一种鹅不食草多糖及其制备方法和应用

摘要

本发明属于植物多糖领域，公开了一种鹅不食草多糖及其制法和应用。该鹅不食草多糖结构式如下所示。本发明将鹅不食草粉碎，乙醇回流脱脂脱色，热水浸提，得到水提液；醇沉分离，得到鹅不食草粗多糖；利用Sevag试剂除去蛋白后，经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离，依次以水、0.1M、0.2M及0.5M的NaCl溶液洗脱，收集0.1M NaCl溶液洗脱组分，再经G‑200凝胶柱纯化，得到鹅不食草多糖。其具有高效的清除DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基能力，同时具有抗氧化和抑制α‑糖苷酶活性的性能，可作为天然抗氧化剂，及应用在制备降血糖药物或保健食品中。

权利要求

1.一种鹅不食草均一多糖，命名为CMP‑2B，其特征在于由以下方法制备得到：将鹅不食草粉碎，加乙醇回流脱脂脱色，再在60‑90℃下热水浸提2‑4小时，得到水提液；在水提液中添加无水乙醇使鹅不食草水提液中的乙醇浓度达到75‑85%进行醇沉分离，得到鹅不食草粗多糖；利用Sevag试剂除去蛋白后，经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离，依次以水、0.1 mol/L、0.2 mol/L及0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1 mol/L NaCl溶液洗脱组分，再经G‑200凝胶柱纯化，合并收集第一个吸收峰，得到鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

2.根据权利要求1所述的鹅不食草均一多糖，其特征在于：所述的鹅不食草均一多糖CMP‑2B分子量分布范围为80‑200 KDa，重均分子量为126.35 KDa。

3.一种根据权利要求1或2所述的鹅不食草均一多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将鹅不食草粉碎，加乙醇回流脱脂脱色，再在60‑90℃下热水浸提2‑4小时，得到水提液；在水提液中添加无水乙醇使鹅不食草水提液中的乙醇浓度达到75‑85%进行醇沉分离，得到鹅不食草粗多糖；利用Sevag试剂除去蛋白后，经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离，依次以水、0.1 mol/L、0.2 mol/L及0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1 mol/L NaCl溶液洗脱组分，再经G‑200凝胶柱纯化，合并收集第一个吸收峰，得到鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

4.根据权利要求3所述的鹅不食草均一多糖的制备方法，其特征在于：所述脱脂脱色的条件为在70‑80℃回流2‑4小时。

5.根据权利要求3所述的鹅不食草均一多糖的制备方法，其特征在于：所述醇沉分离指向水提液中加入无水乙醇后，在‑4℃条件下静置8‑24小时，离心，收集鹅不食草粗多糖；

所述除去蛋白的操作具体为将粗多糖溶于水中，加入Sevag试剂，震荡，离心，收集上清液，重复除蛋白8‑10次，透析，冷冻干燥，得到除蛋白鹅不食草粗多糖。

6.根据权利要求3所述的鹅不食草均一多糖的制备方法，其特征在于：所述分级分离前将除去蛋白的鹅不食草粗多糖溶于水，以8000‑10000r/min速度离心

6‑10min，取上清液再经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离；

所述经G‑200凝胶柱纯化，指将分级分离后的产物溶于水中，离心，上清液经Sephadex G‑200凝胶柱进行纯化，以水洗脱，苯酚‑硫酸法检测，收集第一组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得到纯化的鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

7.根据权利要求3所述的鹅不食草均一多糖的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）鹅不食草的前处理：将鹅不食草用水清洗干净，在45‑60℃条件下烘干，经粉碎机粉碎后过筛得鹅不食草粉，加入无水乙醇，在70‑80℃条件下回流2‑4小时，过滤，将滤渣再用乙醇回流脱脂脱色两次，过滤，滤渣在45‑60℃条件下烘干备用；

（2）提取粗多糖：向步骤（1）中得到的滤渣中加入20‑30倍重量的水，在60‑90℃下浸提

2‑4小时，离心、过滤、浓缩得鹅不食草水提液；向水提液中添加无水乙醇使鹅不食草水提液中的乙醇浓度达到75‑85%，在‑4℃条件下静置8‑16小时，离心，收集鹅不食草粗多糖；

