一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用

摘要

一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用，属于农业和动物检疫技术领域。本发明一方面提供了一种新的抗SWP2蛋白的单克隆细胞株和该单克隆细胞株分泌的SWP2单克隆抗体，另一方面提供了上述单克隆细胞株和SWP2单克隆抗体在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。本发明中抗SWP2蛋白的单克隆细胞株所产生的单克隆抗体能够高特异性地结合SWP2抗原，具有很高的亲和力，对于虾体是否感染EHP能够提供准确结果。

权利要求

1.一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株，其特征在于该单克隆细胞株保藏编号为：CCTCC NO：C2019311。

2.一种SWP2单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由权利要求1所述的单克隆细胞株分泌。

3.一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

5.根据权利要求2所述的一种SWP2单克隆抗体在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

说明书

一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用，和该单克隆细胞株生产的SWP2单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 微孢虫（microsporidia）是一种单细胞的真核内寄生虫，广泛寄生于虾、甲壳类等动物。对虾肝肠微孢虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是微孢虫的一种， 属于微孢
虫科、肠胞虫属，最早于2009年在泰国养殖的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现，随后在
亚洲各国的凡纳滨对虾、脊尾白虾和中国对虾养殖区陆续有EHP检出。研究表明EHP的感染
途径较广，可通过污染的养殖水体和病虾进行水平传播，也可以通过受精卵和虾苗进行垂
直传播。EHP感染的对虾初期没有明显症状，但随着病程的发展体色、胃、肠均明显异常，体
色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别虾体还会出现白便症状。由于该
病在早前难以发现，往往要养殖30‑45天以上才会表现出生长缓慢，不长个的现象，因此极
易造成饲料空耗，给养殖户带来较大的经济损失。近几年，EHP在全世界范围内传播，亚洲的
中国、马来西亚、越南、印度尼西亚、泰国已经成为了重灾区，印度和墨西哥也有发现，极大
地打击了虾农的生产积极性。

[0003] 病害防治首先要对病害做出正确的诊断。PCR技术由于高特异性、高灵敏度的优点，已被广泛应用于虾肝肠微孢虫的鉴定。蛋白质印迹法（Western Blot，WB）也是分子生物
学中常用的一种实验方法，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和
疾病早期诊断等多个方面。

[0004] 本发明所包含的单克隆细胞株及其分泌的单克隆抗体是针对EHP的一种孢壁蛋白基因（SWP2），该基因在微孢子的侵染过程中发挥了重要作用。PCR方法能从DNA水平检测EHP
的存在，而WB方法能提供蛋白水平的检测结果，因此可以作为PCR方法的有效补充，经WB方
法检测为阳性的样品往往说明样品中的EHP具有较强传染性。同时本发明中的单克隆抗体
具有较强特异性，对于虾体是否感染EHP能够提供准确结果。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用的技术方案。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

[0007] 所述的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株，其特征在于该单克隆细胞株保藏编号为：CCTCC NO：C2019311。

[0008] 所述的一种SWP2单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由权利要求1所述的单克隆细胞株分泌。

[0009] 所述的一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。

[0010] 所述的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

[0011] 所述的一种SWP2单克隆抗体在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

[0012] 所述的一种试剂盒作为检测虾肝肠微孢虫病试剂的用途。

[0013] 本发明提供的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株是通过构建SWP2重组表达质粒，将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，进行SWP2重组蛋白的表达和纯化，采用常规免疫方法
对BALB/c小鼠进行免疫，选取效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合，对阳性杂交瘤细胞筛选
和克隆，经过数次克隆化操作，获得分泌单克隆抗体的单克隆细胞株。

[0014] 本发明提供的SWP2单克隆抗体来自BALB/c小鼠脾脏，该小鼠经过液体石蜡致敏，注射杂交瘤细胞，并收集腹水，纯化后得到SWP2单克隆抗体。

[0015] 本发明采用Western blot杂交方法检测虾样品，取虾的肝胰腺组织，得到蛋白溶液澄清液，根据样品的蛋白浓度进行制胶制样，取样品进行电泳实验，转膜后进行一抗和二
抗孵育，ECL曝光得到发光条带，得到虾病验证结果。

