胆碱转运蛋白2的医药用途

摘要

胆碱转运蛋白2的医药用途，涉及在心血管领域。主动脉夹层患者主动脉胆碱转运蛋白2表达显著上调。细胞及动物水平构建主动脉夹层模型，均发现平滑肌胆碱转运蛋白2表达升高。在人主动脉平滑肌中敲低胆碱转运蛋白2，平滑肌收缩型标记物水平下降，合成型标记物及基质金属蛋白酶升高，出现明显去分化。过表达胆碱转运蛋白2能降低基质金属蛋白酶活性，延缓主动脉夹层进程，提示胆碱转运蛋白2在主动脉夹层中发挥保护作用，有助于发现主动脉夹层新的标志物。本发明开拓了主动脉夹层新的防治方法，对于主动脉夹层的新型药物的研制提供了有意义的参考。

权利要求

1.主动脉平滑肌细胞中的胆碱转运蛋白2作为标志物在制备检测主动脉夹层试剂盒中的应用。

2.胆碱转运蛋白2作为标志物在筛选治疗主动脉夹层药物中的应用。

3.胆碱转运蛋白2在制备治疗主动脉夹层药物中的应用。

说明书

胆碱转运蛋白2的医药用途

技术领域

[0001] 本发明属于主动脉夹层防治技术领域，具体涉及调控胆碱转运蛋白2在主动脉夹层防治中的应用。

背景技术

[0002] 主动脉夹层是指主动脉内膜撕裂，血液经裂口流入主动脉壁，使中膜从外膜剥离，进而形成依附于血管壁的假腔。主动脉夹层的主要病理特征为血管基质降解以及弹性纤维层断裂，其病因分为遗传因素如基质金属蛋白酶Fibrillin 1、平滑肌肌动蛋白MYH11、TGF信号TGFβR1/2基因突变等，以及环境因素如动脉粥样硬化、高血压、吸烟及代谢等。多种发病因素如基质降解升高，尤其是基质金属蛋白酶2/9表达上调；慢性炎症；氧化应激；平滑肌细胞凋亡及平滑肌细胞的去分化均参与到主动脉夹层的发生。临床上用于主动脉夹层治疗的药物如β受体拮抗剂，血管紧张素转化酶抑制剂和钙离子通道拮抗剂等疗效不确切，大量临床研究显示这些一线药物不能改善主动脉夹层患者血管并发症的发生率和长期生存率。因此，找寻主动脉夹层新的干预靶点，对于动脉夹层的分子诊断及药物治疗具有重要意义。

[0003] 血管平滑肌细胞的去分化通常为主动脉夹层血管病变发生的第一步。生理状态下，血管壁中绝大多数平滑肌细胞均维持在一种收缩静息状态，对维持血管张力、形态发挥关键作用。而病理状态下，平滑肌细胞表型转换为合成型，从而引发血管重塑。合成型平滑肌细胞主要体现在收缩型标记蛋白的显著下调，基质金属蛋白酶过度活化从而使胞外基质过度降解，加速增殖迁移。此外，合成型的平滑肌细胞可分泌大量细胞外基质，促进炎症反应，使血管硬度增加发生血管钙化。因此明确平滑肌细胞去分化的分子机制，寻找治疗手段有效抑制平滑肌的表型转化十分关键。

[0004] 胆碱转运蛋白2是一种跨膜蛋白，主要位于细胞膜与线粒体膜上。研究报道在肿瘤细胞中，胆碱转运蛋白2参与胆碱的转运，与肿瘤细胞的增殖相关。此外，除了转运胆碱的功能外，胆碱转运蛋白2还参与体内的一些免疫反应，比如研究报道胆碱转运蛋白2在自身免疫性听力障碍和输血后急性肺损伤中发挥关键的调控作用。我们质谱筛选结果发现，在主动脉夹层患者的病人血管组织中胆碱转运蛋白2的蛋白水平明显增加，但是胆碱转运蛋白2在主动脉夹层血管病变中是否发生调控作用及具体作用机制尚不明确，同时，利用过表达胆碱转运蛋白2基因治疗在主动脉夹层是否发挥治疗作用也尚未报道。

发明内容

[0005] 解决的技术问题：本发明提供一种胆碱转运蛋白2的医药用途，可用于主动脉夹层防治。

[0006] 技术方案:胆碱转运蛋白2作为标志物在制备检测主动脉夹层试剂盒中的应用。

[0007] 胆碱转运蛋白2作为标志物在筛选治疗主动脉夹层药物中的应用。

[0008] 胆碱转运蛋白2在制备治疗主动脉夹层药物中的应用。

[0009] 有益效果：在人体样本、小鼠、细胞疾病模型(主动脉夹层)平滑肌中发现胆碱转运蛋白2均显著上调，提示胆碱转运蛋白2可作为检测主动脉夹层发生的标记物。通过表达胆碱转运蛋白2，可有效抑制基质金属蛋白酶2/9活性升高，从而抑制血管胞外基质过度降解，弹性纤维层断裂，延缓主动脉夹层疾病进程。过表达胆碱转运蛋白2，可抑制平滑肌细胞去分化，使收缩型标记物水平恢复，合成型标记物下降，从而恢复平滑肌正常的生理功能，提示胆碱转运蛋白2本身具有治疗作用，其可作为标志物应用于筛选治疗主动脉夹层药物。