（3）除蛋白：将步骤（2）得到的粗多糖溶于水中，加入Sevag试剂，震荡，离心，收集上清液，重复除蛋白8‑10次，透析，冷冻干燥，得到除蛋白鹅不食草粗多糖；

（4）多糖纯化：将步骤（3）得到的除蛋白鹅不食草多糖用水溶解，以8000‑10000r/min速度离心6‑10min，上清液经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离，依次以水、

0.1mol/L、0.2 mol/L及0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1 mol/L NaCl溶液洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥；再将其溶于水中，离心，上清液经Sephadex G‑200凝胶柱进行纯化，以水洗脱，收集第一洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得到鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

8.根据权利要求7所述的鹅不食草均一多糖的制备方法，其特征在于：步骤（2）中的离心条件均为：在6000‑8000r/min转速下，离心5‑8min；

步骤（3）中透析袋的截留分子量为3500‑8000 Da；

步骤（4）中，多糖经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行初步纯化，依次以水、0.1mol/L、0.2 mol/L及0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，苯酚硫酸法检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线的吸收峰，收集0.1 mol/L的NaCl溶液洗脱组分，浓缩、透析、冷冻干燥，得到产物；再将产物溶于水中，离心，上清液经Sephadex G‑200凝胶柱进一步纯化，以水洗脱，苯酚‑硫酸法检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线得两个吸收峰，合并收集第一个吸收峰，浓缩，透析，冷冻干燥，得到最终产物。

9.根据权利要求1或2所述的鹅不食草均一多糖在制备抗氧化剂中的应用。

10.根据权利要求1或2所述的鹅不食草均一多糖在制备降血糖药物和保健食品中的应用。

说明书

一种鹅不食草多糖及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物多糖领域，特别涉及一种鹅不食草多糖及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 二型糖尿病为非胰岛素依赖性疾病，是一种由于β‑胰岛细胞破损或靶细胞对胰岛素的抵抗导致体内胰岛素的相对不足，引起体内代谢絮乱的慢性疾病。

[0003] 餐后高血糖症是二型糖尿病的主要特征之一，同时也是糖尿病并发症的主要诱导因素之一。延缓碳水化合物的消化是缓解餐后高血糖的有效方法。α‑葡萄糖苷酶是糖苷水
解酶，其水解末端非还原1→4连接的α‑D‑葡萄糖残基，从而释放葡萄糖到血液中。因此，抑
制α‑葡萄糖苷酶可以减少碳水化合物的消化并减缓糖尿病患者的餐后血糖水平。同时，二
型糖尿病与氧化应激的增加密切相关。持续高血糖将降低抗氧化酶的活性，导致抗氧化防
御系统的破坏。因此，同时具有降低餐后高血糖和氧化应激的药剂或物质可用于治疗二型
糖尿病患者。

[0004] 目前，多糖具有多糖生物活性受到人们广泛的研究，其具有提高免疫力、抗炎、抗氧化、抗肿瘤及降血糖等多种生物活性。此外，有研究表明，从桑果、桦褐孔菌和马尾藻中分
离的多糖同时具有抗氧化和α‑葡萄糖苷酶抑制能力。因此，多糖可作为潜在的降血糖药物
或保健食品应用于糖尿病患者。

[0005] 鹅不食草(Centipeda minima)为菊科植物，广泛分布于我国的湖北、江苏广东和浙江等地方。研究表明，鹅不食草可用于治疗鼻炎、气管炎风湿关节炎等疾病，同时还具有
抗炎、抗氧化及抗肿瘤活性。目前，关于鹅不食草多糖的结构与生物活性之间的关系鲜见报
道。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种同时具有抗氧化和抑制α‑糖苷酶活性的鹅不食草均一多糖。

[0007] 本发明另一目的在于提供上述同时具有抗氧化和抑制α‑糖苷酶活性的鹅不食草均一多糖的制备方法。

[0008] 本发明再一目的在于提供上述鹅不食草均一多糖作为抗氧化剂，及在制备降血糖药物或保健食品中的应用。

[0009] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0010] 一种鹅不食草均一多糖，命名为CMP‑2B，其结构式如下所示：

[0011]

[0012] 其中A表示1,6‑linked‑β‑D‑Galp；B表示1,3,6‑linked‑β‑D‑Manp；C表示1,4‑linked‑α‑D‑GalpA；D表示1,3‑linked‑α‑L‑Araf；E表示1,4,6‑linked‑α‑D‑Galp；F表示1‑
linked‑α‑L‑Araf；

[0013] 所述的鹅不食草均一多糖CMP‑2B主链为1,3,6‑linked‑D‑Manp和1,4,6‑linked‑D‑Galp,其支链上链接有1,4‑linked‑α‑D‑GalpA,1,6‑linked‑β‑D‑Galp,T‑linked‑α‑L‑
Araf,和1,3‑linked‑α‑L‑Araf.

