一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途

摘要

本发明公开了一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途，属于基因工程技术领域。本发明中的信号肽突变体是将来源于革兰氏阳性菌Sec途径的信号肽N区的带电荷氨基酸进行定点突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8之间；对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性在0～70之间；对所述信号肽C区的氨基酸进行定点突变，使C区最后三位氨基酸突变为丙氨酸‑任意氨基酸‑丙氨酸。本发明可以有效提高异源蛋白在微生物宿主中的分泌量，有效推动了目的蛋白的高效表达及工业化生产。

权利要求

1.一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体，其特征在于：所述信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.编码权利要求1所述信号肽突变体的基因。

3.权利要求1所述信号肽突变体在提高异源蛋白分泌表达中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述异源蛋白为碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述信号肽突变体的编码基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求1所述信号肽突变体的编码基因或权利要求5所述重组载体。

7.一种异源蛋白的生产方法，其特征在于：步骤如下：

将含有权利要求1所述信号肽突变体的编码基因以及异源蛋白的编码基因的基因工程菌经活化后以1.5-5％的接种量转接于发酵培养基中，于34-40℃、215-225r/min发酵培养

20-50h；所述发酵培养基组成为：玉米粉60-70g/L，豆饼粉30-50g/L，磷酸氢二钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.1-0.6g/L，高温淀粉酶0.5-1.0g/L，余量为水；

或者发酵培养基组成为：木聚糖8-12g/L，蛋白胨2-8g/L，酵母粉1-1.5g/L，K2HPO41-3g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.4g/L，氯化钠2-8g/L，琼脂粉10-20g/L，余量为水；

或者发酵培养基组成为：葡萄糖6-12g/L，蛋白胨8-16g/L，酵母膏20-30g/L，磷酸氢二钠8-14g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，余量为水，p H 7.0-7.5。

8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述异源蛋白为碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述发酵培养基组成为：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠

4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L，余量为水，pH自然。

说明书

一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与

用途

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途。

背景技术

[0002] 工业酶和生物制药蛋白等重组蛋白具有非常广阔的应用市场。目前人们已经研究出多种原核和真核表达系统来生产重组蛋白。其中，细菌具有容易处理、基因操作工具多等优点，更多地被用来当作重组蛋白的表达宿主。然而，异源蛋白在宿主中的表达往往会形成不溶性的包涵体，且容易被蛋白酶降解，这些都使得异源蛋白难以规模化生产。而将重组蛋白分泌到细菌宿主的生长介质中，则可以有效防止重组蛋白在胞浆中形成不溶性包涵体。另外，重组蛋白的分泌可以减轻该蛋白对生产宿主的毒性作用，可以简化产品下游处理步骤，显著降低生产成本。因此在生产过程中，人们希望能够将重组蛋白高效地分泌到细菌表达宿主的培养上清液中。

[0003] 信号肽(signal peptide，缩写为SP)是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，多数位于分泌蛋白的N末端，其长度通常为16～30个氨基酸残基。信号肽包含三个区域：N区、H区和C区。N区由1～5个带正电荷的氨基酸残基组成，与带负电荷的磷脂相互作用。信号肽的中间部分是H区，由7～15个疏水性氨基酸残基构成。C区长度通常是3～7个氨基酸，主要包括能被信号肽酶识别并切割的亲水性氨基酸。在异源蛋白的分泌过程中，信号肽的性质对异源蛋白的分泌量起着关键的作用。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种利用定点突变对信号肽进行改造，从而提高异源蛋白在细菌宿主中的分泌量的方法。

[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体，所述突变体是将来源于革兰氏阳性菌的Sec途径的信号肽N区的带电荷氨基酸进行定点突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8；对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性为0～70；对所述信号肽C区的氨基酸进行定点突变，使C区最后三位氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸。本发明可以有效提高异源蛋白在微生物宿主中的分泌量。

