一种耐盐异养好氧硝化细菌菌株、培养方法、菌液及应用

摘要

本发明公开了一种耐盐异养好氧硝化菌菌株，并提供了该菌株的培养方法、含有该菌株的菌液及其用于去除废水中氨氮的应用方式。该菌株是从活性污泥中分离得到的。经鉴定该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。该菌株在以葡萄糖为碳源、氯化铵为唯一氮源的液体培养基中，对氨氮的去除率达85%以上，总氮的去除率也可到达70%，具有高效脱氮功能，该菌株为生物脱氮、治理高盐高氨氮污染水体提供一种良好的微生物材料，具有较好的市场应用前景。

权利要求

1.一种耐盐异养好氧硝化菌菌株，其特征在于：所述菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.），并命名为Pseudomonas sp. HQXH‑21，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号中国科学院微生物研究所，保藏编号：19106，保藏时间为：2019年12月6日。

2.根据权利要求1所述的一种耐盐异养好氧硝化菌菌株，其特征在于：所述菌株在LB培养基中的单菌落为规则圆形、湿润、黄色、不透明、呈粘稠态。

3.采用权利要求1‑2任一所述的一种耐盐异养好氧硝化菌菌株制备的菌液。

4.根据权利要求3所述的菌液，其特征在于：制备菌液的方法包括以下步骤，将所述菌株接种于异养硝化培养基中，在温度为20℃‑40℃的恒温震荡培养箱中培养，pH为6‑8，并每隔24h‑48h更换新鲜的异养硝化培养基，培养30h以上，选取OD600为0.4‑0.8的菌液为菌株菌液；异养硝化培养基的成分如下：氯化铵0.1g/L‑0.5g/L，醋酸钠0.5g/L‑1g/L，磷酸氢二钠

0.02g/L‑0.5g/L，氯化钾0.01g/L‑0.1g/L，氯化钠 5g/L‑10g/L，硫酸镁0.01g/L‑0.05g/L和

1mL微量元素溶液；pH为6‑8。

5.权利要求1‑2任一所述的一种耐盐异养好氧硝化菌菌株的应用，其特征在于：所述菌株应用于高氨氮废水治理中。

6.根据权利要求5所述的一种耐盐异养好氧硝化菌菌株的应用，其特征在于：将所述菌株按照2%‑10%（v/v）的接种量添加到高氨氮废水中。

说明书

一种耐盐异养好氧硝化细菌菌株、培养方法、菌液及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及环境微生物的技术领域，更具体地说，涉及一种耐盐异养好氧硝化细菌菌株、培养方法、菌液及应用。

背景技术

[0002] 随着工农业的发展和人民生活水平的提高，含氮化合物废水的排放量急剧增加，已经成为环境的主要污染源而备受关注。近年来，氮素污染已成为我国地表水环境安全的
一大隐患，大量氨氮废水排入水体不仅引起水体富营养化、造成水体黑臭，给水处理的难度
和成本加大，甚至对人群及生物产生毒害作用。废水中氨氮的构成主要有两种，一种是氨水
形成的氨氮，一种是无机氨形成的氨氮，主要是硫酸铵，氯化铵等。氨氮废水主要来自化工、
冶金、化肥、煤气、炼焦、鞣革、味精、肉类加工和养殖等行业排放的废水以及垃圾渗滤液等。
氨氮废水对鱼类及某些生物也有毒害作用。另外，当含少量氨氮的废水回用于工业中时，对
某些金属，特别是铜具有腐蚀作用，还可以促进输水管道和用水设备中微生物的繁殖，形成
生物垢，堵塞管道和设备。

[0003] 处理氨氮废水的方法有很多，目前常见的有化学沉淀法、吹脱法、化学氧化法、生物法、膜分离法、离子交换法以及土壤灌溉等。其中以微生物为主体的生物修复技术以其高
效率、低成本的优势在污染水体脱氮中展示出了巨大的应用前景。

