一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用。所述荧光素标记的蛋白四聚体是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的。生物素标记的目标蛋白由HEK293细胞中重组表达，其N‑端或C‑端共表达一个Avi Tag，进而在BirA酶作用下，Avi Tag的赖氨酸残基被连接上一个生物素。将生物素标记的目标蛋白与荧光素标记的链霉亲和素混合反应获得荧光直标的蛋白四聚体。本发明的荧光直标的蛋白四聚体可用于流式筛选免疫检测点靶点蛋白的中和性抗体或CAR‑T细胞的阳性率检测，由于链霉亲和素与生物素起到级联放大作用，其检测灵敏度较其他方法制备的荧光素标的蛋白有很大提高。

权利要求

1.一种荧光素标记的蛋白四聚体在流式检测CAR-T细胞阳性率中的应用，其中所述荧光素标记的蛋白四聚体是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的，生物素标记的目标蛋白为CAR-T靶点蛋白，CAR-T靶点蛋白为CD19。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，生物素标记的目标蛋白是由HEK293细胞重组表达的，其N-端或C-端共表达一个Avi Tag，在BirA酶作用下，Avi Tag的赖氨酸残基被连接上一个生物素，进而获得生物素标记的目标蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，生物素标记的目标蛋白是按照以下制备方法获得的：将AviTag基因连接到目标蛋白基因片段的N-端或者C-端，并构建其重组表达载体，然后将该载体质粒与BirA酶质粒共转染到HEK293细胞内，并在细胞培养基内添加生物素（biotin），收集样品纯化后，获得生物素标记的目标蛋白。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，构建目标蛋白的重组表达载体是将目标蛋白基因和AviTag基因构建到运载体pcDNA3.1上。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，BirA酶表达载体构建时所用的运载体也为pcDNA3.1。

6.根据权利要求1所述的应用，其中，荧光素标记的链霉亲和素，荧光素包括FITC，PE，APC，Alexa Flour染料中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的荧光素标记的蛋白四聚体是按照以下方法制备得到的，所述制备方法包括：将生物素标记的目标蛋白与荧光素标记的链霉亲和素按比例混合，在室温避光条件下反应， 获得到荧光素标记的蛋白四聚体。

8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的荧光素标记的蛋白四聚体为冻干粉末形式，其原料组成为荧光素标记的蛋白四聚体及冻干溶液，所述冻干溶液为磷酸盐缓冲液（PBS），含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和10%海藻糖（Trehalose）。

说明书

一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明是关于一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用，具体地说是关于一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法，以及其在筛选免疫检测点蛋白的中和性抗体或检测CAR-T细胞的阳性率中的应用。

背景技术

[0002] 近些年，以免疫检查点(Immune Checkpoint)抑制剂与CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)疗法所代表的癌症免疫治疗已经成为了多个肿瘤的一线治疗方案。PD-1抑制剂与CAR-T细胞治疗在多个癌症治疗中所展现出的惊人效果，也奠定了免疫治疗在肿瘤治疗中的新地位，特别是新兴的CAR-T细胞疗法，被誉为癌症治愈的新希望。

[0003] 目前已经批准上市的免疫检测点抑制剂主要以免疫检测点蛋白的中和性抗体为主，比如罗氏的Tecentriq、辉瑞的Bavencio、阿斯利康的Imfinzi等是针对免疫检测点蛋白PD-L1的抗体类药物，MSD的Keytruda、BMS的Opdive、再生元的Libtayo等是蛋白PD1的抗体药物，还有BMS的Yervoy是针蛋白CTLA-4的抗体药。这类抗体在研发过程中最常用的筛选方法就是用流式检测其在配体蛋白与受体蛋白结合中的作用。但是配体蛋白与受体蛋白之间的作用普遍较弱，所以筛选中和性抗体的检测窗口就比较小。

[0004] CAR-T细胞疗法的原理是通过基因工程手段去修饰人的T细胞，使其细胞膜上表达嵌合抗原受体(chimeric antigen recetor,CAR)，CAR与肿瘤细胞表面的靶点蛋白结合后就会激活T细胞，以此增强T细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。T细胞表面CAR的表达是CAR-T细胞制备过程必须检测的一个指标。常规检测CAR表达可选用protein L蛋白和抗Fab段的抗体，但是protein L只识别κ轻链类型的CAR，抗Fab段的抗体只识别CAR的Fab的结构，即使检测到CAR的表达，也不能检测出T细胞膜表面的CAR是否能够识别它的靶点抗原。只有用CAR相应的靶点抗原检测转染CAR的表达情况才是最有效的，但是用单体的CAR-T靶点蛋白检测灵敏度较差，尤其在CAR-T疗法的PK实验检测中。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的在于提供一种荧光素标记的蛋白四聚体。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种制备荧光素标记的蛋白四聚体的方法。

