花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用转让专利
申请号 : CN201911251981.6
文献号 : CN111100474B
文献日 : 2021-03-23
发明人 : 肖述章 , 严晓婧 , 李杨 , 朱鹏程
申请人 : 三峡大学
摘要 :
本发明涉及花菁染料的合成制备技术，具体涉及一种对酸碱有显著响应的花菁染料的设计合成，检测了该花菁染料在不同pH的PBS溶液中的吸收光谱和荧光光谱。测试发现在酸性和碱性条件下，该化合物的吸收和荧光光谱发生了明显的变化，适用于对癌细胞的检测。
权利要求 :
1.一种花菁染料的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)氮气保护下，将N‑乙酰甘氨酸溶解在DMF中，在冰盐浴下缓慢滴加三氯氧磷，室温下反应0.5‑3h，再升温至80‑100℃下反应3‑5h，反应结束后将反应液缓慢倒入冰水中，经中和、萃取、 柱层析提纯，得到淡黄色固体粉末，即为3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛；
(2)将2,3,3‑三甲基吲哚和碘甲烷溶解在乙腈中，70‑90℃下搅拌反应1‑3h，反应完成后冷至室温，过滤、洗涤，得到淡粉色固体粉末，即为1,2,3,3‑四甲基吲哚盐；
(3)将3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛和1,2,3,3‑四甲基吲哚盐溶解在无水正丁醇中，在100‑140℃下反应4‑6h，反应结束后旋蒸除去正丁醇，柱层析提纯，得到灰黑色固体粉末，即为花菁染料，反应式如下：
2.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法，其特征在于，步骤(1)中N‑乙酰甘氨酸、三氯氧磷的摩尔比为1：2.5‑5。
3.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法，其特征在于，步骤(1)中室温下反应时间为1h，再升温至90℃下反应4h。
4.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法，其特征在于，步骤(2)中2,3,3‑三甲基吲哚、碘甲烷的摩尔比为1：2‑4。
5.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法，其特征在于，步骤(2)中2,3,3‑三甲基吲哚和碘甲烷在乙腈中80℃下搅拌反应2h。
6.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法，其特征在于，步骤(3)中3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛和1,2,3,3‑四甲基吲哚盐的摩尔比为1：1.5‑3.5。
7.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法，其特征在于，步骤(3)中3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛和1,2,3,3‑四甲基吲哚盐在无水正丁醇中，在120℃下反应5h。
8.根据权利要求1‑7任一项所制备得到的花菁染料在制备酸碱响应的荧光试剂上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的花菁染料在制备检测pH为3‑5的溶液的荧光试剂上的应用。
说明书 :
花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种荧光染料的合成方法，具体为花菁染料作为酸碱响应的荧光染料的合成及其应用。
背景技术
[0002] 花菁染料是一种近红外荧光染料，由含两个氮原子的杂环和多甲川链组成，其发射和吸收波长均在600‑800nm之间，能有效减少生物样品由于自吸收与自发荧光身所带来
的背景干扰。除此之外，花菁染料摩尔消光系数大，荧光量子产率高，水溶性好，生物相容性
好，这些优点使它更适合应用在生物环境的分析中。而在生物环境中，pH是一个重要的参
数，它的改变与病理学状态息息相关，是某些疾病诊断的一个重要依据(例如，癌细胞一般
是酸性环境)。因此，设计一种酸碱响应的花菁染料在医学研究上有重大的意义。
的背景干扰。除此之外，花菁染料摩尔消光系数大，荧光量子产率高，水溶性好，生物相容性
好，这些优点使它更适合应用在生物环境的分析中。而在生物环境中，pH是一个重要的参
数，它的改变与病理学状态息息相关，是某些疾病诊断的一个重要依据(例如，癌细胞一般
是酸性环境)。因此，设计一种酸碱响应的花菁染料在医学研究上有重大的意义。
[0003] 但是，传统花染料通过增加聚甲川链来增加其激发波长和发射波长，容易造成染料的光稳定性降低和光漂白性增加等问题，而功能化花菁染料具有多个修饰位点，可以通
过分子设计，合成得到不同官能化的菁染料。但是功能化的菁染料产率低，价格高；尤其是
大Stokes位移的不对称结构的花菁染料，合成难度更大，限制了其应用。因此，本发明通过
Knoevenagl缩合反应在吡咯的1位和3位连接两个含氮杂环，提供了一种简单高效的花菁染
料的合成方法。
过分子设计，合成得到不同官能化的菁染料。但是功能化的菁染料产率低，价格高；尤其是
大Stokes位移的不对称结构的花菁染料，合成难度更大，限制了其应用。因此，本发明通过
Knoevenagl缩合反应在吡咯的1位和3位连接两个含氮杂环，提供了一种简单高效的花菁染
料的合成方法。
发明内容
[0004] 针对上述问题，本发明的技术方案通过Knoevenagl缩合反应在吡咯的1位和3位连接两个含氮杂环，提供一种花菁染料的合成方法，工艺步骤：
[0005]
[0006] (1)氮气保护下，将N‑乙酰甘氨酸溶解在DMF中，在冰盐浴下缓慢滴加三氯氧磷，室温下反应0.5‑3h，再升温至80‑100℃下反应3‑5h(优选条件为，在室温下反应时间为1h，再
