：90%→16%：84%；3 3.2min，流动相A与流动相B的体积比为16%：84%→18%：82%；3.2~ ~
5min，流动相A与流动相B的体积比为18%→82%；5 5.1min，流动相A与流动相B的体积比为~
18%：82%→15%：85%；5.1 7min，流动相A与流动相B的体积比为15%→85%；7 9min，流动相A与~ ~
流动相B的体积比为15%：85%→35%：65%；9 10min，流动相A与流动相B的体积比为35%：65%→~
60%：40%；10 12min，流动相A与流动相B的体积比为60%：40%→10%：90%；
~
测定法：分别精密吸取标准工作液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定并计算；
上述检测方法还包括检测限和定量限的测定，步骤如下：对标准工作液，进行UPLC的分析，并逐级降低其浓度，配置成约55 μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，以溶液检测时的信噪比（S/N）分别大于等于3和10 作为药物的检测限和定量限；
所述柴芍口服液由柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药组方，经提取制备而成；所述柴芍口服液由以下按重量份数的组分组成：柴胡5‑15份、白芍3‑5份、枳实5‑15份、甘草1‑10份。
2.如权利要求1所述的检测方法在检测中药组合物或中药制剂中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的应用。
说明书 :
一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测
方法
技术领域
[0001] 本发明属于中兽药制剂的质量检测领域，涉及一种芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法，具体涉及一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法。
背景技术
[0002] 新中兽药柴芍口服液具有透解郁热、调和肝脾的功效。根据新兽药相关技术要求对其进行了药学、药理毒理和临床研究，主治由霉菌毒素导致的鸡肝损伤。其主要含有五环
三萜类、单萜苷类化合物、三萜皂苷和黄酮类化合物等，具有镇静、解热镇痛，抗炎和免疫调
节、强心、抗氧化、抗菌、保肝等多种药理活性。芍药苷、甘草苷和甘草酸铵为柴芍口服液中
的重要有效成分。
三萜类、单萜苷类化合物、三萜皂苷和黄酮类化合物等，具有镇静、解热镇痛，抗炎和免疫调
节、强心、抗氧化、抗菌、保肝等多种药理活性。芍药苷、甘草苷和甘草酸铵为柴芍口服液中
的重要有效成分。
[0003] 中药是一种由多种成分、多种因素构成的复杂体系，其质量的不稳定性、不可控性会直接导致中药复方治疗效果的不稳定、不可控。现有技术中，利用液相色谱方法对柴芍口
服液只进行芍药苷的检测，检测时间长，耗材流动相用量多。
服液只进行芍药苷的检测，检测时间长，耗材流动相用量多。
发明内容
[0004] 本发明针对上述问题，提供了一种芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法，具体涉及柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法，本发明检测时间短，耗材
流动相可节约90％以上。本发明的技术方案如下：
流动相可节约90％以上。本发明的技术方案如下：
[0005] 一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法，具体步骤如下：
[0006] (1)供试品溶液的的制备精密量取本品1mL，置50mL容量瓶中，加 10％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别依次精密吸取对照品溶液及供试品溶液各1μL，
注入液相色谱仪，测定，即得供试品溶液；
注入液相色谱仪，测定，即得供试品溶液；
[0007] (2)标准储备液的制备精密称取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量mg，精密称定，加10％乙腈溶液制成每1mL含0.11mg的溶液，即得标准储备液；
[0008] (3)标准工作液的制备取混和对照溶液，倍比稀释配置成55μg/mL、 25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL；
[0009] (4)色谱操作条件及参数色谱柱：C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7 μm)；流动相A：乙腈；流动相B：0.4％磷酸水溶液，进行梯度洗脱；流速： 0.35mL/min；进样量：1μL；柱温：35
℃，进样室温度10℃。二极管阵列检测器，扫描范围：190‑400nm，检测波长为238nm；液相色
谱梯度洗脱程序如表1所示：
℃，进样室温度10℃。二极管阵列检测器，扫描范围：190‑400nm，检测波长为238nm；液相色
谱梯度洗脱程序如表1所示：
[0010] 表1梯度洗脱条件表
[0011]
[0012] (5)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2‑10μL，注入液相色谱仪，测定并计算。