附图说明

[0010] 图1为主动脉夹层患者及正常对照患者的蛋白表达情况示意图，其中A：Western blot检测主动脉夹层患者及正常对照患者主动脉中胆碱转运蛋白2、平滑肌收缩型标志物α平滑肌肌动蛋白/钙调蛋白-1表达，n＝5；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs正常对照。B：免疫荧光检测主动脉夹层患者及正常对照患者主动脉平滑肌中胆碱转运蛋白2表达。标尺为40μm，n＝2。

[0011] 图2为主动脉夹层模型鼠及正常对照小鼠血管蛋白表达示意图，ApoE-/-小鼠腹部皮下埋植微渗泵，实验组给予血管紧张素II，对照组给予生理盐水，皮下埋植时间为28天，构建血管紧张素II微渗泵诱导小鼠主动脉夹层模型。免疫荧光检测对照组及血管紧张素II微渗泵诱导主动脉夹层模型鼠主动脉平滑肌胆碱转运蛋白2的表达。标尺为40μm，n＝4。

[0012] 图3为主动脉夹层细胞模型蛋白表达示意图，其中A：人主动脉平滑肌细胞给予血管紧张素II(1μM)处理24小时，RT-PCR检测胆碱转运蛋白不同亚型(1～5)的mRNA水平，n＝4，**P<0.01vs对照组；B：人主动脉平滑肌细胞给予血管紧张素II(1μM)处理不同时间点(1小时～48小时)，Western blot检测胆碱转运蛋白2表达。n＝4，*P<0.05，**P<0.01vs 0h。

[0013] 图4为人主动脉平滑肌细胞转染胆碱转运蛋白2及对照小干扰24小时后，无血清培养基培养24小时，提取细胞RNA的检测示意图，其中A：检测人主动脉平滑肌细胞收缩型标志物的表达，n＝4；B：检测人主动脉平滑肌细胞合成型标志物的表达，n＝3；C：检测人主动脉平滑肌细胞中基质金属蛋白酶(MMP)不同亚型表达，n＝3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs对照组。

[0014] 图5为细胞水平敲低/过表达胆碱转运蛋白2后基质金属蛋白酶活性检测示意图，其中A：人主动脉平滑肌细胞中，转染胆碱转运蛋白2及对照小干扰24小时后，无血清培养基饥饿24小时，再给予AngII(1μM)处理24小时，原位酶谱检测基质金属蛋白酶2/9活性；B：人主动脉平滑肌细胞中，转染胆碱转运蛋白2及对照质粒24小时后，无血清饥饿24小时，再给予AngII(1μM)处理24小时，原位酶谱检测基质金属蛋白酶2/9活性。标尺为40μm，n＝5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

[0015] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0016] 实施例1：

[0017] 主动脉夹层的病理条件下，CTL2表达明显增加。

[0018] 首先，我们采用Western Blot检测发现，相比于对照组，平滑肌收缩型的标志物α平滑肌肌动蛋白及钙调蛋白-1的表达在主动脉夹层患者的血管组织中明显下降，同时，胆碱转运蛋白2(基因序列号：57153，链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝57153)的表达在主动脉夹层患者的血管组织中明显增加(图1：A)，进一步免疫荧光实验发现，胆碱转运蛋白2的表达主要在患者组织的平滑肌细胞中明显增加(图1：B)。我们在ApoE-/-小鼠中给予血管紧张素II微渗泵诱导主动脉夹层模型，取主动脉血管组织，免疫荧光同样发现，胆碱转运蛋白2在血管平滑肌细胞中表达明显增加(图2)。此外，我们在人主动脉平滑肌细胞中给予血管紧张素II处理构建主动脉夹层细胞模型，RT-PCR检测发现，五种胆碱转运蛋白亚型中，只有胆碱转运蛋白2表达明显增加(图3：A)；Western Blot同样发现，在AngII处理6h后，胆碱转运蛋白2蛋白表达明显增加(图3：B)。上述结果表明在主动脉夹层中，胆碱转运蛋白2表达增加，提示其参与到该病理过程中，且极大可能作为主动脉夹层发生的标记物，用于筛选治疗主动脉夹层药物。

[0019] 实施例2：

[0020] 细胞水平敲低胆碱转运蛋白2导致主动脉夹层，过表达胆碱转运蛋白2延缓主动脉夹层进程。

[0021] 我们进一步在人主动脉平滑肌细胞中，利用siRNA敲低胆碱转运蛋白2，RT-PCR检测发现，平滑肌细胞收缩性标志物Fbn1，Cnn1，Smth，Tagln，Acta2的表达明显下降，合成型标志物Opn，Klf4的表达明显增加，基质金属蛋白酶MMP2，MMP9的表达明显增加(图4)。原位酶谱实验检测发现，在人主动脉平滑肌细胞中给予血管紧张素II处理后，基质金属蛋白酶2/9活性明显增加；在此基础上，敲低胆碱转运蛋白2后，基质金属蛋白酶活性进一步增加，而利用质粒转染过表达胆碱转运蛋白2后(Lip3000转染)，基质金属蛋白酶活性受到抑制(图5)，逆转平滑肌细胞去分化。上述结果提示，胆碱转运蛋白2在主动脉夹层中发挥保护作用，过表达胆碱转运蛋白2延缓主动脉夹层疾病进程。