[0007] 本发明的另一目的在于提供荧光素标记的蛋白四聚体的应用。

[0008] 一方面，本发明提供了一种荧光素标记的蛋白四聚体，其是通过荧光素标记的链霉亲和素结合生物素标记的目标蛋白而形成的。其结构示意图见图1。

[0009] 相对比单体蛋白，本发明的蛋白四聚体应用于流式检测时具有操作简便、省时、灵敏度高等特点，原理对比示意图请参见图2。

[0010] 根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光素标记的蛋白四聚体中，生物素标记的目标蛋白是由HEK293细胞重组表达的，其N-端或C-端共表达一个Avi Tag，在BirA酶作用下，Avi Tag的赖氨酸残基被连接上一个生物素，进而获得生物素标记的目标蛋白。

[0011] 根据本发明的具体实施方案，本发明的这种四聚体蛋白包含两类，一类是免疫检测点类的荧光素标记的蛋白四聚体，主要用于建立一种灵敏度高，操作简便的筛选免疫检测点蛋白的中和性抗体的方法，另一类是CAR-T靶点类的荧光素标记的蛋白四聚体，主要用于建立高灵敏度高特异性的CAR-T细胞的阳性率检测方法。换而言之，本发明的荧光素标记的蛋白四聚体中，生物素标记的目标蛋白主要为免疫检测点蛋白或CAR-T靶点蛋白；优选地，免疫检测点蛋白包括PD1，PD-L1，CD80，CD86，CD28，CTLA-4，CD155，FGL1，LAG3，TIGIT，CD30L，CD30，CD40，CD4L，OX40，OX40L等一系列蛋白中的一种或多种；CAR-T靶点蛋白包括CD19，BCMA，MSLN，CD22，GCP3，CD20，PMSA等一系列蛋白中的一种或多种。

[0012] 根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光素标记的蛋白四聚体中，生物素标记的目标蛋白是按照以下制备方法获得的：将AviTag基因连接到目标蛋白基因片段的N-端或者C-端，并构建其重组表达载体，然后将该载体质粒与BirA酶质粒共转染到HEK293细胞内，并在细胞培养基内添加生物素(biotin)，收集样品纯化后，获得生物素标记的目标蛋白。更具体地，其中，构建目标蛋白的重组表达载体是将目标蛋白基因和AviTag基因构建到运载体pcDNA3.1上；优选地，BirA酶表达载体构建时所用的运载体也为pcDNA3.1。

[0013] 根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光素标记的蛋白四聚体中，荧光素标记的链霉亲和素可以为商品化的荧光素标记的链霉亲和素，例如，荧光素包括FITC，PE，APC，Alexa Flour染料等常用荧光素中的一种或多种。

[0014] 另一方面，本发明还提供一种制备所述的荧光素标记的蛋白四聚体的方法：其包括：将生物素标记的目标蛋白与荧光素标记的链霉亲和素按比例混合，在室温避光条件下反应，获得到荧光素标记的蛋白四聚体。

[0015] 根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光素标记的蛋白四聚体的制备方法包括：

[0016] 将生物素化的目标蛋白与商品化的荧光素标记的链霉亲和素按4:1的摩尔比混合，充分混匀后在室温条件下，避光反应30分钟，获得荧光素标记的蛋白四聚体；所得荧光素标记的蛋白四聚体可进行分装，冻干并置于-80℃冰箱保存备用。

[0017] 根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光素标记的蛋白四聚体的制备方法还包括生物素标记蛋白的制备：

[0018] 构建含有目标蛋白基因与Avi Tag基因的表达载体，测序无误后，扩增表达该载体质粒，与BirA酶质粒一起共转染到HEK293细胞中，37℃培养6-10天，收获细胞培养上清液，Protein A亲和纯化，再经G25脱盐，得到纯化的生物素标记蛋白。

[0019] 根据本发明的具体实施方案，所述的纯化的生物素标记蛋白可置换磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，冻干保存备用。

[0020] 另一方面，本发明还提供了一种包括本发明所述的荧光素标记的蛋白四聚体的冻干粉末，其原料组成为本发明所述的荧光素标记的蛋白四聚体及冻干溶液，所述冻干溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.5％牛血清白蛋白(BSA)和10％海藻糖(Trehalose)。

