金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化及筛选抑制剂的应用

摘要

本发明公开了金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化及筛选抑制剂的应用。本发明以溶菌酶为模型蛋白，研究发现，金纳米簇的荧光强度随着溶菌酶纤维浓度的增大而增强，并且在一定的浓度范围内溶菌酶纤维浓度与荧光强度呈线性关系，因此可将金纳米簇应用于生物样品中蛋白质淀粉样纤维化过程的检测。与利用传统有机染料硫黄素T(ThT)的荧光法相比，金纳米簇具有低毒性、大Stocks位移的优点，且金纳米簇的荧光信号随蛋白质纤维化的程度变化灵敏，可以更灵敏地检测蛋白质由纤维化初期到对数生长期的转变，可更有效地研究蛋白质淀粉样纤维化过程和机理，并可用于筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂。

权利要求

1.金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的用途，其特征在于：

（1）将生物样品孵育使其中淀粉样蛋白质完全纤维化；

（2）取步骤（1）中完全纤维化的样品，用超纯水稀释后加入金纳米簇，并用超纯水定容，然后检测体系的荧光强度，绘制600nm处的荧光强度随淀粉样纤维浓度变化的标准曲线；

（3）将生物样品用超纯水稀释后加入金纳米簇，并用超纯水定容，然后检测体系的荧光强度，根据600nm处的荧光强度结合步骤（2）的标准曲线即可获得生物样品中淀粉样纤维的浓度。

2.根据权利要求1所述的金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的用途，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中，所述金纳米簇在检测体系中的体积浓度为8%～12%。

3.根据权利要求1所述的金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的用途，其特征在于：所述淀粉样蛋白质选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α‑突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的用途，其特征在于：所述生物样品选自组织样品、细胞样品、血液、唾液、脊髓液、淋巴液、阴道液、精液和尿液。

说明书

金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化及筛选抑制

剂的应用

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白淀粉样纤维化检测技术领域，具体涉及金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的应用，以及金纳米簇在筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂中的应用。

背景技术

[0002] 阿尔兹海默症、亨廷顿症等老年疾病越来越受到人们的关注。临床研究表明，这些老年病症的一个很重要的病因是由于体内蛋白质的变性聚集，即蛋白的淀粉样纤维化。例如，当体内胰岛素变性聚集时，就会导致Ⅱ型糖尿病的发生。因此，研究蛋白质纤维化的机理和筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂在疾病的治疗和预防中都有极其重大的意义。但是，淀粉样纤维的形成机理至今仍有很大争议，先后提出了多种形成机理，其中，核依赖模型是其中比较有代表性的一种。核依赖模型认为蛋白质浓度达到一个临界值后出现滞后期，先成核，再逐渐形成结构规律的淀粉样纤维。蛋白质在滞后期，单体形成寡聚体然后聚合形成晶核；在生长期，晶核与单体蛋白进一步聚集生成了原纤维；在成熟期原纤维进一步生长，最终生成了具有β‑折叠的成熟纤维。虽然这一机理被广泛接受，但是，目前仍没有确凿的证据证实这一机理。除此之外，在制定疾病预防和治疗方案时，蛋白纤维化抑制剂有着十分重要的作用。因此，建立一种全新的蛋白质淀粉样纤维化过程的检测方法，对探究这些老年性疾病的发生机制和筛选蛋白质纤维化的抑制剂十分重要。因为功能蛋白在人体中的含量极低，所以通常采用模型蛋白进行研究，例如鸡蛋清溶菌酶、牛胰岛素、β‑乳球蛋白等。而鸡蛋清溶菌酶因为其价格低廉、易纤维化的特点以及与人体溶菌酶结构的相似性，最常应用于蛋白纤维化的研究。

[0003] 随着科学技术的发展，检测蛋白质淀粉样纤维化的方法越来越多，其中包括硫黄素T(ThT)荧光标记检测法、ANS荧光标记检测法、圆二色光谱法、透射电子显微镜、红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁、高效液相、散射法、原子力显微镜、偏光显微镜等等。虽然方法众多，但是这些方法都存在一些不便，例如仪器昂贵，操作步骤复杂，需要专业的操作人员，耗时长等，这将会浪费很大的人力财力物力。但是，荧光检测方法操作简便，在这一系列方法中占有很大的优势，成为了最受欢迎的检测方法之一，尤其是ThT荧光标记检测法一直沿用至今，是一种广泛应用的研究方法。但它也存在一些不足之处，例如可能会产生假阳性信号、较低的选择性和灵敏度，Stocks位移小、无法识别蛋白质的低聚体等。因此有很多工作者在荧光检测法中继续提出了一些新型的荧光探针并将其应用于蛋白质纤维化过程的检测。

