一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒及应用

摘要

本发明提供一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒及应用，该试剂盒包括用于检测钙需求相关的GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的引物组合物，包括5对PCR引物和5个正向延伸引组合物，如SEQ ID No:1‑15所示，本发明不仅能够快速同步检测多个SNP位点,对与钙需求相关的基因SNP位点进行有效的基因分型，而且有效提高了多数量的SNP位点在一个反应体系中分型的准确性且检测限低，实现快速而准确地给出钙质补充的指导意见。

权利要求

1.一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：包括用于检测钙需求相关的GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的引物组合物，所述引物组合物的序列为：GC基因RS2282679位点的正反向PCR引物：SEQ ID No:1‑2，正向延伸引物：SEQ ID No:

11；

IL‑6基因RS1800795位点正反向PCR引物：SEQ ID No:3‑4，正向延伸引物：SEQ ID No:

12；

PTH基因RS6254位点正反向PCR引物：SEQ ID No:5‑6，正向延伸引物：SEQ ID No:13；

VDR基因RS1544410位点正反向PCR引物：SEQ ID No:7‑8，正向延伸引物：SEQ ID No:

14；

VDR基因RS2228570位点正反向PCR引物：SEQ ID No:9‑10，正向延伸引物：SEQ ID No:

15；

GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的正向延伸引物浓度比为2:1:3:2:1；

GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的各对正反向PCR引物浓度比为1:1:1:1:2；

正向延伸引物序列中的5’端采用不同数量的ploy T修饰；其中，GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的正向延伸引物上的ploy T修饰数量依次为：22、16、35、29、19；

纯化后多重PCR产物、正向延伸引物组合物与多重单碱基延伸反应试剂中的SNaPshot Multiplex KitABI的体积比为2:1:1。

2.如权利要求1所述的一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以下试剂：

2

(1)多重PCR扩增试剂：包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、1× GC‑I缓冲液、Mg+

：

(2)PCR产物纯化试剂：AP酶、Exol1酶、Seq buffer；

(3)多重单碱基延伸反应试剂：SNaPshot Multiplex KitABI；

(4)延伸产物纯化试剂：SAP酶；

(5)测序变性反应试剂：120Liz SIZE STANDARD内标、Hi‑Di甲酰胺。

3.如权利要求1所述的一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：纯化后的延伸产物与测序变性反应试剂中的120Liz SIZE STANDARD内标、Hi‑Di甲酰胺的体积比为12:3:92。

说明书

一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因多态性检测技术领域，特别涉及一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒及应用。

背景技术

[0002] 钙是人体内含量最多的矿物元素，广泛存在于身体的各个部分。绝大多数钙元素沉积于骨骼和牙齿中，既组成人体的支架，又是机体内钙元素的储存库，而只有1％的钙存
在于人体的软组织、细胞外液及血液中。软组织和血液中的钙又叫“混合钙池”，与骨骼中的
钙保持着动态平衡，完成多种生理功能，钙在神经冲动的传递、神经与肌肉应激、血液凝固、
心跳节律的维持、人体代谢酶的激活等许多生理过程中起重要的作用。

[0003] 当长期钙摄入不足，机体势必动用大量的骨钙来维持体液钙的水平，影响骨骼健康。在儿童身上会引起佝偻病，成人则会发生严重骨质疏松。科学研究表明，人体需钙量在
不同时期存在差异，膳食营养中的摄入的钙质并不全能被人体吸收利用，被肠道吸收后通
过血循环沉积到骨骼中，部分经肠道、肾脏等途径排出体外。在这一系列过程中，不仅与多
种营养元素相互作用，还受到多种激素的调控。因此，遗传因素的影响是一个重要方面，不
同基因型、不同遗传体质的人群钙吸收代谢能力存在差异，特别是儿童、青少年人群，处于
生长发育旺盛时期，对钙的需求量高，钙的足量摄入尤为重要，一旦钙在体内的吸收代谢过
程发生障碍，不但影响到儿童的正常生长发育，还可导致儿童时期的佝偻病，低钙性手足搐
搦，孕妇骨矿含量下降、牙齿损害和骨质疏松等问题。

