一种iPS来源心肌细胞复合补片及其制备和应用转让专利
申请号 : CN201811411726.9
文献号 : CN111214703B
文献日 : 2021-06-15
发明人 : 孙广炜 , 刘洋 , 张英 , 赵姗
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
本发明涉及一种iPS来源心肌细胞复合补片，此心肌补片由天然高分子材料的基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。本发明还提供上述iPS来源心肌细胞复合补片的制备方法。本发明操作简单，成本低，所制备的复合补片生物活性高，强度好，可贴附在心脏受损部位，促进受损心肌组织的修复。本发明克服了已有技术的缺陷，在再生医学领域中将发挥重要作用。
权利要求 :
1.一种iPS来源心肌细胞复合补片，其特征在于：由基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成；
基底膜制备：配制含有壳聚糖、透明质酸及明胶的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；
所述壳聚糖在成胶水溶液中的浓度为1‑10%（w/v, g/mL）；
所述透明质酸在成胶水溶液中的浓度为0.1‑1%（w/v, g/mL）；
所述明胶在成胶水溶液中的浓度为3‑15%（w/v，g/mL）；
所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01‑3%（w/v, g/mL）。
2.按照权利要求1所述的复合补片，其特征在于：所述壳聚糖在成胶水溶液中的浓度为5%（w/v, g/mL）；
所述透明质酸在成胶水溶液中的浓度为0.5%（w/v, g/mL）；
所述明胶在成胶水溶液中的浓度为10%（w/v，g/mL）；
所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.5%（w/v, g/mL）。
3.按照权利要求1所述的复合补片，其特征在于：所述壳聚糖的分子量为30000‑200000 kDa；
所述透明质酸的分子量为1300000‑3000000 kDa；
所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；所述明胶的胶冻强度为大于100 Bloom g；
所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平、碳二亚胺的一种。
4.按照权利要求1所述的复合补片，其特征在于：交联条件为温度18‑25℃，交联过程时间大于等于60分钟；
中和过程为使用0.05‑0.3M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶膜，中和过程时间大于等于10分钟；干燥的条件为温度18‑25℃，湿度20‑40%。
5.一种权利要求1‑4任一所述复合补片的制备方法，其特征在于：
1）将iPS细胞依次用Activin A及BMP4进行预处理；
2）将Activin A及BMP4预处理后的细胞接种在用水浸润后的基底膜上，并进行无血清诱导分化1‑3周，获得具有搏动能力的复合补片。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述Activin A预处理为使用含有50‑200ng/mL Activin A及质量浓度1‑3% B27的RPMI 1640培养液处理iPS细胞12‑36h。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述BMP4预处理指在Activin A预处理之后再使用含有5‑20ng/mLBMP4及质量浓度1‑
3% B27的RPMI 1640培养液处理细胞2‑6天。
8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述将Activin A及BMP4预处理后的细胞消化，之后接种在用水浸润后的基底膜上，细
4 2
胞接种密度为2‑10×10/cm；
所述无血清诱导分化指使用含有质量浓度1‑3% B27的RPMI 1640培养液培养细胞。
9.一种权利要求1‑3任一所述iPS来源心肌细胞复合补片作为制备修复心肌损伤移植物的材料的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于：心肌补片具有与心肌组织相似的组成、结构及功能，将iPS来源心肌细胞复合补片贴附于受损心肌组织表面，其即可修复心肌损伤。
说明书 :
