抗PTN抗体在抑制白血病干细胞以及治疗慢性粒细胞白血病中的应用

摘要

本发明涉及一种抗PTN抗体在抑制白血病干细胞以及治疗慢性粒细胞白血病中的应用，所述抗PTN抗体能够以较高的亲和力结合PAI‑1蛋白，能够抑制CML干细胞的植入，能够抑制CML细胞生长，能够用于预防或治疗慢性粒细胞白血病，有着广阔的应用前景。

权利要求

1.一种抗PTN抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区中VH-CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；轻链可变区中VL-CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。

2.根据权利要求1 所述的抗PTN抗体，其特征在于：所述重链可变区序列如SEQ ID No :7所示；所述轻链可变区序列如SEQ ID No :8所示。

3.根据权利要求1-2任一项所述的抗PTN抗体，其特征在于：所述抗体为全长抗体。

4.根据权利要求1-2任一项所述的抗PTN抗体，其特征在于：所述抗体还包含选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa 或Lambda 亚型的轻链恒定区。

5.根据权利要求4所述的抗PTN抗体，其特征在于：所述抗体重链恒定区为IgG1，所述抗体轻链恒定区为kappa亚型。

6.原核或真核细胞系中复制的表达载体，其特征在于：其编码权利要求1-2任一项所示的抗体。

7.权利要求1-5任一项的抗PTN抗体在制备用于治疗慢性粒细胞白血病的药物中的用途。

8.权利要求1-5任一项的抗PTN抗体在制备用于检测PTN蛋白的制剂中的用途。

9.权利要求1-5任一项的抗PTN抗体在制备用于抑制白血病干细胞的药物中的用途。

10.一种用于治疗慢性粒细胞白血病的药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-5任一项所述的抗体以及imatinib。

说明书

抗PTN抗体在抑制白血病干细胞以及治疗慢性粒细胞白血病

中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体的涉及抗PTN抗体在抑制白血病干细胞以及治疗慢性粒细胞白血病中的应用。

背景技术

[0002] 慢性粒细胞性白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）是骨髓造血干细胞异常增殖形成的恶性肿瘤。起病较慢，以脾脏增大、外周血粒细胞明显增多为特征，第 9 号染色体和 22 号染色体的易位，形成费城染色体（Philadelphia chromosome，Ph）,进而编码产生 BCR-ABL1 融合基因是其特殊性生物学标志，最终导致白血病干细胞（leukemia stem cell，LSC）的形成[1-3]。由于 BCR-ABL1 致癌蛋白具有持续激活的酪氨酸激酶活性，可诱导白血病细胞增殖失控、凋亡抑制，引起慢性粒细胞白血病的发生发展[4]。

[0003] 目前CML主要是通过酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）进行治疗。但 TKIs 治疗一旦中止，疾病常常会复发，说明 TKIs 只能抑制但不能将疾病治愈[5-7]。后续研究证明CML停药后复发与患者体内的白血病干细胞的持续存在有关。各项研究证明TKIs只能杀死处于分裂增殖状态的白血病细胞，并不能清除处于静止休眠期的慢粒白血病干细胞[8-11]，这也是导致CML复发的关键原因。因此，清除白血病干细胞成为完全治愈慢性粒细胞白血病的关键点，也是当前慢性粒细胞白血病研究的热点[12]。

[0004] 现研究表明多效生长因子（pleiotrophin ，PTN）在慢性粒细胞白血病干细胞的生长、存活以及慢性粒细胞白血病疾病发展过程中起到重要作用[13]。多效生长因子是Bohlen等在 20 世纪 80 年代从成年牛脑中分离纯化出的一种蛋白质，因为这种蛋白质可以与肝素结合因此称其为肝素结合生长因子。之后因其具有多种功能而被重新命名为多效生长因子。实验研究表明，PTN 与细胞增殖与迁移[14]、肿瘤生长[15]、细胞分化[16, 17]等功能有关。除此之外，研究表明小鼠CML干细胞中PTN的表达上调、分泌增多[18]；TKIs处理后小鼠CML干细胞中PTN表达上调，且PTN以依赖c-Jun 和UPR基因活化的方式诱导CML干细胞的生长和存活，表明PTN基因表达可能是TKIs处理后，CML干细胞仍然存活的原因[13]。因此可通过靶向PTN，达到清除CML干细胞以及完全治愈慢性粒细胞白血病的目的。