[0007] 其中，信号肽N区电荷密度的计算方法为：氨基酸R、K所带电荷量为+1，氨基酸D、E所带电荷量为-1，其余氨基酸所带电荷量为0。N区氨基酸的电荷总数除以N区氨基酸总个数所得值为N区电荷密度。

[0008] 其中，信号肽H区氨基酸疏水性计算采用Kyte-Doolittle方法，氨基酸对应的疏水值如下表：

[0009] 表1不同氨基酸对应的疏水值

[0010]

[0011] 优选地，对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性为0-38。

[0012] 更优选地，对所述信号肽H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性为20-38。

[0013] 优选地，对所述信号肽N区的带电荷氨基酸进行定点突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.25-0.45。

[0014] 优选地，所述信号肽来源于枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

[0015] 优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，来源于解淀粉芽孢杆菌。

[0016] 优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，来源于枯草芽孢杆菌。

[0017] 优选地，所述信号肽的原始氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，来源于枯草芽孢杆菌。

[0018] 优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：2所示的原始氨基酸序列的基础上，将其C区最后三位氨基酸由TSA突变为ASA，信号肽突变前后，N区电荷密度均为0.42，H区疏水性均为36，得到信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0019] 优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：6所示的原始氨基酸序列的基础上，将所述信号肽的N区电荷密度由0.5突变为0.29，H区疏水性由72.9突变为35.7，C区最后三位氨基酸由GRA突变为AHA，得到信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

[0020] 优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：9所示的原始氨基酸序列的基础上，将所述信号肽的N区电荷密度由0.1突变为0.67，H区疏水性由38.5突变为40.5，C区最后三位氨基酸由VFS突变为ADA，得到信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

[0021] 优选地，所述信号肽的突变体的氨基酸序列是在如序列SEQ ID NO：9所示的原始氨基酸序列的基础上，将所述信号肽的N区电荷密度由0.1突变为0.67，H区疏水性由38.5突变为35.8，C区最后三位氨基酸由VFS突变为ADA，得到信号肽突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

[0022] 本发明的第二个目的是提供所述信号肽突变体在提高异源蛋白分泌表达中的用途。

[0023] 优选地，所述目的异源蛋白为碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶，来源于克劳氏芽孢杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0024] 所述碱性蛋白酶的编码基因为基因aprE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，其GenBank:FJ940727.1。

[0025] 优选地，所述目的异源蛋白为碱性木聚糖酶，来源于短小芽孢杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

[0026] 所述碱性木聚糖酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，其GenBank:KU301789.1。

[0027] 优选地，所述目的异源蛋白为角质酶，来源于腐皮镰孢霉菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

[0028] 所述角质酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，其GenBank:AAA33335.1。

[0029] 本发明的第三个目的是提供一种含有所述信号肽突变体的编码基因的重组载体。

[0030] 优选地，所述重组载体所用的表达载体为pWB980或PUB110。

[0031] 本发明的第五个目的是提供一种含有所述重组载体或所述信号肽突变体编码基因的宿主细胞。

[0032] 优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

[0033] 所述宿主细胞不具有分泌表达碱性蛋白酶的功能。

[0034] 更优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。参考非专利文献(史超硕、李登科等。两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响[J].中国生物工程杂志.2019,39(10)：17-23。

[0035] 本发明的第六个目的是提供一种基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞，通过载体表达连接有所述信号肽突变体编码基因和异源蛋白的编码基因。

[0036] 本发明的第七个目的是提供所述信号肽突变体的构建方法，步骤如下：

[0037] 将所述信号肽突变体编码的基因序列与异源蛋白编码的基因序列片段经相同酶切后连接，得到连接产物，将所述连接产物纯化后克隆到表达载体上，得到重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子。

[0038] 本发明的第七个目的是提供所述碱性蛋白酶的生产方法，步骤如下：

[0039] 将含有所述信号肽突变体的基因工程菌经活化后以1.5-5％(v/v)的接种量转接于发酵培养基中，于34-40℃、215-225r/min发酵培养20-50h。