一种iPS来源心肌细胞复合补片及其制备和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及再生医学领域，特别涉及一种iPS来源心肌细胞复合补片及其制备和应用。
背景技术
[0002] 现有的溶栓药物与介入手术疗法尽管可以改善心肌梗死患者的症状，但却无法逆转坏死心肌。对于严重的心肌梗死患者，器官移植是根本治疗手段，但由于移植供体的缺乏
与免疫排斥问题，严重限制了器官移植的开展。尽管一些临床研究证实常规细胞注射方法
能够改善患者心功能，但是存在细胞存留量少、细胞活率低以及心律失常等问题。心肌补片
是通过组织工程手段制备的片状的工程化心脏组织，它具有细胞片层结构，能够提高植入
后细胞的存留量和存活率，因此越来越受到重视。不同的构建方法可以制备不同特点的心
肌补片，其功能和特性也各不相同，对治疗效果有很大影响。目前研究比较广泛的是日本
Teruo Okano团队发明的无载体细胞片层制备方法，即利用温敏材料聚异丙基丙烯酰胺在
37℃呈疏水性，在20℃时材料转变为亲水性这一原理，将温敏材料铺在培养皿底部并在其
上种植种子细胞，细胞经一段时间培养并建立好细胞间连接后，通过降低温度(20℃)使得
细胞片逐渐与培养皿底部分离。然而他们所制备的细胞片层是依靠细胞之间的连接构成
的，培养时间长，且细胞层厚度受限，力学强度低，因此移植前的培养时间较长，移植时细胞
片层缺乏支撑，操作困难。与无载体细胞片层相比，有载体细胞片层是使用支架材料作为补
片的基底层，一方面可显著提高细胞片层的厚度和力学强度，增加移植手术的可操作性，另
一方面支架材料的特性可以影响心肌组织微环境及细胞片层的活性和功能。目前心肌补片
基底层主要包括聚丙烯晴、聚己内酯等人造高分子基底层，以及胶原、壳聚糖、蚕丝蛋白等
一种或两种天然高分子所构建的基底层，其成分、结构及功能与体内细胞外基质差距很大，
缺乏足够的生物活性。另外，目前心肌补片以成熟的心肌单细胞层为主，尚未形成微组织，
缺乏足够的生物学功能，治疗效果很有限。iPS细胞具有全能性，在近似在体培养环境中经
过诱导分化能够形成具有搏动能力的心肌微组织层，其功能明显好于心肌单细胞层。
与免疫排斥问题，严重限制了器官移植的开展。尽管一些临床研究证实常规细胞注射方法
能够改善患者心功能，但是存在细胞存留量少、细胞活率低以及心律失常等问题。心肌补片
是通过组织工程手段制备的片状的工程化心脏组织，它具有细胞片层结构，能够提高植入
后细胞的存留量和存活率，因此越来越受到重视。不同的构建方法可以制备不同特点的心
肌补片，其功能和特性也各不相同，对治疗效果有很大影响。目前研究比较广泛的是日本
Teruo Okano团队发明的无载体细胞片层制备方法，即利用温敏材料聚异丙基丙烯酰胺在
37℃呈疏水性，在20℃时材料转变为亲水性这一原理，将温敏材料铺在培养皿底部并在其
上种植种子细胞，细胞经一段时间培养并建立好细胞间连接后，通过降低温度(20℃)使得
细胞片逐渐与培养皿底部分离。然而他们所制备的细胞片层是依靠细胞之间的连接构成
的，培养时间长，且细胞层厚度受限，力学强度低，因此移植前的培养时间较长，移植时细胞
片层缺乏支撑，操作困难。与无载体细胞片层相比，有载体细胞片层是使用支架材料作为补
片的基底层，一方面可显著提高细胞片层的厚度和力学强度，增加移植手术的可操作性，另
一方面支架材料的特性可以影响心肌组织微环境及细胞片层的活性和功能。目前心肌补片
基底层主要包括聚丙烯晴、聚己内酯等人造高分子基底层，以及胶原、壳聚糖、蚕丝蛋白等
一种或两种天然高分子所构建的基底层，其成分、结构及功能与体内细胞外基质差距很大，
缺乏足够的生物活性。另外，目前心肌补片以成熟的心肌单细胞层为主，尚未形成微组织，
缺乏足够的生物学功能，治疗效果很有限。iPS细胞具有全能性，在近似在体培养环境中经
过诱导分化能够形成具有搏动能力的心肌微组织层，其功能明显好于心肌单细胞层。
[0003] 为了改善现有心肌补片基底层与体内细胞外基质相差较大以及心肌单细胞层生物功能低的问题，本发明将仿生基底和iPS相结合，提出了一种新型的iPS来源心肌细胞复
合补片及其制备方法。本发明提出的心肌补片由仿细胞外基质的基底膜以及基底膜上的经
iPS细胞分化产生的心肌微组织层所构成，具有更高的生物学活性和更好的力学强度，且植
入操作更方便，能够显著提高治疗效果。因此，本发明克服了已有技术的缺陷，在心肌修复
领域中将发挥重要作用。
合补片及其制备方法。本发明提出的心肌补片由仿细胞外基质的基底膜以及基底膜上的经
iPS细胞分化产生的心肌微组织层所构成，具有更高的生物学活性和更好的力学强度，且植
入操作更方便，能够显著提高治疗效果。因此，本发明克服了已有技术的缺陷，在心肌修复
领域中将发挥重要作用。
发明内容
