Adamtsl3作为腹主动脉瘤诊治标志物的应用

摘要

本发明公开了Adamtsl3作为腹主动脉瘤诊治标志物的应用，同时还公开了用于检测Adamtsl3的试剂、试剂盒。另外，本发明还公开了用于治疗腹主动脉瘤的方法和药物，上述研究成果为临床治疗腹主动脉瘤提供了新的策略和思路。

权利要求

1.检测Adamtsl3的产品在制备诊断腹主动脉瘤的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测Adamtsl3的产品包括检测样品中Adamtsl3基因表达量的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测Adamtsl3的产品包括能够定量样品中Adamtsl3基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中Adamtsl3蛋白的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量样品中Adamtsl3基因mRNA的产品包括特异扩增Adamtsl3基因的引物；所述能够定量样品中Adamtsl3蛋白的产品包括特异性结合Adamtsl3蛋白的抗体。

5.一种用于治疗腹主动脉瘤的药物，其特征在于，所述药物包括促进Adamtsl3表达的试剂，所述试剂包括含有Adamtsl3基因的载体或者宿主细胞。

6.促进Adamtsl3表达的试剂在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用，其特征在于，所述试剂包括含有Adamtsl3基因的载体或者宿主细胞。

说明书

Adamtsl3作为腹主动脉瘤诊治标志物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及Adamtsl3作为腹主动脉瘤诊治标志物的应用。

背景技术

[0002] 腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)为一种常见的慢性主动脉退行性疾病，常见于60岁以上的老年男性人群。目前，腹主动脉瘤在60岁以上老年男性人群中患病率为5％-10％。腹主动脉瘤发病率随着年龄的增长而逐渐上升，瘤体最大直径逐渐增大，发生破裂风险亦逐渐增高。腹主动脉瘤不断进展，晚期可以并发破裂出血，急诊死亡率高达90％。因此，腹主动脉瘤有高发病率，高致死率的特点，严重威胁中老年人群健康。

[0003] 目前，腹主动脉瘤的治疗目的在于降低其破裂出血的风险，动脉瘤切除+人工血管置换术以及腹主动脉瘤腔内隔绝术(EVAR)为最常采用的治疗方案。手术治疗(动脉瘤切除+人工血管置换术)创伤较大，并发症较多，EVAR治疗方案花费高昂且对动脉瘤形态、部位等解剖条件要求较高。因此，对于瘤体最大直径在5.0cm以上的腹主动脉瘤，因其破裂风险较高，指南推荐进行手术或EVAR干预；对于最大直径小于5.0cm的小腹主动脉瘤，其破裂风险较小，推荐进行以随访观察为基础的保守治疗方案。但是，在随访观察期间，超过40％的小腹主动脉瘤患者(最大直径小于5.0cm)在3年内因发生瘤体快速增大或者出现先兆破裂征象而需要行手术治疗或腔内修复进行干预。目前，尚无明确药物能够延缓小腹主动脉瘤的进展。因此，明确腹主动脉瘤的发生发展的机制，根据相关作用机制寻找合适靶点以及药物干预控制腹主动脉瘤进展，具有极其重大的临床意义。

发明内容

[0004] 根据本发明一个方面，本发明提供了检测Adamtsl3的产品在制备诊断腹主动脉瘤的工具中的应用。

[0005] 进一步，所述检测Adamtsl3的产品包括检测样品中Adamtsl3基因表达量的产品。

[0006] 更进一步，所述检测Adamtsl3的产品包括能够定量样品中Adamtsl3基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中Adamtsl3蛋白的产品。

[0007] 本发明的定量样品中Adamtsl3基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

[0008] 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

[0009] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

[0010] 所述能够定量样品中Adamtsl3基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增Adamtsl3基因的引物。

[0011] 产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

[0012] 如本文使用的，术语“引物”是指具有短的游离3′-末端羟基的核酸序列，其是短的核酸序列，可以与互补模板形成碱基对并用作模板链复制的起始点。在合适的缓冲液在合适的温度在存在用于聚合的试剂(例如，DNA聚合酶或反转录酶)和四种三磷酸核苷的情况下，引物可以起始DNA合成。PCR条件和有义和反义引物的长度可以根据本领域中已知技术适当选择。

