一种吡啶并[2,3-d]嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202010105708.9
文献号 : CN111205287B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 刘新泳 , 康东伟 , 展鹏 , 汪昭 , 李国雄
申请人 : 山东大学
摘要 :
本发明涉及一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3及其制备方法和应用。所述化合物结构如下。本发明还涉及含有WB3的药物组合物。本发明还提供上述化合物以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。
权利要求 :
1.一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3，或其药学上可接受的盐，其特征在于具有如下所示的结构：
2.如权利要求1所述的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3，其特征在于所述化合物的药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐，以及WB3药学上可接受的衍生物。
3.如权利要求1所述的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3的制备方法，其特征在于，步骤包括：以2,4‑二氯吡啶并[2,3‑d]嘧啶1为初始原料，首先在N,N‑二甲基甲酰胺溶液中与(E)‑3,5‑二甲基‑4‑羟基苯丙烯腈经亲核取代生成中间体2；然后中间体2与N‑Boc‑4‑氨基哌啶反应生成中间体3，进而在三氟乙酸中脱去Boc保护基团得到关键中间体4；
最后4与4‑(甲磺酰基)苄溴反应生成目标产物WB3；合成路线如下：试剂及条件:(i)(E)‑3,5‑二甲基‑4‑羟基苯丙烯腈，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；
(ii)N‑Boc‑4‑氨基哌啶，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，100℃；(iii)二氯甲烷，三氟乙酸，室温；(iv)4‑(甲磺酰基)苄溴，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，25℃。
4.一种如权利要求1所述吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。
5.一种药物组合物，包含权利要求1所述吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
说明书 :
一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂及其制备方
法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 艾滋病(AIDS)是由人体免疫缺陷病毒1型(HIV‑1)感染并导致人体防御机能缺陷(尤其是细胞介导的免疫机能缺陷)，而易于发生机会性感染和肿瘤的临床综合征，属于“重
大新药创制”科技重大专项列出的10类严重危害我国人民健康的重大疾病之一。目前我国
HIV/AIDS流行已经进入快速增长期，且滋病防治工作面临一些新的挑战，如男性同性性行
为人群疫情上升明显，配偶间传播增加；抗艾滋病病毒治疗耐药增多加大了治疗的压力和
难度等。另外，我国用于免费临床治疗的抗HIV药物大多为专利过期的仿制药物，品种少，价
格贵，且毒副作用大，无法满足患者的临床需求。因此，立足自主创新，研发具有自主知识产
权的抗艾滋病的原创药物，为国民提供安全、有效和价廉的药物，是我国医药发展的一项重
大战略。
大新药创制”科技重大专项列出的10类严重危害我国人民健康的重大疾病之一。目前我国
HIV/AIDS流行已经进入快速增长期，且滋病防治工作面临一些新的挑战，如男性同性性行
为人群疫情上升明显，配偶间传播增加；抗艾滋病病毒治疗耐药增多加大了治疗的压力和
难度等。另外，我国用于免费临床治疗的抗HIV药物大多为专利过期的仿制药物，品种少，价
格贵，且毒副作用大，无法满足患者的临床需求。因此，立足自主创新，研发具有自主知识产
权的抗艾滋病的原创药物，为国民提供安全、有效和价廉的药物，是我国医药发展的一项重
大战略。
[0003] HIV‑1逆转录酶(reverse transcriptase，RT)在该病毒的复制周期中具有关键性的作用，使其成为抗HIV‑1药物研发的重要靶点。作用于RT的抑制剂主要分为核苷类逆转录
酶抑制剂(Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NRTIs)和非核苷类逆转录酶
抑制剂(Non‑nucleoside Reverse Transcriptase inhibitors,NNRTIs)。其中，NNRTIs由