[0021] 另一方面，本发明还提供了所述的荧光素标记的蛋白四聚体在筛选免疫检测点蛋白的中和性抗体中的应用。细胞株的膜表面表达目标蛋白的配体蛋白，荧光素标记的蛋白四聚体能够与这些配体蛋白结合，进而将细胞标记上荧光素，通过流式检测细胞的荧光强度，加入抗配体蛋白或者抗目标蛋白的中和性抗体，细胞的荧光强度会与加入的中和抗体的浓度梯度成负相关递减趋势。

[0022] 在本发明的一类具体的实施方案中，生物素标记的目标蛋白为免疫检测类靶点蛋白，比如PD1,SIRP-alpha，CD80,CD86,CD155等，这类荧光素标记的蛋白四聚体可以用来筛选免疫检测点靶点蛋白的中和性抗体。本发明中其方法设计原理参见图3：细胞膜表面表达目标蛋白的配体蛋白，荧光素标记的目标蛋白四聚体能够与之结合，进而将细胞标记上相应的荧光素，可用流式检测到相应的荧光信号；如果在这个实验体系中加入抗配体蛋白的中和性抗体，这些抗体与细胞膜上的配体蛋白结合，阻止了荧光标记的目标蛋白四聚体再与细胞结合，流式检测到细胞的荧光信号就会减弱或检测不到，中和性抗体的与配体蛋白的亲和力越强，检测到荧光信号越弱。同理，如果加入的是抗目标蛋白的中和性抗体，这些抗体会与目标蛋白结合而使其不能再与细胞膜表面的配体蛋白结合，流式检测到的细胞的荧光信号也会减弱。

[0023] 另一方面，本发明还提供了所述的荧光素标记的蛋白四聚体在流式检测CAR-T细胞阳性率中的应用。CAR-T细胞膜表面表达目标蛋白特异性的CAR，荧光素标记的蛋白四聚体能够与CAR特异性结合，进而将CAR-T细胞标记上荧光素，通过流式检测细胞的荧光强度。CAR-T细胞膜表面的CAR的表达水平与细胞的阳性率和荧光强度成正相关

[0024] 在本发明的另一类具体的实施方案中，生物素标记的目标蛋白为CAR-T靶点类蛋白。比如CD19,MSLN,CD22,HER2,BCMA等，这类荧光标记的蛋白四聚体可用来做CAR-T细胞阳性率的检测。本发明中其方法设计原理参见图4：CAR-T细胞膜表面表达靶点特异性的CAR,荧光素标的CAR-T类靶点蛋白四聚体能够与其特异性结合，进而CAR-T细胞被标记上荧光素，流式可检测CAR-T细胞的荧光强度。如果待测的CAR-T细胞表达的CAR不能识别目标蛋白或者膜表面不表达CAR，就不能被标记上荧光，进而也检测不到荧光信号。

[0025] 综上所述，本发明提供了一种蛋白四聚体及其制备制备方法，以及其在免疫检测点蛋白的中和性抗体筛选和CAR-T细胞阳性率检测中的应用。链霉亲和素与生物素起到级联放大作用，其检测灵敏度较其他方法制备的荧光素标的蛋白有很大提高。

附图说明

[0026] 图1为四聚体蛋白的制备示意图。

[0027] 图2为四聚体蛋白应用于流式检测原理示意图。

[0028] 图3为免疫检测点蛋白的中和抗体筛选原理示意图。

[0029] 图4为CAR-T阳性率检测原理示意图。

[0030] 图5显示PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体能够增强流式检测信号。

[0031] 图6为显示流式检测PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体识别293T-PD-L1细胞膜表面PD-L1蛋白的直方图。

[0032] 图7为显示流式检测PD1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体识别293T-PD-L1细胞膜表面PD-L1蛋白的密度图。

[0033] 图8显示PD1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体筛选抗PD-L1中和抗体应用。

[0034] 图9显示CD19 Fc-Avi-PE四聚体识别RC222细胞膜表面表达的CAR。

[0035] 图10显示CD19 Fc-Avi-PE四聚体能够增强流式检测信号。

[0036] 图11显示CD19 Fc-Avi-PE四聚体检测CAR阳性率应用。

具体实施方式

[0037] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

[0038] 实施例1、免疫检测点蛋白四聚体(PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体)的制备与应用[0039] 1.Biotinylated Human PD-1/PDCD1Avi Tag蛋白的制备