[0013] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

[0014] 在本文使用的术语“基因”指编码功能蛋白质、多肽或者肽的单元。如本领域的技术人员所理解的，这一功能性的术语包括两个基因组序列、cDNA序列或者其片段或组合，以及基因的产物，包括可以经人工改变的那些。经纯化的基因、核酸、蛋白质等等用于指从至少一种通常与其相关的污染核酸或者蛋白质中鉴定并分离出来的这些实体。术语“等位基因”或者“等位基因形式”指编码同样的功能性蛋白的基因的可选择的形式，但是含有与同一基因的其他形式相关的核苷酸序列上的差异。

[0015] 如本文所使用的，“核酸”或者“核酸分子”指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)所产生的片段以及通过任意的连接、剪切、核酸内切酶和核酸外切酶活动产生的片段。核酸分子可以由天然产生的核苷酸的单体组成(例如DNA和RNA)，或者由天然产生的核苷酸的类似物组成(例如天然产生的核苷酸的α-对映体形式)，或者两者的组合组成。经修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或者嘌呤碱基部分上有改变。糖的修饰包括，例如将一个或者多个羟基以卤素、烷基、胺和叠氮基团替代，或者可以将糖功能化成为醚或者酯。除此之外，整个的糖部分可以用空间上和电子上类似的结构替换，如阿扎糖以及碳环的糖类似物。在碱基部分上修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或者其他公知的杂环替代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者该连接的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括连接到聚酰胺骨架上的天然产生的或者经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或者双链的。

[0016] 本发明的定量样品中Adamtsl3蛋白通过抗原-抗体反应测量。更特别是，抗原-抗体反应可以根据本领域已知的定量或定性免疫测定方案进行。免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(FACS)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。

[0017] 本发明的定量样品中Adamtsl3蛋白的产品包括特异性结合Adamtsl3蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量样品中Adamtsl3蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

[0018] 抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的Adamtsl3蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对Adamtsl3蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

[0019] 标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)
555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

[0020] 作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

[0021] 术语“组织样品”(术语“组织”与术语“组织样品”可交换地使用)应该理解为包括由一个或者多个细胞所组成的任意材料，其是单独的或者与任意的基质复合，或者与任意的化学物质结合。该定义应包括任意的生物或有机材料，以及任意的细胞的亚部分，其产物或者副产物。“组织样品”的定义应该理解为包括但不限于精子、卵子、胚胎和血液的组分。为了本发明的目的，术语“组织”还包括的是特定的非细胞结构如皮肤的真皮层，该真皮层来自于细胞但是不再具有细胞的特征。

[0022] 进一步，所述定量Adamtsl3基因或Adamtsl3蛋白的产品可以是检测Adamtsl3基因或Adamtsl3蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

[0023] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种诊断腹主动脉瘤的试剂盒，包括检测生物样本中Adamtsl3的试剂。

[0024] 上述试剂盒可用于检测生物样本中Adamtsl3的表达量。

[0025] 在其中一个实施例中，生物样本包括：获取自检测对象的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、血液、细胞中的至少一种。优先为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液、RNA提取物等适用于本检测的多种形式存在。

[0026] 在其中一个实施例中，该试剂盒包括免疫组化反应试剂。以免疫组化的方式检测Adamtsl3，具有直观、准确的效果。

[0027] 在其中一个实施例中，所述免疫组化反应试剂包括Adamtsl3单克隆或多克隆抗体。

[0028] 在其中一个实施例中，该试剂盒还包括对照样本，所述对照样本中含有预定量的Adamtsl3，作为判断Adamtsl3高表达或低表达的对照。

[0029] 通过含有预定量的Adamtsl3的对照样本的使用，便于病理学检视人员判断评估，区分Adamtsl3的低表达和高表达；并且，根据不同的评估目的，所预设的对照样本中Adamtsl3含量是不同的，需要根据对照目的和区分场景进行调整。

