一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用转让专利
申请号 : CN202010093203.5
文献号 : CN111117936B
文献日 : 2021-08-13
发明人 : 杨桂娣 , 陈伟 , 陈雨曦 , 林文雄
申请人 : 福建农林大学
摘要 :
本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用，属于微生物和生物防治技术领域。所述解淀粉芽孢杆菌TBA03的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.19108。该解淀粉芽孢杆菌TBA03是青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的拮抗菌，能有效防治烟草青枯雷尔氏菌病害，为缓解烟草青枯病害提供一种环保、生态、安全的生物防治方法。
权利要求 :
1.一株解淀粉芽孢杆菌TBA03，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌TBA03的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.19108。
2.如权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌TBA03在防治烟草青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的应用。
3.一种含如权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌TBA03的微生物制剂。
4.一种如权利要求3所述微生物制剂在防治烟草青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的应用。
说明书 :
一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物和生物防治技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用。
背景技术
[0002] 烟草是一种叶用经济作物。中国作为烟草生产大国，烟草种植面积、产量和销量均位居世界首位。烟草是一种忌连作的作物，如果在同一片耕地上连续种植烟草，会带来产量
降低、烟叶品质变劣和生育状况变差的现象，严重影响了烟草的产量和质量。据统计，每年
由于烟草连作带来的直接及间接经济损失高达40亿元人民币，严重威胁到我国烟业的可持
续发展。所以，如何缓解烟草连作障碍是当前亟待解决的重要问题，成为国内外同行研究的
热点。
降低、烟叶品质变劣和生育状况变差的现象，严重影响了烟草的产量和质量。据统计，每年
由于烟草连作带来的直接及间接经济损失高达40亿元人民币，严重威胁到我国烟业的可持
续发展。所以，如何缓解烟草连作障碍是当前亟待解决的重要问题，成为国内外同行研究的
热点。
[0003] 当前国内外对于烟草连作障碍的治理主要采用化学试剂法、轮作和间套作法和微生物消减法。往连作烟草土壤中添加肥料等化学试剂具有速效、方便、经济效益高等优点，
但是有效期短，过量或长期使用会污染环境，影响植物品质；轮作和间套作法对消减连作障
碍有着不可忽视的作用，但由于土壤资源匮乏，该方法目前很少应用；微生物消减法通过从
土壤中筛选并添加有益微生物，抑制有害微生物生长，改善烟草生长性状，减轻烟草病害，
具有环保、生态、安全等优点。
但是有效期短，过量或长期使用会污染环境，影响植物品质；轮作和间套作法对消减连作障
碍有着不可忽视的作用，但由于土壤资源匮乏，该方法目前很少应用；微生物消减法通过从
土壤中筛选并添加有益微生物，抑制有害微生物生长，改善烟草生长性状，减轻烟草病害，
具有环保、生态、安全等优点。
[0004] 据报导，土壤微生物结构是影响烟草病害、导致烟草连作障碍的重要因素之一。利用拮抗菌进行植物病害防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明的
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03能显著抑制烟草土壤中青枯雷尔氏
病原菌的生长，可达到缓解烟草青枯病害的目的。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03能显著抑制烟草土壤中青枯雷尔氏
病原菌的生长，可达到缓解烟草青枯病害的目的。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株TBA03及其在缓解烟草青枯病病8
害中的应用。研究表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株TBA03在接种浓度为4.0 × 10
CFU/kg风干土壤时，能够达到显著缓解烟草青枯病害的目的。
害中的应用。研究表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株TBA03在接种浓度为4.0 × 10
CFU/kg风干土壤时，能够达到显著缓解烟草青枯病害的目的。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一株解淀粉芽孢杆菌TBA03，其分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普
通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.19108，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3
号中国科学院微生物研究所，该菌株为青枯雷尔氏病原菌的拮抗菌。
通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.19108，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3
号中国科学院微生物研究所，该菌株为青枯雷尔氏病原菌的拮抗菌。
[0008] 一株解淀粉芽孢杆菌TBA03在防治烟草青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的应用。
[0009] 一种含上述一株解淀粉芽孢杆菌TBA03的微生物制剂。
[0010] 一种含上述一株解淀粉芽孢杆菌TBA03的微生物制剂在防治烟草青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的应用。
