抗AMH单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种新的抗AMH单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体是由氨基酸序列号为SEQ ID NO：1的肽片段制备而成。该抗AMH单克隆抗体效价高、特异性反应好；并且可应用在检测血清AMH和卵巢组织AMH上，使用范围广；此外，作为检测抗体制备得到的试剂盒样本稳定性显著增加。

权利要求

1.一种抗AMH单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由氨基酸序列号为SEQ ID NO：1的肽片段制备而成，且所述单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C202035的杂交瘤细胞分泌而成。

2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞保藏于中国典型培养保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202035。

3.权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体在制备检测人血清中AMH的试剂的应用。

4.根据权利要求3所述的抗AMH单克隆抗体在制备检测人血清中AMH的试剂的应用，其特征在于：所述试剂包括固相载体和包被在固相载体的抗体，所述抗体是由保藏号为CCTCC NO:C202035的杂交瘤细胞分泌而成的单克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的抗AMH单克隆抗体在制备检测人血清中AMH的试剂的应用，其特征在于：所述试剂包括固相载体、包被在固相载体的抗体和检测单抗；所述检测单抗是由保藏号为CCTCC NO:C202035的杂交瘤细胞分泌而成。

6.根据权利要求5所述的抗AMH单克隆抗体在制备检测人血清中AMH的试剂的应用，其特征在于：所述包被在固相载体上的抗体为抗人AMH单克隆抗体或抗人AMH多克隆抗体；并且抗人AMH单克隆抗体的抗原识别表位与检测单抗的抗原识别表位不同。

7.权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体在制备检测卵巢组织AMH的试剂的应用。

说明书

抗AMH单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗AMH单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 抗苗勒管激素(anti‑mullerian hormone，AMH)是血清中的大分子，属于转化生长因子β(transforming growth factor‑β，TGF‑β)超家族成员之一，是睾丸未成熟的支持细
胞及卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌的一种糖蛋白，其是由两个相同的70KD亚
基、通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量约为140KD(Rodolfo Rey等，2003
年)。

[0003] AMH是不孕不育治疗、卵巢储备功能评估、多囊卵巢综合征诊断的最有临床价值的新兴标志物。AMH的正常值界于2～6.8ng/ml之间，AMH数值越高，代表卵子存量越丰沛，适合
受孕的黄金期较长，AMH值越低则卵巢功能越差，35岁过后AMH值会开始急剧下降，当AMH值
低于0.7ng/ml 时，表示卵子库存量已严重不足，几乎难以受孕。若AMH值大于6.8时，可考虑
有多囊性卵巢症候群的体质，使用排卵针剂、药物时，卵巢也容易对反应过度而排出过多的
卵子，造成卵巢过度刺激症候群。全世界有10％～15％的育龄女性受不孕不育的困扰，中国
不孕不育率在短短的20年间，由2.5％‑ 3％迅速攀升到12.5％‑15％，与发达国家发病率基
本持平。中国不孕不育患者人数超过5000万，这意味着每8对夫妇中就有1对面临不孕不育
的问题，其中女性问题占1/4。女性生育能力与体内各类生殖激素和卵巢储备功能密切相
关。

[0004] 目前有专利文献认为AMH成熟区含有半胱氨酸数量较多，在体内结构更稳定，因而抗原识别表位在成熟区的单克隆抗体检测的再现性更好，可以克服AMH蛋白稳定性差导致
的检测结果因保存条件变化而引起的变化(参见专利文献US 7897350)。然而在临床实际使
用过程中，许多研究(Xan et al.,2014；Lukaszuk et al.,2014)表明使用针对成熟区抗体
的试剂盒性能表现并没有达到厂家宣称的效果，认为根据专利文献US7897350报道的方法，
AMH的检测浓度被低估，且检测方法灵敏度低。

[0005] 此外，我国检测AMH的高特异性试剂盒研究报道很少，产品原料长期依赖进口(Dewailly Didier等，2019；Sonigo Charlotte等，2019；Broer SL 等，2014)。为了开发高
灵敏高特异性高稳定性的国产AMH检测试剂，亟需研究新的单克隆抗体，为进一步制备高特
异性检测试剂盒、提高试剂盒的检测样本稳定性打下结实的基础。

发明内容

[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种新的抗AMH单克隆抗体及其应用。

[0007] 在一方面，本发明提供了一种抗AMH单克隆抗体，所述单克隆抗体是由氨基酸序列号为SEQ ID NO：1的肽片段制备而成。

[0008] 在一些实施方式中，所述单克隆抗体是由氨基酸序列号为SEQ  ID  NO：  1(RGRDPRGPGRAQR)的肽片段与卵清蛋白(ovalbumin，简称ova)或牛血清白蛋白(bovine 
serum albumin，简称BSA)偶联，免疫小鼠纯化得到。

