运动金球菌麦草畏降解基因dicM的用途

摘要

本发明发现基因dicM具有降解除草剂麦草畏的功能。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，具有降解除草剂麦草畏的功能，可用于抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复。

权利要求

1.SEQ ID NO:1所示序列的基因在抗除草剂麦草畏转基因作物培育和环境生物修复中降解麦草畏的应用。

2.权利要求1所述的应用，所述降解麦草畏是将有毒性的麦草畏化合物降解为无毒性的化合物的反应。

3.含有SEQ ID NO:1所示序列基因的质粒在抗除草剂麦草畏转基因作物培育及麦草畏降解中的应用。

4.权利要求1所述基因编码的多肽在降解除草剂麦草畏中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

说明书

运动金球菌麦草畏降解基因dicM的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及运动金球菌dicM基因表达蛋白质降解除草剂麦草畏的用途。

背景技术

[0002] 据报道，运动金球菌菌株分离自印度洋深海，目前没有任何关于其功能基因及菌株生物学功能与应用的研究文献。

[0003] 麦草畏(Dicamba)，是一种具有选择性和内吸传导型苗后生长素类除草剂，属苯甲酸类除草剂，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果，其持效期长，常被广泛的用于小
麦、玉米、谷子等作物田防除杂草。

[0004] 麦草畏属于合成生长素类除草剂，在植物体内可以通过韧皮部和木质部上下行传导，多积累在活跃的分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物体内激素的正常活动，引起
茎叶和根的畸形，细胞分裂、伸长和分化不规律，破坏核酸代谢，从而使敏感植物枯死。麦草
畏易挥发，若高温施用则会形成雾滴而漂移数十里，对邻近敏感的阔叶作物易造成药害，同
时也会造成作物减产。

[0005] 近年来，随着麦草畏的过度使用，造成其在土壤中的残留十分严重，因此，越来越多的科研工作者开始研究麦草畏在土壤中的降解问题。目前，对麦草畏的降解机制还不清
晰，无法针对靶蛋白进行研究。仅针对麦草畏降解酶基因的克隆和获取开展了部分研究。

发明内容

[0006] 本发明的目的是发现一种新的除草剂麦草畏降解基因，其编码的蛋白质能够用于麦草畏分子的降解。

[0007] 本发明发现了一种具有降解除草剂麦草畏功能的基因dicM，该基因来自于运动金球菌。

[0008] 通过构建了该基因的表达载体，将其在除草剂降解筛选菌株大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，具有降解除草剂麦草畏的功能，可用于抗除草
剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复。具体研究工作如下：

[0009] 1、获得了含有dicM基因的重组工程菌株

[0010] 1)通过PCR从南方某制药厂周围土壤样品的微生物宏基因组扩增出dicM基因，该基因来自于运动金球菌，其大小为1086bp，该基因编码361个氨基酸，将其克隆于载体pJET
上，构建了含有完整dicM基因的重组克隆质粒pJET‑dicM；

[0011] 2)将dicM基因连接于pRAD1质粒上，该质粒含组成型高表达groEL启动子，可高效持续表达下游靶标蛋白。构建完成的重组质粒pRAD‑dicM；

[0012] 3)将导入dicM基因的重组质粒pRAD‑dicM转入麦草畏降解基因筛选菌株大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM‑dicM(详见实施例1)；

[0013] 2、表达dicM的重组大肠杆菌工程菌株的催化活性实验

[0014] 已有研究表明，除草剂麦草畏降解的关键步骤在于麦草畏分子的去甲氧基化反应。经过微生物酶的催化将除草剂麦草畏去甲氧基生成无除草剂活性的3,6‑二氯水杨酸
(DCSA)。

[0015] 实验证实，向培养基中添加除草剂麦草畏化合物后，经过60小时孵育，表达dicM的重组大肠杆菌工程菌株JM‑dicM能够将麦草畏分子完全降解，生成去甲基的无除草剂活性
的DCSA。

[0016] 实验表明，重组表达的DicM蛋白质具有降解除草剂麦草畏的催化功能，降解产物主要为DCSA。该基因在抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的生物修复方面具有应用
潜力。

[0017] 序列表信息

[0018] SEQ ID NO.1：dicM基因的核苷酸序列。

[0019] SEQ ID NO.2：DicM的氨基酸序列。附图说明：

[0020] 图1重组工程菌JM‑dicM能够代谢麦草畏。

[0021] 图2标准品麦草畏与3,6‑二氯水杨酸的HPLC检测图。A，麦草畏，检测波长λ＝275nm，出峰时间6min；B，DCSA，检测波长为λ＝319nm，出峰时间为5.1min；

[0022] 图3工程菌株JM‑dicM对麦草畏降解效果。图2A中，60h孵育培养后，表达dicM基因的重组工程菌JM‑dicM(实线)培养基中麦草畏(1号峰)已经检测不到。图2B中显示，60h孵育
培养后，重组工程菌JM‑dicM(实线)的主要产物为无除草剂活性的3,6‑二氯水杨酸(DCSA)
(2号峰)。而对照菌株JM‑D1(虚线)未检测到2号峰物质麦草畏降解能力。

具体实施方式

[0023] 以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本
领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株
来源如下：