[0011] 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03的筛选方案参见图1。先采集中国云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，通过高通量测序并分析，获得
连作烟草土壤病原菌为青枯病菌（Ralstonia）。接着，采用青枯病菌选择性培养基(SMSA培
养基)，富集培养青枯雷尔氏病原菌。设计了青枯雷尔氏病原菌特异性引物，进行PCR扩增
后，获得纯的青枯雷尔氏病原菌，再添加到常规水稻土壤中，验证青枯雷尔氏病原菌对烤烟
K326幼苗的致病性，获得具有导致烟草青枯病害的青枯雷尔氏病原菌，再采用平板对峙法，
筛选出对青枯雷尔氏病原菌具有最佳拮抗作用的拮抗菌，并对筛选出的拮抗菌做形态学和
16S核榶体RNA基因(16S rDNA)等相关鉴定工作，最终得到解淀粉芽孢杆菌TBA03。
连作烟草土壤病原菌为青枯病菌（Ralstonia）。接着，采用青枯病菌选择性培养基(SMSA培
养基)，富集培养青枯雷尔氏病原菌。设计了青枯雷尔氏病原菌特异性引物，进行PCR扩增
后，获得纯的青枯雷尔氏病原菌，再添加到常规水稻土壤中，验证青枯雷尔氏病原菌对烤烟
K326幼苗的致病性，获得具有导致烟草青枯病害的青枯雷尔氏病原菌，再采用平板对峙法，
筛选出对青枯雷尔氏病原菌具有最佳拮抗作用的拮抗菌，并对筛选出的拮抗菌做形态学和
16S核榶体RNA基因(16S rDNA)等相关鉴定工作，最终得到解淀粉芽孢杆菌TBA03。
[0012] 具体步骤如下：
[0013] (1) 土壤采集：2018年08月底，分别采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤和烟区附近未植烟的对照土壤，采用四分法缩分土壤样品，将采集的土壤样
品保存于‑80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。
品保存于‑80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。
[0014] (2) 土壤微生物群落结构多样性分析：分别提取未植烟对照土壤(CS)和连作烤烟根际土壤(CCS)的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度，使用带有
Barcode 的特异性引物(341F: CCTAYGGGRBGCASCAG和543R: ATTACCGCGGCTGCTGG)，进行CS
和CCS基因组DNA的PCR扩增。DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina
Miseq PE300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3‑V4区。测序结
果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌。
Barcode 的特异性引物(341F: CCTAYGGGRBGCASCAG和543R: ATTACCGCGGCTGCTGG)，进行CS
和CCS基因组DNA的PCR扩增。DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina
Miseq PE300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3‑V4区。测序结
果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌。
[0015] (3) 青枯雷尔氏病原菌富集、分离和纯化：称取10 g云南省玉溪市富良棚乡30年‑1
连作烤烟K326根际土壤，溶于装有90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10 稀释液。
‑1
取10 mL 10 稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10
‑2 ‑3 ‑3
稀释液，依次稀释得10 稀释液。吸取50 µL 10 稀释度的土壤稀释液，涂布到SMSA选择性
培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中，培养72 h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌菌落时，
将SMSA固体培养基上清晰可见的细菌菌落挑至装有1 mL SMSA液体培养基的离心管中，30
℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4 ℃冰箱中，保存备用。SMSA培养基参照Elphinstone J
G等的配方进行配制(Elphinstone J G., Hennessy J., Wilson J K., Stead D E.
Sensitivity of different methods for the detection of Ralstonia solanacearum
in potato tuber extracts. Eppo Bulletin, 1996, 26, 663‑678)。
连作烤烟K326根际土壤，溶于装有90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10 稀释液。
‑1
取10 mL 10 稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10
‑2 ‑3 ‑3
稀释液，依次稀释得10 稀释液。吸取50 µL 10 稀释度的土壤稀释液，涂布到SMSA选择性
培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中，培养72 h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌菌落时，
将SMSA固体培养基上清晰可见的细菌菌落挑至装有1 mL SMSA液体培养基的离心管中，30
℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4 ℃冰箱中，保存备用。SMSA培养基参照Elphinstone J
G等的配方进行配制(Elphinstone J G., Hennessy J., Wilson J K., Stead D E.