于其活性高、选择性强、毒性低等诸多优点，是目前治疗艾滋病高效抗逆转录病毒疗法
(HAART)重要组成部分。但是NNRTIs在临床治疗出现的耐药性以及药代动力学性质差的问
题限制了该类药物的临床应用。因此，研发新型高效、抗耐药性强且具有良好药代动力学性
质的新型NNRTI是目前抗艾滋病药物研究的重要方向之一。
酶抑制剂(Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NRTIs)和非核苷类逆转录酶
抑制剂(Non‑nucleoside Reverse Transcriptase inhibitors,NNRTIs)。其中，NNRTIs由
于其活性高、选择性强、毒性低等诸多优点，是目前治疗艾滋病高效抗逆转录病毒疗法
(HAART)重要组成部分。但是NNRTIs在临床治疗出现的耐药性以及药代动力学性质差的问
题限制了该类药物的临床应用。因此，研发新型高效、抗耐药性强且具有良好药代动力学性
质的新型NNRTI是目前抗艾滋病药物研究的重要方向之一。
发明内容
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3及其制备方法，本发明还提供了WB3作为HIV‑逆转录酶抑制剂的活性筛选结果和应
用。
用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 1.一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3
[0007] 一种吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3，或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有如下所示的结构：
[0008]
[0009] 2.吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3的制备方法
[0010] 吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3的制备方法，步骤包括：以2,4‑二氯吡啶并[2,3‑d]嘧啶1为初始原料，首先在N,N‑二甲基甲酰胺溶液中与(E)‑3,5‑二甲基‑
4‑羟基苯丙烯腈经亲核取代生成中间体2；然后中间体2与N‑Boc‑4‑氨基哌啶反应生成中间
体3，进而在三氟乙酸中脱去Boc保护基团得到关键中间体4；最后4与4‑(甲磺酰基)苄溴反
应生成目标产物WB3。
4‑羟基苯丙烯腈经亲核取代生成中间体2；然后中间体2与N‑Boc‑4‑氨基哌啶反应生成中间
体3，进而在三氟乙酸中脱去Boc保护基团得到关键中间体4；最后4与4‑(甲磺酰基)苄溴反
应生成目标产物WB3。
[0011] 合成路线如下：
[0012]
[0013] 试剂及条件:(i)(E)‑3,5‑二甲基‑4‑羟基苯丙烯腈，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(ii)N‑Boc‑4‑氨基哌啶，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，100℃；(iii)二氯甲烷，三氟乙
酸，室温；(iv)4‑(甲磺酰基)苄溴，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，25℃。
酸，室温；(iv)4‑(甲磺酰基)苄溴，N,N‑二甲基甲酰胺，碳酸钾，25℃。
[0014] 3.吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3的抗HIV‑1活性及应用
[0015] 本发明对按照上述方法合成的部分吡啶并嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗HIV‑1野生株(NL4‑3)，HIV‑1多突变株GH9(K101P+K103N+V108I)、RV1(K101E+Y181V)、RV2
(K101E+Y181C+G190A)、RV3(K101E+Y181C+E138K)、RV4(L100I+M230I)、RV5(M230L)的活性
筛选，以利匹韦林(RPV)为阳性对照。
(K101E+Y181C+G190A)、RV3(K101E+Y181C+E138K)、RV4(L100I+M230I)、RV5(M230L)的活性
筛选，以利匹韦林(RPV)为阳性对照。
[0016] 活性结果如表1所示，WB3对HIV‑1野生株(NL4‑3)和多数针对最新上市药物RPV的多突变株表现出极强的抗病毒活性。尤其是对针对临床出现的RPV超级耐药株GH9(K101P+
K103N+V108I)，WB3的活性为1.37nM，远优于RPV(EC50>273nM)。活性结果表明吡啶并[2,3‑d]
嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3具有极大的研究与开发价值，可作为抗HIV‑1的先导化合