[0040] 1.1.试剂与仪器

[0041] TransT1感受态细胞(全式金，CD501-01)；TransT1感受态细胞(ThermoFisher，C505003)；胰蛋白胨(Sigma,T7293-1KG)，酵母提取物(Sigma,Y1625-1KG)；琼脂(Sigma,A7002-1KG)；Max plasmid Kit(promega，A2492)；细菌摇床(欧诺，HN211B)；细菌培养箱(天津泰斯特，DH3600B)Nanodrop 2000；Expi293F细胞(Invitrogen，Cat#R790-07)；细胞表达培养基，实验室自配；Polyethylenimine，PEI(Polysciences，Cat#23966)。细胞摇床培养箱(欧诺，HNY-2102)

[0042] 1.2.溶液配制

[0043] 1.2.1.LB培养基：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化钠10g,加水定容至1000ml，高压灭菌,冷却到室温加入Amp,终浓度为100ug/ml,备用。

[0044] 1.2.2.LB固体培养基：胰蛋白胨5g,酵母提取物2.5g，氯化钠5g,琼脂7.5g,加水定容至500ml，高压灭菌或微波炉煮沸，待冷却后加入Amp(终浓度为100ug/ml)，超净台内铺平板，4℃保存备用。

[0045] 1.2.3.Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966,1mg/ml:将50mg的PEI粉末溶于45mL DDH2O中，用HCL将其pH值调至〈2.0，搅拌至PEI全溶，加入NaOH将pH值调至7.0，加入DDH2O定容体积至50mL，0.22um过滤器过滤除菌，分装成每管1.0mL，-80℃冻存备用。

[0046] 1.2.4.Biotinylated Human PD-1/PDCD1 Avitag制备

[0047] 1.3.表达载体的构建

[0048] 5'-CACagtcgcaaggccaccATGCAGATCCCACAGGCGCCC(SEQ ID No.1)

[0049] 5'-ATAGGGCCCTCTAGATTATTCATGCCATTCGATCTTTTGAG(SEQ ID No.2)

[0050] 自身信号肽，表达区间：(21Pro-167 Gln)，C端标签Fc&Avi以cDNA质粒为模板，HiFI DNA Polymerase，98℃3min预变性，98℃10s变性，64℃30s退火，72℃30s延伸，共35个循环，琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的片段，在无缝连接试剂盒的作用下，重组连接到ACRO内部的表达载体上。

[0051] 1.4.质粒鉴定与扩增

[0052] 1.4.1.质粒鉴定：将冻存的TransT1感受态细胞融化，再加入连接产物，混匀，冰浴30min，于42℃热激45S，冰浴2min，加入700ul LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1小时；涂菌，37℃培养过夜；次日挑取单菌落，接种含3ml LB培养基的摇菌管内，于37℃细菌摇床内，
200rpm，培养过夜；收菌液，按promega的plasmid Kit说明提取质粒DNA；Nanodrop2000定量，送测序公司测序，核对基因序列是否正确。

[0053] 1.4.2.质粒扩增：按1.4.1方法将测序正确的质粒转化Top10菌株，扩大培养，提取质粒，供胞转染使用。

[0054] 1.5.Biotinylated Human PD-1/PDCD1 Avi Tag蛋白表达

[0055] 1.5.1.对Expi293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率(细胞活率≥90％)，并将细胞密度调整至1ⅹ106/ml，接种细胞培养三角瓶内。

[0056] 1.5.2.分别取相应量的BirA酶质粒、目的基因质粒与PEI混匀，室温孵育5min，再取相应的体积加入细胞培养三角瓶内；

[0057] 1.5.3.将转染后的细胞放置在摇床培养箱中培养，37℃，二氧化碳浓度8％，培养7天，收集细胞悬液，离心后收集细胞培养上清液用于蛋白纯化。

[0058] 1.6.Biotinylated Human PD-1/PDCD1 Avi Tag蛋白纯化：

[0059] 收获后离心收集上清液，ProtinA亲和纯化，收集样品，经G25脱盐，置换缓冲液(PBS，含10％的Trehalose)，保存在含保护剂(10％海藻糖)的PBS缓冲液中。

[0060] 2.PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体的制备

[0061] 2.1.试剂与仪器

[0062] Biotinylated Human PD-1/PDCD1,Avi Tag(AvitagTM)；PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)；5％BSA-PBS母液；30％Trehalose-PBS母液；15ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2010)；50ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2012)；移液器(瑞宁RAININ)；西林瓶(肖特新康药品包装有限公司，中硼260)；冻干机(Telstar,lyobeta 5PS)；旋涡混匀器(江苏康健医疗用品有限公司，XH-B型)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,Cat.No.DL-CJ-2ND)。