[0014] 所述的鹅不食草均一多糖CMP‑2B分子量分布范围为80‑200KDa，重均分子量为126.35KDa。

[0015] 一种上述的鹅不食草均一多糖CMP‑2B的制备方法，其包括以下步骤：

[0016] 将鹅不食草粉碎，加乙醇回流脱脂脱色，再热水浸提，得到水提液；对水提液进行醇沉分离，得到鹅不食草粗多糖；利用Sevag试剂除去蛋白后，经纤维素DEAE‑52阴离子交换
树脂进行分级分离，依次以水、0.1mol/L、0.2mol/L及0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集
0.1mol/L NaCl溶液洗脱组分，再经G‑200凝胶柱纯化，得到鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

[0017] 所述鹅不食草使用前优选先清洗干净，并在45‑60℃条件下烘干；所述粉碎优选经粉碎机粉碎后过60‑100目筛得鹅不食草粉。

[0018] 所述脱脂脱色的条件优选为在70‑80℃回流2‑4小时。所述脱脂脱色优选使用无水乙醇反复脱脂脱色三次或以上。

[0019] 所述脱脂脱色后滤渣优选在45‑60℃条件下烘干备用。

[0020] 所述热水浸提的条件优选为在60‑90℃下水浸提2‑4小时。

[0021] 所述醇沉分离优选向水提液中加入无水乙醇后，在‑4℃条件下静置8‑24小时，离心，收集鹅不食草粗多糖。

[0022] 所述除去蛋白的操作具体为：将粗多糖溶于水中，加入Sevag试剂，震荡，离心，收集上清液，重复除蛋白8‑10次，透析，冷冻干燥，得到除蛋白鹅不食草粗多糖。

[0023] 所述分级分离前，优选将除去蛋白的鹅不食草粗多糖溶于水，以8000‑10000r/min速度离心6‑10min，取上清液再经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离。

[0024] 所述经G‑200凝胶柱纯化，优选将分级分离后的产物溶于水中，离心，上清液经Sephadex G‑200凝胶柱进行纯化，以水洗脱，苯酚‑硫酸法检测，收集第一组分，浓缩，透析，
冷冻干燥，得到纯化的鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

[0025] 优选的，上述的鹅不食草均一多糖CMP‑2B的制备方法，具体包括以下步骤：

[0026] (1)鹅不食草的前处理：将鹅不食草用水清洗干净，在45‑60℃条件下烘干，经粉碎机粉碎后过筛得鹅不食草粉，加入无水乙醇，在70‑80℃条件下回流2‑4小时，过滤，将滤渣
再用乙醇回流脱脂脱色两次，过滤，滤渣在45‑60℃条件下烘干备用；

[0027] (2)提取粗多糖：向步骤(1)中得到的滤渣中加入20‑30倍重量的水，在60‑90℃下浸提2‑4小时，离心、过滤、浓缩得鹅不食草水提液；向水提液中添加无水乙醇，在‑4℃条件
下静置8‑16小时，离心，收集鹅不食草粗多糖；

[0028] (3)除蛋白：将步骤(2)得到的粗多糖溶于水中，加入Sevag试剂，震荡，离心，收集上清液，重复除蛋白8‑10次，透析，冷冻干燥，得到除蛋白鹅不食草粗多糖；

[0029] (4)多糖纯化：将步骤(3)得到的除蛋白鹅不食草多糖用水溶解，以8000‑10000r/min速度离心6‑10min，上清液经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行分级分离，依次以水、
0.1mol/L、0.2mol/L及0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱组分，浓缩，
透析，冷冻干燥；再将其溶于水中，离心，上清液经Sephadex G‑200凝胶柱进行纯化，以水洗
脱，收集洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得到鹅不食草均一多糖CMP‑2B。