物进行进一步的成药性评价。
K103N+V108I)，WB3的活性为1.37nM，远优于RPV(EC50>273nM)。活性结果表明吡啶并[2,3‑d]
嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3具有极大的研究与开发价值，可作为抗HIV‑1的先导化合
物进行进一步的成药性评价。
[0017] 本发明对化合物WB3进行了大鼠体内初步的成药性评价，结果如表2所示。初步的药代动力学试验显示WB3在大鼠体内达峰时间为0.4小时，半衰期为1.77小时，口服的最大
血药浓度(Cmax)高达9934ng/mL，且显示出良好的口服生物利用度(F＝59.9％)。这些结果表
明WB3可以作为制备抗艾滋候选药物进行规范化的临床前评价。
血药浓度(Cmax)高达9934ng/mL，且显示出良好的口服生物利用度(F＝59.9％)。这些结果表
明WB3可以作为制备抗艾滋候选药物进行规范化的临床前评价。
[0018] 本发明的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3可作为抗艾滋病药物候选药物用于制备抗艾滋病药物。
[0019] 一种抗HIV‑1药物组合物，包括本发明的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
[0020] 本发明提供了结构全新的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3及其制备方法，本发明还提供了WB3抗HIV‑1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过
试验证明，本发明的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3可作为制备抗艾滋病
候选药物应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV‑1抑制剂用于制备抗艾滋病药
物。
试验证明，本发明的吡啶并[2,3‑d]嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂WB3可作为制备抗艾滋病
候选药物应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV‑1抑制剂用于制备抗艾滋病药
物。
具体实施方式
[0021] 通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
[0022] 实施例1：(E)‑3‑(4‑((2‑氯吡啶基[2,3‑d]嘧啶‑4‑基)氧基)‑3,5‑二甲基苯基)丙烯腈(2)的制备
[0023]
[0024] 称取(E)‑3,5‑二甲基‑4‑羟基苯丙烯腈(1.73g,10mmol)和碳酸钾(1.7g,12mmol)于30mL的DMF中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4‑二氯吡啶并[3,2‑d]嘧啶1(2.2g,10mmol)
继续室温搅拌2h(TLC检测反应完毕)。待有大量白色固体生成，慢慢向其中加入100mL冰水，
1
过滤，真空干燥箱干燥，乙醇中重结晶得中间体2。白色固体，收率86％。H NMR(400MHz,
DMSO‑d6)δ9.31(dd,J＝4.2,2.0Hz,1H,C5‑pyridopyrimidine‑H),8.94(dd,J＝8.2,1.9Hz,
1H,C7‑pyridopyrimidine‑H),7.87(dd,J＝8.4,4.5Hz,1H,C6‑pyridopyrimidine‑H),7.71–
7.59(m,1H,ArCH＝),7.56(s,2H,C3,C5‑Ph‑H),6.49(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.12(s,6H,
CH3×2).ESI‑MS:m/z 337.2(M+1).C18H13ClN4O(336.08).
继续室温搅拌2h(TLC检测反应完毕)。待有大量白色固体生成，慢慢向其中加入100mL冰水，
1
过滤，真空干燥箱干燥，乙醇中重结晶得中间体2。白色固体，收率86％。H NMR(400MHz,
DMSO‑d6)δ9.31(dd,J＝4.2,2.0Hz,1H,C5‑pyridopyrimidine‑H),8.94(dd,J＝8.2,1.9Hz,
1H,C7‑pyridopyrimidine‑H),7.87(dd,J＝8.4,4.5Hz,1H,C6‑pyridopyrimidine‑H),7.71–
7.59(m,1H,ArCH＝),7.56(s,2H,C3,C5‑Ph‑H),6.49(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.12(s,6H,
CH3×2).ESI‑MS:m/z 337.2(M+1).C18H13ClN4O(336.08).