[0016] 本发明具有以下有益效果：

[0017] 本发明提供了一种新的抗SWP2蛋白的单克隆细胞株，并且该抗SWP2蛋白的单克隆细胞株所产生的单克隆抗体能够高特异性地结合SWP2抗原，具有很高的亲和力，对于虾体
是否感染EHP能够提供准确结果。

附图说明

[0018] 图1为融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS‑PAGE分析图，M：Protein marker(Cat.No.:C600525):1：上样；2：流出；3:20 mM Imidazole洗脱组分；4‑5:50mM midazole洗
脱组分；6：500mM midazole洗脱组分。

[0019] 图2为纯化蛋白的SDS‑PAGE分析图。

[0020] 图3为纯化蛋白的Western Blot分析图。

[0021] 图4为1‑8EHP阳性虾样品的Western Blot分析图。

具体实施方式

[0022] 下面将结合具体实施例来进一步解释本发明。

[0023] 实施例：

[0024] 1 SWP2重组表达质粒的构建

[0025] 根据SWP2的基因组信息，采用基因合成方法获得SWP2基因片段的PCR产物；将PCR产物和表达载体Pet15B用NdeI、XhoI进行双酶切，割胶回收双酶切片段和载体，并用T4 
DNAigase将两者连接；连接液转入top10感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行测序鉴定。

[0026] 2.1 SWP2重组蛋白的表达和纯化

[0027] 2.1 表达

[0028] 将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，热激后涂布在含有对应抗生素的平板上，培养；挑取单克隆到含有抗生素的液体培养基中培养，当OD值达到0.6时，添加诱导剂IPTG
继续培养，分别于20°C条件下培养16 h、37°C条件下培养4 h，未添加诱导剂的为阴性对照；
离心弃上清，收集菌体；在收集到的菌体中加入缓冲液A悬浮，使用超声破碎仪使其充分溶
解并离心，离心后的沉淀使用缓冲液B进行溶解，分别对上清和沉淀制样，进行SDS‑PAGE检
测；在含对应抗生素的培养基中培养菌液，当OD值达到0.6时，添加0.5 mM的IPTG，20°C条件
下过夜培养进行大量表达，离心收集细胞菌体。

[0029] 2.2 纯化

[0030] 细胞菌体用缓冲液C溶解并超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取5 ml Ni‑NTA，用5倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5 ml/min；将粗蛋白与平衡后的柱填料
孵育1 h；将孵育后的产物上柱，收集流出；用Binding buffer清洗平衡柱子；用Washing 
buffer洗柱子，并收集流出；用Elution buffer洗脱，收集流出； 对粗蛋白、洗杂流出、洗脱
流出分别制样，进行SDS‑PAGE检测；将纯度较好的3组分透析到1×PBS， pH7.4缓冲液中，透
析结束后蛋白用PEG20000浓缩，0.22 μm滤膜过滤后分装1 ml/tube，‑80°C保存。

[0031] 2.3 目的蛋白检测

[0032] 对纯化后的蛋白进行SDS‑PAGE检测与Western Blot验证。

[0033] 3 单抗的筛选与制备

[0034] 3.1 动物免疫及小鼠效价测定

[0035] 采用常规免疫方法对BALB/c小鼠进行免疫。初免后每隔三周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次。使用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体效价，选取免
疫效价检测值最高的小鼠追加免疫一次，三天后取该鼠的脾脏进行细胞融合。

[0036] 3.2 骨髓瘤细胞复苏

[0037] 从液氮中取出冻存细胞，立即放入37°C水浴中融化，离心，弃上清，用少量完全培养液打散细胞团，加入约完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养
瓶中，置于37°C二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养，在倒置
显微镜下观察其细胞状态，状态良好的细胞准备做融合用。

[0038] 3.3 免疫脾细胞的制备

[0039] 取效价最高且加强免疫的小鼠，眼球摘除采血，分离血清作为检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内，固定于解剖板上，剪开左
侧皮肤和腹膜，取出脾脏置于已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组
织。将脾脏移入另一盛有基础培养液的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏
刺孔，然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到基础培
养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移到离心
管中，离心弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次。

[0040] 3.4 细胞融合

[0041] 用PEG将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞进行融合，离心后弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次，加入用HAT的细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细
胞培养板。