[0004] 本发明公开了一种iPS来源心肌细胞复合补片，此心肌补片由天然高分子材料的基底膜，以及附着于基底膜一侧或二侧表面上的由iPS细胞分化产生的心肌细胞层所构成，
具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。
具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。
[0005] 基底膜制备：配制含有壳聚糖、透明质酸及明胶的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；
[0006] 所述壳聚糖在成胶水溶液中的浓度为1‑10％(w/v,g/ml)，优选浓度为5％(w/v,g/ml)；
[0007] 所述透明质酸在成胶水溶液中的浓度为0.1‑1％(w/v,g/ml)，优选浓度为0.5％(w/v,g/ml)；
[0008] 所述明胶在成胶水溶液中的浓度为3‑15％(w/v，g/ml)，优选浓度为10％(w/v，g/ml)；
[0009] 所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01‑3％(w/v,g/ml)，优选浓度为0.5％(w/v,g/ml)。
[0010] 所述壳聚糖的分子量为30000‑200000kDa，优选分子量为110000；
[0011] 所述透明质酸的分子量为1300000‑3000000kDa，优选分子量为2000000kDa；
[0012] 所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；所述明胶的胶冻强度为大于100Bloom g；
[0013] 所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平、碳二亚胺的一种。
[0014] 所述交联条件为温度18‑25℃，交联过程时间大于等于60分钟；
[0015] 所述中和过程为使用0.05‑0.3M甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶膜，优选浓度为0.1M，中和过程时间大于等于10分钟。
[0016] 所述干燥的条件为温度18‑25℃，湿度20‑40％。
[0017] 将iPS细胞依次用Activin A及BMP4进行预处理；
[0018] 将Activin A及BMP4预处理后的细胞接种在用水浸润后的基底膜上，并进行无血清诱导分化1‑3周，优选2周，获得具有搏动能力的复合补片。
[0019] 所述Activin A预处理为使用含有50‑200ng/ml Activin A(优选浓度为100ng/ml)及质量浓度1‑3％B27(不含胰岛素，优选质量浓度为2％)的RPMI 1640培养液处理iPS细
胞12‑36h，优选处理时间为24h。
胞12‑36h，优选处理时间为24h。
[0020] 所述BMP4预处理指在Activin A预处理之后再使用含有5‑20ng/ml BMP4(优选浓度为10ng/ml)及质量浓度1‑3％B27(不含胰岛素，优选质量浓度为2％)的RPMI 1640培养液
处理细胞2‑6天，优选处理时间为4天。
处理细胞2‑6天，优选处理时间为4天。
[0021] 所述将Activin A及BMP4预处理后的细胞消化，之后接种在用水浸润后的基底膜4 2 4 2
上，细胞接种密度为2‑10×10/cm，优选5×10/cm；
上，细胞接种密度为2‑10×10/cm，优选5×10/cm；
[0022] 所述无血清诱导分化指使用含有质量浓度1‑3％B27(不含胰岛素，优选质量浓度为2％)的RPMI 1640培养液培养细胞。
[0023] 所述iPS来源心肌细胞复合补片作为修复心肌损伤移植物的应用。
[0024] 此心肌补片具有与心肌组织相似的组成、结构及功能，将iPS来源心肌细胞复合补片贴附于受损心肌组织表面，其即可修复心肌损伤。
[0025] 本发明的优点
[0026] 1.体内细胞外基质由蛋白、多糖等活性物质构成，本发明利用多种天然高分子材料制备了与体内细胞外基质组成及结构相近的仿生基底膜，显著提高了基底膜的生物活
性，为细胞层提供了更好的生长微环境，并有利于与宿主心肌组织的融合，同时还显著提高
了补片的力学强度和韧性，有利于植入操作；
性，为细胞层提供了更好的生长微环境，并有利于与宿主心肌组织的融合，同时还显著提高
了补片的力学强度和韧性，有利于植入操作；
[0027] 2.本发明在仿生基底膜上制备iPS细胞分化产生的心肌微组织层，使得补片形成了功能性心肌微组织，其生物活性比常规单层心肌细胞更高，体内促心肌修复效果更好。
具体实施方式
[0028] 实施例1：
