与青光眼发生发展相关的生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了与青光眼发生发展相关的生物标志物及其应用。本发明首次发现了SPATA33和WDR61在青光眼患者中表达上调，基于此，本发明公开了SPATA33或WDR61在制备诊断青光眼的产品中的应用，以及包含检测SPATA33或WDR61表达水平的试剂的诊断青光眼的产品。同时公开了SPATA33或WDR61在制备治疗青光眼的产品中的应用。

权利要求

1.检测人小梁组织生物标志物人SPATA33基因的基因表达水平的试剂在制备诊断青光眼的产品中的应用，其特征在于，与正常人相比，当受试者样本中人SPATA33基因的基因表达水平上调时，则受试者患有青光眼。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：特异性识别人SPATA33基因的寡核苷酸探针；

特异性扩增人SPATA33基因的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增人SPATA33基因的引物序列如SEQ IDNO.1 2所示。

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4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括核酸膜条、芯片或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片，基因芯片包括针对人SPATA33的引物或寡核苷酸探针。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括特异性针对人SPATA33的引物、寡核苷酸探针或芯片。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，特异性针对人SPATA33的引物序列如SEQ ID NO.1 2所示。

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8.人SPATA33基因的基因表达水平的抑制剂在制备治疗青光眼的药物组合物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7 8所示。

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说明书

与青光眼发生发展相关的生物标志物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，涉及一种与青光眼发生发展相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物为SPATA33或WDR61。

背景技术

[0002] 青光眼是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压升高是其主要危险因素。是现今世界第二大的致盲性眼病，位居不可逆盲目的第一位。据统计，2013年全球有6.43亿人患有青光眼，到2020年大约有7.60亿人将患有青光眼，2040年青光眼患病人数将上升至11.18亿人(Tham YC,Li X,Wong TY,Quigley HA,Aung T,Cheng CY.Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040:a systematic review and meta-analysis[J].Ophthalmology 2014；121:2081-
2090.)。青光眼以高发病率及高致盲率，严重威胁人类的生活质量。

[0003] 临床上通常将青光眼分为原发性青光眼、继发性青光眼、儿童(发育)性青光眼三种类型。各类型青光眼的发病机制目前不完全清楚。目前大多数学者认为青光眼眼底视神经损害很大程度上与病理性眼压升高相关，眼压升高后可机械性压迫视神经纤维，或使视网膜血管缺血缺氧，最终导致视网膜神经节细胞的凋亡。青光眼的发病和遗传方式很复杂，可能是多种基因之间的相互作用及基因与环境的相互作用共同引起。青光眼可能与家族史、特征性结构、年龄、种族、环境、遗传等危险因素有关，其中遗传因素在其中占据重要地位。目前临床明确诊断青光眼，青光眼的病程已不在早期，青光眼是不可逆的致盲病，所以早期诊断、早期治疗具有重大意义。

[0004] 人小梁网细胞为附着于小梁网组织的单层筛网状结构，具有滤过、吞噬、收缩等功能，其数量、活性及其细胞外基质(extracellular matrix，ECM)等异常均可影响房水排出阻力，最终干预眼压。因此，小梁网细胞成为研究青光眼发病机制的主要靶细胞，有关细胞因子对小梁网细胞的作用，在探讨青光眼发病机制及提供临床治疗思路方面亦为研究的热点。

[0005] 随着基因研究技术的发展，发现越来越多的青光眼相关致病基因、位点及相关基因突变，对于进一步明确青光眼的分子发病机制，对人群实行早期基因干预，高危人群筛查，临床前诊断及基因治疗，提高青光眼患者生活质量，甚至根治青光眼具有重要的意义。

发明内容

[0006] 为了弥补现有技术的不足，本发明基于遗传因素在青光眼的发生发展中的作用，研究与青光眼发生发展相关的生物标志物，从而为青光眼的诊断和治疗提供新的手段。

[0007] 本发明提供了检测生物标志物的试剂在制备诊断青光眼的产品中的应用，所述生物标志物选自SPATA33或WDR61。

[0008] 进一步，与正常人相比，当SPATA33或WDR61在受试者样本中的表达水平上调时，则受试者患有青光眼或者存在患有青光眼的风险。其中样本包括但不限于组织或流体，如组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其组分或经过处理的材料。

[0009] 进一步，所述样本为组织，更进一步地，所述组织为小梁网组织。

[0010] 进一步，所述试剂包括：

[0011] 特异性识别SPATA33或WDR61基因的探针；

[0012] 特异性扩增SPATA33或WDR61基因的引物；或

[0013] 特异性结合SPATA33或WDR61编码的蛋白的结合剂。

[0014] 进一步，所述特异性扩增SPATA33或WDR61基因的引物序列对分别如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示。

[0015] 本发明提供了一种诊断青光眼的产品，所述产品包括检测SPATA33或WDR61水平的试剂。

[0016] 进一步，所述产品包括核酸膜条、芯片或试剂盒。

[0017] 进一步，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别SPATA33或WDR61的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