[0042] 3.5 阳性杂交瘤细胞的筛选

[0043] 细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先通过ELISA间接法对所有细胞孔进行初次筛选，记录呈现强阳性的细胞孔。对初筛呈阳性的各细胞孔应及时在24
孔细胞培养板中进行扩大培养和克隆化。

[0044] 3.6 阳性杂交瘤细胞的克隆化

[0045] 采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分
泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后
冻存及制备腹水等。

[0046] 3.7 单克隆抗体的大量制备与纯化

[0047] 小鼠腹水的制备：取6周龄健康雌性小鼠，腹腔注射0.5 ml液体石蜡致敏，一到两6
周后，每只小鼠腹腔注射1 2×10个杂交瘤细胞，观察小鼠状态7 10天后待小鼠腹腔明显
~ ~
膨大后收集腹水，离心上清液即为腹水，分装标记备用。

[0048] 单克隆抗体的纯化：腹水离心15 min（4000 rpm，室温）取上清，向纯化柱内倒入，冲散beads。静置，待beads在纯化柱底部全部沉淀后放出腹水，并收集腹水流穿。1×PBS冲
洗纯化柱，直到beads变白为止（少数洗不白的除外）。将腹水流穿重新过一遍纯化柱，重复
上述操作至少2遍10倍柱体积1×PBS分2次冲洗纯化柱。抗体洗脱，将洗脱液加入纯化柱，封
闭纯化柱下端，冲散beads，待beads在纯化柱底部全部沉淀后，流出液体，用事先装有中和
液的1.5ml离心管收集洗脱液。对纯化的抗体用Merinton SMA4000微量紫外分光光度计测
定浓度，并用ELISA检测抗体效价。

[0049] 4 用Western blot杂交方法检测虾样品

[0050] 4.1 蛋白提取

[0051] 取约30 mg虾的肝胰腺组织，加200 μl RIPA裂解液。低温高速匀浆3次，冰上裂解2 h，中间1 h拿出冰浴超声1次，中间停止15 S后继续裂解1 h。4°C 12000 g高速离心，吸取上
清，并再次离心，直到得到的蛋白溶液澄清透亮，4°C暂存待蛋白定量。

[0052] 4.2 浓度测定

[0053] 用8个梯度的BSA作为标准品对照。BCA蛋白定量，BCA液每孔200 μl与硫酸铜液4 μl混合，配制成为BCA蛋白定量工作液使用。上样，标准品与样品每孔上样20 ul，之后加入
BCA工作液，37°C温箱孵育30 min。用酶标仪570 nm读出OD值，绘制标准曲线，以标准品浓度
μg/μl为横轴，OD值为纵轴，绘制线性方程，计算每个样品的蛋白浓度。

[0054] 4.3 制胶

[0055] 根据目的蛋白的分子量，配制12%的分离胶，浓缩胶浓度为5%，备用。

[0056] 4.4 制样

[0057] 5×Loading Buffer室温融化并平衡，按照1:4的比例加入到调整好浓度的样品中，反复轻柔吹打。样品管插入浮漂板中，使样品体积浸没于沸水液面以下，不加盖，沸水浴
10 min以使蛋白充分变性。自然冷却样品后，低速离心，混匀后分装样本。

[0058] 4.5 上样与电泳

[0059] 10孔胶上样6 ul，电泳条件：浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压160 V，通过样品中溴酚蓝的位置来确定电泳停止时间。电泳时在电泳槽外加入冰块或冰袋，避免长时
间电泳造成电极与溶液温度过高。

[0060] 4.6 转膜

[0061] 电泳结束后，轻轻取下凝胶，去除浓缩胶部分，只保留分离胶，用纯净水冲洗；打开转膜夹芯，先放一层海绵垫，再放三张浸润平衡过转膜液的中速滤纸，小心在滤纸上放上凝
胶，再加三张滤纸，使用凝胶滚筒反复轻柔赶走去除其中可能存在的气泡，整个过程不时滴
加转膜液；将整个转膜芯放入转膜槽，加满提前4°C冰箱预冷的转膜液，外槽中放入冰冻好
的冰盒用于降温。