[0063] 2.2.PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体的制备

[0064] 2.2.1.配置Biotinylated Human PD-1/PDCD1 Avi Tag蛋白溶液，向蛋白溶液中缓慢滴加相应体积的PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)溶液，相应体积的5％BSA-PBS母液和30％Trehalose-PBS母液，轻轻混匀，再补加PBS，至使Biotinylated Human PD-1/PDCD1,His Tag&Fc Tag,Avi Tag浓度为10ug/ml,BSA终浓度为0.5％，Trehalose的终浓度为10％。Biotinylated Human PD-1/PDCD1,His Tag&Fc Tag,Avi Tag与PE-Streptavidin的最终摩尔比为4:1。

[0065] 2.2.2.混合静置于37℃充分反应30min,获得PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体偶联物。将PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体偶联物分装于西林瓶内，50ul/瓶或250μg/瓶，放置冻干机内冻干成干粉状态，压盖贴标签后-80℃冰箱保存备用。四聚体蛋白形成示意图如图1所示。

[0066] 3.PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体的流式鉴定

[0067] 3.1.试剂与仪器

[0068] Biotinylated Human PD-1/PDCD1,Avi Tag(AvitagTM)；PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)；293T-PD-L1细胞：过表达人源PD-L1的293T稳定细胞株，实验室自构建；磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone，SH30256.01)；流式检测样品稀释液：含2％BSA的PBS缓冲液，pH7.4；细胞培养皿(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.150466)；15ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2010)；50ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2012)；1.5ml离心管(Axygen,MCT-150-C)；移液器。

[0069] LUNA II全自动计数仪(logos,Cat.No.L40001)超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,Cat.No.DL-CJ-2ND)；湘仪低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司,Cat.No.L-550)；倒置显微镜(OLYMPUS,Cat.No.CKX31SF)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.Thermo 3111)；流式细胞仪(BD,FACSCelestar)；流式分析软件(FCS Express 6Flow Research Editio)。

[0070] 3.2.实验步骤：

[0071] 3.2.1.收集细胞：吸走293T-PD-L1细胞养上清液，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞(1000rpm，4min，RT)，使用细胞洗涤缓冲液洗涤1次细胞，用样品稀释液重悬细胞。

[0072] 3.2.2.细胞分装：分装前充分混匀细胞悬液，按照每个样本1×106个细胞分装到离心管内，洗涤1次，备用。

[0073] 3.2.3.四聚体样品稀释：用与冻干前等体积的去离子水重构PD-1/PDCD1C-Fc-avi-PE四聚体，再用流式样品稀释液将PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体稀释一系列浓度梯度。

[0074] 3.2.4.对照组样品稀释:用流式样品稀释液将Biotinylated Human PD-1/PDCD1,His Tag&Fc Tag,Avi Tag(Acro，Cat.NO.PD1-H82F2,Lot.NO.BV1052-74DF1-EV)蛋白稀释至于PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体相同浓度梯度。

[0075] 3.2.5.与细胞反应：向每管细胞内分别加入稀释好的样品和，100ul/管，吹打混匀，放置4℃孵育1h。

[0076] 3.2.6.孵育PE-Streptavidin：对照组样品组的细胞与Biotinylated Human PD-1/PDCD1,His Tag&Fc Tag,Avi Tag孵育后，加入1:200稀释的PE-Streptavidin，放置4℃孵育1h。四聚体实验组不需此步骤。

[0077] 3.2.7.细胞洗涤：孵育后洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管中备用。

[0078] 3.2.8.流式检测：分别使用相应的荧光检测通道检测相应的荧光信号；保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCS Express 6Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析。

[0079] 3.3.实验结果：

[0080] 结果分析显示：PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体蛋白在于流式检测中的检测信号远远强于单体蛋白Biotinylated Human PD-1/PDCD1对照组，MFI增加了10-20倍(见表1)。低浓度(1ug/m)时，Biotinylated Human PD-1/PDCD1对照组阳性率降低至49.68％，而PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE的阳性率没有降低(98.82％)；PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体用于流式检测能够增强检测信号，结果见图5、图6和图7。

[0081] 表1.PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体流式检测结果

[0082]

[0083]

[0084] 4.筛选抗PD-L1的中和抗体的应用案例

[0085] 4.1.试剂与仪器

[0086] 293T-PD-L1细胞：过表达人源PD-L1的293T稳定细胞株，实验室自构建；PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体；抗人PD-L1抗体，实验室自生产；磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone，SH30256.01)；流式检测样品稀释液：含2％BSA的PBS缓冲液，pH7.4；细胞培养皿(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.150466)；15ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2010)；50ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2012)；1.5ml离心管(Axygen,MCT-150-C)；移液器[0087] LUNA II全自动计数仪(logos,Cat.No.L40001)超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,Cat.No.DL-CJ-2ND)；湘仪低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司,Cat.No.L-550)；倒置显微镜(OLYMPUS,Cat.No.CKX31SF)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.Thermo 3111)；流式细胞仪(BD,FACSCelestar)；流式分析软件(FCS Express 6Flow Research Editio)。