[0040] 优选地，所述发酵培养基组成为：玉米粉60-70g/L，豆饼粉30-50g/L，磷酸氢二钠2-8g/L，磷酸二氢钾0.1-0.6g/L，高温淀粉酶0.5-1.0g/L，余量为水，p H自然；

[0041] 或者组成为：木聚糖8-12g/L，蛋白胨2-8g/L，酵母粉1-1.5g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.4g/L，氯化钠2-8g/L，琼脂粉10-20g/L，余量为水；

[0042] 或者组成为：葡萄糖6-12g/L，蛋白胨8-16g/L，酵母膏20-30g/L，磷酸氢二钠8-14g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，余量为水，p H 7.0-7.5。

[0043] 优选地，所述基因工程菌的活化步骤为：将所述基因工程菌接入种子培养基中，34-40℃、215-225r/min振荡培养10-13h；

[0044] 所述种子培养基组成为：卡那霉素45-55mg/L，酵母粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠4-6g/L，余量为水；

[0045] 或者为LB培养基；

[0046] 或者组成为：葡萄糖6-12g/L，蛋白胨8-16g/L，酵母膏20-30g/L，磷酸氢二钠8-14g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，余量为水，p H 7.0-7.5。

[0047] 有益效果

[0048] (1)信号肽的C区长度通常是3～7个氨基酸，主要包括能被信号肽酶识别并切割的亲水性氨基酸。在异源蛋白的分泌过程中，信号肽的性质对异源蛋白的分泌量起着关键的作用。通过将信号肽C区最后三位氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸，显著提高了信号肽对于异源蛋白的分泌表达量。在信号肽中，C区氨基酸的突变对于异源蛋白的分泌表达量起到主导作用。

[0049] (2)信号肽的H区域是由一段疏水残基组成的，信号肽假说认为：蛋白质之所以能够跨膜运输，主要是因为信号肽中存在疏水结构。常规的信号肽的H区的疏水性大致在-10～100之间。信号肽中的疏水区对于蛋白质的分泌有着重要的影响,本发明确定的信号肽的H区的疏水性在0～70之间，更有利于蛋白的分泌,疏水区过长或过短都不利于蛋白的分泌。而本发明通过氨基酸突变，使得H区的氨基酸疏水性在0～70之间，更有利于信号肽与膜上蛋白的结合，从而更有利于促进外源蛋白更好地分泌表达，从而有效提高目的基因的表达量，同时H区的突变可以减弱N区对信号肽的影响(即N区对于信号肽跨膜运输的作用)。当信号肽H区的氨基酸疏水性小于0或者大于70时，外源蛋白的分泌表达量会减弱，或甚至不能有效的分泌目的蛋白。H区经过突变，H区的氨基酸疏水性优选范围为0-38，更优选范围为
20-38，在优选值范围内，更有利于信号肽与膜上蛋白的结合，本发明的外源蛋白分泌表达量更为显著。

[0050] (3)成熟蛋白质N端和信号肽的N端带相反的电荷，二者之间形成的静电相互作用而利于发夹结构的形成，从而有利于信号肽的疏水性区域插入到细胞膜中，进而有利于蛋白质的分泌。

[0051] 信号肽的N端区域至少含有一个精氨酸或赖氨酸，该带正电荷的残基是信号肽跨膜的关键，带有正电荷的信号肽与负电荷的磷脂相结合从而使信号肽跨膜，常规信号肽，N区的电荷密度，大致在-0.2～0.9之间，本发明通过N端区域的氨基酸经过突变后，使氨基酸的电荷密度控制在0.2～0.8之间，从而提高信号肽跨膜的效率，进而有效的提高外源蛋白分泌表达量。当信号肽N区的氨基酸疏水性小于0.2或者大于0.8时，外源蛋白的分泌表达量会减弱，或甚至不能有效的分泌目的蛋白。