[0030] 在其中一个实施例中，该试剂盒包括检测生物样本中Adamtsl3编码mRNA试剂。这样的试剂盒可用于检测生物样本中mRNA的含量，该检测可以为定量检测、半定量检测或定性检测均可。

[0031] 根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诊断腹主动脉瘤的方法，其特征在于：所述方法包括将Adamtsl3作为检测的靶目标，当受试者体内有Adamtsl3低表达时，该受试者患有腹主动脉瘤或患有腹主动脉瘤的风险高。

[0032] 根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种治疗腹主动脉瘤的方法，其特征在于：所述方法包括将Adamtsl3作为靶目标，诱导和/或提高Adamtsl3表达，以治疗腹主动脉瘤。

[0033] 根据本发明的又一个方面，本发明提供了用于治疗腹主动脉瘤的药物，所述药物包括促进Adamtsl3表达的试剂。

[0034] 促进Adamtsl3表达的试剂不受限制，只要是可以促进Adamtsl3或涉及Adamtsl3上游或下游途径的物质的表达，且能够治疗腹主动脉瘤的药物即可。

[0035] 作为上述试剂的一个实例是：包含Adamtsl3基因的载体或者宿主细胞。

[0036] 本发明还提供了Adamtsl3在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

[0037] 本发明还提供了前面所述的促进Adamtsl3表达的试剂在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

[0038] 本发明的促进Adamtsl3表达的试剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的促进Adamtsl3表达的试剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把促进Adamtsl3表达的试剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

[0039] 本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

[0040] 本发明的药物的施用途径不受限制，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

[0041] 本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。

附图说明

[0042] 图1显示ROC曲线图；

[0043] 图2显示利用QPCR检测重组质粒过表达效果的统计图。

[0044] 具体的实施方式

[0045] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

[0046] 实施例1 Adamtsl3基因表达与腹主动脉瘤的关联性研究

[0047] 1、动物与处理

[0048] 雄性野生型C57BL/6J获自杰克逊实验室(Bar Harbor,Me)。在无病原体的隔离笼中饲养所有小鼠作为同窝仔对照。小鼠接受正常的实验室饮食。将10-12周龄的小鼠使用Alzet渗透微型泵(2004年，Durect Corporation)皮下注射生理盐水或血管紧张素II(AngII)，注射剂量为1000ng.kg-1.min-1(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将AAA小鼠和正常对照小鼠采用10％水合氯醛麻醉，75％酒精浸泡2min消毒。打开胸腔、腹腔，将脏器推至一边，暴露出心脏和主动脉，用纱布吸走血液。小心将心脏和主动脉全长剪下直至腹主动脉分叉处，立即放入0.01M PBS缓冲液中。分离脂肪组织及结缔组织，小心剪掉心脏，其间采用0.01M PBS缓冲液冲洗三次。将分离好的透明的主动脉纵向剪开，刮去内膜，获得主动脉组织。

[0049] 所有动物实验方案均经首都医科大学动物护理和使用委员会批准(20120109)，并且实验符合《实验室动物的护理和使用指南》(美国国立卫生研究院出版号85-23，1996)。

[0050] 2、RNA分离

[0051] 按照产品说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen，Life Technologies)分离总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)、2100生物分析仪(RNA6000Nano LabChip；安捷伦科技公司，Santa Clara,CA)、琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的纯度，浓度和完整性。

[0052] 3、实时定量PCR(RT-qPCR)分析

[0053] 使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)以500ng总RNA为模板合成cDNA(具体步骤参见产生说明书)。

[0054] 使用iCycler IQ系统(Bio-Rad)进行定量实时PCR(qPCR)。将cDNA样品稀释20倍，使用SYBR green JumpStart Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich)和100μM引物进行了实时PCR反应。然后，在ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems)中扩增了上述产物。扩增条件是：50℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒，共40次循环，然后59℃，1分钟。β-actin作为参考基因以标准化所有样品。

[0055] 引物序列如下：

[0056] Adamtsl3上游引物：5’-GATTCTCCACAGATAACATTG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-AGATAGGCTTCCGTAGTT-3’(SEQ ID NO.2)；