[0004] 从遗传角度评估人群个体对钙元素的需求程度，通过基因检测来评估个体对钙需求的情况，以及时进行干预，指导合理补充。但对于钙需求相关基因的检测，现有采用的
Sanger测序、Taqman法、高分辨率溶解曲线等检测，往往存在通量低，操作步骤繁琐，并且为
了更加全面合理地指导钙质补充，随着检测位点的增多时，对于大通量地检测多基因位点
反而容易出现特异性和灵敏度低，上样量高，检出率和检测效率降低、准确度低的问题，因
而始终无法将其有效应用于评估个体对于钙需求的差异，以指导补充钙质的遗传检测中。

发明内容

[0005] 鉴以此，本发明提出一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒及应用，该试剂盒不仅能够快速同步检测多个SNP位点,对与钙需求相关的基因SNP位点进行有效的基因
分型，而且有效提高了更多数量的SNP位点在一个反应体系中分型的准确性且检测限低，反
应电泳图谱结果稳定清晰，实现快速而准确地给出钙质补充的指导意见。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：

[0007] 一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒，包括用于检测钙需求相关的GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位
点和VDR基因RS2228570位点的引物组合物，所述引物组合物的序列为：

[0008] GC基因RS2282679位点的正反向PCR引物：SEQ ID No:1‑2，正向延伸引物：SEQ ID No:11；

[0009] IL‑6基因RS1800795位点正反向PCR引物：SEQ ID No:3‑4，正向延伸引物：SEQ ID No:12；

[0010] PTH基因RS6254位点正反向PCR引物：SEQ ID No:5‑6，正向延伸引物：SEQ ID No:13；

[0011] VDR基因RS1544410位点正反向PCR引物：SEQ ID No:7‑8，正向延伸引物：SEQ ID No:14；

[0012] VDR基因RS2228570位点正反向PCR引物：SEQ ID No:9‑10，正向延伸引物：SEQ ID No:15。

[0013] 进一步说明，正向延伸引物序列中的5’端采用不同数量的ploy T修饰；其中，GC基因RS2282679位点、、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点
和VDR基因RS2228570位点的正向延伸引物上的ploy T修饰数量依次为：22、16、35、29、19。

[0014] 进一步说明，所述GC基因RS2282679位点、、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的正向延伸引物浓度比为2:
1:3:2:1。

[0015] 进一步说明，所述GC基因RS2282679位点、、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的各对正反向PCR引物浓度
比为1:1:1:1:2。

[0016] 进一步说明，所述试剂盒还包括以下试剂：

[0017] (1)多重PCR扩增试剂：包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、1x GC‑I缓冲液、Mg2+：

[0018] (2)PCR产物纯化试剂：AP酶、Exol1酶、Seq buffer；

[0019] (3)多重单碱基延伸反应试剂：SNaPshot Multiplex Kit(ABI)；

[0020] (4)延伸产物纯化试剂：SAP酶；

[0021] (5)测序变性反应试剂：120 Liz SIZE STANDARD内标、Hi‑Di甲酰胺。

[0022] 进一步说明，纯化后多重PCR产物、正向延伸引物组合物与多重单碱基延伸反应试剂中的SNaPshot Multiplex Kit(ABI)的体积比为2:1:1。

[0023] 进一步说明，纯化后的延伸产物与测序变性反应试剂中的120  Liz SIZE STANDARD内标、Hi‑Di甲酰胺的体积比为12:3:92。

[0024] 一种用于检测钙需求相关基因SNP位点的试剂盒在婴幼儿、儿童、青少年及孕妇的钙需求遗传检测的应用。

[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明不仅能够实现了快速同步检测多个SNP位点,对与钙需求相关的基因SNP位点进行有效的基因分型，实现大通量的钙需求相
关基因的快速有效检测，更重要的是，本发明还通过对与钙需求相关的基因进行了优选，由
GC基因、IL‑6基因、PTH基因和VDR基因中筛选出了5个SNP位点进行同步检测，结合其SNP位
点体系的特点，优化设计出了PCR引物组合物和紧邻SNP位点的正向延伸组合物，并针对不
同的SNP位点进一步调整其正向延伸引物组合的不同长度，使得所有的引物序列均能够对
样本基因进行准确快速分型，提高更多数量的SNP位点在一个反应体系中分型的准确性，高
效直观地根据电泳锋图移动的位置确定不同延伸产物对应的SNP位点，根据锋的颜色直接
判定掺入的碱基种类，易判读，且检测限低，检出率高，特异性好，重复性好，样本检测的准
确性100％，从而实现更加快速、准确地分析个体对钙需求的差异，根据遗传检测结果，实现
快速而准确地给出钙质补充的指导意见，促进骨骼健康发育，避免钙缺乏疾病和骨质疏松
症的发生。