[0052] N区经过突变，N区的氨基酸疏水性优选范围为0.25-0.45，从而使得信号肽跨膜的效率更为高效，进而使外源蛋白分泌表达量更为显著。

附图说明

[0053] 图1：信号肽结构示意图。

[0054] 图2：目标异源蛋白和信号肽重组载体图谱

[0055] 图3：本发明实施例1的碱性蛋白酶编码基因PCR琼脂糖电泳图，其中泳道1为marker，泳道2为碱性蛋白酶编码基因PCR产物；

[0056] 图4：本发明实施例2的碱性木聚糖酶编码基因酶切琼脂糖电泳图，其中泳道1为碱性木聚糖酶编码基因PCR产物，泳道2为marker；

[0057] 图5：本发明实施例3的角质酶编码基因酶切琼脂糖电泳图，其中泳道1为角质酶编码基因PCR产物，泳道2为marker。

具体实施方式

[0058] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

[0059] 以下为发明的实施例中所用培养基：

[0060] 枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

[0061] SP-A盐溶液：(NH4)2SO4 4g/L，K2HPO4·3H2O 28g/L，KH2PO4 12g/L，柠檬酸钠2g/L，余量为水；

[0062] SP-B盐溶液：MgSO4·7H2O 0.4g/L，余量为水；

[0063] 100×CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L，余量为水；

[0064] SPI(200mL)：SP-A盐溶液98mL，SP-B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100×CAYE 2mL；

[0065] SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl2 6mL，250mmol/L MgCl2 6mL；

[0066] 100×EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。

[0067] 实施例1：信号肽突变体的制备及其诱导外源蛋白的表达

[0068] 以克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶为报告基因，改造解淀粉芽孢杆菌来源信号肽，获得一种信号肽突变体，提高碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌宿主中的分泌量，其中信号肽的结构示意图参照附图1。

[0069] (1)目的基因的获取

[0070] 目的基因为碱性蛋白酶基因aprE(碱性蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶基因aprE的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，GenBank:FJ940727.1，目的基因的构建参考专利文献：申请号为201910332253.1的发明专利《高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》，其中碱性蛋白酶基因的获取：来源与上述文献实施案例1；重组碱性蛋白酶基因工程菌的构建：来源与上述文献实施案例2，其中碱性蛋白酶编码基因PCR琼脂糖电泳图参照附图3。

[0071] (2)信号肽以及其突变体的制备：

[0072] 依据解淀粉芽孢杆菌基因组测序结果，通过在线信号肽预测软件SignalP 5.0Server预测获得信号肽。本实施案例中使用信号肽命名为信号肽A，来源于解淀粉芽孢杆菌，CGMCC No.11218基因组中Sec途径的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,突变后的信号肽命名为信号肽B，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。突变前信号肽N区电荷密度为
0.42，H区疏水性为36，C区末尾氨基酸为TSA。由于信号肽N区电荷密度符合0.2～0.8，H区疏水性同样符合0～70，因此不对信号肽的N区和H区进行突变，仅对信号肽C区的最后三位氨基酸进行突变，突变后的信号肽N区电荷密度仍然保持为0.42，H区疏水性仍然保持为36，C区最后三位氨基酸突变为ASA。突变后的信号肽符合本发明对信号肽C区最末尾的氨基酸是丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸的要求。

[0073] 表2信号肽突变

[0074]

[0075] 通过引物设计构建未突变的信号肽以及突变后的信号肽，与启动子Ply-2(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(启动子来源于枯草芽孢杆菌淀粉酶，构建方法来源于专利申请号为201910332240.4的发明专利《一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》)通过重叠PCR的方法构建目的片段。以实验室现有的解淀粉芽孢杆菌基因组为模板进行信号肽的扩增。