[0004] 随着聚集诱导发光效应和分子转子等概念的提出，聚集诱导发光现象受到了广泛的关注，聚集诱导发光分子在溶液状态下荧光很弱甚至是不发荧光的，但是当它们分散在不良溶剂中或者是在固体状态时，却会发出明显的荧光。基于这样的性质，一些研究学者开始将一些分子转子应用于蛋白质淀粉样纤维化的检测，例如4‑[2‑(2‑萘基)(E)乙烯基)苄基三苯基溴化磷、2(四苯基磷)四苯基乙烯等等，这一类的检测方法都是基于有机小分子的聚集诱导荧光来实现的。当它们与蛋白质纤维结合之后，其荧光强度会有所增强，而且随着蛋白质孵育时间的增加，其荧光强度是在不断增强后趋于不变的，直至纤维化过程结束，但这些方法依旧是小分子类的探针，其合成方法都较为繁琐。研究表明，新型荧光探针金纳米簇也具有聚集诱导荧光增强效应，而且金纳米簇具有低毒性、高稳定性、大的Stokes位移、低能红光发射、荧光寿命长且具有良好的生物相容性等优势。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为金纳米簇提供新的应用。

[0006] 金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的用途，具体检测方法如下：

[0007] 1、将生物样品孵育使其中淀粉样蛋白质完全纤维化。

[0008] 2、取步骤1中完全纤维化的样品，用超纯水稀释后加入金纳米簇，并用超纯水定容，然后检测体系的荧光强度，绘制600nm处的荧光强度随淀粉样纤维浓度变化的标准曲线。

[0009] 3、将生物样品用超纯水稀释后加入金纳米簇，并用超纯水定容，然后检测体系的荧光强度，根据600nm处的荧光强度结合步骤2的标准曲线即可获得生物样品中淀粉样纤维的浓度。

[0010] 上述步骤2和步骤3中，优选所述金纳米簇在检测体系中的体积浓度为8％～12％。

[0011] 上述的淀粉样蛋白质选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α‑突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

[0012] 上述的生物样品选自组织样品、细胞样品、血液、唾液、脊髓液、淋巴液、阴道液、精液和尿液。

[0013] 金纳米簇在筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂中的用途，具体方法为：将未加抑制剂和加入抑制剂的生物样品分别进行孵育，在不同孵育时间下取样，将所取样品用超纯水稀释后加入金纳米簇并检测荧光，绘制荧光强度随孵育时间变化的生长曲线，将未加抑制剂和加入抑制剂的生长曲线进行对比，若在相同孵育时间下，加入抑制剂后荧光强度明显降低，说明该抑制剂对生物样品中蛋白质的淀粉样纤维化有抑制作用。

[0014] 本发明的有益效果如下：

[0015] 1、本发明基于金纳米簇荧光检测蛋白质淀粉样纤维化过程，金纳米簇的荧光强度随着纤维化蛋白质浓度的增大而增强，并且在一定的浓度范围内纤维化蛋白质浓度与荧光强度呈线性关系。所述金纳米簇具有低毒性、高稳定性、大的Stokes位移、低能红光发射、荧光寿命长且具有良好的生物相容性等优势。其中，以溶菌酶为模型蛋白进行研究时，发现随着溶菌酶孵育时间的增加，金纳米簇的荧光强度逐渐增强，显示溶菌酶在纤维化过程中经历了成核期、生长期和平台期三个阶段，与利用ThT检测结果一致，但本发明方法检测灵敏度高，可以更早地检测到成熟的纤维，这将为检测疾病和制定预防疾病方案争取更多的时间。

[0016] 2、本发明方法还可用于筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂。利用该方法研究了抗坏血酸对蛋白质纤维化的抑制效应，表明该方法可用于筛选蛋白质纤维化的抑制剂。与利用传统有机染料硫黄素T(ThT)的荧光法相比，金纳米簇的荧光强度具有低毒性、大Stocks位移的优点，且金纳米簇的荧光增强对纤维化溶菌酶的程度变化灵敏，可以更灵敏地检测溶菌酶由纤维化初期到对数生长期的转变，可更有效地研究蛋白质淀粉样纤维化过程和机理，并可用于筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂。

