白血病生物标志物LINC02033及其应用

摘要

本发明提供了一种白血病生物标志物LINC02033及其应用。通过实验检测发现患有急性髓性白血病的患者外周血中的LINC02033的表达量显著高于正常人外周血中的LINC02033的表达量，而完全恢复的患者则与正常人外周血中的LINC02033表达量无统计学差异，说明LINC02033可以作为急性髓性白血病患者诊断的标志物。而且，ROC曲线结果显示，LINC02033作为标志物具有优异的诊断价值。此外，本发明证明通过siRNA抑制LINC02033表达能够抑制急性髓性白血病细胞HL‑60的细胞增殖速率，因此，LINC02033的siRNA抑制剂可以用于制备用于治疗急性髓性白血病的药物。

权利要求

1.一种长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA为LINC02033。

2.长链非编码RNA LINC02033在制备用于诊断急性髓性白血病的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括利用RT-PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、芯片检测LINC02033所使用的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LINC02033引物的正向序列如SEQ ID NO.2所示，所述LINC02033引物的反向序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物用于特异性检测LINC02033表达。

5.一种用于急性髓性白血病诊断的LINC02033荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括管家基因GAPDH引物对，逆转录试剂，SYBR Green荧光染料，PCR缓冲液，DEPC水。

7.LINC02033基因抑制剂在制备治疗急性髓性白血病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述LINC02033基因抑制剂为抑制LINC02033的siRNA。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.6所示，siRNA的反义链如SEQ ID NO.7所示。

10.LINC02033基因抑制剂在制备抑制急性髓性白血病细胞增殖药物中的应用。

说明书

白血病生物标志物LINC02033及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及白血病生物标志物LINC02033及其应用。

背景技术

[0002] 白血病是造血干细胞水平异常转化的一类克隆性恶性血液病。白血病细胞由于分化停滞、增殖失控、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量的克隆增生，并且浸润其他组织和器官。白血病的死亡率在男性恶性肿瘤中居第六位，在女性恶性肿瘤中居第八位。急性髓性白血病是白血病的一种，包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病，是最常见的成人白血病之一。近年来，随着环境污染的不断加剧，急性髓性白血病的发病率明显升高。因此，实现急性髓性白血病患者的快速诊断对于实现患者的早发现，早治疗具有重要的意义。

[0003] 长链非编码RNA是缺乏开放阅读框，长度约为200nt-100000bp的一种不具有编码蛋白质能力的RNA。目前认为，长链非编码RNA已被证明参与基因表达调控的几乎每一个层面，涉及转录调控、细胞内物质运输和染色体重塑，并且参与细胞分化、生长发育、应激反应以及疾病发生发展等多种生物学进程。目前已有研究显示，长链非编码RNA不仅参与调节机体的生理过程，在疾病治疗前后对某些异常表达的长链非编码RNA表达水平的检测也成为目前肿瘤诊断及预后的重要部分，同时，长链非编码RNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。目前，长链非编码在白血病中的研究还处于起始阶段，发明新的白血病相关长链非编码RNA对于实现白血病的快速临床诊断、靶向治疗均具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的其一在于提供一种快速诊断急性髓性白血病的LINC02033试剂盒，其二在于提供一种用于制备治疗急性髓性白血病的LINC02033基因抑制剂。

[0005] 本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC02033，所述LINC02033的转录本为NR_147141.1。

[0006] 此外，本发明提供了一种长链非编码RNA LINC02033在制备用于诊断急性髓性白血病的试剂盒中的应用。

[0007] 优选地，所述试剂盒包括利用RT-PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、芯片检测LINC02033所使用的引物。

[0008] 优选地，所述LINC02033引物的正向序列如SEQ ID NO.2所示，所述LINC02033引物的反向序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物用于特异性检测LINC02033表达。

[0009] 此外，本发明提供了一种用于急性髓性白血病诊断的LINC02033荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括所述LINC02033引物。

[0010] 优选地，所述试剂盒还包括管家基因GAPDH引物对，逆转录试剂，SYBR Green荧光染料，PCR缓冲液，DEPC水。

[0011] 此外，本发明提供了一种LINC02033基因抑制剂在制备治疗急性髓性白血病药物中的应用。

[0012] 优选地，所述LINC02033基因抑制剂为抑制LINC02033的siRNA。

[0013] 优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

[0014] 除此之外，本发明提供了一种LINC02033基因抑制剂在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用。