[0030] 优选地，步骤(2)中的离心条件均为：在6000‑8000r/min转速下，离心5‑8min；此外，在水提液中添加无水乙醇使鹅不食草水提液中的乙醇浓度优选达到75‑85％(v/v)。

[0031] 优选地，步骤(3)中所述透析袋的截留分子量为3500‑8000Da。

[0032] 优选地，步骤(4)中，多糖经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行初步纯化，依次以水、0.1mol/L、0.2mol/L及0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，苯酚硫酸法检测，绘制洗脱曲线，根据
洗脱曲线的吸收峰，收集0.1mol/L的NaCl溶液洗脱组分，浓缩、透析、冷冻干燥，得到产物；
再将产物溶于水中，Sephadex G‑200凝胶柱进一步纯化，以水洗脱，苯酚‑硫酸法检测，绘制
洗脱曲线，根据洗脱曲线得两个吸收峰，合并收集第一个吸收峰，浓缩，透析，冷冻干燥，得
到最终产物。经高效凝胶排阻色谱检测，多糖CMP‑2B的凝胶色谱图上仅存在一个均一对称
的吸收峰，根据保留时间计算，其分子量分布在80‑200KDa。

[0033] 本发明的鹅不食草均一多糖CMP‑2B，是一种酸性多糖，含有1,3,6‑linked‑D‑Manp,1,4,6‑linked‑D‑Galp,1,4‑linked‑α‑D‑GalpA,1,6‑linked‑β‑D‑Galp,T‑linked‑α‑
L‑Araf和1,3‑linked‑α‑L‑Araf六种糖苷键。CMP‑2B具有高效的清除DPPH自由基、ABTS自由
基和超氧自由基能力，同时具有抗氧化和抑制α‑糖苷酶活性的性能，可作为天然抗氧化剂，
及应用在制备降血糖药物或保健食品中。

附图说明

[0034] 图1为实施例1制备的多糖CMP‑2B的单糖组分分析结果，其中，A为标准单糖图谱；B为鹅不食草均一多糖CMP‑2B的单糖组成分析图谱。图中标记：Man‑甘露糖，Rha‑鼠李糖，
GalA‑半乳糖醛酸，Glc‑葡萄糖，Gal‑半乳糖，Ara‑阿拉伯糖，Fuc‑岩藻糖。

[0035] 图2为实施例1制备的多糖CMP‑2B的红外光谱图。

[0036] 图3为实施例1制备的多糖CMP‑2B的1H NMR图谱。

[0037] 图4为实施例1制备的多糖CMP‑2B的13C NMR图谱。

[0038] 图5为实施例1制备的多糖CMP‑2B的COSY图谱。

[0039] 图6为实施例1制备的多糖CMP‑2B的HSQC图谱。

[0040] 图7为实施例1制备的多糖CMP‑2B的HMBC图谱。

[0041] 图8为实施例1制备的多糖CMP‑2B的抗氧化活性图；A为清除DPPH自由基活性图；B为清除ABTS自由基活性图；C为清除超氧自由基活性图。

[0042] 图9为实施例1制备的多糖CMP‑2B抑制α‑糖苷酶活性图。

具体实施方式

[0043] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0044] 实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

[0045] 实施例1：鹅不食草多糖CMP‑2B的制备

[0046] (1)多糖提取：

[0047] 取1000g洗净烘干的鹅不食草，经粉碎机粉碎后过60目筛，添加6L无水乙醇在70℃水浴条件下回流两小时，重复回流脱脂脱色两次，过滤，滤渣在45℃的鼓风烘箱中烘干，加
入20L水，在80℃水浴条件下浸提4小时，离心，过滤，浓缩至2.5L，在500r/min的转速下缓慢
加入四倍量体积10L的无水乙醇，在‑4℃条件下静置12小时，离心，收集沉淀物，再依次用无
水乙醇和丙酮洗涤3次，沉淀物冷冻干燥得鹅不食草23.6g粗多糖。

[0048] (2)除蛋白：

[0049] 取上述制备的鹅不食草粗多糖20g溶于300mL的水中，搅拌，离心分离，在上清液中添加Sevag试剂，振荡，静置，离心分离，取上清液，再加入Sevag试剂，重复10次，上清液透
析，浓缩，冷冻干燥得除蛋白鹅不食草粗多糖。