[0018] 进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片，其中基因芯片包括针对SPATA33或WDR61的引物或寡核苷酸探针，蛋白质芯片包括特异性结合SPATA33或WDR61蛋白的结合剂。其中，特异性结合剂是例如蛋白质SPATA33或WDR61的受体、结合蛋白质SPATA33或WDR61的凝集素、针对蛋白质SPATA33或WDR61的抗体、针对蛋白质SPATA33或WDR61的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

[0019] 特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为SPATA33或WDR61特异性抗体。

[0020] 进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括特异性针对SPATA33或WDR61的引物、寡核苷酸探针或芯片；所述蛋白检测试剂盒包括特异性结合SPATA33或WDR61蛋白的结合剂。试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。

[0021] 进一步，特异性针对SPATA33或WDR61的引物序列如SEQ IDNO.1～4所示。

[0022] 本发明提供了一种诊断青光眼的方法，包括步骤：

[0023] 1)获取样本；

[0024] 2)提取样本中的RNA；

[0025] 3)检测RNA中的SPATA33或WDR61的表达水平；

[0026] 4)比较判断，与正常人相比，当SPATA33或WDR61的表达水平显著升高时，则受试者患有青光眼。

[0027] 本发明提供了SPATA33或WDR61在制备治疗青光眼的药物组合物中的应用。

[0028] 进一步，所述药物组合物包括SPATA33或WDR61的抑制剂。其中，所述抑制剂可以在转录或翻译水平降低SPATA33或WDR61的表达。

[0029] 进一步，所述抑制剂为siRNA。

[0030] 进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。

[0031] 本发明提供了一种治疗青光眼的药物组合物，所述药物组合物包括SPATA33或WDR61的抑制剂。所述抑制剂可以在转录或翻译水平降低SPATA33或WDR61的表达。

[0032] 进一步，所述抑制剂为siRNA。

[0033] 进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。

[0034] 在本发明中，SPATA33(基因ID：124045)包括人SPATA33基因及其所编码的蛋白。作为非限制性的实例，SPATA33的基因序列如NM_001271907.1、NM_001271908.1、NM_001271909.1、NM_001271910.1、NM_153025.2任一转录本所示，相应的氨基酸序列如NP_
001258836.1、NP_001258837.1、NP_001258838.1、NP_001258839.1、NP_694570.1所示。其中，一种代表性的SPATA33的基因序列如NM_001271907.1所示，相对应的氨基酸序列如NP_
001258836.1所示。

[0035] WDR61(基因ID：80349)包括人WDR61基因及其所编码的蛋白。作为非限制性的实例，WDR61的基因序列如NM_001303247.2、NM_001303248.2、NM_025234.3任一转录本所示，其相应的氨基酸序列如NP_001290176.1、NP_001290177.1、NP_079510.1所示。在本申请中，一种代表性的WDR61的基因序列如NM_001303247.2所示，氨基酸序列如NP_001290176.1所示。

[0036] 本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。

[0037] 本发明的SPATA33或WDR61使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

[0038] 本发明中诊断青光眼的产品可用于检测包括SPATA33或WDR61基因在内的多个基因(例如，与青光眼相关的多个基因)的表达水平，将青光眼的多个标志物同时进行检测，可大大提高青光眼诊断的准确率。

[0039] 本发明的优点和有益效果：

[0040] 本发明首次发现了SPATA33或WDR61基因在青光眼患者中表达水平上调，通过检测SPATA33或WDR61基因的表达水平可以辅助诊断受试者是否患有青光眼或患青光眼病病的风险，从而指导医生提供预防或治疗方案。

附图说明

[0041] 图1是利用QPCR检测SPATA33在青光眼患者中的表达水平图，其中图A是SPATA33的表达水平图，图B是WDR61的表达水平图。

[0042] 具体的实施方式

[0043] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0044] 实施例1QPCR检测SPATA33和WDR61在青光眼中的表达

[0045] 1、样品收集

[0046] 青光眼手术过程中的小梁组织31例以及正常外伤的小梁组织19例，排除角膜病、葡萄膜炎、眼内炎和眼底病及全身系统疾病的患者。

[0047] 2、RNA样品的制备及质量分析

[0048] 使用Trizol法提取组织中的总RNA

[0049] 取组织加加液氮研磨，加入Trizol裂解液(美国Invitrogen公司)和氯仿(Trizo1裂解液：氯仿＝5：1)，振荡混匀15s，37℃孵育2min，4℃下12 000r/min。离心15min，吸取上层无色液体至干净的无菌离心管中，加入等体积异丙醇混匀，37℃孵育10min，4℃下12 000r/min离心10min，弃上清，用体积分数75％乙醇清洗RNA沉淀，室温下干燥5～10min，用无RNA酶的无菌水溶解RNA。紫外吸收法检测RNA纯度，A260/A280比值1.8～2.1。

[0050] 3、逆转录：

[0051] 使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

[0052] 1)去除基因组DNA

[0053] 在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

[0054] 2)反转录反应

[0055] 将5× Buffer 2 4.0μl， RT Enzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 1.0μl，RNase Free ddH2O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中
37℃15min，85℃5s。