附图说明

[0026] 图1为本发明实施例中实验样本2对GC基因RS2282679位点基因分型的反应电泳图谱；

[0027] 图2为本发明实施例中实验样本2对IL‑6基因RS1800795位点基因分型的反应电泳图谱；

[0028] 图3为本发明实施例中无法对IL‑6基因RS1800795位点基因分型的反应电泳图谱

[0029] 图4为本发明实施例中实验样本2对PTH基因RS6254位点基因分型的反应电泳图谱；

[0030] 图5为本发明实施例中无法对PTH基因RS6254位点基因分型的反应电泳图谱；

[0031] 图6为本发明实施例中实验样本2对VDR基因RS1544410位点基因分型的反应电泳图谱；

[0032] 图7为本发明实施例中实验样本2对VDR基因RS2228570位点基因分型的反应电泳图谱。

具体实施方式

[0033] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

[0034] 本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0035] 本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0036] 实施例1‑引物组合物的设计

[0037] 本发明基于GC基因、IL‑6基因、PTH基因和VDR基因中筛选出了5个SNP位点体系的优化选择，结合其SNP位点体系的特点，设计PCR引物组合物用于扩增不同基因上包含5个
SNP位点的DNA片段，以及组合设计了紧邻SNP位点的正向延伸引组合物；同时，针对不同的
SNP位点调整不同长度的延伸引物，利用调整5种单碱基延伸引物上修饰的poly T的数量和
单碱基延伸引物的浓度，使其根据各自基因产生的延伸产物具有不同的分子量，使得所有
的引物序列均能够对样本基因进行准确快速分型，提高更多数量的SNP位点在一个反应体
系中分型的准确性，高效直观地根据电泳锋图移动的位置确定不同延伸产物对应的SNP位
点，根据锋的颜色直接判定掺入的碱基种类，易判读且检测准确性和效率高。

[0038] 本发明用于检测钙需求相关的GC基因RS2282679位点、IL‑6基因RS1800795位点、PTH基因RS6254位点、VDR基因RS1544410位点和VDR基因RS2228570位点的引物组合物，如
下：

[0039]

[0040]

[0041] 实施例2‑试剂盒的制备及使用

[0042] a.本发明的试剂盒的组分和含量包括：

[0043] (1)多重PCR扩增试剂：dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、1x GC‑I缓冲液、Mg2+：

[0044] (2)PCR产物纯化试剂：AP酶、Exol1酶、Seq buffer；

[0045] (3)多重单碱基延伸反应试剂：SNaPshot Multiplex Kit(ABI)；

[0046] (4)延伸产物纯化试剂：SAP酶；

[0047] (5)测序变性反应试剂：120 Liz SIZE STANDARD内标、Hi‑Di甲酰胺。

[0048] b.试剂盒的使用

[0049] 1、样本取样

[0050] 取口腔试子唾液样本，并进行DNA提取得DNA样本1μl 1％agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本等量分为4份，并分别稀释至浓度
1ng/μl、1.3ng/μl、2g/μl、5ng/μl的实验样本1～4。

[0051] 2、多重PCR反应

[0052] (1)PCR反应条件

[0053] 配制反应体系，包括2.4μl dNTP Mixture，0.2μl TaqDNA聚合酶，2μl 10X PCR buffer，10μl 1x GC‑I buffer，1.6ul Mg2+，2μl样本DNA和2μl实施例1的多重PCR引物；具
体见下表：

[0054] dNTP Mixture 2.4μlTaqDNA聚合酶 0.2μl
10X PCR buffe 2μl
1x GC‑I buffer 10μl
Mg2+ 1.6ul
样本DNA 2μl
多重PCR引物 2μl

[0055] 多重PCR引物中各对引物的浓度：(μM)

[0056]rs2282679F/R rs1800795F/R rs6254F/R rs1544410F/R rs2228570F/R
1 1 1 1 2

[0057] (2)PCR循环程序

[0058] 根据上述PCR反应条件进行以下PCR循环程序：

[0059]

[0060] 3、PCR产物纯化

[0061] 取PCR扩增后的样本进行纯化：在10μl PCR产物中加入7.2μl SAP酶，1.2μl Exonuclease I酶和0.7ulSeq buffer，37℃温浴30分钟,然后75℃灭活15分钟。