[0013] 本发明还包括检测限和定量限的测定对混合标准工作液，进行UPLC 的分析，并逐级降低其浓度，配置成约55μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、 2μg/mL、1μg/mL，以溶液检测
时的信噪比(S/N)分别大于等于3和10作为药物的检测限和定量限。
时的信噪比(S/N)分别大于等于3和10作为药物的检测限和定量限。
[0014] 本发明中柴芍口服液由柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药组方，经提取制备而成。
[0015] 进一步的，所述柴芍口服液由以下按重量份数的组分组成：
[0016] 柴胡5‑15份、白芍3‑5份、枳实5‑15份、甘草1‑10份。
[0017] 本发明还包括所述检测方法在检测中药组合物或中药制剂中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的应用。
[0018] 本发明中“％”均为体积百分数。
[0019] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0020] (1)芍药苷、甘草苷和甘草酸铵为柴芍口服液中的重要有效成分。本发明采用超高效液相色谱法对主成分含量进行检测，并进行方法学验证，简单快速，经济环保。
[0021] (2)现有技术中通过普通液相色谱的方法，只测定芍药苷就需要40分钟的检测时间，流速1.0mL/min，运行1针需要45mL流动相(见图13)，而且样品杂峰干扰很多。本发明一
次能检测3种成分，芍药苷、甘草苷和甘草酸铵，流速0.35mL/min，运行1针，需要4.2mL流动
相，节约40多mL流动相。
次能检测3种成分，芍药苷、甘草苷和甘草酸铵，流速0.35mL/min，运行1针，需要4.2mL流动
相，节约40多mL流动相。
附图说明
[0022] 图1为55μg/mL混合对照溶液芍药苷的光谱图；
[0023] 图2为55μg/mL混合对照溶液甘草苷的光谱图；
[0024] 图3为55μg/mL混合对照溶液甘草酸铵的光谱图；
[0025] 图4为芍药苷校正曲线；
[0026] 图5为甘草苷校正曲线；
[0027] 图6为甘草酸铵校正曲线；
[0028] 图7为对照品252nm超高效液相色谱图；
[0029] 图8为对照品238nm超高效液相色谱图；
[0030] 图9为对照品232nm超高效液相色谱图；
[0031] 图10为待测样品252nm超高效液相色谱图；
[0032] 图11为待测样品238nm超高效液相色谱图；
[0033] 图12为待测样品232nm超高效液相色谱图。
[0034] 图13为待测样品232nm普通液相色谱图。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应
该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修
改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修
改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0036] 实施例1一种柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法
[0037] 1材料与方法
[0038] 1.1药品及试剂 对照品为中国食品药品检定研究院：芍药苷对照品：批号： 110736‑201438，含量96.4％；甘草酸铵对照品，批号110731‑201720，含量97.7％；甘草苷对
照品，批号11610‑201106，含量93.7％。乙腈、磷酸均为色谱纯；乙醇分析纯；超纯水。柴芍口
服液为2018年省重点研发计划项目新兽药研发合作单位青岛蔚蓝生物有限公司提供。
照品，批号11610‑201106，含量93.7％。乙腈、磷酸均为色谱纯；乙醇分析纯；超纯水。柴芍口
服液为2018年省重点研发计划项目新兽药研发合作单位青岛蔚蓝生物有限公司提供。
[0039] 1.2仪器 分析天平：感量0.00001g；Waters AcquityTM Ultra performance LC 超高效液相色谱仪；
[0040] 1.3方法
[0041] 1.3.1供试品溶液的的制备精密量取本品1mL，置50mL容量瓶中，加10％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别依次精密吸取对照品溶液及供试品溶液各1μ
L，注入液相色谱仪，测定，即得。
L，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0042] 1.3.2标准储备液的制备精密称取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量mg，精密称定，加10％乙腈溶液制成每1mL含0.11mg的溶液，即得。
[0043] 1.3.3标准工作液的制备取混和对照溶液，倍比稀释配置成55μg/mL、 25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL。
[0044] 1.3.4色谱操作条件及参数色谱柱：C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相A：乙腈；流动相B：0.4％磷酸水溶液，进行梯度洗脱；流速：0.35mL/min；进样量：1μL；柱温：35℃，
进样室温度10℃。二极管阵列检测器，扫描范围：190‑400nm，检测波长为238nm。液相色谱梯