[0004] 微生物通过硝化作用，在硝化细菌作用下，将NH3和NH4+或者负三价氧化态的有机态氮氧化到羟胺（NH2OH）、NO2‑‑N和NO3‑‑N 的过程。目前在土壤、污泥、湖水、深海及火山口
等多处都有异养硝化微生物的存在，分布区域十分广泛。这些具有硝化功能的异样硝化微
生物包含多种微生物种类，既有真核生物、又有原核生物，如真菌、细菌、放线菌、甚至是藻
类。微生物的生长、繁殖以及代谢活动受外界环境条件的影响较大，如温度、pH、营养物质，
不同种类微生物最适生长条件差异非常大。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种耐盐异养好氧硝化菌菌株，其具有高效脱氮能力。

[0006] 本发明的第二个目的在于提供一种耐盐异养好氧硝化菌菌株的培养方法，其具有高效、快速筛选耐盐异养好氧硝化菌株，且能够保证该菌硝化脱氮性质稳定的优点。

[0007] 本发明的第三个目的在于提供一种耐盐异养好氧硝化菌菌株制备的菌液，该菌液应用于废水的脱氮处理。

[0008] 本发明的第四个目的在于提供一种耐盐异养好氧硝化菌菌株的应用，该菌种使得废水的处理工艺操作简单，对废水中氨氮的去除率达85 %以上，总氮的去除率也可到达70 
%，该菌株为生物脱氮、治理高盐高氨氮污染水体提供一种良好的微生物材料。

[0009] 为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种耐盐异养好氧硝化菌菌株，所述菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.），并命名为Pseudomonas sp. HQXH‑21，保藏
于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号中国科学
院微生物研究所，保藏编号：19106，保藏时间为：2019年12月6日。

[0010] 进一步地，所述菌株在LB培养基中的单菌落为规则圆形、湿润、黄色、不透明、呈粘稠态。

[0011] 进一步地，所述菌株是从活性污泥中筛选出来的。

[0012] 进一步地，所述菌株的分离和筛选包括以下步骤：

[0013] （1）采集活性污泥样本，经过稀释和平板涂步法接种于硝化培养基，硝化培养基中+
初始NH4‑N浓度为100 mg/L，30℃条件下培养；

[0014] （2）按（1）中分离到的菌株进行置于培养基中进行NH4+‑N去除实验，NH4+‑N去除率最高的菌株即为所需菌株。

[0015] 本发明提供的耐盐异养好氧硝化菌菌株是从活性污泥中筛选出来的，污泥中含有多种微生物，一般情况下，高氨氮废水底部的活性污泥中含有很多微生物，此类微生物由于
长期与高氨氮废水接触，一部分微生物会因为高氨氮的恶劣环境而无法生存，还有一部分
微生物会对高氨氮的环境逐渐适应，可以在恶劣环境下正常生存，其中有大多为硝化细菌，
硝化细菌具有脱氮能力，本发明筛选到的正是这种耐盐的硝化细菌。

[0016] 进一步地，对所述菌株的异养硝化能力检测，包括以下步骤，

[0017] （1）制备种子液：将该菌种接种于含NaCl 10g/L的LB培养基中，于25℃‑35℃进行培养；

[0018] （2）收集菌体：得到（1）中的种子液中的菌体，并制备成菌体重悬液；

[0019] （3）接种：将（2）得到的菌体重悬液接种至唯一氮源的异养硝化培养基，于25℃‑35℃进行培养；

[0020] （4）取样测定：于不同培养时间下测定菌株对氨氮的去除程度、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的累积情况。

[0021] 通过上述技术方案，对筛选出的硝化细菌进行异养硝化能力的检测，得到Pseudomonas sp.  HQXH‑21为一株具有高效脱氮能力的硝化菌株，并利用该菌株进行废水
中氨氮的脱氮处理。