[0005] 到目前为止，已有PTN抗体在US20040234519专利中提及，但一方面它们对PTN的结合能力还并不十分理想，另一方面，它也没有用来治疗慢性粒细胞白血病。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种新的且具有更高PTN结合能力的抗PTN抗体，为治愈慢性粒细胞白血病提供一种新可能性。

[0007] 本发明提供以下技术方案：

[0008] 一种PTN抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区包含3个互补决定区，分别命名为VH-CDR1，VH-CDR2,VH-CDR3；同样地，轻链可变区也包含3个互补决定区，分别命名为VL-CDR1,VL-VDR2,VL-CDR3 。所述PTN抗体的重链包含如SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1氨基酸序列，和如SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:3所示的VH-CDR3氨基酸序列；所述PTN抗体的轻链包含如SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1氨基酸序列，和如SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3氨基酸序列。

[0009] 本发明所述PTN抗体包含SEQ ID NO :7 所示的重链可变区和SEQ ID NO :8 所示的轻链可变区。

[0010] 本发明所述PTN抗体的重链可变区和轻链可变区均包含框架区，所述抗体轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链框架区。所述抗体重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或IgG4或其变体的重链框架区。

[0011] 本发明所述PTN抗体包含恒定区,并且所述恒定区是人源化的，包含选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa 或Lambda 亚型的轻链恒定区。

[0012] 在一些实施方案中, 所述PTN抗体以37.2±5.3ng/ml的EC50值与PTN相结合。

[0013] 在一些实施方案中，所述PTN抗体能够抑制CML干细胞的植入。

[0014] 在一些实施方案中，所述PTN抗体能够抑制CML细胞生长。

[0015] 本发明提供一种治疗慢性粒细胞白血病的方法，其特征在于：使用本发明所述的抗PTN抗体或者将TKI抑制剂的与本发明所述的抗PTN抗体联合应用。

[0016] 本发明所述的PTN抗体可应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中，优选为与TKI抑制剂联合应用。

[0017] 本发明所使用的术语“ 抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，涵盖全长抗体(例如，IgG1或IgG4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如Fab、Fab′、F(ab′)2)。抗体的实例包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2片段等。

[0018] 术语“ 单克隆抗体”，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“ Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此可在两个Fab  ′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。“ F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。

[0019] 本文所用术语“ 超变区”或“ CDR区”或“ 互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由Kabat、Chothia方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、Chothia定义中的任一者来定义。具体地，本发明提供的CDR序列根据Kabat 定义。

[0020] 术语“人源化抗体”是指抗体具有的人源框架、铰链区和恒定区与来自人基因组序列的框架和恒定区相同或基本上相同（基本上人源）。全人框架、铰链区和恒定区为那些人种系序列和具有自然发生的体细胞突变的序列。人源改造抗体可包含来自全人框架、铰链或恒定区的框架、铰链或恒定区，并在其中包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。通常，人源改造抗体优选的在入中基本上没有免疫原性。在本发明的一优选实施方案中，所述的PTN人源化抗体的抗体轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区。所述PTN人源化抗体的抗体重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或IgG4或其变体的重链FR区。人源化抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源的IgG1重链恒定区。所述人源化抗体抗体还包含选自kappa 或Lambda 亚型的轻链恒定区。

[0021] 有益效果

[0022] 本发明的PTN抗体具有下列性质：1)能够以较高的亲和力结合PTN蛋白；2) 能够抑制CML干细胞的植入；3) 能够抑制CML细胞生长；4)能够用于预防或治疗慢性粒细胞白血病。

附图说明

[0023] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

[0024] 图1为h5D7-2抗体抑制CML干细胞的植入实验结果。

[0025] 图2a 为h5D7-2抗体抑制CML细胞生长； 图2b 为h5D7-2抗体与IM联合应用抑制CML细胞生长，且效果优于IM单独处理的效果。

具体实施方式

[0026] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0027] 实施例1.制备PTN抗原

[0028] 将PTN cDNA插入pET-43.1b（+）载体中，构建PTN原核表达质粒，记作pET-43.1b（+）-PTN。将上述质粒转化到大肠杆菌感受态BL21（DE3）中，再将感受态加入含有氨苄抗性的2ml LB 培养中过夜培养，第二天，按1%接种量接种于含有氨苄抗性的20 mL LB 培养基，37 ℃ 振摇培养3h后，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG于30 ℃诱导培养 6 h。离心收集菌体，加入裂解液后进行超声破碎，离心收取上清，再经过镍柱进一步纯化，获得可溶性重组抗原蛋白，利用肠激酶酶切，除去质粒上携带的标签蛋白，最终获得PTN重组蛋白。因PTN蛋白基因高度保守，因此将PTN蛋白与钥孔血蓝蛋白（KLH）进行交联，以增加免疫原性。采用双功能偶联剂戊二醛进行偶联，将上述重组表达的PTN蛋白与KLH(购自Sigma)溶解于PBS后，在偶联瓶中混匀，向混合液中缓慢的滴加0.25%戊二醛溶液，与4℃反应4h后，将反应液置于
4摄氏度透析PBS,最终获得化学偶联的PTN-KLH。