Sensitivity of different methods for the detection of Ralstonia solanacearum
in potato tuber extracts. Eppo Bulletin, 1996, 26, 663‑678)。
[0016] SMSA培养基配制：称取10 g蛋白胨和l g酪蛋白氨基酸，加入5 mL甘油和995 mL 18.2 MΩ超纯水，制得1 L液体培养基。若配制固体培养基，每1 L液体培养基中需加入15 g
琼脂。121 ℃高压灭菌15 min，冷却至50 ℃后，每升培养基中加入25 mg杆菌肽(1250 U)、
100 mg多粘菌素B硫酸盐(600000 U)、0.5 mg青霉素(825 U)、5 mg氯霉素、5 mg结晶紫和50
mg 2, 3, 5‑氯化三苯基四氮唑(TTC)。
琼脂。121 ℃高压灭菌15 min，冷却至50 ℃后，每升培养基中加入25 mg杆菌肽(1250 U)、
100 mg多粘菌素B硫酸盐(600000 U)、0.5 mg青霉素(825 U)、5 mg氯霉素、5 mg结晶紫和50
mg 2, 3, 5‑氯化三苯基四氮唑(TTC)。
[0017] (4) 青枯雷尔氏病原菌鉴定：
[0018] 参照Kubota R等的描述(Kubota R., Vine B G., Alvarez A M., JenkinsDM. Detection of Ralstonia solanacearum by Loop‑Mediated Isothermal Amplification
[J]. Phytopathology, 2008, 98, 1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物
(F: 5′‑TGGCGGTTGCGGTCTA‑3′和R: 5′‑GATCAGGTCTTCCGGCTCTA‑3′)，PCR扩增 flic基因。
PCR扩增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA
模板3 μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延
伸1 min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度
检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数
据库上进行BLAST比对分析，鉴定该病原菌为青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum)。
[J]. Phytopathology, 2008, 98, 1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物
(F: 5′‑TGGCGGTTGCGGTCTA‑3′和R: 5′‑GATCAGGTCTTCCGGCTCTA‑3′)，PCR扩增 flic基因。
PCR扩增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA
模板3 μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延
伸1 min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度
检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数
据库上进行BLAST比对分析，鉴定该病原菌为青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum)。
[0019] (5) 拮抗菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03富集、分离和纯化：
[0020] S1：通过五点采样法采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，并将采集到的土壤保存在‑80 ℃冰箱中，备用；
[0021] S2：将采集到的土壤研细过筛后，称取10 g土壤，溶于90 mL无菌水中，充分振荡摇匀，置于80 ℃水浴，处理10 min (以杀死不能形成芽孢的菌体)，得到土壤悬浮液；
[0022] S3：将上述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同稀释度的土壤悬浮液；
[0023] S4：吸取稀释度为10‑1、10‑2和10‑3的土壤悬浮液各50 μL，涂布到肉汤(LB)固体培养基上，放置于30 ℃培养箱中，培养24 h；
[0024] S5：挑选培养基上清晰可辨且形态不一的单菌落，富集培养12 h，置于4 ℃冰箱中，保存备用；
[0025] S6：将富集、分离和纯化并于4 ℃冰箱中保存备用的青枯雷尔氏菌用无菌水稀释10倍，制成青枯雷尔氏菌悬浮液。吸取50 μL菌株悬浮液，涂布到LB平板上，在LB平板上均匀
放置2张直径为7 mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20 μL S5中富集培养的菌液，另一块滤
纸上点接20 μL灭菌水作为对照，置于30 ℃培养箱中，培养3 d后，挑选出一株对青枯雷尔
氏菌具有强拮抗效应的细菌，命名为TBA03。将筛选出的强拮抗菌株转接至5 mL LB液体培
养基中扩大培养，30℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4 ℃冰箱中，保存备用。
放置2张直径为7 mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20 μL S5中富集培养的菌液，另一块滤
纸上点接20 μL灭菌水作为对照，置于30 ℃培养箱中，培养3 d后，挑选出一株对青枯雷尔
氏菌具有强拮抗效应的细菌，命名为TBA03。将筛选出的强拮抗菌株转接至5 mL LB液体培
养基中扩大培养，30℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4 ℃冰箱中，保存备用。