度洗脱程序见表2。
进样室温度10℃。二极管阵列检测器，扫描范围：190‑400nm，检测波长为238nm。液相色谱梯
度洗脱程序见表2。
[0045] 表2梯度洗脱条件表
[0046]
[0047] 1.3.5检测限和定量限的测定对混合标准工作液，进行UPLC的分析，并逐级降低其浓度，配置成约55μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、 1μg/mL，以溶液检测时的信噪
比(S/N)分别大于等于3和10作为药物的检测限和定量限。
比(S/N)分别大于等于3和10作为药物的检测限和定量限。
[0048] 1.3.6重复性试验和精密度试验精密吸取0.11mg/mL芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品储备溶液，制成每55μg/mL混合对照品溶液，重复配置6份，进样，计算三种药物的峰面
积RSD。取55μg/mL混合对照品溶液，重复进样6 次，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积
RSD；待测样品重复处理6份，上机检测其含量，计算平均值。
积RSD。取55μg/mL混合对照品溶液，重复进样6 次，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积
RSD；待测样品重复处理6份，上机检测其含量，计算平均值。
[0049] 1.3.7稳定性试验进样室温度设置到10℃。取“1.3.5”项下55μg/mL混合对照溶液，在10℃放置3、6、12、24h，各进样1μL，计算三种主成分各自的峰面积RSD。
[0050] 1.3.8色谱柱耐受性试验采用不同温度和流速做微小的改变，测试其保留时间和分离的稳定性。采用0.34mL/min的流速不变，以33℃、38℃柱温，或保持柱温35℃不变，流速
改变以0.34mL/min、0.36mL/min进行采样。
改变以0.34mL/min、0.36mL/min进行采样。
[0051] 2结果与分析
[0052] 2.1色谱分离和专属性在优化的色谱条件下，测得三种成分色谱峰峰形良好，且均达到基线分离，在1.3.4项条件下，对照品和样品待测液，芍药苷、甘草苷、甘草酸铵色谱保
留时间为2.23min、6.01min、10.06min左右，分离度大于1.5均满足要求，理论塔板数均大于
20000。光谱图可以用于定性和专属性鉴别，如图1‑图3所示：
留时间为2.23min、6.01min、10.06min左右，分离度大于1.5均满足要求，理论塔板数均大于
20000。光谱图可以用于定性和专属性鉴别，如图1‑图3所示：
[0053] 2.2线性在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离目的峰，2～2
110μg/mL的范围内，芍药苷标准曲线：y＝3605.6x+1255.9，R>0.999。甘草苷标准曲线：y＝
2 2
2156.4x+1657，R>0.999，甘草酸铵标准曲线： y＝5093.2x+3754，R>0.999。校正曲线结果
见图4‑图6所示。
110μg/mL的范围内，芍药苷标准曲线：y＝3605.6x+1255.9，R>0.999。甘草苷标准曲线：y＝
2 2
2156.4x+1657，R>0.999，甘草酸铵标准曲线： y＝5093.2x+3754，R>0.999。校正曲线结果
见图4‑图6所示。
[0054] 2.3检测限和定量限1μg/mL混合对照品溶液信噪比>3为检出限，2μg/mL 混合对照品溶液信噪比>10为定量限。
[0055] 2.4不同波长条件对照品检测结果比较对照品溶液不同波长峰面积表如表3所示，不同波长下的色谱图见图7‑图9所示。
[0056] 表3对照品溶液不同波长峰面积表
[0057]
[0058] 结合相应峰面积、理论塔板数和信噪比等因素，滤掉部分杂峰干扰，我们选择了238nm，理论塔板数均大于20000。
[0059] 不同波长下待测样品色谱图如图10‑图12所示，待测样品不同波长峰面积表如表4所示：
[0060] 表4待测样品不同波长峰面积表
[0061]
[0062]
[0063] 从样品检测来看，也选择238nm，信噪比高，相对均匀。
[0064] 2.5重复性试验和精密度试验
[0065] 配制55μg/mL混合对照品溶液，重复配置6份，进样，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD为0.71％、0.63％、0.81％，满足实验要求。
[0066] 取55μg/mL混合对照品溶液，重复进样6次，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸铵峰面积RSD分别为0.35％、0.39％、0.38％，满足实验要求。
[0067] 待测样品，重复测定6次，含量结果如表5所示：
[0068] 表5
[0069]
[0070] 2.6稳定性试验进样室温度设置到10℃。取55μg/mL混合对照溶液，在 10℃放置3、6、12、24h，各进样1μL，计算三种主成分各自的峰面积RSD 分别为0.51％、0.58％、0.69％。
[0071] 2.7色谱柱耐受性试验采用不同温度和流速做微小的改变，测试其保留时间和分离的稳定性良好，保留时间不超过±0.15min，分离度均满足要求。
[0072] 实施例2柴芍口服液中芍药苷、甘草苷和甘草酸铵含量的检测方法中柴芍口服液包括以下按重量份数的组分：
[0073] 柴胡12份、白芍4份、枳实10份、甘草8份。