[0076] 以解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218的基因组为模板，以A-F为上游引物，以A-R为下游引物，通过PCR扩增，获得信号肽A，其氨基酸如SEQ ID NO：2所示，在信号肽A的基础上，以A-F为上游引物，以B-RT为下游引物进行PCR，将信号肽C端最后三位氨基酸TSA突变成ASA，同时信号肽N区电荷密度为0.42，H区疏水性为36，由于符合信号肽N区电荷密度0.2～0.8，H区疏水性在0～70的要求，因此未经突变，得到信号肽突变体，其氨基酸如SEQ ID NO：
3所示。

[0077] 以专利(路福平等一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，201910332240.4.实施案例2中所构建的表达碱性蛋白酶Ply-2+SPDacB)的质粒为模板(其含有启动子Ply-2)，以Ply-2-F为上游引物，以Ply-2-R为下游引物，进行PCR扩增Ply-2-A的基因片段。

[0078] 采用重叠PCR的方法，以Ply-2-A和信号肽A基因为模板，以Ply-2-F为上游引物，以A-R为下游引物，进行PCR扩增，获得启动子Ply-2和信号肽A的重叠PCR产物。同时以Ply-2-A和突变后的信号肽B为模板，以Ply-2-F为上游引物，以B-RT为下游引物，进行PCR扩增获得启动子Ply-2和突变后的信号肽B的重叠PCR产物。启动子Ply-2和信号肽A、B所用引物序列及酶切位点如下表3所示。表3中，下划线是酶切位点，小写字母为为同源片段，RT为突变体的下游引物。

[0079] 表3启动子Ply-2和信号肽A重叠PCR所用引物序列及酶切位点

[0080]

[0081] 启动子Ply-2和信号肽A重叠PCR时所用的反应体系为50μL，如下所示：

[0082]

[0083] 启动子Ply-2和信号肽A重叠PCR退火温度是60℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：

[0084]

[0085] 启动子片段Ply-2和信号肽基因经重叠PCR扩增纯化后经双酶切(EcoRI-HindIIⅠ)回收产物酶切体系同上，构建到经双酶切(EcoRI-HindIIⅠ)含有碱性蛋白酶基因aprE的pWB980表达载体上(如图2所示)。化转枯草芽孢杆菌WB600。获得重组菌株分别命名为AY(含有原信号肽A)，BT(含有信号肽突变体B)

[0086] (3)重组基因工程菌的表达：

[0087] 枯草芽孢杆菌WB600化转方法：

[0088] (1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；

[0089] (2)取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期OD600＝1.2(约3–4h)；

[0090] (3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；

[0091] (4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL 10mmol/L EGTA，37℃，100r/min培养10min；

[0092] (5)加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；

[0093] (6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

[0094] 将新鲜平板上的重组基因工程菌AY和BT的单菌落分别接入含有终浓度为50mg/L的卡那霉素抗性种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

[0095] 其中种子培养基组成为：卡那霉素50mg/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水；

[0096] 发酵培养基组成为：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L，余量为水，p H自然。

[0097] 按照国家标准GB/T 23527-2009附录B福林酚法，测定重组基因工程菌发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活。经测定，48h两种重组菌发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力达到最高。测定重组碱性蛋白酶的酶活，与未突变重组菌株酶活相比，本发明构建的信号肽突变体的重组菌株表达碱性蛋白酶的活性有所提高。其酶活如表4：

[0098] 表4信号肽突变前后重组菌的酶活比较

[0099]

[0100] 按照本发明构建的信号肽突变体，将信号肽C区最末尾的氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸，能够有效的提高异源蛋白的分泌量。

[0101] 实施例2：信号肽突变体的制备及其诱导外源蛋白的表达

[0102] 以短小芽孢杆菌来源的碱性木聚糖酶为报告基因，改造枯草芽孢杆菌来源信号肽YwjE，获得一种信号肽突变体，提高碱性木聚糖酶在枯草芽孢杆菌宿主中的分泌量，其中信号肽的结构示意图参照附图1。

[0103] (1)目的基因碱性木聚糖酶基因的获取：

[0104] 目的基因碱性木聚糖酶基因(碱性木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，碱性木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，687bp，GenBank:KU301789.1)由苏州金维智有限公司合成。