[0026] LB购自青岛高科园海博生物技术有限公司，其成分为：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L。每升超纯水中加25 g LB，121 ℃高压灭菌15 min后备用。若
配制固体培养基，每升LB液体培养基中需加入15 g琼脂。
配制固体培养基，每升LB液体培养基中需加入15 g琼脂。
[0027] (6) 拮抗菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03鉴定：
[0028] 采用细菌通用性引物(27F: 5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'和1492R: 5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3')，进行TBA03的16S核榶体RNA基因(16S rDNA)的PCR扩增。PCR扩
增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA模板3
μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1
min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测
后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库
上进行BLAST比对分析，构建进化树，鉴定该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens TBA03)，保藏编号为：CGMCC NO. 19108。
增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA模板3
μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1
min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测
后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库
上进行BLAST比对分析，构建进化树，鉴定该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens TBA03)，保藏编号为：CGMCC NO. 19108。
[0029] 菌学特征如下：菌体呈杆状、形态为长直、两端钝圆、长2 3 μm、宽0.6 0.7 μm，革~ ~
兰氏阳性菌，适宜生长温度20 50℃，适宜pH 3.0‑9.0，兼性好氧，在LB培养基上为乳白色、
~
圆形、突起的菌落。
兰氏阳性菌，适宜生长温度20 50℃，适宜pH 3.0‑9.0，兼性好氧，在LB培养基上为乳白色、
~
圆形、突起的菌落。
[0030] 解淀粉芽孢杆菌TBA03的保藏：解淀粉芽孢杆菌TBA03使用甘油冷冻管‑80 ℃保藏。
[0031] 本发明的优点在于：
[0032] 利用拮抗菌进行植物病害防治是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明分离筛选到的解淀粉芽孢杆菌TBA03能够显著抑制青枯雷尔氏病原菌的生长，降低烟草
青枯病的危害。本发明菌株是从连作烟草土壤中分离筛选得到的，对烟草土壤环境具有较
强的抗性和适应性，在缓解烟草青枯病害方面发挥重要作用。
青枯病的危害。本发明菌株是从连作烟草土壤中分离筛选得到的，对烟草土壤环境具有较
强的抗性和适应性，在缓解烟草青枯病害方面发挥重要作用。
附图说明
[0033] 图1：本发明的技术路线图。
[0034] 图2：本发明的30年连作烤烟K326根际土壤中病原菌在属水平上的相对丰度，CCS代表云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，CS代表烟区附近未植烟的对照土
壤；横坐标代表土壤，纵坐标代表微生物的相对丰度。
壤；横坐标代表土壤，纵坐标代表微生物的相对丰度。
[0035] 图3：本发明的解淀粉芽孢杆菌TBA03与青枯雷尔氏菌的平板对峙图。A：接种解淀粉芽孢杆菌TBA03，B：接种无菌水对照组。
[0036] 图4：本发明的解淀粉芽孢杆菌TBA03的进化树。
[0037] 图5：本发明的解淀粉芽孢杆菌TBA03的扫描电镜照片。
[0038] 图6：本发明的解淀粉芽孢杆菌TBA03防控青枯病菌侵染烟草幼苗结果。A：未添加青枯雷尔氏病原菌和解淀粉芽孢杆菌TBA03的对照土壤，B：同时接种青枯雷尔氏病原菌
8 8
(4.0×10 CFU/kg土壤)和解淀粉芽孢杆菌TBA03(4.0×10 CFU/kg土壤)的烟苗土壤，C：仅
8
接种青枯雷尔氏病原菌(4.0×10 CFU/kg土壤)的烟苗土壤。
8 8
(4.0×10 CFU/kg土壤)和解淀粉芽孢杆菌TBA03(4.0×10 CFU/kg土壤)的烟苗土壤，C：仅
8
接种青枯雷尔氏病原菌(4.0×10 CFU/kg土壤)的烟苗土壤。
具体实施方式
[0039] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发
明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
[0040] 实施例1 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03的筛选及鉴定
[0041] 1、青枯雷尔氏病原菌(Ralstonia solanacearum)的筛选
[0042] (1) 土壤采集：2018年08月底，分别采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤和烟区附近未植烟的对照土壤，采用四分法缩分土壤样品，将采集的土壤样
品保存于‑80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。
品保存于‑80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。
[0043] (2) 土壤微生物群落结构多样性分析：分别提取未植烟对照土壤(CS)和连作烤烟根际土壤(CCS)的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度，使用带有