[0088] 4.2.实验步骤：

[0089] 4.2.1.收集细胞：吸走293T-PD-L1细胞养上清液，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞(1000rpm，4min，RT)，使用细胞洗涤缓冲液洗涤1次细胞，用样品稀释液重悬细胞。

[0090] 4.2.2.细胞分装：分装前充分混匀细胞悬液，按照每个样本1×106个细胞分装到离心管内，洗涤1次，备用。

[0091] 4.2.3.四聚体样品稀释：用与冻干前等体积的去离子水重构PD-1/PDCD1C-Fc-avi-PE四聚体，再用流式样品稀释液将PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体稀释至0.2ug/ml。

[0092] 4.2.4.抗PD-L1抗体稀释：用流式样品稀释液将抗PD-L1抗体稀释一些列浓度梯度。

[0093] 4.2.5.将PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体与抗PD-L1抗同体积混合，混匀后加入含有细胞的离心管内，100ul/管，吹打混匀，放置4℃孵育1h。

[0094] 4.2.6.流式检测：分别使用相应的荧光检测通道检测相应的荧光信号；保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCS Express 6Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析。

[0095] 4.3.实验结果：

[0096] 应用PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE四聚体蛋白筛选抗体人PD-L1的中和抗体。实验结果如图8所示，PDCD1/PD1 C-Fc-avi-PE蛋白四聚体与293T-PD-L1细胞结合产生PE的荧光信号，但是随着加入的抗人PD-L1中和抗体的剂量增加，流式检测到PE的荧光信号越来越弱(荧光强度见表2)。

[0097] 表2.筛选抗体人PD-L1的中和抗体的流式检测结果

[0098]抗体人PD-L1的中和抗体 PE的平均荧光强度(MFI)
10.00ug/ml 44.
3.00ug/ml 42.
2.00ug/ml 44.
1.00ug/ml 48.
0.50ug/ml 288.
0.30ug/ml 1337.
0.10ug/ml 2605.
0.03ug/ml 2842.
0.00ug/ml 2966.

[0099] 实施例2、CAR-T靶点蛋白四聚体(CD19 Fc-Avi-PE四聚体)的制备与应用[0100] 1.Biotinylated Human CD19 FcAvi Tag蛋白的制备

[0101] 1.1.试剂与仪器

[0102] TransT1感受态细胞(全式金，CD501-01)；TransT1感受态细胞(ThermoFisher，C505003)；胰蛋白胨(Sigma,T7293-1KG)，酵母提取物(Sigma,Y1625-1KG)；琼脂(Sigma,A7002-1KG)；Max plasmid Kit(promega，A2492)；细菌摇床(欧诺，HN211B)；细菌培养箱(天津泰斯特，DH3600B)Nanodrop 2000；Expi293F细胞(Invitrogen，Cat#R790-07)；细胞表达培养基，实验室自配；Polyethylenimine，PEI(Polysciences，Cat#23966)。细胞摇床培养箱(欧诺，HNY-2102)。

[0103] 1.2.溶液配制

[0104] 1.2.1.LB培养基：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化钠10g,加水定容至1000ml，高压灭菌,冷却到室温加入Amp,终浓度为100ug/ml,备用。

[0105] 1.2.2.LB固体培养基：胰蛋白胨5g,酵母提取物2.5g，氯化钠5g,琼脂7.5g,加水定容至500ml，高压灭菌或微波炉煮沸，待冷却后加入Amp(终浓度为100ug/ml)，超净台内铺平板，4℃保存备用。

[0106] 1.2.3.Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966,1mg/ml:将50mg的PEI粉末溶于45mL DDH2O中，用HCL将其pH值调至〈2.0，搅拌至PEI全溶，加入NaOH将pH值调至7.0，加入DDH2O定容体积至50mL，0.22um过滤器过滤除菌，分装成每管1.0mL，-80℃冻存备用。

[0107] 1.3.表达载体的构建

[0108] 5'-GGGGCGGCCGCGCCACCATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTG-3'(SEQ ID No.3)

[0109] 5'-GGGACGCGTTTATTCATGCCATTCGATCTTTTG-3'(SEQ ID No.4)

[0110] 自身信号肽，表达区间：(20Pro-291Lys)，C端标签Fc&Avi以cDNA质粒为模板，HiFI DNA Polymerase，98℃3min预变性，98℃10s变性，64℃30s退火，72℃30s延伸，共35个循环，琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的片段，在无缝连接试剂盒的作用下，重组连接到ACRO内部的表达载体上。