[0105] 重组碱性木聚糖酶基因工程菌的构建：

[0106] 将含有碱性木聚糖酶基因的质粒经(BamHI-SphⅠ)双酶切，切胶回收687bp的条带，通过Solution I连接酶连接到经双酶切(BamHI-SphⅠ)的pWB980表达载体上(如图2所示)，转化枯草芽孢杆菌WB600。后续构建信号肽的宿主的表达构建参考专利文献：申请号为201910332253.1的发明专利《高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》中的实施案例2，其中碱性木聚糖酶编码基因PCR产物的琼脂糖电泳图参照附图4。

[0107] (2)信号肽及其突变体的制备：

[0108] 信号肽为枯草芽孢杆菌YwjE基因(GenBank:JQ302237.1)信号肽。突变之前氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，信号肽N区电荷密度为0.5，信号肽H区疏水性为72.9，信号肽C区最末尾的氨基酸为GRA。其中H区疏水性不符合本发明对信号肽H区的氨基酸疏水性在0～70之间的要求。C区最末尾氨基酸不符合本发明对信号肽C区最末尾的氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸的要求。信号肽突变之后氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，突变之后信号肽N区电荷密度为0.29，使得信号肽N区氨基酸的电荷密度在0.25-0.45优选的范围之内，H区疏水性为35.7，符合本发明对信号肽H区的氨基酸疏水性在0～70之间的要求。突变之后信号肽C区最末尾氨基酸为AHA，符合本发明对信号肽C区最末尾的氨基酸是丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸的要求。

[0109] 表5信号肽突变

[0110]

[0111] 突变前后的信号肽和Ply-2启动子片段由苏州金维智有限公司合成，合成的条带经过(EcoRI-HindIIⅠ)双酶切，切胶回收。通过Solution I连接酶连接到经双酶切(EcoRI-HindIIⅠ)的含有碱性木聚糖酶基因的pWB980表达载体上，转化枯草芽孢杆菌WB600。转化方法同实施例1。获得重组菌株分别命名为YE(含有原信号肽)，YE-T(含有信号肽突变体)[0112] (3)重组基因工程菌的表达：

[0113] 挑取新鲜平板上的重组基因工程菌YE和YE-T的单菌落接入LB培养基中，在37℃，220rpm震荡培养16h，得到种子液，过夜培养制备种子液(OD600约1.0)。将种子液按1.0％的接种量分别接种至250mL三角瓶的30mL液体木聚糖发酵培养基中，37℃震荡培养48h后，取发酵液4℃，12000g，离心10min，取上清液做为粗酶液进行酶活的测定。

[0114] 木聚糖发酵培养基：

[0115] 木聚糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂粉15.0g/L，余量为水，p H自然。

[0116] 酶活测定方法:

[0117] 酶活力测定：吸取木聚糖底物溶液0.6mL作为底物，放入25mL具塞刻度管中，加入适当稀释度的粗酶液0.4mL，恒温水浴10min，加入1.5mL DNS，煮沸5min。同时制备空白对照，即在25mL的比色管中加入适当比例稀释的粗酶液0.4mL沸水浴10min灭活纤维素酶，然后分别加入1％的羧甲基纤维素钠0.6mL、3,5-二硝基水杨酸溶液1.5mL，混匀后作为空白对照。待混合液冷却，在540nm处比色，根据A540 nm吸光值计算酶活。

[0118] 其中，木聚糖底物溶液的制备：称1.0g桦木木聚糖，溶于80mL酸性缓冲溶液(醋酸-醋酸钠缓冲溶液中)或碱性缓冲液(Tris-HCl和甘氨酸-NaOH缓冲液)中，加热溶解并定容至100mL，4℃储存备用。

[0119] 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液组成：6.3g 3,5-二硝基水杨酸溶解于少量水，依次加入21.0g NaOH，182.0g酒石酸钾钠，5.0g重蒸酚和5.0g亚硫酸钠，定容至1000mL，避光储存备用。