[0029] 实施例2.抗PTN抗体制备

[0030] 将实施例1制备的PTN-KLH抗原与引起免疫反应的弗氏完全佐剂一起注射到雌性Balb/c小鼠腹膜内，进行初次免疫，随后每2周再以相同量的抗原注射到上述雌性Balb/c小鼠腹膜内，继续免疫。最后在与骨髓瘤细胞融合前3天进行末次免疫，将PTN-KLH抗原与免疫佐剂混合乳化，腹腔注射进行末次免疫。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用含有10%血清的Iscove培养基（0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷）稀释，稀释至适宜浓度后，加入96孔板内进行培养。10天后，取细胞上清，高通量ELISA法检测上清中与PTN 表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株5D7-2。

[0031] 实施例2.基因克隆和抗PTN抗体人源化改造

[0032] 将培养的杂交瘤细胞株5D7-2用TRNzol-A+裂解后，置入离心管，每ml TRNzol-A+加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000 rpm 4°C离心10分钟，Trizol-A+ 细胞溶液分为三层：上层无色水相、中层和下层黄色有机相，将溶有RNA的水相转移至离心管中，向水相中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25分钟。13000 rpm 4°C离心10分钟，弃去废液得到沉于底部的RNA沉淀。用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次后，用PEDC水溶解RNA，-80℃保存。利用反转录试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)制备编码抗体基因的cDNA；以cDNA为模板，利用PCR扩增出含有抗体重链可变区和轻链可变区的DNA产物，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化含有抗体重链可变区和轻链可变区的目的片断。将其克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，根据测序结果进一步获得可变区基因对应的氨基酸序列。

[0033] 根据杂交瘤细胞株5D7-2分泌的抗体的可变区序列，采用CDR移植抗体人源化改造方法进行人源化改造，所述CDR区序列采用kabat方法定义。首先，用NCBI中提供的＂Blast for Ig sequences"在线序列比对法，将杂交瘤细胞株5D7-2的VH区和VK 区与NCBI数据库中已有人源抗体序列进行比对，选出人胚胎系框架序列；之后利用SwissModel搭建鼠源抗体可变区三维结构，通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，确定维持结合亲和力及维护空间构架的关键氨基酸，将其嫁接回已经选择的人胚胎系抗体框架。将获得的人源化改造后的抗体可变区基因克隆进含有人IgG恒定区基因的真核表达载体pCMV-163中，构建全抗体表达载体。真核表达载体pCMV-163的各个组成成分均为本领域已知的成分，按照所示次序重组而成。

[0034] 最终，将人源化改造后的抗体命名为h5D7-2，测序结果显示，抗体h5D7-2的VH-CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；抗体VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；h5D7-2的VL-CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；抗体VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

[0035] 实施例3. 抗PTN抗体与PTN结合能力测定

[0036] 将实施例2中获得的抗体质粒转染CHO-K1细胞筛选高表达克隆，并用无血清培养基扩大培养，用Protein A 亲和柱分离纯化人源化抗体h5D7-2。将纯化抗体用PBS进行透析，获得纯度较高的PTN人源化抗体h5D7-2。将通过US20040234519专利获得抗PTN抗体3B10，（其轻重链序列参见该专利说明书附图1B、1C）的序列且通过上述中的方法获得抗体
3B10，作为对照抗体。通过ELISA 实验评估上述获得的人源化抗PTN抗体h5D7-2、对照抗体
3B10与PTN蛋白在50%有效浓度时(EC50)的结合亲和力。将重组人PTN蛋白用PBS稀释
1000ng/mL，以每孔100μL添加到96板中，4℃过夜包被。通过反向离心除去固相液，以每1孔
200μL添加封闭剂，在室温下静置30分钟。将上述PTN固相化板用TBS洗涤后，以每孔100μl添加PTN抗体。将PTN抗体h5D7-2以及对照抗体3B10用培养基稀释成1000ng/ml，250ng/ml，
62.5ng/ml，15.63ng/ml，3.91ng/ml，0.98ng/ml的浓度梯度，4℃孵育2h，吸出培养基，加入戊二醛室温孵育10min，用PBS洗涤3次后加入100ul抗人IgG抗体，室温孵育2h。用PBS洗涤3次后加入50μl显色液，室温避光孵育15min，加入终止液终止显色反应，用酶标仪检测样品在450nm波长处的吸光度值，并用620nm波长处的吸光度值校正。处理数据，最终确定各样品EC50值，结果如表一所示。结果表明，人源化的抗PTN抗体h5D7-2与对照抗体3B10相比，展现出更强的结合能力。

