一株沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118的分离及应用

摘要

本发明公开了一株沙门氏菌噬菌体RDP‑SA‑17118的分离及应用,其宿主为沙门氏菌S6，该噬菌体在双平板上能形成直径在2mm‑4mm的噬菌斑；透过电镜观察，该噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径70nm，有一个长120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科。该噬菌体效价高，可达1012pfu/mL,对温度和pH均有较好的耐受性，在连续传代29次后，其效价仍然保持在1012pfu/mL以上，在稀释106倍后，仍对宿主有较好的裂解效果，通过饲喂后，在心肝、肺、肾、胸腺和血清种均能检测到该噬菌体的存在，通过动物实验，在治疗鸡沙门氏菌病中，具有较好的效果。

权利要求

1.一株沙门氏菌噬菌体（Salmonella Gallinarum phage）RDP-SA-17118，其宿主为沙门氏菌（Salmonella Gallinarum）S6，该噬菌体在双平板上能形成直径在2mm-4mm的噬菌斑；透过电镜观察，该噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径70nm，有一个长120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目(Caudovirales)肌尾病毒科（Myoviridae），保藏编号为CGMCC No. 18198。

说明书

一株沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118的分离及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118的分离及应用。

背景技术

[0002] 菌抗药性升高这一问题早己得到国际上重视，欧盟自1999年起就开始禁止饲料中大量添加抗生素使用，且欧盟以及美国等地区和国家较早就开始监控本地区的抗药性问题，其结果不仅显示沙门氏菌对多种抗生素均具有较高抗药性且多重抗药性问题也日益严重。在我国，细菌抗药性问题近年来也更受重视，相关抗药性及药敏试验也正不断开展。目前针对抗药性的研宄，主要集中在抗药性基因的分子水平分析以及研发新的抗生素上。但是相比于细菌抗性突变的速度，新药研发在周期明显落后，且抗药性逐步提高趋势难能控制，因此，应该从多种途径来解决抗药性问题。抗菌肽、粪菌移植、噬菌体、微生态制剂等都是近来研宄开展的对象。噬菌体具有高专一性，并且具有自我复制、治疗所需剂量小、生产成本低、可随着宿主菌的变异而变异等优势。噬菌体与宿主细菌长期的相互作用也丰富了宿主及其自身基因组的多样性，在细菌进化方面也发挥了作用。

[0003] 鸡沙门氏菌病是由多种沙门氏菌引起鸡的急性或慢性疾病的总称，对养鸡业危害极大且发病广泛的传染性疾病。由鸡白痢沙门氏菌所引起的称为鸡白痢，主要危害雏鸡，以白痢为特征；由鸡伤寒沙门氏菌引起的称为鸡伤寒，通常引起败血症，出现急性或慢性经过；由其他有鞭毛且可以运动的沙门氏菌所引起的鸡的疾病则都叫鸡副伤寒，常见于幼鸡，多数呈现急性和亚急性中毒。上述3种沙门氏菌病是鸡场的重要的传染性细菌疾病，可导致雏鸡的大批死亡，产蛋鸡的产蛋量和孵化率下降。该病也可以经过受污染的鸡蛋垂直感染，对养鸡业的危害性很大。

[0004] 在沙门氏菌病治疗中，采用抗生素控制疫情，可以迅速有效得遏制沙门氏菌疫病在养殖禽类中的蔓延。然而实际养殖中，由于养殖户缺乏抗生素使用的相关知识，常采用广谱抗生素或大量使用药物，致使细菌对抗生素的抗药性逐步提高，药物逐渐失效。噬菌体具有对细菌具有高效快速杀伤的特点，特定的噬菌体只感染并裂解特定的目标菌。不受细菌耐药性的限制，噬菌体增殖能力强，在杀菌的同时可以进行自我复制，增殖的噬菌体对人和动物体以及环境都是安全的。噬菌体作为抗生素替代品越来越受到社会的关注和认同。