[0025] 实施例2：(E)‑3‑(3,5‑二甲基‑4‑((2‑(哌啶‑4‑基氨基)吡啶基[2,3‑d]嘧啶‑4‑基)氧基)苯基)丙烯腈(4)的制备
[0026]
[0027] 依次将2(1.06g,3.17mmol)，N‑Boc‑4‑氨基哌啶(0.83g,3.80mmol)与碳酸钾(0.87g,6.33mmol)加入到10mL的DMF中，然后加热回流8h(TLC检测)。待反应冷却至室温，慢
慢将反应液滴加到50mL饱和氯化钠溶液中，有大量黄色固体生成。过滤，真空干燥得粗品3。
称取粗品3(1.28g,2.53mmol)溶于6mL二氯甲烷中，加入2.30mL三氟乙酸(30mmol)，室温条
件下搅拌4h(TLC检测)。然后用饱和的碳酸氢钠溶液调节反应液PH为9，二氯甲烷萃取(3×
15mL)，饱和氯化钠溶液洗涤，分取有机层，无水硫酸钠干燥。然后进行快速柱层析分离得中
1
间体4。白色固体，收率39％。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.88(d,J＝4.3Hz,1H,C5‑
pyridopyrimidine‑H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H,C7‑pyridopyrimidine‑H),7.63(dd,J＝
16.0,7.1Hz,2H,C6‑pyridopyrimidine‑H,ArCH＝),7.52(s,2H,C3,C5‑Ph‑H),7.39–7.23(m,
1H,NH),6.45(d,J＝16.5Hz,1H,＝CHCN),4.12(s,1H,piperidine‑H),3.28(s,1H),3.03(t,
J＝12.5Hz,2H,piperidine‑H),2.11(s,6H,CH3×2),2.04(d,J＝14.6Hz,2H,piperidine‑
+
H),1.91–1.09(m,4H,piperidine‑H).ESI‑MS:m/z 401.4[M+1] .C23H24N6O(400.20).
慢将反应液滴加到50mL饱和氯化钠溶液中，有大量黄色固体生成。过滤，真空干燥得粗品3。
称取粗品3(1.28g,2.53mmol)溶于6mL二氯甲烷中，加入2.30mL三氟乙酸(30mmol)，室温条
件下搅拌4h(TLC检测)。然后用饱和的碳酸氢钠溶液调节反应液PH为9，二氯甲烷萃取(3×
15mL)，饱和氯化钠溶液洗涤，分取有机层，无水硫酸钠干燥。然后进行快速柱层析分离得中
1
间体4。白色固体，收率39％。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.88(d,J＝4.3Hz,1H,C5‑
pyridopyrimidine‑H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H,C7‑pyridopyrimidine‑H),7.63(dd,J＝
16.0,7.1Hz,2H,C6‑pyridopyrimidine‑H,ArCH＝),7.52(s,2H,C3,C5‑Ph‑H),7.39–7.23(m,
1H,NH),6.45(d,J＝16.5Hz,1H,＝CHCN),4.12(s,1H,piperidine‑H),3.28(s,1H),3.03(t,
J＝12.5Hz,2H,piperidine‑H),2.11(s,6H,CH3×2),2.04(d,J＝14.6Hz,2H,piperidine‑
+
H),1.91–1.09(m,4H,piperidine‑H).ESI‑MS:m/z 401.4[M+1] .C23H24N6O(400.20).
[0028] 实施例3：(E)‑3‑(3,5‑二甲基‑4‑((2‑((1‑(4‑(甲基磺酰基)苄基)哌啶‑4‑基)氨基)吡啶基][2,3‑d]嘧啶‑4‑基)氧基)苯基)丙烯腈(WB3)的制备
[0029]
[0030] 称取化合物4(0.20g,0.5mmol)于5mLDMF中，然后依次加入碳酸钾(0.14g,1.0mmol)与4‑(甲磺酰基)苄溴(0.15g,0.6mmol)，室温搅拌4h(TLC检测)。向反应液中加入
饱和氯化钠溶液20mL,乙酸乙酯洗涤(3×10mL)，分取有机层，无水硫酸钠干燥。然后经快速
柱层析分离得到目标化合物粗品，进而在乙酸乙酯‑石油醚体系中重结晶得到目标化合物
1
WB3。白色固体，收率75％。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.84(d,J＝4.3Hz,1H,C5‑
pyridopyrimidine‑H),8.49(d,J＝7.9Hz,1H,C7‑pyridopyrimidine‑H),7.87(d,J＝
7.9Hz,2H,C3,C5‑Ph′‑H),7.63(s,1H,ArCH＝),7.57(d,J＝8.0Hz,2H,C2,C6‑Ph′‑H),7.50
(s,2H,C3,C5‑Ph″‑H),7.39(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.25(dd,J＝8.1,4.6Hz,1H,C6‑
pyridopyrimidine‑H),6.43(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),3.85(d,J＝10.6Hz,1H,
piperidine‑H),3.57(s,2H,N‑CH2),3.20(s,3H,SO2CH3),2.79(d,J＝11.1Hz,2H,
piperidine‑H),2.10(s,6H,CH3×2),1.99(s,1H,piperidine‑H),1.82(d,J＝12.2Hz,2H,
piperidine‑H),1.66–1.35(m,2H,piperidine‑H),1.18(t,J＝7.1Hz,1H,piperidine‑H)
13
. C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ166.1,162.4,159.9,157.4,151.8,150.3,145.4,139.8,
133.5,131.9,131.5,129.8,128.7,127.4,119.3,118.3,105.4,97.0,61.9,52.8,48.5,
+
44.0,40.6,40.4,40.2,40.0,39.7,39.5,39.3,31.5,16.6.ESI‑MS:m/z 569.5[M+1]
.C31H32N6O3S(568.22).