[0037] 表一 抗PTN抗体与PTN结合能力测定

[0038] 名称 EC50（ng/ml）h5D7-2 37.2±5.3
对照抗体3B10 93.4±11.2

[0039] 实施例4. 抗PTN抗体抑制CML干细胞功能

[0040] 取CML病人外周血样品，将细胞用 PBS（含 2mM EDTA，Invitrogen）稀释到合适的浓度，缓慢滴加到含 Ficoll 溶液（GE Healthcare）的 15ml 离心管中，Ficoll 和稀释后外周血体积比为 1:1， 400g，20℃ 离心 30min，用无菌塑料滴管吸取血清和 Ficoll 交界的单个核细胞层，转移至 15ml离心管中，加 3 倍体积的 PBS 液洗脱，400g 离心 10min，去上清，沉淀即为单核细胞。利用人CD34+分离试剂盒（Miltenyi Biotec）制备单核细胞悬液，将分离柱固定于MACS磁场内，使细胞悬液缓慢通过分离柱，洗脱组分为CD34-细胞。将分离柱移除磁场，加入缓冲液洗脱，洗脱组分为CD34+细胞。将从CML患者骨髓中分离的CD34+细胞分别与抗PTN抗体h5D7-2、对照抗体抗PTN抗体3B10以及IgG（不具有结合PTN的能力）抗体共培养，72h后收取细胞，将其注射到300-cGy 射线辐射过的NOD/SCID IL-2–receptor γ–null (NSG)小鼠中。CML干细胞即CD34+移植16周后，处死小鼠，取小鼠骨髓细胞，利用流式细胞仪分析骨髓细胞中人CD45+细胞的含量。结果如图1所示：抗PTN抗体h5D7-2以及抗PTN抗体3B10处理过的实验组中CD45+细胞含量明显低于IgG处理过的实验组, 且抗PTN抗体h5D7-2优于抗PTN抗体3B10的效果。证明抗PTN抗体处理后，能够明显的抑制CML干细胞的植入。

[0041] 实施例5. 抗PTN抗体抑制CML细胞生长

[0042] 培养慢性粒细胞性白血病细胞株 K562，将其注射到小鼠胫骨骨

[0043] 髓腔。每只小鼠注射5X107个K562细胞。将注射K562细胞后的小鼠随机其分成3组，分别用抗PTN抗体h5D7-2、对照抗体抗PTN抗体3B10或IgG（不具有结合PTN的能力）抗体处理，每两天腹腔注射抗体一次，每次2mg/kg，共注射2周。两周后，取出胫骨处实体瘤，测量其大小。结果如图2a所示: CML移植瘤模型中，经抗PTN抗体h5D7-2以及抗PTN抗体3B10处理后，CML移植瘤的大小明显减小且抗PTN抗体h5D7-2优于抗PTN抗体3B10的效果。进一步研究PTN抗体与IM（imatinib）联合应用后效果。将慢性粒细胞性白血病细胞株 K562与IM共培养72h后，收取细胞，将其注射到小鼠胫骨骨髓腔。每只小鼠注射5X107个K562细胞。将注射K562细胞后的小鼠随机其分成3组，分别用抗PTN抗体h5D7-2、对照抗体抗PTN抗体3B10或IgG抗体处理，每两天腹腔注射抗体一次，每次2mg/kg，共注射2周。两周后，取出胫骨处实体瘤，测量其大小。结果如图2b所示: CML移植瘤模型中，经抗PTN抗体与IM共处理后，CML移植瘤的大小明显减小且抗PTN抗体h5D7-2优于抗PTN抗体3B10的效果。以上结果表明抗PTN抗体能够抑制CML细胞生长，且与IM联合应用的效果更优。

[0044] 参考文献

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