[0005] 本发明通过沙门氏菌噬菌体的分离，进而分离其噬菌体"筛选裂解谱宽的噬菌体"并研究其生物学特性"扩充鸡白痢治疗的噬菌体储备库为开发治疗鸡白痢的抗生素替代品奠定基础。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一在于提供一株治疗禽沙门氏菌病的，安全可靠的裂解性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118，该噬菌体RDP-SA-17118保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年7月10日，保藏编号CGMCC No.18198，并提供一株生产该噬菌体的病原菌S6。

[0007] 本发明的另一目的在于提供该噬菌体在治疗禽沙门氏菌病中的应用，提供该病原菌在生产该噬菌体的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0009] 一株高裂解率沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118，其宿主为沙门氏菌S6，该噬菌体在双平板上能形成直径在2mm-4mm的噬菌斑；透过电镜观察，该噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径70nm，有一个长120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科。

[0010] 上述噬菌体RDP-SA-17118的分离方法，包括宿主沙门氏菌S6的分离和噬菌体RDP-SA-17118的分离。

[0011] 噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，宿主沙门氏菌S6的分离步骤如下：

[0012] 从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基上划线，于37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL LB肉汤中，37℃、200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液，再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，鉴定完毕后保存于-80℃冰箱。

[0013] 噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，噬菌体RDP-SA-17118的分离步骤如下：

[0014] (1)粪便处理：称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；

[0015] (2)制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；

[0016] (3)噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主沙门氏菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，即得。

[0017] 优选的，该噬菌体RDP-EC-16029的保藏方式为：将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。

[0018] 优选的，其对养殖环境中禽沙门氏菌S6具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽沙门氏菌S6的防治提供了噬菌体来源。

[0019] 优选的，噬菌体RDP-SA-17118在pH6.0-9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-SA-17118能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。

[0020] 优选的，该噬菌体可高效感染宿主菌禽沙门氏菌S6，其最佳感染复数为0.1。

[0021] 优选的，该噬菌体连续传29代后，其效价稳定在1012pfu/mL以上，具有较好的遗传稳定性。

[0022] 优选的，该噬菌体经全基因测序后，该噬菌体基因中不存在溶原性基因和毒力基因。

[0023] 本发明的有益效果体现在：

[0024] (1)本发明发现并分离了一种禽沙门氏菌S6，并以该沙门氏菌S6为宿主分离得到了噬菌体RDP-SA-17118，该噬菌体RDP-SA-17118对养殖环境中禽沙门氏菌S6具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽沙门氏菌S6的防治提供了噬菌体来源；

[0025] (2)在本发明中，噬菌体RDP-SA-17118在pH6.0-9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-SA-17118能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性；

[0026] (3)本发明得到的噬菌体在40-65℃活性基本不变，对温度有一定的耐受性；可高效感染宿主菌禽沙门氏菌S6，其最佳感染复数为0.1；

[0027] (4)通过对本发明分离得到的噬菌体的生物学特性研究，为下一步研发新的抑菌药物提供理论指导意义。

附图说明

[0028] 本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：

[0029] 图1为电镜观察本发明分离得到的噬菌斑的示意图；

[0030] 图2为本发明噬菌体一步生长曲线实验的示意图；

[0031] 图3为本发明噬菌体pH稳定性实验的示意图；

[0032] 图4为本发明噬菌体对宿主裂解实验的示意图；

[0033] 图5为本发明噬菌体热稳定性实验的示意图；

[0034] 图6为本发明噬菌体稳定性遗传实验的示意图。

[0035] 图7为本发明噬菌体RTD实验结果示意图。

具体实施方式

[0036] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0037] 实施例1致病性禽沙门氏菌S6的分离及其鉴定

[0038] 从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基(SS琼脂)上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mLLB肉汤中，37℃200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性沙门氏菌，将其命名为S6，保存于-80℃冰箱。

[0039] 实施例2噬菌体RDP-SA-17118的分离及鉴定：

[0040] (1)粪便处理：称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；

[0041] (2)制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；

[0042] (3)噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主沙门氏菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，即得。