[0062] 湿转法转膜：300 mA恒流，转膜时间以目的蛋白分子大小而定，每1 kDa分子的转膜1 min。完成后用丽春红染色试剂染色，观察转膜效果，丽春红使PVDF膜上的蛋白条带染
色，条带清晰，带型清楚，则说明蛋白分离效果明显，可以进行下一步实验。

[0063] 4.7 封闭

[0064] 用TBST洗涤染色后的膜5 min，弃去洗涤液，选择脱脂牛奶封闭，将膜完全浸没5%牛奶‑TBST中室温轻摇60 min。

[0065] 4.8 孵育一抗

[0066] 一抗孵育：用5% BSA/TBST稀释一抗（抗体稀释液通常与封闭液相同），室温孵育15 min，放4℃摇床过夜。

[0067] 4.9洗涤

[0068] 从4℃拿出膜，在摇床室温平衡15 min ，待溶液恢复室温之后吸弃抗体孵育液，加入5 ml TBST洗膜5次，每次3 min；最后一次洗完后，倒去TBST，将孵育盒反扣在吸水纸上，
吸取残留的液体。

[0069] 4.10孵育二抗

[0070] 用5%脱脂奶粉‑TBST稀释二抗，加入Goat‑Anit‑Mouse二抗，室温轻摇40 min。

[0071] 4.11洗涤

[0072] 加入5 ml TBST洗膜5次，每次3 min，最后一次洗完，不要倒掉TBST，将洗好的膜浸没其中，放4℃平衡10 min。

[0073] 4.12 ECL曝光

[0074] 在压片盒中先铺一层保鲜膜，使用平头镊取膜，用吸水纸吸去多余的TBST，平整将PVDF膜放在保鲜膜上。加入配制好的ECL发光液，关闭红光灯，待肉眼可辨有微弱荧光条带
时，开红光灯，用吸水纸吸去多余发光液，覆盖保鲜膜，加上大小合适的胶片，压盒曝光30 S
左右，胶片取出放入显影液显影1‑3 min，条带出现后，放入定影液定影2 min。

[0075] 5 实验结果

[0076] 5.1 SWP2基因片段序列

[0077] SWP2基因片段序列如SEQ ID NO.1所示。

[0078] 5.2 表达的SWP2蛋白序列

[0079] SWP2重组蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

[0080] 5.3 蛋白纯化与验证

[0081] SWP2蛋白的原核表达、纯化及检测验证的结果如图1‑3所示，表明重组表达的SWP2蛋白大小与预测相符合，满足实验要求。

[0082] 5.4 小鼠血清效价测定

[0083] 用间接ELISA方法对免疫小鼠进行血清效价的检测，结果显示1#，2#，3#，4#, 5# ，其3#小鼠血清效价最高，大约为1︰256K，可以满足细胞融合的要求（如下表）。

[0084] 小鼠尾血效价测定

[0085]

[0086] 5.5 单克隆细胞株的筛选

[0087] 免疫的BALB/c小鼠脾细胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后，取细胞上清经间接ELISA方法测定OD450值，选中其中阳性值最高的单克隆细胞株经亚克隆筛选，共获得3株能
稳定分泌单克隆抗体的单克隆细胞株，分别命名为2D11H7、3G3D4、3H3C8。

[0088] 5.6 纯化后的抗体效价检测

[0089] 经纯化后的抗体的效价和浓度检测结果如下表，其中3H3C8菌株的效价最高，因此以此菌株制备高效的单克隆抗体为WB杂交实验使用。并将3H3C8菌株送至中国典型培养物
保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2019311，地址位于中国武汉市武汉大学，保藏日期
为2019年11月28日，分类命名为单克隆细胞株3H3C8。

[0090] 纯化抗体效价

[0091]

[0092] 5.7 虾样品的Western blot杂交

[0093] 1‑8号样品是明确的EHP阳性虾样品，0号样品是EHP阴性虾样品，使用本发明的抗SWP2蛋白的单克隆细胞株分泌的单克隆抗体，采用WB方法进行重新验证的结果如图4所示。
结果显示，1‑8样品均显示明显的28 kDa大小条带，说明该单克隆抗体能够被用来进行虾的
肝肠微孢虫病检测。