[0050] (3)多糖纯化：

[0051] 取2g除蛋白的粗多糖，溶于100mL水，以8000r/min的转速离心8min，取上清液经纤维素DEAE‑52阴离子交换树脂进行初步分离，依次以水、0.1mol/L、0.2mol/L及0.5mol/L的
NaCl水溶液洗脱，苯酚硫酸法检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线的吸收峰，收集0.1mol/L
的NaCl溶液洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥得到鹅不食草多糖CMP‑2；将CMP‑2溶于水中，离
心，取上清液经Sephadex G‑200凝胶柱进一步纯化，以水洗脱，苯酚‑硫酸法检测，绘制洗脱
曲线，根据洗脱曲线得两个吸收峰，合并收集第一个吸收峰，浓缩，透析，冷冻干燥得107mg
鹅不食草多糖CMP‑2B，经高效凝胶排阻色谱检测，CMP‑2B在凝胶色谱图上仅有一个均一对
称的吸收峰，表明其是均一组分多糖。

[0052] (4)多糖CMP‑2B初级结构解析：

[0053] a、采用高效凝胶渗透色谱测定CMP‑2B的平均分子量为126.35KDa。

[0054] b、取5mg多糖用三氟乙酸完全水解、PMP柱前衍生、氯仿萃取、取水相过0.22μm滤膜后用高效液相进行分析。单糖组成结果如图1所示，鹅不食草多糖CMP‑2B包含甘露糖、半乳
糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖四种单糖，其摩尔比为0.27:0.12:0.42:0.17。

[0055] c、取2mg干燥后的鹅不食草多糖CMP‑2B与KBr粉末混合，压制成颗粒状，在4000‑‑1 ‑1
400cm 的频率范围内进行FT‑IR测量。结果如图2所示，在3388cm 处的吸收峰为多糖羟基
‑1 ‑1
自由伸缩振动吸收峰，2935cm 处的吸收峰属于C‑H键的伸缩振动。1608cm 含有吸收峰，表
明鹅不食草多糖CMP‑2B含有糖醛酸，该结果与单糖组成分析一致。

[0056] d、取5mg干燥的鹅不食草多糖CMP‑2B，完全溶解于2mL无水DMSO，加入100mg NaOH和2mL碘甲烷，在氮气保护下避光反应12小时，加入1mL水终止反应，流水透析24小时，用氯
‑1
仿萃取2次，取氯仿相蒸干得甲基化多糖，在红外光图谱3200‑3600cm 处无羟基特征吸收
峰，证明多糖被完全甲基化。三氟乙酸水解甲基化多糖，硼氢化钠还原，乙酰化，最后进行
GC‑MS分析，结果见表1。

[0057] 表1 鹅不食草多糖CMP‑2B的甲基化分析

[0058]

[0059] 甲基化结果表明，CMP‑2B多糖含有六种不同类型的糖苷键，分别为：1,3,6‑linked‑D‑Manp,1,4,6‑linked‑D‑Galp,1,4‑linked‑α‑D‑GalpA,1,6‑linked‑β‑D‑Galp,T‑
linked‑α‑L‑Araf和1,3‑linked‑α‑L‑Araf。

[0060] e、取40mg鹅不食草多糖CMP‑2B在真空干燥箱中干燥24小时，D2O置换2次后进行1
NMR分析。CMP‑2B多糖的一维及二维核磁图谱如图3‑图7所示，其中，图3为 H NMR图谱，图4
13 1
为 C NMR图谱，图5为COSY图谱，图6为HSQC图谱，图7为HMBC图谱。根据所述多糖的 H NMR、
13
C NMR、COSY和HSQC图谱及前人研究成果，将CMP‑2B含有的六种不同类型糖苷键及其相对
应的化学位移信号归纳总结在表2中，鹅不食草多糖CMP‑2B的H1/C1的化学位移δ4.50/
102.67ppm，4.58/103.44ppm，5.01/99.01ppm，5.07/106.93，5.16/97.53和5.18/109.28ppm
分别代表1,6‑linked‑β‑D‑Galp，1,3,6‑linked‑β‑D‑Manp，1,4‑linked‑α‑D‑GalpA，1,3‑
linked‑α‑L‑Araf，1,4,6‑linked‑α‑D‑Galp和T‑linked‑α‑L‑Araf的异头质子和异头碳的
化学位移。此外，在δ170‑180ppm出现的信号峰属于羧基上碳原子的特征吸收峰，表明多糖
CMP‑2B中含有糖醛酸，该结果与红外及单糖组成分析相一致。在CMP‑2B的HMBC图谱中(图
7)，可以确定糖苷键之间的连接顺序。糖基1,3,6‑linked‑β‑D‑Manp的C‑1和1,4,6‑linked‑
α‑D‑Galp的H‑4有交叉峰，糖基1,4,6‑linked‑α‑D‑Galp的C‑1和1,3,6‑linked‑β‑D‑Manp的
H‑3有交叉峰，糖基1,6‑linked‑β‑D‑Galp的C‑1和1,3,6‑linked‑β‑D‑Manp的H‑6相关，糖基
1,3‑linked‑α‑L‑Araf的C‑1和1,6‑linked‑β‑D‑Galp的H‑6有重叠，糖基1,4‑linked‑α‑D‑
GalpA的C‑1与1,3‑linked‑α‑L‑Araf的H‑3有交叉峰，T‑linked‑α‑L‑Araf的C‑1和1,4,6‑
linked‑α‑D‑Galp的H‑6有交叉峰。