[0043] RDP-SA-17118在双平板形成的噬菌斑直径在2mm-4mm。

[0044] 噬菌体RDP-SA-17118的保藏方式：将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。

[0045] 实施例3噬菌体的电镜观察

[0046] 取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示。

[0047] 噬菌体RDP-SA-17118有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。

[0048] 噬菌体RDP-SA-17118全基因组测序及分析：采用Illumina TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit方法构建文库；具体步骤为：

[0049] 1.以1μg DNA起始量建库；

[0050] 2.Covaris M220超声打断DNA到300-500bp；

[0051] 3.补平、3’端加A、连接index接头(TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit)；

[0052] 4.文库富集，PCR扩增8个cycles；

[0053] 5.2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；

[0054] 6.TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

[0055] 7.cBot固相载体上进行桥式PCR扩增，生成clusters；

[0056] 8.Illumina Hiseq测序平台，进行2×150bp测序。

[0057] 实施例4最佳感染复数的测定

[0058] 按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。具体参见表1。

[0059] 表1最佳感染复数的测定结果

[0060]

[0061]

[0062] 由表1数据显示，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-SA-17118的最佳感染复数为0.1。

[0063] 实施例5噬菌体生长曲线的测定：

[0064] 取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌S6和噬菌体RDP-SA-17118，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图2所示。

[0065] 由图2数据可知，噬菌体感染宿主菌后的30min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约30min，感染后40-120min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为60min。通过计算，噬菌体裂解量约为186PFU/感染细胞，表明噬菌体具有极强的裂解和复制能力。

[0066] 实施例6噬菌体pH稳定性的测定

[0067] 用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×1010pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板，37℃倒置培养4-6h后计数。结果如图3所示。

[0068] 由图3数据可知，噬菌体RDP-SA-17118在pH6.0-9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高。随着pH值的升高或降低，噬菌体的滴度下降明显；表明噬菌体RDP-SA-17118能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。

[0069] 实施例7噬菌体对宿主的裂解试验：

[0070] 在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mL LB培养基中，37℃200rpm振荡培养2h(OD约0.15，约5.0*108cfu/mL)将菌悬液分装在
4个灭菌的锥形瓶中，以最佳感染复数，向其中3个加入噬菌体增殖液0.2mL(约3.6*1011pfu/mL，经0.22μm膜过滤)，同时以不加噬菌体的作为对照，取其平均值。结果如图4所示。

[0071] 由图4可知，沙门氏菌噬菌体RDP-SA-17118加入到宿主菌S6菌悬液中，作用40分钟后出现一定的裂解效果，约40分钟后，OD600值开始下降，持续作用至210分钟，240分钟后混合菌液开始变得浑浊，持续作用6小时后，混合菌液基本与对照组OD600值相同，由于前30分钟，噬菌体处于对宿主菌的吸附、侵染阶段，只有少部分噬菌体开始裂解宿主，因此，其裂解宿主的量远远小于宿主的增长量，因此，OD600在在前30分钟内，依旧保持一定的上升趋势，伴随着噬菌体数量的指数增加，在40分钟后，其裂解宿主数量大于宿主的增殖速度，所以OD600值开始逐渐降低，混合菌液达最澄清。持续作用3小时后，混合菌液出现返浊，原敏感菌被噬菌体裂解，被突变的耐受菌所取代的一种菌群交替。因此，为获得高效价的噬菌体，应控制混合菌液在达到最高清晰度至返浊现象开始之前这一时间范围内，从而避免对噬菌体效价的影响。

[0072] 实施例7噬菌体热稳定性试验：

[0073] 将噬菌体原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图5所示。

[0074] 由图5可知随着温度的升高和时间的延长，噬菌体的活性有一定程度的降低，其中温度在40-65℃范围内，噬菌体活性基本不变，说明RDP-SA-17118对温度有一定的耐受性。