[0022] 为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：一种耐盐异养好氧硝化菌菌株的培养方法，将所述菌株按2%‑10%的接种量接种于硝化培养基，培养基成分如下：氯化
铵0.1g/L‑0.5g/L，醋酸钠0.5g/L‑1g/L，磷酸氢二钠0.02g/L‑0.5g/L，氯化钾0.01g/L‑
0.1g/L，氯化钠 5g/L‑10g/L，硫酸镁0.01g/L‑0.05g/L和1mL微量元素溶液；pH为6‑8；

[0023] 将接种有所述菌株的硝化培养基置于培养温度为20℃‑40℃的恒温震荡培养箱中培养；每隔 24h‑48h 按照5%‑20%的体积比更换新鲜的异养硝化培养基，培养30h以上，选取
OD600为0.4‑0.8的菌液为菌株菌液。

[0024] 针对培养筛选出的菌株的硝化培养基的各个成分的浓度配比以及该菌株的培养温度和培养的pH进行了探究，得到该菌株的最佳培养条件，保证后续利用Rhodococcus 
erythropolis. HQC‑1进行废水脱氮处理中菌株的良好状态。

[0025] 为实现上述第三个目的，本发明提供了采用上述耐盐异养好氧硝化菌菌株制备的菌液。

[0026] 进一步的，制备菌液的方法包括以下步骤，将所述菌株接种于异养硝化培养基中，在温度为20℃‑40℃的恒温震荡培养箱中培养，pH为6‑8，并每隔24h‑48h更换新鲜的异养硝
化培养基，培养30h以上，选取OD600为0.4‑0.8的菌液为菌株菌液。

[0027] 通过采用上述技术方案，制备筛选到的菌株的菌液，利用菌液可对废水中的氨氮进行有效的去除。

[0028] 为实现上述第四个目的，本发明提供了如下技术方案：一种耐盐异养好氧硝化菌菌株的应用，所述菌株应用于高氨氮废水治理中。

[0029] 进一步地，将所述菌株按照2%‑10%（v/v）的接种量添加到高氨氮废水中。

[0030] 将筛选出菌种应用于废水的氨氮处理，并对其处理工艺进行了优化，按照2%‑10%的接种量接种到高氨氮废水中，高氨氮废水的初始氨氮浓度控制在100 mg/L，30℃、150 r/
min 条件下培养，检测氨态氮和总氮的去除情况，氨态氮的去除率达到85 %以上，总氮的去
除率也可到达70%以上。

[0031] 综上所述，本发明提供了一种具有高效脱氮的耐盐异养好氧硝化菌菌株，并且提供了该菌株的培养方法及其用于去除废水中氨氮的较优应用方式。经鉴定该菌株为假单胞
菌（Pseudomonas sp.）HQXH‑21，该菌株在以葡萄糖为碳源、氯化铵为唯一氮源的液体培养
基中，对氨氮的去除率达85 %以上，总氮的去除率也可到达70 %，该菌株为生物脱氮、治理
高盐高氨氮污染水体提供一种良好的微生物材料，具有较好的市场应用前景。

附图说明

[0032] 图1是本发明中的Pseudomonas sp. HQXH‑21硝化能力检测结果。

[0033] 图2 是本发明中的Pseudomonas sp. HQXH‑21在不同C/N条件下的硝化能力检测结果。

[0034] 图3是本发明中的Pseudomonas sp. HQXH‑21在不同温度条件下的硝化能力检测结果。

[0035] 图4是本发明中的Pseudomonas sp. HQXH‑21在不同pH条件下的硝化能力检测结果。

具体实施方式

[0036] 本发明提供了一种耐盐异养好氧硝化菌株，并且提供了该菌株的培养方法及其去除废水中的氨氮含量的处理工艺。该菌株是从天津市中国石油大港石化公司采集的活性污
泥中分离得到的。采用16S r RNA鉴定该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.），并命名为
Pseudomonas sp. HQXH‑21，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址：北京
市朝阳区北辰西路1号中国科学院微生物研究所，保藏编号：19106，保藏时间为：2019年12
月6日。