[0015] 本发明的有益效果在于：

[0016] 1.本发明通过实验检测发现患有急性髓性白血病的患者外周血中的LINC02033的表达量显著高于正常人外周血中的LINC02033的表达量，而完全恢复的患者则与正常人外周血中的LINC02033表达量无统计学差异，而且，ROC曲线显示，LINC02033作为标志物具有优异的诊断价值，因此，LINC02033可以作为急性髓性白血病患者诊断的标志物，用于制备检测急性髓性白血病的诊断试剂盒。相较于普通化学检测方法，本发明提供的检测方法速度更快，检测效果更灵敏。

[0017] 此外，本发明证明，通过siRNA抑制LINC02033表达能够抑制急性髓性白血病细胞HL-60的细胞增殖速率，并能够抑制促增殖蛋白CyclinD1表达和促进抑增殖蛋白P21的表达。因此，LINC02033的siRNA抑制剂可以用于制备用于治疗急性髓性白血病的药物。

附图说明

[0018] 图1 LINC02033在白血病组，正常组，完全恢复组中的差异表达情况。

[0019] 图2 正常组和白血病组之间的ROC曲线。

[0020] 图3 白血病组和完全恢复组之间的ROC曲线。

[0021] 图4 抑制LINC02033对于急性髓性白血病细胞HL-60细胞增殖的速率的影响。

[0022] 图5 抑制LINC02033对于促增殖蛋白cyclinD1和抑增殖蛋白P21蛋白表达的影响。

具体实施方式

[0023] 实施例1

[0024] 检测LINC02033在正常组，白血病组和完全恢复组中的差异表达情况[0025] 1.材料

[0026] 30例急性髓性白血病患者外周血样本，30例正常人外周血样本，10例完全恢复患者外周血样本来自于北京大学肿瘤医院。所有样本均通过医院伦理委员会审查和批准，且所有样本来源均签署知情同意书。

[0027] 所有急性髓性白血病患者均通过病理诊断确认，且患者未患有其他肿瘤，并且未采取放疗或化疗等治疗。

[0028] 2. RNA提取

[0029] （1）采用Ficoll法分离单个核细胞；

[0030] （2）加入1ml Trizol充分吹打混匀，室温静置5min；

[0031] （3）加入200μl氯仿，震荡离心管，充分混匀后，室温放置10min；

[0032] （4）置于离心机中，12000rpm/min 离心15min；

[0033] （5）将上层水相转移至另一离心管中，加入等体积预冷异丙醇，上下颠倒混匀，混匀后冰上静置10min；

[0034] （6）置于离心机中，4℃，12000rpm离心10分钟；

[0035] （7）小心去除上清，加入1ml 75%乙醇悬浮沉淀；

[0036] （8）置于离心机中，4℃，12000rpm离心5分钟；

[0037] （9）小心去除乙醇液体，室温下放置5min充分干燥沉淀，加入DEPC水溶解沉淀；

[0038] （10）使用紫外分光光度计测量RNA的纯度和浓度。

[0039] 3.荧光定量PCR检测

[0040] 参照Takara试剂盒

[0041] （1）去除基因组DNA

[0042] 反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1μl，Total RNA 1μg，RNase Free dH2O up to 10μl；

[0043] 反应条件42℃ 2min，4℃。

[0044] （2）逆转录反应

[0045] 反应体系：步骤（1）反应液 10μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl ，RT Primer Mix 1.0μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μl，RNase Free dH2O 4.0μl。

[0046] 反应条件：37℃ 15分钟；85℃ 5s；4℃。

[0047] （3）PCR检测

[0048] 反应体系：SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10μl，正向引物0.4μl，反向引物 0.4μl，cDNA模板 2μl，ddH2O 7.2μl。

[0049] 反应条件：95℃ 5min；95℃ 10s，58℃ 30s，72℃ 30s,35个循环；75℃，30s。

[0050] LINC02033

[0051] 正向引物序列5’- TGTGTCCCGGGTCATCTGTA-3’（SEQ ID NO.2）[0052] 反向引物序列5’- TCAGGGGAAGCCAGTATCCA-3’（SEQ ID NO.3）[0053] GAPDH

[0054] 正向引物序列5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’（SEQ ID NO.4）

[0055] 反向引物序列5’-ATCTAGGAAAAGCATCACCCGG-3’（SEQ ID NO.5）[0056] 实验结果

[0057] 1. LINC02033在正常组，白血病组，完全缓解组的表达量差异

[0058] 使用2-△△Ct方法处理得到的数据，计算LINC02033的相对表达水平。结果如图1所示，从图1可以看出，相较于正常组，白血病组（3.34±0.23）的LINC02033表达量显著上调，差异具有统计学意义。