[0009] 在一些实施方式中，所述单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO: C202035的杂交瘤细胞分泌而成。

[0010] 在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞保藏于中国典型培养保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202035。

[0011] 在第三方面，本发明提供了上述抗AMH单克隆抗体在制备检测人血清中AMH的试剂的应用。

[0012] 在一些具体实施方式中，所述试剂包括固相载体和包被在固相载体的抗体，所述抗体是由氨基酸序列号为SEQ ID NO：1的抗原制备而成的单克隆抗体。

[0013] 在另一些具体实施方式中，所述试剂包括固相载体、包被在固相载体的抗体和检测单抗；所述检测单抗是由氨基酸序列号为SEQ ID NO：1的抗原制备而成。

[0014] 在一些具体实施方式中，所述包被在固相载体上的抗体为抗人AMH单克隆抗体或抗人AMH多克隆抗体；并且抗人AMH单克隆抗体的抗原识别表位与检测单抗的抗原识别表位
不同。

[0015] 在第四方面，本发明提供了上述抗AMH单克隆抗体在制备检测卵巢组织AMH的试剂的应用。

[0016] 在第五方面，本发明还提供一种上述抗AMH单克隆抗体作为检测抗体制备的试剂盒。

[0017] 使用AMH前区439～451aa的序列，在偶联卵清蛋白的情况下，免疫小鼠后，纯化得到了的利用该试剂盒检测血清中的AMH，其样本稳定性好。

[0018] 本发明的单克隆抗体的有益效果在于：

[0019] 首先，本发明经过大量的实验，才筛选到一株可分泌识别439～451aa‑ova 抗原、重组AMH蛋白抗原和卵巢组织总蛋白(天然AMH蛋白)的单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤
细胞分泌的单克隆抗体可识别重组AMH蛋白亦可识别天然的蛋白，并且仅识别特异抗原表
位，与其余表位(如表位2～3) 不反应，因此特异性好。并且预计可以应用在诸如放射自显
影、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等各种
检测技术上；

[0020] 其次，本发明的单克隆抗体并不识别卵清蛋白、牛血清白蛋白、宿主细胞蛋白和其他表位，特异性极好的同时效价高(1:12000)，相比较现有商购抗体来说，有着更佳的免疫
效果，进一步为制备具有较好的检测灵敏度和特异性的商品化产品提供必要前提；

[0021] 另外，通过使用氨基酸序列号为SEQ ID NO：1(RGRDPRGPGRAQR) 的抗原制备出识别类似抗原表位的单克隆抗体，意外发现，当在制备试剂盒时，将该单克隆抗体作为检测抗
体，该试剂盒在进行血清AMH检测时，可以明显提高检测的样本稳定性，即样本室温放置23h
或者在2～8℃下保存3 天后的检测结果与新鲜样本比较，相缠不大，样本的长期保存对其
检测结果准确性影响小。

[0022] 综上，本发明的单克隆抗体在抗体效价、特异性反应和检测效果等多方面均展现出了很好的性能，从而本发明提供了一种经系统性评价可用于体外诊断且综合能力突出的
抗AMH单克隆抗体。

附图说明

[0023] 图1为本发明单克隆抗体anti‑amh‑1的western blot表位及特异性结合反应分析图；其中，epitope1为439～451aa‑ova、epitope2为42～54aa‑ova、epitope3 为237～
285aa‑ova、epitope4为494～506aa‑ova、Host total protein为BL21(DE)3 菌体蛋白、
Total ovarian tissue为卵巢组织总蛋白(天然AMH)。

具体实施方式

[0024] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明
本发明，而非限制本发明。

[0025] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领
域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

[0026] 抗体

[0027] 如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、CDR移植抗体和抗体构建体，如单链Fv (scFv)或抗体融合蛋白；此外，
还涉及重组地或合成地产生/合成的抗体。

[0028] 如本文使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高
度特异性的，针对单一抗原。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆
抗体制剂形成对照，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释
为需要通过任何具体方法生产抗体。

[0029] 肽片段

[0030] 如本文使用的，术语“肽片段”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语肽片段互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“肽片段”包含天然或人工蛋白质、蛋
白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。肽片段可以是单体或聚合的。

[0031] 表位

[0032] 如本文使用的，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺
酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、
和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质
和/或大分子复杂混合物中优先识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。