[0062] 4、多重单碱基延伸反应

[0063] (1)延伸反应条件

[0064] 配制延伸反应体系，包括1μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI),1μl纯化后多重PCR产物，1μl实施例1的正向延伸引物组合物，3μl超纯水；具体见下表：

[0065] NaPshot Multiplex Kit(ABI) 1μl纯化后多重PCR产物 2μl
正向延伸引物组合物 1μl
超纯水 3μl

[0066] 延伸引物组合物中各条延伸引物的浓度：(μM)

[0067]rs2282679F rs1800795F rs6254F rs1544410F rs2228570F
2 1 3 2 1

[0068] (2)延伸反应程序

[0069] 根据上述延伸反应条件进行以下延伸反应程序：

[0070]

[0071] 5、延伸产物纯化

[0072] 向6μl延伸产物中加入3.6μl SAP酶，于37℃下温浴30分钟,然后75℃灭活15分钟。

[0073] 6、延伸产物变性及测序

[0074] 取1.2μl纯化后的延伸产物，与0.3μl 120 Liz SIZE STANDARD内标，9.2μl Hi‑Di甲酰胺混匀，95℃5分钟，4℃5分钟变性后上ABI3730XL测序仪电泳。

[0075]纯化后的延伸产物 1.2μl
120 Liz SIZE STANDARD内标 0.3μl
Hi‑Di甲酰胺 9.2μl

[0076] 并用GeneMapper 4.1软件分析电泳结果，根据反应后的电泳图中各峰的情况，确定各SNP位点的基因型，同时，与采用“金标准”sanger测序方法进行上述基因位点的检测进
行对比，结果如下表：

[0077] 基因位点 实验样本1 实验样本2 实验样本3 实验样本4 Sanger测序rs2282679 G,G G,G G,G G,G G,G
rs1800795 G,C G,C G,C G,C G,C
rs6254 A,A A,A A,A A,A A,A
rs1544410 G,G G,G G,G G,G G,G
rs2228570 A,G A,G A,G A,G A,G

[0078] 根据上表可以得知，本发明针对GC基因、IL‑6基因、PTH基因和VDR基因中的5个SNP位点，所设计的5对PCR引物和5种单碱基延伸引物，以及根据SNaPshot反应电泳后可有效、
准确呈现了五个SNP基因位点的图谱：rs2282679、rs1800795、rs6254、rs1544410和
rs2228570的基因分型。

[0079] 同时，由上述的不同实验样本的分型结果，以及采用传统的“金标准”sanger测序方法所进行的上述基因位点的检测结果可以看出，本发明在样品检测浓度为1.3ng/ul时，
能够检测出所有的基因位点的基因突变情况，达到准确、快速的基因分型，而且其检测结果
与“金标准”sanger测序的结果完全一致。但当浓度低于1ng/ul时，则出现了部分基因位点
无法实现同步的基因分型，无法有效对IL‑6基因RS1800795位点和PTH基因RS6254位点进行
基因分型，如图1～7所示。表明，本发明试剂盒对于钙需求相关基因的低检测限可低至
1.3ng/ul，且样本检测的准确性为100％,本发明试剂盒的检测图谱结果简明、清晰，实验结
果的判断快速且准确度高。

[0080] 本发明通过优化了每个单碱基延伸引物修饰的Poly T的不同数量以及各个延伸引物组合物之间的浓度比，使得不同峰处于不同位置，有利于进一步利用ddNTPs进行荧光
标记，使引物延伸后的一个碱基有效携带了不同重量的荧光素，实现同一位置的不同峰也
并不会重叠，提高各峰的之间分离的均匀度，使反应电泳图谱结果更加地准确清晰判定，进
一步提高本发明的试剂盒检测的效率、准确性、大通量和易判读，避免出现部分基因位点无
法有效基因分型。其中，通过对上述的GC基因、IL‑6基因、PTH基因和VDR基因中的5个SNP位
点的正向延伸引物序列中的5’端分别采用采用不同数量的ploy T修饰和调整各个延伸引
物组合物之间的浓度比，对比最终的反应电泳图谱结果发现，优选GC基因、IL‑6基因、PTH基
因和VDR基因中的5个SNP位点的正向延伸引物序列中的5’端分别22、16、35、29、19数量的
ploy T进行修饰，且正向延伸引物浓度比为2:1:3:2:1时，其反应电泳图谱中各峰的之间的
距离均匀且稳定，各基因位点的分型清晰，准确稳定，易判读。

[0081] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。