[0111] 1.4.质粒鉴定与扩增

[0112] 1.4.1.质粒鉴定：将冻存的TransT1感受态细胞融化，再加入连接产物，混匀，冰浴30min，于42℃热激45S，冰浴2min，加入700ul LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1小时；涂菌，37℃培养过夜；次日挑取单菌落，接种含3ml LB培养基的摇菌管内，于37℃细菌摇床内，
200rpm，培养过夜；收菌液，按promega的plasmid Kit说明提取质粒DNA；Nanodrop2000定量，送测序公司测序，核对基因序列是否正确。

[0113] 1.4.2.质粒扩增：按1.4.1方法将测序正确的质粒转化Top10菌株，扩大培养，提取质粒，供胞转染使用。

[0114] 1.5.Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag蛋白表达

[0115] 1.5.1.对Expi293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率(细胞活率≥90％)，并将细胞密度调整至1ⅹ106/ml，接种细胞培养三角瓶内。

[0116] 1.5.2.分别取相应量的BirA酶质粒、目的基因质粒与PEI混匀，室温孵育5min，再取相应的体积加入细胞培养三角瓶内；

[0117] 1.5.3.将转染后的细胞放置在摇床培养箱中培养，37℃，二氧化碳浓度8％，培养7天，收集细胞悬液，离心后收集细胞培养上清液用于蛋白纯化。

[0118] 1.6.Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag蛋白纯化：

[0119] 收获后离心收集上清液，Protin A亲和纯化，收集样品，经G25脱盐，置换缓冲液(PBS，含10％的Trehalose)，保存在含保护剂(10％海藻糖)的PBS缓冲液中。

[0120] 2.Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag四聚体的制备

[0121] 2.1.试剂与仪器

[0122] Biotinylated Human CD19 Fc  Avi Tag；PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)；5％BSA-PBS母液；30％Trehalose-PBS母液；15ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2010)；50ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2012)；移液器(瑞宁RAININ)；西林瓶(肖特新康药品包装有限公司，中硼260)；冻干机(Telstar,lyobeta 5PS)；旋涡混匀器(江苏康健医疗用品有限公司，XH-B型)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,Cat.No.DL-CJ-2ND)。

[0123] 2.2.CD19 Fc-Avi-PE四聚体的制备

[0124] 2.2.1.配置Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag蛋白溶液，向蛋白溶液中缓慢滴加相应体积的PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)溶液，相应体积的5％BSA-PBS母液和30％Trehalose-PBS母液，轻轻混匀，再补加PBS，至使Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag浓度为10ug/ml,BSA终浓度为0.5％，Trehalose的终浓度为10％。Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag与PE-Streptavidin的最终摩尔比为4:1。

[0125] 2.2.2.混合静置于37℃充分反应30min,获得CD19 Fc-Avi-PE四聚体偶联物。将CD19 Fc-Avi-PE四聚体偶联物分装于西林瓶内，50ul/瓶或250μg/瓶，放置冻干机内冻干成干粉状态，压盖贴标签后-80℃冰箱保存备用。四聚体蛋白形成示意图如图1所示。

[0126] 3.CD19 Fc-Avi-PE四聚体的流式鉴定

[0127] 3.1.试剂与仪器

[0128] Biotinylated Human CD19 Fc  Avi Tag；PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)；RC222细胞株(膜表面过表达CAR,FCM63-scFv)，实验室自构建；磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone，SH30256.01)；流式检测样品稀释液：含2％BSA的PBS缓冲液，pH7.4；细胞培养皿(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.150466)；15ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2010)；50ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2012)；1.5ml离心管(Axygen,MCT-150-C)；移液器。

[0129] LUNA II全自动计数仪(logos,Cat.No.L40001)超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,Cat.No.DL-CJ-2ND)；湘仪低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司,Cat.No.L-550)；倒置显微镜(OLYMPUS,Cat.No.CKX31SF)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.Thermo 3111)；流式细胞仪(BD,FACSCelestar)；流式分析软件(FCS Express 6Flow Research Editio)。

[0130] 3.2.实验步骤：

[0131] 3.2.1.收集细胞：吸走RC222细胞养上清液，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞(1000rpm，4min，RT)，使用细胞洗涤缓冲液洗涤1次细胞，用样品稀释液重悬细胞。