附图说明

[0017] 图1是金纳米簇检测纤维化溶菌酶的对照实验。

[0018] 图2是金纳米簇与溶菌酶纤维结合前后的荧光寿命图。

[0019] 图3是加入不同浓度溶菌酶纤维时金纳米簇的荧光光谱图。

[0020] 图4是金纳米簇荧光强度的变化量随加入溶菌酶纤维浓度的关系。

[0021] 图5是金纳米簇荧光强度随溶菌酶孵育时间的变化关系。

[0022] 图6是金纳米簇和ThT荧光强度随溶菌酶孵育时间的变化关系。

[0023] 图7是加入不同浓度的抑制剂后金纳米簇荧光强度随溶菌酶纤维孵育时间的变化。

[0024] 图8是加入不同浓度的抑制剂后ThT荧光强度随溶菌酶纤维孵育时间的变化。

具体实施方式

[0025] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

[0026] 实施例1

[0027] 金纳米簇在检测生物样品中蛋白质淀粉样纤维化的应用

[0028] 以溶菌酶为模型蛋白，具体检测方法如下：

[0029] 1、准确称量2mg溶菌酶和0.0176g NaCl于离心管中，然后向其中加入2mL pH＝2的盐酸溶液并震荡使其充分溶解，再向其中加入20μL 5mM NaN3水溶液，使溶菌酶、NaCl、NaN3的最终浓度分别为1mg/mL、150mM、和0.05mM。最后用封口膜将离心管封口，置于65℃的震荡水浴锅中，震荡速度60rpm，孵育120h使溶菌酶完全纤维化。待溶菌酶纤维化过程结束后，取出溶菌酶纤维样品并置于4℃冰箱内保存。

[0030] 为了证明金纳米簇可用于检测溶菌酶的纤维化，首先进行了对照实验。样品1是将40μL未孵育的溶菌酶样品用超纯水稀释至500μL；样品2是将孵育好的溶菌酶纤维样品取40μL用超纯水稀释至500μL；样品3是50μL金纳米簇(尺寸大约在2.7nm)加入450μL超纯水中；
样品4是40μL未孵育溶菌酶样品和50μL金纳米簇同时加入到410μL超纯水中；样品5是40μL孵育好的溶菌酶纤维样品和50μL金纳米簇同时加入到410μL超纯水中。各样品中溶菌酶或溶菌酶纤维的最终浓度为0.08mg/mL。检测各样品的荧光，设置激发波长365nm，扫描波段
500～700nm，激发狭缝和发射狭缝均设置为3nm。

[0031] 如图1所示，未孵育的溶菌酶和孵育好的溶菌酶纤维在365nm的光激发下是没有荧光的，在该激发条件下，金纳米簇可以发出荧光，但荧光强度很弱。在金纳米簇中加入未孵育的溶菌酶，可以发现，它的荧光强度稍有降低，但是，当向金纳米簇中加入孵育好的溶菌酶纤维后，金纳米簇的荧光强度明显增强，且其荧光强度增加到原来的两倍左右。因此，金纳米簇可应用于溶菌酶纤维的检测中。

[0032] 进一步对金纳米簇与溶菌酶纤维结合前后的荧光寿命和荧光量子产率进行检测，结果如图2和表1。

[0033] 表1金纳米簇与溶菌酶纤维结合前后的荧光寿命和荧光量子产率

[0034]

[0035] 由图2和表1可见，金纳米簇的荧光寿命为1.32us，当它与溶菌酶纤维结合之后，其荧光寿命增长到了1.93us。它的量子产率在与溶菌酶纤维结合前后也发生了变化。金纳米簇的荧光量子产率是1.8％，而它与溶菌酶纤维结合后，它的荧光量子产率增加到了3.9％，是原先的两倍多。这说明金纳米簇检测溶菌酶纤维是比较灵敏的。

[0036] 2、分别向8个离心管中加入450μL、445μL、440μL、435μL、430μL、425μL、410μL、400μL超纯水，之后向超纯水中加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、40μL、50μL溶菌酶纤维样品，再向其中加入50μL金纳米簇，使最终体积为500μL，然后检测样品的荧光，设置激发波长365nm，扫描波段500～700nm。检测结束后，以溶菌酶纤维样品的浓度为横坐标，对应600nm处的荧光强度值为纵坐标作图，得到金纳米簇荧光强度随溶菌酶纤维浓度的变化关系，拟合作标准曲线，结果见图3和图4。由图3和图4可见，随着溶菌酶纤维浓度的增大，金纳米簇的荧光强度不断增强，当溶菌酶纤维的浓度达到0.08mg/mL时，金纳米簇的荧光强度不再随着溶菌酶纤维浓度的增大而继续增强。而且在0～0.05mg/mL的浓度范围内，金纳米簇的荧光强度与溶菌酶纤维的浓度之间有良好的线性关系，线性方程如下：