升温至90℃下反应4h)，反应结束后将反应液缓慢倒入冰水中，经中和、萃取柱层析提纯，得
到淡黄色固体粉末，即为3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛；所述的N‑乙酰甘氨酸、三氯氧磷
的摩尔比为1：2.5‑5。
升温至90℃下反应4h)，反应结束后将反应液缓慢倒入冰水中，经中和、萃取柱层析提纯，得
到淡黄色固体粉末，即为3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛；所述的N‑乙酰甘氨酸、三氯氧磷
的摩尔比为1：2.5‑5。
[0007] (2)将吲哚和碘甲烷溶解在乙腈中，70‑90℃下搅拌反应1‑3h(优选条件为吲哚和碘甲烷在乙腈中80℃下搅拌反应2h)，反应完成后冷至室温，过滤、洗涤，得到淡粉色固体粉
末，即为1,2,3,3,‑四甲基吲哚盐；吲哚、碘甲烷的摩尔比为1：2‑4。
末，即为1,2,3,3,‑四甲基吲哚盐；吲哚、碘甲烷的摩尔比为1：2‑4。
[0008] (3)将3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛和1,2,3,3,‑四甲基吲哚盐溶解在无水正丁醇中，在100‑140℃下反应4‑6h(优选条件为120℃下反应5h)，反应结束后旋蒸除去正丁醇，
柱层析提纯，得到灰黑色固体粉末，即为花菁染料，3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛和1,2,
3,3,‑四甲基吲哚盐的摩尔比为1：1.5‑3.5。
柱层析提纯，得到灰黑色固体粉末，即为花菁染料，3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛和1,2,
3,3,‑四甲基吲哚盐的摩尔比为1：1.5‑3.5。
[0009] 上述反应步骤(1)中，DMF要干燥，反应温度不可过高，防止高温下DMF分解。
[0010] 上述反应步骤(2)中，碘甲烷要过量，取用的时候要小心，如果是夏天泡在冰水中再取，防止温度过高快速挥发。
[0011] 上述反应步骤(3)中，正丁醇要重蒸除水，反应时可加分水器除水。
[0012] 本发明合成得到的产品采用磁共振氢谱与碳谱验证了上述产品的结构。同时，本发明将所制备得到的花菁染料作为酸碱响应的荧光试剂上的应用。测试发现，该化合物具
有两个荧光通道，分别为875nm‑900nm和500nm‑650nm，在这两个荧光通道内，都是pH在3到5
之间荧光开启响应，而溶酶体的正常pH为4.5‑5.5，引起该化合物荧光开启响应，即该化合
物可以用于生物体内。
有两个荧光通道，分别为875nm‑900nm和500nm‑650nm，在这两个荧光通道内，都是pH在3到5
之间荧光开启响应，而溶酶体的正常pH为4.5‑5.5，引起该化合物荧光开启响应，即该化合
物可以用于生物体内。
附图说明
[0013] 图1为实施例1所得到的花菁染料的核磁共振氢谱图。
[0014] 图2为实施例1得到的花菁染料在DMSO溶液中的吸收和荧光图，a为吸收光谱图，b‑5
为荧光光谱图，测试浓度为10 mol/L，激发波长为630nm。
为荧光光谱图，测试浓度为10 mol/L，激发波长为630nm。
[0015] 图3为实施例1得到的花菁染料在不同pH下PBS溶液中的吸收。
[0016] 图4为实施例1得到的花菁染料在470nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性，其中，a为荧光光谱图，b为570nm处的荧光强度随pH的变化曲线。
[0017] 图5为实施例1得到的花菁染料在590nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性，其中，a为荧光光谱图，b为893nm处的荧光强度随pH的变化曲线。
[0018] 图6为不同浓度的花菁染料在人体乳腺癌细胞MCF‑7的毒性。
具体实施方式
[0019] 实施例1
[0020] 一种花菁染料的合成方法，步骤如下：
[0021] Step1:氮气保护下，将N‑乙酰甘氨酸(8.54mmol,1g)溶解在10mLDMF中，在冰盐浴下缓慢滴加三氯氧磷(31.3mmol,2.92mL)，室温反应1h,再90℃反应4小时。反应结束后将反
应液缓慢倒入冰水中，加碳酸钠中和，乙酸乙酯萃取。柱层析提纯(EA:PE＝2:1)，得到中间
体3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛，产率69％。
应液缓慢倒入冰水中，加碳酸钠中和，乙酸乙酯萃取。柱层析提纯(EA:PE＝2:1)，得到中间
体3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛，产率69％。
[0022] Step2：将吲哚(2.871g,0.018mol)和碘甲烷(7.69g,0.054mol)溶解在20mL乙腈中，80℃下搅拌2h。冷至室温后过滤，并用冷的乙醚洗涤。得到1,2,3,3‑四甲基‑3H‑吲哚‑1‑
碘化物，产率60％。
碘化物，产率60％。
[0023] Step3：将化合物双醛(0.026mol,0.5g)和1,2,3,3,‑四甲基吲哚盐(0.055mol,1.65g)溶解在15mL无水正丁醇中，在120℃下反应5h。反应结束后旋蒸除去正丁醇，柱层析
提纯(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到灰黑色固体粉末，即为花菁染料，产率90％。
提纯(CH2Cl2:CH3OH＝20:1)，得到灰黑色固体粉末，即为花菁染料，产率90％。
[0024] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.32(s,1H),8.02–7.84(m,2H),7.84–7.70(m,4H),7.53(t,J＝19.7,14.9,7.4Hz,4H),7.37(s,1H),7.11(d,J＝14.9Hz,1H),3.91(d,J＝11.7Hz,
6H),1.75(t,J＝11.9Hz,12H).