[0120] 碱性木聚糖酶活定义为：每分钟降解底物产生1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位，用U/mL表示。

[0121] 测定重组碱性木聚糖酶的酶活，与未突变重组菌株酶活相比，本发明构建的信号肽突变体的重组菌株表达碱性木聚糖酶的活性比未突变组有所提高。其酶活如下表6：

[0122] 表6信号肽突变前后重组菌的酶活比较

[0123]

[0124] 按照本发明构建的信号肽突变体，对信号肽的H区进行突变，使H区的氨基酸疏水性在0～70之间，对信号肽C区的氨基酸进行定点突变，使C区最末尾的氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸，能够有效地提高异源蛋白的分泌量。

[0125] 对比例1：选择信号肽YpuA(GenBank:NC_000964.3)作为对比例，该信号肽来源于枯草芽孢杆菌168，氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，其H区的氨基酸疏水性为40.5，满足在0～70之间，C区最后三位氨基酸序列为ADA，满足丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸，但N区的氨基酸的电荷密度为1，不满足0.2-0.8区间范围，将该信号肽同样经过本发明实施例2的重组基因工程菌的表达，构建重组菌株为YY，以碱性木聚糖酶为目的蛋白进行表达，经过酶活测定，其碱性木聚糖酶活为0U/mL，信号肽YpuA不能有效的分泌碱性木聚糖酶，由此说明，当信号肽的H区不满足0.2-0.8区间范围，信号肽并不能有效的分泌目的蛋白或者表达量极低。

[0126] 实施例3：

[0127] 以腐皮镰孢霉菌来源角质酶为报告基因，改造枯草芽孢杆菌来源信号肽YjiA，获得一种信号肽突变体，提高角质酶在枯草芽孢杆菌宿主中的分泌量，其中信号肽的结构示意图参照附图1。

[0128] (1)目的基因的获得：

[0129] 目的基因角质酶基因(角质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，角质酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，GenBank:M29759.1)由苏州金维智有限公司合成。

[0130] 重组角质酶基因工程菌的构建：

[0131] 将含有角质酶基因的质粒经(BamHI-SphI)双酶切，切胶回收2770bp的条带，通过Solution I连接酶连接到经双酶切(BamHI-SphI)的pWB980表达载体上(如图2所示)，转化枯草芽孢杆菌WB600。后续构建信号肽的宿主的表达参考专利：申请号为201910332253.1，《高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法》中的实施案例2，其中角质酶编码基因酶切琼脂糖电泳图参照图5。

[0132] (2)信号肽及其突变体的制备：

[0133] 信号肽为枯草芽孢杆菌YjiA基因(GenBank:JQ302291.1)信号肽。信号肽突变之前氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，信号肽N区电荷密度为0.1，信号肽H区疏水性为38.5，信号肽C区最末尾氨基酸为VFS。其中信号肽N区电荷密度不符合本发明对信号肽N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8之间的要求，C区最末尾氨基酸不符合本发明对信号肽C区最末尾的氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸的要求。信号肽突变之后氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，突变之后信号肽N区电荷密度为0.67，符合本发明对信号肽N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8之间的要求。突变后信号肽H区疏水性为40.5，符合本发明对信号肽H区的氨基酸疏水性在0～70之间的要求，作为H区的氨基酸疏水值在优选范围外的对比。突变之后信号肽C区最末尾氨基酸为ADA，符合本发明对信号肽C区最末尾的氨基酸是丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸的要求。YA-T2是在YA-T1信号肽N区和C区不变的基础上，突变H区域的疏水性，将H区的氨基酸疏水值由40.5突变为35.8，使得H区的氨基酸疏水性在优选范围区间0-38之内，信号肽突变之后氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

[0134] 表7信号肽突变

[0135]