[0029] 制备含有1％(w/v,g/ml)壳聚糖(30000kDa)、0.1％(w/v,g/ml)透明质酸(1300000kDa)及3％(w/v,g/ml)明胶(220Bloom g)的成胶水溶液，之后加入交联剂京尼平
进行交联反应，交联剂终浓度为0.01％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度50％，交联
过程时间为60分钟，获得凝胶膜，再经过0.05M甘氨酸溶液中和10分钟，清洗及干燥(18℃，
5
湿度20％)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照10 细
2 TM
胞/cm的密度接种于培养皿中并使用mTeSR 1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为
TM TM
含有50ng/ml Activin A及1％B27(不含胰岛素，Gibco B‑27 Supplement,minus
insulin，货号：A1895601)的RPMI 1640培养液预处理12小时。之后，替换为含5ng/ml BMP4
及1％B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液再预处理细胞2天。之后，将Activin A及BMP4预
4 2
处理后的细胞消化，接种在复水后的基底膜上，细胞接种密度为2×10 /cm ，使用含有1％
B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液培养细胞1周。
进行交联反应，交联剂终浓度为0.01％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度50％，交联
过程时间为60分钟，获得凝胶膜，再经过0.05M甘氨酸溶液中和10分钟，清洗及干燥(18℃，
5
湿度20％)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照10 细
2 TM
胞/cm的密度接种于培养皿中并使用mTeSR 1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为
TM TM
含有50ng/ml Activin A及1％B27(不含胰岛素，Gibco B‑27 Supplement,minus
insulin，货号：A1895601)的RPMI 1640培养液预处理12小时。之后，替换为含5ng/ml BMP4
及1％B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液再预处理细胞2天。之后，将Activin A及BMP4预
4 2
处理后的细胞消化，接种在复水后的基底膜上，细胞接种密度为2×10 /cm ，使用含有1％
B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液培养细胞1周。
[0030] 此外，制备壳聚糖分子量为110000、200000及300000的补片作为对照组(其它制备条件均相同)。将上述4种心肌补片分别植入大鼠心肌梗死模型受损心肌组织部位的表面，4
2
周后评价各组心肌梗死区域的面积。实验结果显示，初始动物模型的心肌梗死面积为5cm ，
2
移植壳聚糖分子量300000的心肌补片的大鼠心肌梗死区域面积最大，为4.9cm ，其次是壳
2 2
聚糖分子量200000的心肌补片(4.3cm)，之后是壳聚糖分子量30000的心肌补片(4cm)，梗
2
死面积最小的是壳聚糖分子量110000的补片(3.3cm)。这些结果说明，本发明制备的具有
iPS来源心肌微组织层的复合心肌补片能够治疗效受损心肌组织，且壳聚糖分子量对修复
效果有重要影响，优选110000。
2
周后评价各组心肌梗死区域的面积。实验结果显示，初始动物模型的心肌梗死面积为5cm ，
2
移植壳聚糖分子量300000的心肌补片的大鼠心肌梗死区域面积最大，为4.9cm ，其次是壳
2 2
聚糖分子量200000的心肌补片(4.3cm)，之后是壳聚糖分子量30000的心肌补片(4cm)，梗
2
死面积最小的是壳聚糖分子量110000的补片(3.3cm)。这些结果说明，本发明制备的具有
iPS来源心肌微组织层的复合心肌补片能够治疗效受损心肌组织，且壳聚糖分子量对修复
效果有重要影响，优选110000。
[0031] 实施例2：
[0032] 制备含有10％(w/v,g/ml)壳聚糖(200000kDa)、1％(w/v,g/ml)透明质酸(3000000kDa)及15％(w/v,g/ml)明胶(200Bloom g)的成胶水溶液，之后加入交联剂戊二醛