[0057] β-actin上游引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCCC-3’(SEQ ID NO.4)。

[0058] 4、统计分析

[0059] 应用SPSS 20.0统计软件分析，计量数据以均数±标准差表示，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

[0060] 5、结果

[0061] 结果显示，50只AAA小鼠中80％的小鼠Adamtsl3基因表达下调；50例对照组小鼠中10％的小鼠Adamtsl3基因表达下调。统计结果显示，相比对照组，AAA组小鼠Adamtsl3基因表达显著下调，设定对照组相对表达量为1，2-△△CT法计算的AAA组Adamtsl3基因相对表达量的平均值约为0.142，组间差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示，Adamtsl3基因在区分AAA患者和正常对照时，其AUC值是0.892(图1)。统计结果见表1。

[0062] 表1 ROC结果统计

[0063]

[0064] 实施例2 Adamtsl3基因表达对主动脉平滑肌细胞功能的影响

[0065] 一、Adamtsl3基因过表达

[0066] 1、人主动脉平滑肌细胞的培养

[0067] T/G HA-VSMC细胞(简称HVSMC细胞)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中进行培养，取对数生长期细胞进行实验。

[0068] 2、细胞转染

[0069] 根据Gen Bank数据库中Adamtsl3基因序列设计扩增引物，并在扩增引物中引入BamHⅠ切点和HindⅢ切点，BamHⅠ+HindⅢ消化pcDNA3.1(-)载体，分别纯化回收目的片段。连接线性化载体和目标基因序列，转化DH5α感受态细胞，挑克隆，双酶切鉴定，得到包含完整Adamtsl3基因序列的pcDNA3.1(-)-Adamtsl3表达载体，用无内毒素试剂盒大量制备质粒。将LipofectamineTM 2000室温放置5min后与重组质粒或pcDNA3.1(-)空载体混合并室温放置20min形成转染复合物。转染前取对数生长期细胞悬浮于无抗生素培养基，转染时细胞密
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度达到(8～16)×10/ml，接种于96孔板，每孔2×10 个细胞，终体积为100μl。对照组转染pcDNA3.1(-)空载体，实验组转染pcDNA3.1(-)-Adamtsl3表达载体。每组设6个平行孔，每孔终体积为2ml。转染后置37℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中继续培养48h。

[0070] 3、实时定量PCR(RT-qPCR)分析

[0071] 步骤基本同实施例1，根据CT值通过公式2-ΔΔCt进行相对定量分析计算得mRNA相对表达量。

[0072] 引物序列：

[0073] Adamtsl3上游引物：5’-AGATACAGATACAGAATCCTACAA-3’(SEQ ID NO.5)；下游引物：5’-GCATACAGCACAGAAGAAC-3’(SEQ ID NO.6)；

[0074] β-actin上游引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)，下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.8)。

[0075] 4、结果

[0076] 结果如图2所示，本发明构建的重组质粒能成功表达Adamtsl3。

[0077] 二、基因对平滑肌细胞凋亡的影响

[0078] 1、步骤

[0079] 使用血管紧张素II(A9525，购自SIGMA)诱导平滑肌细胞凋亡。

[0080] 按照前面的步骤培养和转染，转染24小时后，加入血管紧张素II(终浓度为10μM)刺激细胞24h后，之后使用碧云天公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(货号：C1091)测定细胞凋亡情况，按照操作说明书进行。

[0081] 2、结果

[0082] 10μM血管紧张素II刺激组TUNEL染色阳性细胞百分数为(32.8±4.3)％，与未刺激对照组(11.2±1.9)％相比差异具有统计学意义(P<0.05)。在10μM血管紧张素II刺激的条件下，pcDNA3.1(-)组TUNEL染色阳性细胞百分数为(35.4±5.8)％，而pcDNA3.1(-)-Adamtsl3组TUNEL染色阳性细胞百分数为(19.7±2.2)％，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，Adamtsl3基因过表达可以有效抑制平滑肌细胞凋亡，故基因可成为治疗AAA的药物靶标。

[0083] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。