饱和氯化钠溶液20mL,乙酸乙酯洗涤(3×10mL)，分取有机层，无水硫酸钠干燥。然后经快速
柱层析分离得到目标化合物粗品，进而在乙酸乙酯‑石油醚体系中重结晶得到目标化合物
1
WB3。白色固体，收率75％。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.84(d,J＝4.3Hz,1H,C5‑
pyridopyrimidine‑H),8.49(d,J＝7.9Hz,1H,C7‑pyridopyrimidine‑H),7.87(d,J＝
7.9Hz,2H,C3,C5‑Ph′‑H),7.63(s,1H,ArCH＝),7.57(d,J＝8.0Hz,2H,C2,C6‑Ph′‑H),7.50
(s,2H,C3,C5‑Ph″‑H),7.39(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.25(dd,J＝8.1,4.6Hz,1H,C6‑
pyridopyrimidine‑H),6.43(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),3.85(d,J＝10.6Hz,1H,
piperidine‑H),3.57(s,2H,N‑CH2),3.20(s,3H,SO2CH3),2.79(d,J＝11.1Hz,2H,
piperidine‑H),2.10(s,6H,CH3×2),1.99(s,1H,piperidine‑H),1.82(d,J＝12.2Hz,2H,
piperidine‑H),1.66–1.35(m,2H,piperidine‑H),1.18(t,J＝7.1Hz,1H,piperidine‑H)
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. C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ166.1,162.4,159.9,157.4,151.8,150.3,145.4,139.8,
133.5,131.9,131.5,129.8,128.7,127.4,119.3,118.3,105.4,97.0,61.9,52.8,48.5,
+
44.0,40.6,40.4,40.2,40.0,39.7,39.5,39.3,31.5,16.6.ESI‑MS:m/z 569.5[M+1]
.C31H32N6O3S(568.22).
[0031] 实施例4：目标化合物的体外抗HIV活性测试实验
[0032] 实验原理
[0033] 荧光素酶报告基因实验：通过检测病毒感染后TZM‑bl细胞荧光素酶基因表达的减少来测定待测化合物对病毒株(nef基因缺失的HIV‑1NL4‑3)的抑制。
[0034] 测试材料
[0035] 化合物WB3与利匹韦林，nef基因缺失的HIV‑1NL4‑3病毒株，TZM‑bl细胞
[0036] 实验方法
[0037] 在TZM‑bl细胞中的抗HIV‑1感染试验
[0038] 以单轮病毒感染TZM‑bl细胞后荧光素酶基因表达水平的降低程度来测定化合物对HIV‑1感染的抑制活性。在不同浓度的化合物WB3存在下，使用200TCID50的病毒(NL4‑3)感
染TZM‑bl细胞。感染2天后，移除培养液，并向每孔中加入100μL Bright Glo试剂(Promega，
San Luis Obispo，CA)再使用Victor 2光度计检测其荧光活性。化合物抑制HIV‑1菌株的有
效浓度(EC50)定义为与病毒对照孔相比导致荧光素酶活性(相对光单位)降低50％的浓度。
染TZM‑bl细胞。感染2天后，移除培养液，并向每孔中加入100μL Bright Glo试剂(Promega，
San Luis Obispo，CA)再使用Victor 2光度计检测其荧光活性。化合物抑制HIV‑1菌株的有
效浓度(EC50)定义为与病毒对照孔相比导致荧光素酶活性(相对光单位)降低50％的浓度。
[0039] 细胞毒性试验