[0056] 4、实时荧光定量PCR

[0057] 1)引物设计

[0058] 根据SPATA33、WDR61和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如表1所示：

[0059] 表1引物序列

[0060]

[0061] 2)实时荧光定量PCR扩增检验

[0062] 用 Premix Ex TaqTM II(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal Cycler Real Time System扩增仪上进行PCR扩增，扩增体系和反应条件如表2所示。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

[0063] 表2实时荧光定量PCR扩增体系和反应条件

[0064]

[0065] 5、结果

[0066] QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，SPATA33和WDR61在青光眼患者中表达显著上调，SPATA33上调约7.46倍，WDR61上调约5.37倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中31例青光眼患者中有26例SPATA33显著上调，有29例WDR61显著上调，提示SPATA33和WDR61可应用于青光眼的诊断。

[0067] 同时，根据SPATA33和WDR61在青光眼中显著上调，可以设计针对SPATA33和WDR61基因的siRNA、shRNA或者特异性结合SPATA33和WDR61蛋白的抗体应用于青光眼的治疗。

[0068] 实施例2CCK-8检测SPATA33和WDR61对青光眼小梁网细胞增殖的影响

[0069] 1、细胞培养

[0070] 在无菌条件下，将从小梁切除术中取得的带小梁网的深层巩膜组织块接种于一次性塑料培养瓶壁上，在光镜下确认组织块内皮面并将小梁网面贴壁。将培养瓶放入37℃、5％CO2的培养箱，细胞长至培养瓶底面积约80％后用2.5g/L胰蛋白酶消化传代培养。初次传代以1:1，以后根据细胞密度可按1:2～4进行传代。

[0071] 2、干扰RNA的设计与合成

[0072] 由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对SPATA33和WDR61的siRNA，对照为通用的siRNA-NC。具体序列如下：

[0073] siRNA-SPATA33：

[0074] 正义链为5’-UUACAUCAGGUUUCUCUUCCA-3’(SEQ ID NO.7)

[0075] 反义链为5’-GAAGAGAAACCUGAUGUAAAG-3’(SEQ ID NO.8)

[0076] siRNA-WDR61：

[0077] 正义链为5’-UUGAUGUAGCCAUCAUCUGAA-3’(SEQ ID NO.9)

[0078] 反义链为5’-CAGAUGAUGGCUACAUCAAGA-3’(SEQ ID NO.10)

[0079] 3、干扰效率检测

[0080] 使用Invitrogen公司的LipofectaminTM2000试剂盒提供的方法，将SPATA33和WDR61的siRNA转染至传3代的小梁网细胞，细胞转染前准备取培养箱中提前种植在6孔板中的细胞，转染后24h，对6孔板中细胞进行换液并继续培养。将实验分为3组，空白对照组(小梁网细胞)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-SPATA33、siRNA-WDR61)。

[0081] 使用QPCR实验检测siRNA的干扰效率，使用Trizol法提取细胞总RNA，之后采用实施例1的方法逆转录和QPCR。

[0082] 4、CCK-8检测小梁网细胞增殖情况

[0083] 将转染siRNA-SPATA33、siRNA-WDR61的细胞作为实验组，转染siRNA-NC的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每组加入的细胞数量为10000个，每组设置5个复孔，培养48h时，细胞孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入37℃细胞培养箱中避光孵育孵育2h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，根据检测的OD值，检测细胞的增殖情况。

[0084] 5、统计学分析

[0085] 所有数据用采用均数士标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，P<0.05定义为差异有统计学意义。

[0086] 6、结果显示

[0087] siRNA转染结果显示，以空白对照组基因的表达水平作为参比设为1，相比转染空白对照组的SPATA33的表达量(相对表达量：1)与转染siRNA-NC组的SPATA33的表达量(相对表达量：0.93±0.05)，转染siRNA-SPATA33实验组的SPATA33的表达量(相对表达量：0.20±0.08)显著下调，差异具有统计学意义(实验组vs空白对照组，P＝0.0034；实验组vs siRNA-NC组，P＝0.0025)，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异(P＝0.1362)；相比转染空白对照组的WDR61的表达量(相对表达量：1)与转染siRNA-NC组的WDR61的表达量(相对表达量：0.95±0.04)，转染siRNA-WDR61实验组的WDR61的表达量(相对表达量：0.37±
0.085)显著下调，差异具有统计学意义(实验组vs空白对照组，P＝0.006；实验组vs siRNA-NC组，P＝0.015)，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异(P＝0.1628)[0088] CCK-8实验检测结果显示，相比转染siRNA-NC的对照组(OD值：0.74±0.105)，转染siRNA-SPATA33和siRNA-WDR61的实验组的细胞增殖活性(OD值：1.45±0.15)和(OD值：1.32±0.104)显著增加(P<0.0001)，说明SPATA33和WDR61的表达水平影响小梁网细胞的增殖。

[0089] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。