[0132] 3.2.2.细胞分装：分装前充分混匀细胞悬液，按照每个样本1×106个细胞分装到离心管内，洗涤1次，备用。

[0133] 3.2.3.四聚体样品稀释：用与冻干前等体积的去离子水重构CD19 Fc-Avi-PE四聚体，再用流式样品稀释液将CD19 Fc-Avi-PE四聚体稀释一系列浓度梯度。

[0134] 3.2.4.对照组样品稀释:用流式样品稀释液将Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag蛋白稀释相同的浓度梯度。

[0135] 3.2.5.与细胞反应：向每管细胞内分别加入稀释好的样品和，100ul/管，吹打混匀，放置4℃孵育1h。

[0136] 3.2.6.孵育PE-Streptavidin：对照组样品组的细胞与Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag孵育后，加入1:200稀释的PE-Streptavidin，放置4℃孵育1h。四聚体实验组不需此步骤。

[0137] 3.2.7.细胞洗涤：孵育后洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管中备用。

[0138] 3.2.8.流式检测：分别使用相应的荧光检测通道检测相应的荧光信号；保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCS Express 6Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析。

[0139] 3.3.实验结果：

[0140] RC222细胞膜表面表达能够与CD19蛋白结合的CAR,流式检测结果表明CD19Fc-Avi-PE四聚体能够与RC222细胞结合，而PE-Streptavidin对照组未检测到与RC222细胞有结合。且CD19 Fc-Avi-PE四聚体的检测信号远远强于单体蛋白Biotinylated Human CD19 Fc Avi Tag对照组，具体检测数据见表3和图9、图10。

[0141] 表3.PD-1/PDCD1 C-Fc-avi-PE四聚体流式检测结果

[0142]

[0143] 4.D19 Fc-Avi-PE四聚体用于CAR-T阳性率检测的案例

[0144] 4.1.试剂与仪器

[0145] Biotinylated Human CD19 Fc  Avi Tag；PE-Streptavidin(Jackson，Cat.No.016-110-084)；四聚体阴性对照蛋白(Acrobiosystems,Cat.No.LA3-HP2H3)；HEK293细胞；RC222细胞株(膜表面过表达CAR,FCM63-scFv)，实验室自构建；磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone，SH30256.01)；流式检测样品稀释液：含2％BSA的PBS缓冲液，pH7.4；细胞培养皿(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.150466)；15ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2010)；50ml无菌离心管(TrueLine,Cat.No.TR2012)；1.5ml离心管(Axygen,MCT-
150-C)；移液器。

[0146] LUNA II全自动计数仪(logos,Cat.No.L40001)超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司,Cat.No.DL-CJ-2ND)；湘仪低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司,Cat.No.L-550)；倒置显微镜(OLYMPUS,Cat.No.CKX31SF)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.Thermo 3111)；流式细胞仪(BD,FACSCelestar)；流式分析软件(FCS Express 6Flow Research Editio)。

[0147] 4.2.实验步骤：

[0148] 4.2.1.收集细胞：HEK293细胞和RC222细胞分别吸走上清液，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞(1000rpm，4min，RT)，使用细胞洗涤缓冲液洗涤1次细胞，用样品稀释液重悬细胞。

[0149] 4.2.2.细胞分装：分装前充分混匀细胞悬液，按照每个样本1×106个细胞分装到离心管内，洗涤1次，备用。

[0150] 4.2.3.四聚体样品稀释：用与冻干前等体积的去离子水分别重构CD19 Fc-Avi-PE四聚体和四聚体阴性对照蛋白，再用流式样品稀释液分别将其稀释至1ug/ml(次浓度据实验优化结果确定)。

[0151] 4.2.4.与细胞反应：向每管细胞内分别加入稀释好的样品和，100ul/管，吹打混匀，放置4℃孵育1h。

[0152] 4.2.5.细胞洗涤：孵育后洗涤3次后，加入200ul PBS重悬细胞，转移至流式上样管中备用。

[0153] 4.2.6.流式检测：分别使用相应的荧光检测通道检测相应的荧光信号；保存FCS格式文件拷贝装备De Novo Software-FCS Express 6Flow Research Edition流式分析软件的电脑上，进行数据分析。

[0154] 4.3.实验结果：

[0155] RC222细胞的膜表面过表达能够识别CD19的CAR,被作为本应用案例中类CAR-T细胞，HEK293细胞未被转染CD19的CAR，被作为本案例的阴性对照细胞。实验结果显示CD19 Fc-Avi-PE四聚体能够与RC222细胞膜结合，而与空的293细胞不结合，而阴性对照四聚体蛋白与RC222没有结合(具体请见图11)。CD19 Fc-Avi-PE四聚体能够特异性识别CD19的CAR,可用于CAR-T阳性率检测。