[0136] 突变前后的信号肽和Ply-2启动子片段由苏州金维智有限公司合成，合成的条带经过(EcoRI-HindIII)双酶切，切胶回收。通过Solution I连接酶连接到经双酶切(EcoRI-HindIII)的含有角质酶基因的pWB980表达载体上，转化枯草芽孢杆菌WB600。转化方法同实施例1。获得重组菌株分别命名为YA(含有原信号肽)，YA-T(含有信号肽突变体)[0137] (3)重组基因工程菌的表达：

[0138] 将新鲜平板上的重组基因工程菌YjiA和YjiA-T的单菌落分别接入种子培养基中，500mL三角瓶装50mL培养基，200r/min，37℃，培养12h。之后种子以5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，200r/min，37℃，培养22h。无特别说明，装液量均为250mL三角瓶中装25mL。

[0139] 种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，磷酸氢二钠12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，余量为水，pH 7.5。

[0140] 发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，磷酸氢二钠12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，余量为水，pH 7.5。

[0141] 角质酶粗酶液制备：

[0142] 取一定量发酵液于10000r/min下离心5min，上清液为角质酶酶活测定液。

[0143] 角质酶活性测定：

[0144] 采用分光光度法，参考非专利文献：MaartenR,EgmondJDV.Fusariumsolanipisicutinase[J].Biochimie,2000,82:67-69。反应液体积为1mL，包括20μL酶液和980μL的50mmol/L硫磺脱氧胆酸钠缓冲液(pH 8.0，含50mmol/L对硝基苯丁酸酯)。20℃、405nm处，记录对硝基酚的生成速率。

[0145] 酶活定义：

[0146] 20℃时，每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解生成1μmol对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。

[0147] 测定重组角质酶的酶活，与未突变重组菌株酶活相比，本发明构建的信号肽突变体的重组菌株表达角质酶的活性比未突变组有所提高。其酶活如下表6：

[0148] 表8信号肽突变前后重组菌的酶活比较

[0149]

[0150] 按照本发明构建的信号肽突变体，对信号肽的N区进行突变，使N区氨基酸的电荷密度为0.2～0.8之间，对信号肽C区的氨基酸进行定点突变，使C区最末尾的氨基酸突变为丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸，能够有效的提高异源蛋白的分泌量。

[0151] 突变后信号肽1和突变后信号肽2较初始信号肽，其重组菌株所产的角质酶酶活均有显著的提高。

[0152] 相比于突变后信号肽1，突变后信号肽2在N区(电荷密度为0.67)和C区不变(ADA)的基础上，H区的疏水值，经过突变后，由40.5突变为35.8，使得H区的氨基酸疏水性在优选范围区间0-38之内，突变后，角质酶酶活提高。

[0153] 需要说明的是，信号肽YjiA的H区疏水性为38.5，虽然和信号肽H区疏水性优选范围区间范围值0-38中的38仅差0.5，但是由于H区的疏水性是由多个氨基酸的疏水值相加和得到的，且信号肽YjiA的疏水区(即氨基酸序列为VVGILLSLAFVLF)氨基酸数量较多，因此信号肽YjiA的H区疏水值38.5和优选范围内的38之间，会在氨基酸种类和氨基酸数量上均有显著的不同。

[0154] 对比例2：选择信号肽YwqC(GenBank:Z92952.1)作为对比例，该信号肽来源于枯草芽孢杆菌168，氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，其H区的氨基酸疏水性为31.6，满足在0～70之间，C区最后三位氨基酸序列为ATA，满足丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸，但N区的氨基酸的电荷密度为-0.1，不满足0.2-0.8区间范围，将该信号肽同样经过本发明实施例3的重组基因工程菌的表达，构建重组菌株为YC，以角质酶酶活为目的蛋白进行表达，经过酶活测定，其角质酶酶活为0U/mL，信号肽YwqC不能有效的分泌角质酶，由此说明，当信号肽的H区不满足0.2-0.8区间范围，信号肽并不能有效的分泌目的蛋白或者表达量极低。