[0040] 使用CytoTox‑GloTM荧光细胞毒性试剂盒(购自Promega)测定合成化合物的细胞毒性。与抗HIV‑1活性试验平行测定，TZM‑bl细胞在不同浓度的化合物WB3的存在下培养1天。
然后根据试剂盒要求的操作步骤，确定所测试目标化合物的细胞毒性(CC50)，即目标化合物
使细胞生存率降低50％时所需的浓度。实验结果如表1所示。
然后根据试剂盒要求的操作步骤，确定所测试目标化合物的细胞毒性(CC50)，即目标化合物
使细胞生存率降低50％时所需的浓度。实验结果如表1所示。
[0041] 表1.化合物WB3的抗HIV活性及毒性
[0042]
[0043] a EC50:抑制50％的病毒诱导的致细胞突变效应的化合物浓度或保护50％感染病毒的细胞免于细胞病变的化合物浓度。
[0044] b CC50：使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度。
[0045] 实施例5：目标化合物WB3的体外药代动力学实验
[0046] 材料和仪器
[0047] 色谱甲醇购自Sigma‑Aldrich，肝素购自山东大学齐鲁医院，纯净水为哇哈哈集团生产。Eppendorf 5415D型离心机；Agilent 1200LC/MSD液相色谱质谱联用仪；移液枪
(IKA)；大鼠灌胃针。健康雄性SD大鼠，体重220g，购自山东大学实验动物中心。动物在适宜
条件下(温度：25±1℃，湿度60±5％)于饲养室饲养1周，期间自由进食和进水。实验前禁食
12h，自由进水。实验完毕后所有动物均按照医药科学委员会动物实验职业道德的规定处死
动物。
(IKA)；大鼠灌胃针。健康雄性SD大鼠，体重220g，购自山东大学实验动物中心。动物在适宜
条件下(温度：25±1℃，湿度60±5％)于饲养室饲养1周，期间自由进食和进水。实验前禁食
12h，自由进水。实验完毕后所有动物均按照医药科学委员会动物实验职业道德的规定处死
动物。
[0048] 试验方法
[0049] 10只雄性SD大鼠随机分成2组，每组5只。给药前禁食12h，自由饮水。WB3单次口服剂量为20mg/kg，在给药前以70％的PEG400和30％的生理盐水配制成给药制剂。灌胃后分别
在5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h和14h，经锁骨静脉窦采血约0.2mL，血样置于肝
素化的离心管中，2200g离心15min后，取上清血浆样品保存于‑20℃备用。对WB3进行尾静脉
注射试验，剂量2mg/kg。注射后分别在2min、5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、6h和8h，经
锁骨静脉窦采血约0.2mL，血样处理同前。
在5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h和14h，经锁骨静脉窦采血约0.2mL，血样置于肝
素化的离心管中，2200g离心15min后，取上清血浆样品保存于‑20℃备用。对WB3进行尾静脉
注射试验，剂量2mg/kg。注射后分别在2min、5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、6h和8h，经
锁骨静脉窦采血约0.2mL，血样处理同前。
[0050] 用LC‑MS分析方法进行血浆样品中WB3浓度的分析测定。使用DAS 2.0药代动力学程序的非房室模型对测定的血浆药‑时数据进行拟合分析，计算主要药代动力学参数Cmax、
AUC、Tmax、T1/2、MRT、CL等参数，并绘制出平均血药浓度‑时间曲线。按照如下公式进行生物利
用度的计算：
AUC、Tmax、T1/2、MRT、CL等参数，并绘制出平均血药浓度‑时间曲线。按照如下公式进行生物利
用度的计算：
[0051] F(％)＝[AUC(po)×Div]/[AUC(iv)×Dpo]×100％
[0052] AUC：曲线下面积；D：给药剂量(mg/kg)
[0053] 实验结果如表2所示。
[0054] 表2.化合物WB3的成药性评价表
[0055]