进行交联反应，交联剂终浓度为3％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度80％，交联过程
时间为5小时，获得凝胶膜，再经过0.3M甘氨酸溶液中和30分钟、清洗及干燥(25℃，湿度
5 2
40％)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照10 细胞/cm
TM
的密度接种于培养皿中并使用mTeSR 1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为含有
TM TM
200ng/ml Activin A及3％B27(不含胰岛素，Gibco B‑27 Supplement,minus insulin，货
号：A1895601)的RPMI 1640培养液预处理36小时。之后，替换为含20ng/ml BMP4及3％B27
(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液再预处理细胞6天。之后，将Activin A及BMP4预处理后的
5 2
细胞消化，接种在复水后的基底膜上，细胞接种密度为10/cm ，使用含有3％B27(不含胰岛
素)的RPMI 1640培养液培养细胞3周。
进行交联反应，交联剂终浓度为3％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度80％，交联过程
时间为5小时，获得凝胶膜，再经过0.3M甘氨酸溶液中和30分钟、清洗及干燥(25℃，湿度
5 2
40％)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照10 细胞/cm
TM
的密度接种于培养皿中并使用mTeSR 1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为含有
TM TM
200ng/ml Activin A及3％B27(不含胰岛素，Gibco B‑27 Supplement,minus insulin，货
号：A1895601)的RPMI 1640培养液预处理36小时。之后，替换为含20ng/ml BMP4及3％B27
(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液再预处理细胞6天。之后，将Activin A及BMP4预处理后的
5 2
细胞消化，接种在复水后的基底膜上，细胞接种密度为10/cm ，使用含有3％B27(不含胰岛
素)的RPMI 1640培养液培养细胞3周。
[0033] 此外，制备明胶浓度为3％(w/v,g/ml)、10％(w/v,g/ml)及20％(w/v,g/ml)的补片作为对照组(其它制备条件均相同)。将上述4种心肌补片分别植入大鼠心肌梗死模型受损
心肌组织部位的表面，4周后评价各组心肌梗死区域的面积。实验结果显示，初始动物模型
2
的心肌梗死面积为4.8cm ，移植明胶浓度20％(w/v,g/ml)心肌补片的大鼠的心肌梗死区域
2 2
面积最大，为4.6cm ，其次是明胶浓度3％(w/v,g/ml)的心肌补片(4.2cm)，之后是明胶浓度
2
15％(w/v,g/ml)的心肌补片(3.6cm)，梗死面积最小的是明胶浓度10％(w/v,g/ml)的补片
2
(2.7cm)。这些结果说明，本发明制备的具有iPS来源心肌微组织层的复合心肌补片能够治
疗效受损心肌组织，且基底膜制备时明胶浓度对修复效果有重要影响，优选10％。
心肌组织部位的表面，4周后评价各组心肌梗死区域的面积。实验结果显示，初始动物模型
2
的心肌梗死面积为4.8cm ，移植明胶浓度20％(w/v,g/ml)心肌补片的大鼠的心肌梗死区域
2 2
面积最大，为4.6cm ，其次是明胶浓度3％(w/v,g/ml)的心肌补片(4.2cm)，之后是明胶浓度
2
15％(w/v,g/ml)的心肌补片(3.6cm)，梗死面积最小的是明胶浓度10％(w/v,g/ml)的补片
2
(2.7cm)。这些结果说明，本发明制备的具有iPS来源心肌微组织层的复合心肌补片能够治
疗效受损心肌组织，且基底膜制备时明胶浓度对修复效果有重要影响，优选10％。
[0034] 实施例3：
[0035] 制备含有5％(w/v,g/ml)壳聚糖(110000kDa)、0.5％(w/v,g/ml)透明质酸(2000000kDa)及10％(w/v,g/ml)明胶(180Bloom g)的成胶水溶液，之后加入交联剂碳二亚
胺进行交联反应，交联剂终浓度为0.5％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度60％，交联