[0024] 克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

[0025] 表达质粒pRAD1：本实验室保藏；

[0026] 大肠杆菌JM109：为北京全式金公司市售产品。

[0027] 标准品麦草畏与3,6‑二氯水杨酸：为sigma‑aldrich公司市售产品。

[0028] 实施例1土壤宏基因组中dicM基因序列在大肠杆菌中的表达

[0029] 一、实验材料

[0030] 大肠杆菌JM109：为北京全式金公司市售产品。

[0031] PCR模板DNA：土壤宏基因组DNA

[0032] 二、实验方法

[0033] 1.根据测序获得的宏基因组基因序列设计1对PCR特异性引物：

[0034] DicM‑F：5′ACCACTAGTATGCCTTTCGTTTACAATGC 3′

[0035] DicM‑R：5′ACCCATATGTTACCCTCTCAATCCGGTGC 3′

[0036] 2.通过PCR方法从宏基因组DNA中扩增出目的基因序列。

[0037] 反应条件：95℃10min，[95℃30sec，60℃30sec，72℃1.0min]35个循环，72℃10min。

[0038] 3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET‑dicM，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的dicM基因及含有groEL启动子的pRAD1载体，，构
建大肠杆菌表达载体pRAD‑dicM，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证
插入序列正确，将该菌株命名为JM‑dicM。含有pRAD1对照空质粒的E.coli JM109命名为JM‑
D1。

[0039] 三、实验结果

[0040] 利用PCR技术成功克隆了土壤宏基因组中dicM基因，该基因来自于运动金球菌，成功构建了表达dicM基因的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将
该菌株命名为JM‑dicM。含有pRAD1对照空质粒的E.coli JM109，命名为JM‑D1。

[0041] 四、实验结论

[0042] 完成表达dicM的重组大肠杆菌工程菌株的构建。

[0043] 实施例2表达dicM的重组大肠杆菌工程菌株的麦草畏代谢能力

[0044] 一、实验材料

[0045] 重组工程菌株：实施例1得到的表达dicM基因的JM‑dicM菌株

[0046] 对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM‑D1菌株。

[0047] 二、实验方法

[0048] 1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；

[0049] 2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至指数中后期；

[0050] 3.4000rpm,4min,离心收集菌体，用MSM培养基重悬、洗涤菌体两遍；

[0051] 4.将菌株重悬于含有500mg/L麦草畏的50mL MSM培养基中；

[0052] 5.分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h等不同时间点收菌，测定OD600，并观察培养液颜色与浑浊度。

[0053] 三、实验结果

[0054] 如图1所示，重组工程菌JM‑dicM能够代谢麦草畏。图1中表达dicM基因的重组工程菌JM‑dicM能够在以麦草畏为唯一碳源的培养基中生长，培养基颜色变浑浊，60h孵育培养
后，麦草畏被降解培养基颜色逐渐变红。图1含有空质粒的对照菌株JM‑D1菌株孵育60h后，
培养基依然澄清，未见颜色发生变化。

[0055] 四、实验结论

[0056] 表达dicM基因的重组工程菌JM‑dicM能够在以麦草畏为唯一碳源的培养基中生长，具有降解除草剂麦草畏的能力。

[0057] 实施例3表达dicM的重组大肠杆菌工程菌株的催化活性实验

[0058] 一、实验材料

[0059] 重组工程菌株：实施例1得到的表达dicM基因的JM‑dicM菌株

[0060] 对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM‑D1菌株。

[0061] 二、实验方法

[0062] 1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；

[0063] 2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至指数中后期；

[0064] 3.4000rpm,4min,离心收集菌体，用MSM培养基重悬、洗涤菌体两遍；

[0065] 4.将菌株重悬于含有500mg/L麦草畏的50mL MSM培养基中；

[0066] 5.分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h等不同时间点收菌，测定OD600，并取样用于HPLC测定培养液中麦草畏的含量。

[0067] 利用惠普1050系列HPLC系统进行高效液相色谱分析。色谱柱为。样品上样量为100μL，麦草畏及其降解产物

[0068] 过利用移动相的梯度变化进行稀释分析。移动相溶液B变化梯度为30min中从30％‑95％。(A：超纯水：乙腈∶甲醇：乙酸＝58.4:31.7:7.5:2.4；B：100％乙腈)，流速为
0.8mL/min。检测波长：麦草畏λ＝275nm；DCSA λ＝319nm。

[0069] 三、实验结果

[0070] 如图2所示，A中除草剂麦草畏的紫外检测波长为λ＝275nm，出峰时间约6min处；B中其降解产物DCSA峰为紫外检测波长为λ＝319nm，出峰时间约5.1min处。

[0071] 表达dicM基因的重组工程菌JM‑dicM与含有空质粒的对照菌株JM‑D1菌株产物峰型显著不同。图3A中，60h孵育培养后，对照菌株JM‑D1(虚线)的培养基中的主要化合物峰仍
为1号峰，保留时间在6min处，对照标准品结果该峰为麦草畏化合物。而图3A中，表达dicM基
因的重组工程菌JM‑dicM(实线)培养基中的化合物峰型发生了明显的变化，1号峰已经检测
不到。图3B中显示，60h孵育培养后，重组工程菌JM‑dicM(实线)的主要产物为2号峰，保留时
间在5.1min处，对照标准品结果该峰为DCSA化合物。而对照菌株JM‑D1(虚线)未检测到2号
峰物质产生。

[0072] 四、实验结论

[0073] 重组表达的DicM蛋白质具有降解除草剂麦草畏的催化功能，降解产物主要为无除草剂活性的3,6‑二氯水杨酸(DCSA)。该基因在抗除草剂转基因农作物的培育及污染土壤的
生物修复方面具有应用潜力。