[0037] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

[0038] 实施例一

[0039] 异养硝化菌株的分离与富集筛选步骤如下：

[0040] （1）从天津市中国石油大港石化公司采集活性污泥，利用稀释与平板涂布法将污+
泥样本接种灭菌的硝化培养基中，初始NH4 ‑N浓度为100mg/L，硝化培养基配方如下（g/L）：
氯化铵0.3，醋酸钠1，磷酸氢二钠0.2，氯化钾0.1，氯化钠 10，硫酸镁0.05，和1mL微量元素
溶液，pH为7.0，于30℃摇床上培养，得到分离菌株；

[0041] （2）按（1）中分离到的菌株进行置于培养基中进行NH4+‑N去除实验，NH4+‑N去除率最高的菌株即为所需菌株。

[0042] 实施例二

[0043] 菌株的分子生物学鉴定

[0044] 从活性污泥中筛选出30株菌，选择去除氨氮效果最好的HQXH‑21菌株进行16S r RNA鉴定，通采用16S r RNA鉴定其为假单胞菌（Pseudomonas sp.），并命名为Pseudomonas 
sp.  HQXH‑21，该菌株在LB培养基中的单菌落为规则圆形、湿润，颜色为黄色，不透明，呈粘
稠态。本发明的菌株的16S r RNA鉴定中的序列表见附件。

[0045] 实施例三

[0046] Pseudomonas sp. HQXH‑21的培养方法

[0047] 将上述分离的菌株采用硝化培养基培养，其组成为：氯化铵0.3g/L，醋酸钠1g/L，磷酸氢二钠0.2g/L，氯化钾0.1g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁0.05g/L和1mL微量元素溶液；培养
温度为30℃；pH为7；

[0048] 按5%的接种量接种于硝化培养基，37℃、150 r/min摇床培养；每 48 h 按照10%的体积比更换新鲜的异养硝化培养基；连续培养 30h以上。

[0049] 实施例四

[0050] Pseudomonas sp. HQXH‑21的异养硝化能力检测

[0051] 经过上述对活性污泥中菌种的筛选、分离，得到一株去除氨氮能力较好的菌株——Pseudomonas sp. HQXH‑21，对该菌株进行了异养硝化能力的检测，具体步骤如下：

[0052] （1）制备种子液：将Pseudomonas sp.  HQXH‑21接种于LB培养基（含NaCl 10g/L）中，于30℃、150 r/min条件下恒温震动培养12 h，OD600为0.5；

[0053] （2）收集（1）中制备得到的种子液中的菌体：通过离心将种子液中的菌体和发酵液分开，得到Pseudomonas sp. HQXH‑21的菌体，并用无菌水悬浮，制成菌体重悬液；

[0054] （3）接种：将（2）收集的HQXH‑21的菌体重悬液接种至以氯化铵为唯一氮源的异养硝化培养基中，30℃摇床培养，转速150 r/min；

[0055] （4）取样测定：分别于2 h、6 h、12 h、24 h、30 h、36 h、48 h、60 h测定菌株对氨氮的去除程度、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的累积情况，同步绘制其生长曲线，如图1所示。从图1
上看，该菌株对氨氮的去除能力很强。

[0056] 另外，从图1看，菌株在12‑24 h的时间段内生长态势较好，选择对应的OD600为0.4‑0.8的菌液为菌株菌液。

[0057] 实施例五

[0058] 微生物的生长、繁殖以及代谢活动受外界环境条件的影响较大，如温度、pH、营养物质，不同种类微生物最适生长条件差异非常大，故对影响该菌株脱氮性能的因素做了进
一步探究，以下对探究结果做进一步详细说明。