[0075] 实施例8噬菌体的稳定性遗传实验：

[0076] 将RDP-SA-17118连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-EC-16029和S6，每代培养时间6h，然后铺双平板，测定其效价。结果如图6所示。

[0077] 由图6可知，将RDP-SA-17118连续传29代后，测定其效价，其效价稳定在1012pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。

[0078] 实施例9裂解率实验：

[0079] 无菌条件下，分别取1mL样品和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)，37℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10-1-10-3个梯度，每个梯度取100μL涂布于LB琼脂平板上，置于375
℃，培养24小时，每个梯度重复两次。同时取1mL生理盐水和1mL宿主菌菌液(1×10CFU/mL)作为空白对照，重复以上步骤。选取30-300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。噬菌体裂解率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％。

[0080] 经计算可知，RDP-SA-17118的裂解率达96％，对宿主有较好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。

[0081] 实施例10RTD实验

[0082] 在平板上划分区域，将一滴宿主菌(约100μL)滴加到区域中心处，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，37℃培养16-24h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为CL浓度(CL浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案)。结果如图7所示。

[0083] 由图7可知，RDP-SA-17118在稀释106倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。

[0084] 实施例11噬菌体入血实验

[0085] 在口服6h后，用PCR的方法进行噬菌体的检测，结果显示，噬菌体在心肝、肺、肾、胸腺和血清均能检测到，说明该噬菌体可以通过口服进入血液，通过血液循环到达心、肝、肺、肾和胸腺。

[0086] 其中，噬菌体检测方法：

[0087] (1)DNA提取：具体方法参照杭州博日科技有限公司Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒说明。

[0088] (2)PCR反应体系和反应程序：反应体系如表2所示。

[0089] 表2 PCR反应体系

[0090]序号 试剂名称 体积(μL)
1 mix 25
2 上游引物 2.5
3 下游引物 2.5
4 模板 5
5 超纯水 15
6 总体积μL 50μL

[0091] 反应程序：95℃、5min→95℃、45s，55℃、45秒，72℃、45秒，35个循环→72℃、10min。

[0092] 实施例12噬菌体动物实验

[0093] 选择高致病性沙门氏菌S6，通过注射的方法，建立动物模型，初始50只鸡，造模成功后，剩余35只鸡，随机分成5组(实验开始时，肉鸡为11日龄)。选择噬菌体作为实验对象；设定阴性对照与阳性对照，以及抗菌肽组，分别记录鸡群生长状况，如表3所示。

[0094] 表3：

[0095]

[0096]

[0097] 给药10天之后，对不同实验组的肉鸡进行解剖，观察气囊炎的治疗效果。阴性对照组包心现象明显，气囊仍有许多干酪样分泌物；阳性对照2组气囊清亮，没有浑浊；噬菌体组、抗菌肽组、阳性对照1组气囊症状明显减轻，气囊基本明亮，基本无浑浊。通过以上结论可以得出：本发明所得噬菌体可以用于气囊炎的辅助治疗。

[0098] 实施例13裂解普实验

[0099] 选择实验室已鉴定好的30株沙门氏菌(包括10株伤寒沙门氏菌，10株鸡白痢沙门氏菌和10株都柏林沙门氏菌)，进行裂解普实验。结果显示RDP-SA-17118可以裂解其中的26株沙门氏菌。

[0100] 本发明提供的噬菌体效价高，可达1012pfu/mL，对温度和pH均有较好的耐受性，在连续传代29次后，其效价仍然保持在1012pfu/mL以上，遗传性能较好，在稀释106倍后，仍对宿主有较好的裂解效果，通过饲喂后，在心肝、肺、肾、胸腺和血清种均能检测到该噬菌体的存在，进一步通过动物实验，在治疗鸡沙门氏菌病中，具有较好的效果，且使用后没有不良反应。通过全基因测序后，发现该噬菌体基因中不存在溶原性基因和毒力基因，又进一步验证了其安全性。

[0101] 应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。