[0061] 综上所述，该多糖以1,3,6‑linked‑β‑D‑Manp和1,4,6‑linked‑α‑D‑Galp残基为主链，其它糖基为支链以直接或者间接连接方式连接主链糖残基。

[0062] 表2 鹅不食草多糖CMP‑2B的1H和13C化学位移分类表

[0063]

[0064] f、结合以上分析，可确定鹅不食草多糖CMP‑2B的结构式如下所示：

[0065]

[0066] 实施案例2：鹅不食草多糖CMP‑2B的抗氧化活性实验

[0067] 分别采用DPPH、ABTS法和超氧自由基实验评估多糖抗氧化活性，具体如下：

[0068] 清除DPPH自由基：将150μL CMP‑2B水溶液(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mg/mL)与150μL DPPH乙醇溶液(60μmol/L)分别在96孔板中混合，常温避光反应30min，在517nm
处测试混合物的吸光值，以抗坏血酸(Vc)为阳性对照，结果见图8A。

[0069] 清除ABTS自由基：将2mL的ABTS(7mmol/L)水溶液(与2mL的过硫酸钾水溶液(2.45mmol/L)混合，室温避光反应12小时，制得阳离子ABTS自由基。将制得阳离子ABTS自由
基溶液用乙醇稀释至在734nm处吸光值为0.7±0.05。在96孔板中加入20μL的多糖水溶液
(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mg/mL)，再加入180μL的稀释阳离子ABTS自由基溶液，振
荡，在734nm处测试混合物的吸光值，以抗坏血酸(Vc)为阳性对照，结果见图8B。

[0070] 清除超氧自由基：在96孔板中加入30μL多糖水溶液(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mg/mL)和150μL pH 8.2的Tris‑HCl缓冲溶液(0.1mol/L)，混匀，室温避光培养10min，
然后加入30μL邻苯三酚水溶液(6mmol/L)，混匀，避光反应3min，加入30μL HCl(10mol/L)终
止反应，在325nm处测试混合物的吸光值，以抗坏血酸(Vc)为阳性对照，结果见图8C。

[0071] 结果表明，本发明的鹅不食草多糖CMP‑2B具有较强的清除DPPH、ABTS及超氧自由基的能力。

[0072] 实施案例3：鹅不食草多糖CMP‑2B抑制α‑糖苷酶活性实验

[0073] 在96孔板中加入20μL多糖水溶液(0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mg/mL)和40μLα‑葡萄糖糖苷酶水溶液(0.2U/mL)，混匀，在37℃条件下培养10min，然后加入20.0μL 
pNPG水溶液(10mmol/L)，混匀，在37℃条件下反应30min，最后加入100μL Na2CO3(0.2mol/L)
溶液终止反应，在405nm处测试混合物的吸光值，以阿卡波糖(acarbose)为阳性对照，结果
见图11。

[0074] 结果表明，鹅不食草多糖CMP‑2B在0.1‑3.0mg/mL的浓度范围内均具有抑制α‑糖苷酶活性，并且其抑制活性随浓度的升高而增强。在浓度为3.0mg/mL时，CMP‑2B的抑制率为
90.03±1.49％。表明鹅不食草多糖具有很好的抑制α‑糖苷酶活性。

[0075] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。