6H),1.75(t,J＝11.9Hz,12H).
[0025] 实施例2
[0026] 氮气保护下，将3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛(0.05g,2.6mmol)和1,2,3,3‑四甲基‑3H‑吲哚‑1‑碘化物(0.165g,5.5mmol)和醋酸钠(0.067g,8.1mmol)加入反应瓶中，加入
2mL乙酸酐，80℃下反应30min，反应结束后旋蒸除去溶剂，柱层析提纯。得到花菁染料，产率
50％。
2mL乙酸酐，80℃下反应30min，反应结束后旋蒸除去溶剂，柱层析提纯。得到花菁染料，产率
50％。
[0027] 实施例3
[0028] 将3,5‑二氯‑1H‑吡咯‑2,4‑二甲醛(0.05g,2.6mmol)和1,2,3,3‑四甲基‑3H‑吲哚‑1‑碘化物(0.165g,5.5mmol)溶解在5mL乙醇中，回流5h。反应结束后旋蒸除去溶剂，柱层析
提纯(DCM:CH3OH＝100:1)。产率55％。
提纯(DCM:CH3OH＝100:1)。产率55％。
[0029] 实施例4
[0030] 取花菁染料0.0023g溶于3mL DMSO中，配成10‑3M溶液，再用移液枪取出50μL于‑5
5mLDMSO中，配成10 M溶液，分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测试该花菁染料在
DMSO中的吸收光谱和荧光光谱。然后，用PBS缓冲液配置不同浓度的pH，再用移液枪取出50μ
‑3 ‑5
L10 M的花菁溶液于5mL不同pH的PBS缓冲液中，配成10 M溶液，分别用紫外分光光度计和
荧光分光光度计测试该花菁染料在不同pH的PBS缓冲液中的吸收光谱和荧光光谱。
5mLDMSO中，配成10 M溶液，分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测试该花菁染料在
DMSO中的吸收光谱和荧光光谱。然后，用PBS缓冲液配置不同浓度的pH，再用移液枪取出50μ
‑3 ‑5
L10 M的花菁溶液于5mL不同pH的PBS缓冲液中，配成10 M溶液，分别用紫外分光光度计和
荧光分光光度计测试该花菁染料在不同pH的PBS缓冲液中的吸收光谱和荧光光谱。
[0031] 实施例5
[0032] 将花菁染料配成不同浓度放置于MCF‑7细胞中，12h后观察细胞存活率。
[0033] 从图2可以看出在DMSO的稀溶液中，该化合物的吸收和发射分别在625和690nm处。
[0034] 从图3可以看出，该染料在酸性环境下，最大吸收波长位于470nm处，而在中性及碱性环境下，其最大吸收波长位于590nm处，表明该化合物可能存在两条荧光通道。
[0035] 从图3可以看出，目标化合物在470nm和590nm两种激发波长下的荧光光谱，在470nm激发下，580nm处有明显的发射峰，且在酸性条件下荧光较强，而在中性和碱性条件下
荧光较弱。相同的，在590nm激发下，在890nm处有明显的发射峰，在pH＝4时荧光最强。
荧光较弱。相同的，在590nm激发下，在890nm处有明显的发射峰，在pH＝4时荧光最强。
[0036] 从图4可以看出，(a)和(b)是化合物(10‑5M)在470nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性。在强酸性条件下，荧光较强，随着酸性的减弱，在pH从3‑5之间，荧光强度显著下降，
在中性和碱性条件下，荧光强度几乎为0.
在中性和碱性条件下，荧光强度几乎为0.
[0037] 从图5可以看出，(a)和(b)是化合物(10‑5M)在590nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性。在pH为4和8时，荧光强度较高，而在其他条件下，荧光强度较低，表明有两个荧光通
道。
道。
[0038] 从图6可以看出，当花菁染料的溶度浓度小于等于2.5μM时，花菁染料在人体乳腺癌细胞放置12小时后的细胞存活率大于80％，表明基本没有毒性。进一步说明了本发明所
制得的花菁染料可以用于生物体内。
制得的花菁染料可以用于生物体内。