[0059] （1）不同C/N 对Pseudomonas sp. HQXH‑21脱氮性能的影响

[0060] C/N 是影响微生物脱氮反应的一个重要因素，研究认为C/N 过高会导致硝化反应的速率降低，而C/N 过低会使硝化反应时间过长从而抑制反硝化反应的进行，因此合适的 
C/N 是进行脱氮反应的必要条件之一。本发明中，以氯化钠浓度为10 g/L、初始氨氮浓度为
100 mg/L的硝化培养基为基础，使 C/N 分别为2：1、4：1、6：1、8：1、10：1，将对数生长期的
Pseudomonas sp. HQXH‑21按照2‑10%的接种量接种至上述不同C/N浓度的250 mL硝化培养
基中，于30℃、150 r/min 的恒温震荡箱中培养，分别在不同时间下检测不同C/N条件下
Pseudomonas sp. HQXH‑21的生长情况和脱氮效果，如图2所示。由图2可知，随着硝化培养
基的C/N 的增加，Pseudomonas sp. HQXH‑21的氨氮去除率有显著提高；当硝化培养基的C/
N 增加至10：1时，Pseudomonas sp. HQXH‑21的氨氮去除率达到了90%；在上述过程中，伴随
着TOC去除率的下降。

[0061] （2）不同温度对Pseudomonas sp. HQXH‑21脱氮性能的影响

[0062] 以氯化钠浓度为10 g/L、初始氨氮浓度为100 mg/L的硝化培养基为基础，调整 C/N 为（1）中得到的最佳C/N，pH为7，将对数生长期的Pseudomonas sp. HQXH‑21按照2‑10%的
接种量接种至250 mL硝化培养基中，分别于25℃、30℃、35℃条件下，150 r/min 的恒温震
荡箱中培养，24h后分别检测上清液NH4+‑N 和培养基中OD600随时间的变化，Pseudomonas 
sp.  HQXH‑21的生长情况和脱氮效果，如图3所示。由图3可知，随着温度的增加，
Pseudomonas sp. HQXH‑21的氨氮去除率呈现上升趋势；当温度为30℃时，Pseudomonas 
sp. HQXH‑21的氨氮去除率达到了96%；随着温度的继续增加，该菌株的氨氮去除率呈现下
降趋势。

[0063] （3）不同pH对Pseudomonas sp. HQXH‑21脱氮性能的影响

[0064] 以氯化钠浓度为10 g/L、初始氨氮浓度为100 mg/L的硝化培养基为基础，将对数生长期的Pseudomonas sp. HQXH‑21按照2‑10%的接种量分别接种至pH为5、6、7、8、9、10的
250 mL硝化培养基中，于30℃、150 r/min 的恒温震荡箱中培养，24h后分别检测上清液NH4
+‑N 和培养基中OD600随时间的变化，Pseudomonas sp. HQXH‑21的生长情况和脱氮效果，如
图4所示。由图4可知，随着硝化培养基的pH的增加，Pseudomonas sp. HQXH‑21的氨氮去除
率有显著提高；当硝化培养基的pH增加至7时，Pseudomonas sp. HQXH‑21的氨氮去除率达
到了96.8%；随着硝化培养基pH的继续增加，该菌株的氨氮去除率有所下降。

[0065] 实施例六

[0066] Pseudomonas sp. HQXH‑21在高盐高氨氮废水治理中的应用

[0067] 针对菌株Pseudomonas sp. HQXH‑21的硝化能力，用于降解高盐高氨氮废水治理。按实施例五的方法，选取 OD600为0.8的菌液按照5%（v/v）的接种量接种到高盐高氨氮废水
中，高盐高氨氮废水的初始氨氮浓度控制在100 mg/L左右，pH约为7，含盐量为60g/L，30℃、
150 r/min 条件下培养，36 h 后检测氨态氮和总氮的去除情况，氨态氮的去除率达到85 %
以上，总氮的去除率也可到达70%以上。

[0068] 本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本
发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。