[0059] 相较于正常组，完全缓解组（1.349±0.13）的LINC02033表达量有一定程度的上调，但是差异无统计学意义。

[0060] 完全缓解组相较于白血病组，LINC02033表达量显著下调，差异具有统计学意义。

[0061] 2. LINC02033对于白血病的早期诊断和预后诊断的诊断价值

[0062] 正常组和白血病组的ROC曲线如图2所示，其AUC值为0.9339， Std. Error 0.02962，95% confidence interval 0.8758 - 0.9920，P ＜0. 0001,表明检测LINC02033表达量对于白血病患者的早期诊断具有一定的价值。

[0063] 正常组和完全恢复组的ROC曲线如图3所示，其AUC值为0.8950，Std. Error 0.05008，95% confidence interval 0.7968 - 0.9932，P ＜0. 0001,表明检测LINC02033表达量对于白血病患者的预后诊断具有一定的价值。

[0064] 实施例2

[0065] 抑制LINC02033对于急性髓性白血病细胞增殖速率的影响

[0066] 1.RNA干扰

[0067] （1）转染前一天将HL-60细胞的培养基更换为不含有抗生素的培养基；

[0068] （2）24h后，弃去培养基，每孔加入1.6ml无血清培养基；

[0069] （3）取2μl siRNA（20μM）加入400μl无血清培养基中，混匀后，加入4μl Lipofection2000混合，室温孵育20min；

[0070] （4）将孵育好的转染复合液加入到1.6ml无血清培养基中，置于 37℃，5% CO2细胞培养箱中；

[0071] （5）培养6小时后，换成含有血清的培养基。

[0072] si-LINC02033序列为

[0073] 正义链5'-AAAGUCUAUCGGGUUAAACAG-3’（SEQ ID NO.6）

[0074] 反义链5'-GUUUAACCCGAUAGACUUUAA-3’（SEQ ID NO.7）

[0075] 由上海吉玛公司合成，si-NC由公司提供。

[0076] 2.CCK-8检测

[0077] （1）将5×103个转染si-NC和si- LINC02033的细胞分别接种到96孔板中，每组设置3个复孔；

[0078] （2）在接种后的24h、48h和72h时加入10μlCCK-8，放入细胞培养箱孵育4小时后。使用酶标仪检测OD值。

[0079] 实验结果

[0080] 通过图4可以看出，转染si- LINC02033的细胞相较于转染si-NC的细胞增殖速率明显降低，在72h的时候，si-NC组的OD值为1.276±0.083，而si- LINC02033的OD值为0.787±0.065,差异具有统计学意义。说明通过抑制LINC02033能够抑制急性髓性白血病HL-60细胞的增殖速率。

[0081] 实施例3

[0082] 抑制LINC02033对于急性白血病HL-60细胞中抑增殖蛋白P21以及促增殖蛋白Cyclin-D1的影响。

[0083] 1.RNA干扰

[0084] 方法同实施例2

[0085] 2.蛋白质提取

[0086] （1）六孔板中加入100μl蛋白裂解液，冰上放置10min，用细胞刮刀将细胞刮下并转移至离心管中；

[0087] （2）将离心管置于低温离心机中，12000g，4℃，离心15min，取上清；

[0088] （3）参照BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入5×loading buffer调整为2μg/μl，沸水煮5min，得到蛋白样品。

[0089] 3.Western Blot检测

[0090] （1）配置10%的分离胶和浓缩胶，置于电泳槽中，加入新的电泳缓冲液；

[0091] （2）加入si-NC组和si- LINC02033,每孔加入10μl；

[0092] （3）90V电泳，待电泳条带完全跑出浓缩胶的时候，将电压调整到120V，至溴酚蓝完全跑出分离胶；

[0093] （4）按照自下而上海绵-滤纸-分离胶-NC膜-滤纸-海绵的顺序放置转膜夹，250mA转膜90分钟；

[0094] （5）取出NC膜,置于5%脱脂奶粉中，封闭1h；

[0095] （6）剪膜，孵育P21,Cyclin-D1和β-actin一抗，4℃，摇床封闭过夜；

[0096] （7）TBST洗膜3次，每次10min；

[0097] （8）孵育二抗，室温摇床孵育1h；

[0098] （9）TBST洗膜3次，每次10min；

[0099] （10）暗室曝光。

[0100] 实验结果

[0101] 与si-NC组相比，si- LINC02033组的抑增殖蛋白P21表达发生上调，而促增殖蛋白Cyclin-D1表达发生下调，说明通过抑制LINC02033能够抑制白血病细胞HL-60的增殖。

[0102] 上述实验证明：针对LINC02033的siRNA能够抑制急性髓性白血病细胞HL-60的增殖，因此，其可以用于制备治疗急性髓性白血病细胞药物。