Barcode 的特异性引物(341F: CCTAYGGGRBGCASCAG和543R: ATTACCGCGGCTGCTGG)，进行CS
和CCS基因组DNA的PCR扩增。DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina
Miseq PE300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3‑V4区。测序结
果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌(图2)。
Barcode 的特异性引物(341F: CCTAYGGGRBGCASCAG和543R: ATTACCGCGGCTGCTGG)，进行CS
和CCS基因组DNA的PCR扩增。DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina
Miseq PE300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3‑V4区。测序结
果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌(图2)。
[0044] (3) 青枯雷尔氏病原菌富集、分离和纯化：
[0045] 称取10 g云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，溶于装有90 mL无‑1 ‑1
菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10 稀释液。取10 mL 10 稀释度的土壤悬浮液至另一
‑2 ‑3
瓶90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10 稀释液，依次稀释得10 稀释液。吸取50
‑3
µL 10 稀释度的土壤稀释液，涂布到SMSA选择性培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中，培养
72 h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌单菌落时，将SMSA固体培养基上清晰可见的细菌
单菌落挑至装有1 mL SMSA液体培养基的离心管中，30℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4
℃冰箱中，保存备用。SMSA培养基参照Elphinstone J G等的配方进行配制(Elphinstone J
G., Hennessy J., Wilson J K., Stead D E. Sensitivity of different methods for
the detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. Eppo
Bulletin, 1996, 26, 663‑678.)。
菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10 稀释液。取10 mL 10 稀释度的土壤悬浮液至另一
‑2 ‑3
瓶90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10 稀释液，依次稀释得10 稀释液。吸取50
‑3
µL 10 稀释度的土壤稀释液，涂布到SMSA选择性培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中，培养
72 h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌单菌落时，将SMSA固体培养基上清晰可见的细菌
单菌落挑至装有1 mL SMSA液体培养基的离心管中，30℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4
℃冰箱中，保存备用。SMSA培养基参照Elphinstone J G等的配方进行配制(Elphinstone J
G., Hennessy J., Wilson J K., Stead D E. Sensitivity of different methods for
the detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. Eppo
Bulletin, 1996, 26, 663‑678.)。
[0046] SMSA培养基配制：称取10 g蛋白胨和l g酪蛋白氨基酸，加入5 mL甘油和995 mL 18.2 MΩ超纯水，制得1 L液体培养基。若配制固体培养基，每1 L液体培养基中需加入15 g
琼脂。121 ℃高压灭菌15 min，冷却至50 ℃后，每升培养基中加入25 mg杆菌肽(1250 U)、
100 mg多粘菌素B硫酸盐(600000 U)、0.5 mg青霉素(825 U)、5 mg氯霉素、5 mg结晶紫和50
mg 2, 3, 5 ‑ 氯化三苯基四氮唑(TTC)。
琼脂。121 ℃高压灭菌15 min，冷却至50 ℃后，每升培养基中加入25 mg杆菌肽(1250 U)、
100 mg多粘菌素B硫酸盐(600000 U)、0.5 mg青霉素(825 U)、5 mg氯霉素、5 mg结晶紫和50
mg 2, 3, 5 ‑ 氯化三苯基四氮唑(TTC)。
[0047] (4) 青枯雷尔氏病原菌鉴定：
[0048] 参照Kubota R等的描述(Kubota R., Vine B G., Alvarez A M., JenkinsDM. Detection of Ralstonia solanacearum by Loop‑Mediated Isothermal Amplification
[J]. Phytopathology, 2008, 98, 1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物
(F: 5′‑TGGCGGTTGCGGTCTA‑3′和R: 5′‑GATCAGGTCTTCCGGCTCTA‑3′)，PCR扩增 flic基因。
PCR扩增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA
模板3 μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延