过程时间为10小时，获得凝胶膜，再经过0.1M甘氨酸溶液中和20分钟、清洗及干燥(22℃，湿
5
度30％。)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照10 细
2 TM
胞/cm的密度接种于培养皿中并使用mTeSR 1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为
TM TM
含有100ng/ml Activin A及2％B27(不含胰岛素，Gibco B‑27 Supplement,minus
insulin，货号：A1895601)的RPMI 1640培养液预处理24小时。之后，替换为含10ng/ml BMP4
及2％B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液再预处理细胞4天。之后，将Activin A及BMP4预
4 2
处理后的细胞消化，接种在复水后的基底膜上，细胞接种密度为5×10 /cm ，使用含有2％
B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液培养细胞2周。
胺进行交联反应，交联剂终浓度为0.5％(w/v,g/ml)，交联条件为温度25℃，湿度60％，交联
过程时间为10小时，获得凝胶膜，再经过0.1M甘氨酸溶液中和20分钟、清洗及干燥(22℃，湿
5
度30％。)后即得到仿细胞外基质基底膜。将人血液单个核细胞来源的iPS细胞按照10 细
2 TM
胞/cm的密度接种于培养皿中并使用mTeSR 1培养液培养，当细胞达到90％融合时替换为
TM TM
含有100ng/ml Activin A及2％B27(不含胰岛素，Gibco B‑27 Supplement,minus
insulin，货号：A1895601)的RPMI 1640培养液预处理24小时。之后，替换为含10ng/ml BMP4
及2％B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液再预处理细胞4天。之后，将Activin A及BMP4预
4 2
处理后的细胞消化，接种在复水后的基底膜上，细胞接种密度为5×10 /cm ，使用含有2％
B27(不含胰岛素)的RPMI 1640培养液培养细胞2周。
[0036] 此外，制备在复水基底膜上细胞接种密度为104/cm2、2×104/cm2、105/cm2及2×5 2
10/cm 的补片作为对照组(其它制备条件均相同)。将上述5种心肌补片分别植入大鼠心肌
梗死模型受损心肌组织部位的表面，4周后评价各组心肌梗死区域的面积。实验结果显示，
2 4 2
初始动物模型的心肌梗死面积为4.9cm ，移植细胞接种密度为10/cm心肌补片的大鼠的心
2 5 2 2
肌梗死区域面积最大，为4.5cm ，其次是细胞接种密度为2×10 /cm 的心肌补片(4.3cm)，
5 2 2 4 2 2
之后是10/cm的心肌补片(3.5cm)，然后是2×10/cm的心肌补片(3cm)，梗死面积最小的
4 2 2
是细胞接种密度为5×10/cm 的补片(2.2cm)。这些结果说明，本发明制备的具有iPS来源
心肌微组织层的复合心肌补片能够治疗效受损心肌组织，且复水基底膜上的细胞接种密度
4 2
对修复效果有重要影响，优选5×10/cm。
10/cm 的补片作为对照组(其它制备条件均相同)。将上述5种心肌补片分别植入大鼠心肌
梗死模型受损心肌组织部位的表面，4周后评价各组心肌梗死区域的面积。实验结果显示，
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初始动物模型的心肌梗死面积为4.9cm ，移植细胞接种密度为10/cm心肌补片的大鼠的心
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肌梗死区域面积最大，为4.5cm ，其次是细胞接种密度为2×10 /cm 的心肌补片(4.3cm)，
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之后是10/cm的心肌补片(3.5cm)，然后是2×10/cm的心肌补片(3cm)，梗死面积最小的
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是细胞接种密度为5×10/cm 的补片(2.2cm)。这些结果说明，本发明制备的具有iPS来源
心肌微组织层的复合心肌补片能够治疗效受损心肌组织，且复水基底膜上的细胞接种密度
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对修复效果有重要影响，优选5×10/cm。