[0037] y＝4752680x+321907

[0038] 式中y代表荧光强度值，x是溶菌酶纤维的浓度，单位mg/mL。

[0039] 因此，按照上述方法，可以用金纳米簇来检测生物样品(如组织样品、细胞样品、血液、唾液、脊髓液、淋巴液、阴道液、精液、尿液等)中蛋白质淀粉样纤维化，获得生物样品中淀粉样纤维的浓度。

[0040] 实施例2

[0041] 金纳米簇在筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂中的应用

[0042] 以溶菌酶为模型蛋白，研究抗坏血酸对蛋白质纤维化的抑制效应，具体方法如下：

[0043] 1、按照上述实施例1步骤1的方法对溶菌酶进行孵育，分别在孵育0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时取样40μL加入到410μL超纯水中，再向样品中加入
50μL金纳米簇。设置激发波长365nm，扫描波段500～700nm，检测各样品的荧光。通过金纳米簇对孵育不同时间溶菌酶的荧光响应情况，来检测溶菌酶的纤维化过程。以孵育时间为横坐标，金纳米簇荧光强度为纵坐标，作荧光强度随孵育时间变化的生长曲线，结果见图5。同时根据文献方法，用ThT的荧光法检测样品，并作生长曲线，两种方法的检测结果作对比，结果见图6。

[0044] 由图5可见，随着孵育时间的增长，溶菌酶逐渐纤维化，当孵育时间达到12h时，金纳米簇的荧光强度开始增强，而且随着孵育时间的增加，荧光强度依然在增强，入对数期后，金纳米簇的荧光强度增强幅度增大；当孵育时间达到48h时，金纳米簇的荧光强度随孵育时间的变化就不再明显了，溶菌酶纤维化进入平台期。这一过程与蛋白纤维化过程中的核依赖模型相一致，经历了成核期、生长期和平台期。根据拟合处的生长曲线可以看到金纳米簇荧光强度随着溶菌酶在孵育过程中纤维逐渐生成的过程。而且与ThT的荧光法相比较，该方法可以更早地检测到溶菌酶的聚集态(见图6)。

[0045] 2、准确称量2mg溶菌酶和0.0176g NaCl于离心管中，然后向其中加入pH＝2的盐酸溶液并震荡使其充分溶解，再向其中加入20μL 5mM NaN3水溶液，之后向其中加入10μL、50μL、100μL、200μL 2mM的抗坏血酸水溶液，使样品的最终体积为2mL，样品中溶菌酶、NaCl、NaN3的最终浓度分别为1mg/mL、150mM、和0.05mM，抗坏血酸的终浓度分别为10μM、50μM、100μM、200μM。最后用封口膜将离心管封口，置于65℃的震荡水浴锅中孵育，震荡速度60rpm，在孵育0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h时取样40μL样品加入到410μL超纯水中，再向样品中加入50μL金纳米簇。设置激发波长365nm，扫描波段500～700nm，检测各样品的荧光。以孵育时间为横坐标，金纳米簇荧光强度为纵坐标，作加入不同浓度抑制剂的样品的荧光强度随孵育时间变化的生长曲线，并与未加抑制剂的样品作对比，结果见图7。同时根据文献方法，用ThT的荧光法检测各样品，进行抑制剂筛选实验的验证，结果见图8。

[0046] 图7的实验结果表明，抗坏血酸(L‑AC)对溶菌酶(lys)的淀粉样纤维化有抑制作用。当样品中没有抗坏血酸存在时，溶菌酶纤淀粉样维生长速度快，完成孵育后，纤维生成的量较多。而孵育前向其中加入抗坏血酸，溶菌酶淀粉样纤维的生长受到了抑制，不仅生长速度减缓，其最终生成的纤维含量也降低了。除此之外，抗坏血酸对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制效果与浓度相关，随着抗坏血酸加入浓度的增大，溶菌酶淀粉样纤维化过程受到的抑制就越强。这与传统ThT筛选得到的结果是一致的(见图8)，进一步表明该方法可以用于蛋白质淀粉样纤维化抑制剂的筛选。