伸1 min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度
检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数
据库上进行BLAST比对分析，鉴定该病原菌为青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum)。
[J]. Phytopathology, 2008, 98, 1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物
(F: 5′‑TGGCGGTTGCGGTCTA‑3′和R: 5′‑GATCAGGTCTTCCGGCTCTA‑3′)，PCR扩增 flic基因。
PCR扩增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA
模板3 μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延
伸1 min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度
检测后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数
据库上进行BLAST比对分析，鉴定该病原菌为青枯雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum)。
[0049] 2、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03的筛选
[0050] 本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03从云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤分离获得。
[0051] (1) TBA03培养基的选择
[0052] 使用LB肉汤培养基（购自青岛高科园海博生物技术有限公司），其成分为：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L，每1 L超纯水中加25 g LB肉汤粉末（若配
制固体培养基，每1 L液体培养基中需加入15 g琼脂）。经过121 ℃，高压灭菌15 min后使
用。
制固体培养基，每1 L液体培养基中需加入15 g琼脂）。经过121 ℃，高压灭菌15 min后使
用。
[0053] (2) TBA03富集、分离和纯化
[0054] S1：通过五点采样法采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，并将采集到的土壤保存在‑80 ℃冰箱中，备用；
[0055] S2：将采集到的土壤研细过筛后，称取10 g土壤，溶于90 mL无菌水中，充分振荡摇匀，置于80 ℃水浴，处理10 min (以杀死不能形成芽孢的菌体)，得到土壤悬浮液；
[0056] S3：将上述土壤悬浮液10倍梯度稀释，得到不同稀释度的土壤悬浮液；
[0057] S4：吸取稀释度为10‑1、10‑2和10‑3的土壤悬浮液各50 μL，涂布到LB肉汤固体培养基上，放置于30 ℃培养箱中，培养24 h；
[0058] S5：挑选培养基上清晰可辨且形态不一的单菌落，富集培养12 h，置于4 ℃冰箱中，备用；
[0059] S6：将筛选所得青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)转接至SMSA液体培养基中，过夜培养(30℃，200 rpm)后的悬浮液用无菌水稀释10倍，吸取50 μL菌株悬浮液，涂布
到LB平板上，在LB平板上均匀放置2张直径为7 mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20 μL S5
中富集培养的菌液，另一块滤纸上点接20 μL灭菌水作为对照，置于30 ℃培养箱中，培养3
d后，挑选出一株对青枯雷尔氏菌具有强拮抗效应的细菌，命名为TBA03。将筛选出的强拮抗
菌株转接至5 mL LB液体培养基中扩大培养，30℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4 ℃冰
箱中，保存备用。
到LB平板上，在LB平板上均匀放置2张直径为7 mm的滤纸片，其中1张滤纸上点接20 μL S5
中富集培养的菌液，另一块滤纸上点接20 μL灭菌水作为对照，置于30 ℃培养箱中，培养3
d后，挑选出一株对青枯雷尔氏菌具有强拮抗效应的细菌，命名为TBA03。将筛选出的强拮抗
菌株转接至5 mL LB液体培养基中扩大培养，30℃摇床 (200 rpm) 过夜培养，置于4 ℃冰
箱中，保存备用。
[0060] LB购自青岛高科园海博生物技术有限公司，其成分为：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L。每升超纯水中加25 g LB，121 ℃高压灭菌15 min后备用。若
配制固体培养基，每升LB液体培养基中需加入15 g琼脂。
配制固体培养基，每升LB液体培养基中需加入15 g琼脂。
[0061] (3) TBA03抑菌效果检测
[0062] 将上述步骤中富集、分离、纯化所得并保存于4℃冰箱中的青枯雷尔氏菌用无菌水稀释10倍，制成悬浮液。吸取50 μL青枯雷尔氏菌悬浮液，涂布到LB平板上，采用平板对峙法
筛选青枯雷尔氏菌的拮抗菌。首先，在平板上均匀放置2张直径为7 mm的滤纸片，其中1张滤
纸上点接20 μL富集培养的TBA03悬浮液，另一块滤纸上点接20 μL灭菌水作为对照。平行3
组。平板放置于30 ℃培养箱中，培养3天后发现，解淀粉芽孢杆菌TBA03能够高效抑制青枯
病菌的生长（图3）。
筛选青枯雷尔氏菌的拮抗菌。首先，在平板上均匀放置2张直径为7 mm的滤纸片，其中1张滤
纸上点接20 μL富集培养的TBA03悬浮液，另一块滤纸上点接20 μL灭菌水作为对照。平行3
组。平板放置于30 ℃培养箱中，培养3天后发现，解淀粉芽孢杆菌TBA03能够高效抑制青枯
病菌的生长（图3）。
[0063] (4) TBA03鉴定
[0064] 采用细菌通用性引物(27F: 5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'和1492R: 5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3')，进行TBA03的16S核榶体RNA基因(16S rDNA)的PCR扩增。PCR扩
增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA模板3
μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1
min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测
后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库
上进行BLAST比对分析，构建进化树(图4)，鉴定该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens TBA03)。
增体系(20μL)为：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水5 μL，DNA模板3
μL。扩增程序为：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1
min，30个循环，继续72 °C延伸10 min。PCR产物用1% (m/v)琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测
后，送福州伯尚生物科技有限公司测序，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库
上进行BLAST比对分析，构建进化树(图4)，鉴定该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens TBA03)。
[0065] 解淀粉芽孢杆菌TBA03菌株的菌学特征如下：菌体呈杆状、形态为长直、两端钝圆、长2 3 μm、宽0.6 0.7 μm，革兰氏阳性菌，适宜生长温度20 50℃，适宜pH 3.0‑9.0，兼性
~ ~ ~
好氧，在LB培养基上为乳白色、圆形、突起的菌落(图5)。
~ ~ ~
好氧，在LB培养基上为乳白色、圆形、突起的菌落(图5)。
[0066] 解淀粉芽孢杆菌TBA03的保藏：解淀粉芽孢杆菌TBA03使用甘油冷冻管‑80 ℃保藏。
[0067] 解淀粉芽孢杆菌TBA03，其分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TBA03，于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 19108。
微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 19108。
[0068] 实施例2解淀粉芽孢杆菌TBA03防控青枯雷尔氏病原菌侵害烤烟K326幼苗效果评价
[0069] 将4 5叶期K326烟苗移栽到7 cm × 7 cm × 8 cm (长×宽×高)的小方盆中(1~
株/盆)，每盆加常规稻田土壤250 g，移栽后第5天，进行以下三种处理。处理1：不加菌；处理
8
2：采用灌根法，在烟草根部接种1 mL浓度为1×10 CFU/mL的青枯雷尔氏菌菌悬液。接种1
8
d后，继续在烟草根部接种1 mL浓度为1×10 CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌TBA03菌悬液；处理
8
3：只在烟草根部接种1 mL浓度为1×10 CFU/mL青枯雷尔氏菌菌悬液。以上共3个处理，每
个处理3次重复(表1)。放置于24 25 ℃光照培养箱中培养，持续观察病原菌侵染情况。培养
~
30天后，发现不添加致病菌和拮抗菌的实验处理组1中(图6 A)，K326烟草幼苗长势良好，而
在只添加致病菌的实验处理组3中(图6 C)，K326烟草幼苗植株矮小、叶片发黄枯萎，表明青
枯雷尔氏菌显著抑制了K326烟草幼苗的生长；但在同时添加致病菌和拮抗菌的实验处理组
2中(图6 B)， K326烟草植株长势虽然没有实验处理组1好，却显著优于致病菌毒害处理组
3，表明解淀粉芽孢杆菌TBA03显著缓解了青枯雷尔氏病原菌对K326烟草植株的毒害作用。
综上可见，本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌TBA03(保藏号为：CGMCC NO.19108)能够有效防
控青枯雷尔氏病原菌对烟草的毒害，在该领域具有广阔的应用前景。
株/盆)，每盆加常规稻田土壤250 g，移栽后第5天，进行以下三种处理。处理1：不加菌；处理
8
2：采用灌根法，在烟草根部接种1 mL浓度为1×10 CFU/mL的青枯雷尔氏菌菌悬液。接种1
8
d后，继续在烟草根部接种1 mL浓度为1×10 CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌TBA03菌悬液；处理
8
3：只在烟草根部接种1 mL浓度为1×10 CFU/mL青枯雷尔氏菌菌悬液。以上共3个处理，每
个处理3次重复(表1)。放置于24 25 ℃光照培养箱中培养，持续观察病原菌侵染情况。培养
~
30天后，发现不添加致病菌和拮抗菌的实验处理组1中(图6 A)，K326烟草幼苗长势良好，而
在只添加致病菌的实验处理组3中(图6 C)，K326烟草幼苗植株矮小、叶片发黄枯萎，表明青
枯雷尔氏菌显著抑制了K326烟草幼苗的生长；但在同时添加致病菌和拮抗菌的实验处理组
2中(图6 B)， K326烟草植株长势虽然没有实验处理组1好，却显著优于致病菌毒害处理组
3，表明解淀粉芽孢杆菌TBA03显著缓解了青枯雷尔氏病原菌对K326烟草植株的毒害作用。
综上可见，本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌TBA03(保藏号为：CGMCC NO.19108)能够有效防
控青枯雷尔氏病原菌对烟草的毒害，在该领域具有广阔的应用前景。
[0070] 表1 试验设计表
[0071]
[0072] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，任何在本发明申请专利范围之内所作的修改变化与修饰，均属本发明的涵盖范围。