[0033] 固相载体

[0034] 本发明的固相载体A的特征在于，除具有可固定配体的官能团以外，还具有如下基团：具有亚磺酰基(＞S(＝O))、硫醚基(＞S)、氧基(＞O)或亚氨基 (＞NH)与羟基(‑OH)、硫
醇基(‑SH)、氨基(‑NH2)、羧基(‑COOH)、硫酸基(‑ OS(＝O)2(OH))、磷酸基(‑OP(＝O)(OH)2)
或烷酰基的基团。另外，该烷酰基可以是直链状也可以是支链状，其碳原子数优选为2～10，
更优选为2～6，特别优选为2～4。作为烷酰基，可举出乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基。

[0035] 试剂盒

[0036] 本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如，试纸、含有各种测试所需试剂的测试盒、微流体芯片等，可以按照本领域技术人员已知的标准步骤来制造试剂盒。

[0037] 本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂和/或用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。

[0038] 实施例中采用化学发光免疫测定为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于胶体金免疫测定。

[0039] 应用

[0040] 本发明的抗体或杂交瘤细胞可用于检测AMH，本发明的抗体或杂交瘤细胞株可对来源于人类的生物样品进行检测。

[0041] 如本文中所使用的，“生物样品”是指精液、淋巴、血清、血浆、尿、滑液或脊髓液。在优选的实施方式中，生物样品是指血液、血清或血浆。

[0042] 优选的，使用来自于人的发病初期的生物样品。

[0043] 可以使用免疫测定的方法定量或定性检测人IgM的存在，所述免疫测定通常包括将生物样品与本发明的抗体和/或检测所需的其他材料一同孵育或依次接触，并通过多种
本领域熟知的技术检测结合的抗体。

[0044] 检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等。这些方法尤其包括Western 印迹、重叠测定、RIA(放
射免疫测定)和IRMA(免疫放射免疫测定)、GIA (胶体金免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、
ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA (荧光免疫测定)、以及CLIA(化学发光免疫测定)等。

[0045] 下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，为可以通
过商购获得的常规产品。

[0046] 以下实验材料具体如下：

[0047] SPF级BALB/c小鼠，6‑8周龄，购自华西实验动物中心；

[0048] 质粒pET28、大肠杆菌BL21(DE3)和SP2/0骨髓瘤细胞来自华西基础医学与法医学院微生物教研室保存；

[0049] 胎牛血清，购自GIBC；

[0050] 1640培养基，购自GIBICO；

[0051] 次黄嘌呤‑氨基蝶呤‑胸腺嘧啶核苷(hypoxan‑thine‑aminopterin‑ thymidine，HAT)培养基，购自SIGMA；

[0052] 和次黄嘌呤‑胸腺嘧啶核苷(hypoxanthine‑thymidine，HT)培养基，购自SIGMA；

[0053] 小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，购自SIGMA；

[0054] 聚丙烯酰胺凝胶，购自AMOSCERO；

[0055] HRP，购自DYZEMEN公司；

[0056] ELISA酶标反应板，购自CORNING。

[0057] 实施例1多肽合成及偶联OVA蛋白

[0058] 用生物信息学方法从AMH基因中筛选优势表位序列，人工合成(上海生工)4条肽片段分别:42～54aa肽片段、273～285aa肽片段、439～451aa 肽片段(RGRDPRGPGRAQR)、494～
506肽片段；分别与乳清蛋白(ova) 进行偶联。

[0059] 实施例2免疫小鼠

[0060] 取偶联ova肽片段等体积的弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)，混合，使其彻底乳化呈乳糜状。用75％酒精消毒小鼠皮肤，对小鼠背部、腹部皮下或皮内，淋
巴结密集的部位实行多点注射方法，首次注射的免疫原剂量为100μg/只，免疫周期为0、14、
28天。

[0061] 用等量不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant，IFA)乳化同样处理的免疫原，对实验动物进行第二三次免疫，免疫的方法同首次免疫。第三次免疫后2周，断尾采
集免疫后BALB/C小鼠的血清，用间接ELISA 的方法检测小鼠免疫后血清抗体效价水平，以
观察免疫应答效果。

[0062] 对免疫应答结果符合要求的小鼠进行腹腔注射免疫原，加强免疫剂量仍为100μg/只。三天后无菌收集小鼠脾脏细胞作为备用。

[0063] 实施例3杂交瘤细胞的建立及筛选

[0064] 一、杂交瘤细胞的建立

[0065] 选取效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞按10：1的比例融合，并加入1ml事先预热好的45％PEG，以1500r/min离心3分钟的速度反复稀释洗涤离心3次后，弃上清，用1xHAT选
择性培养基重悬细胞，混匀后移入预先加入饲养细胞培养24h的96孔板，CO2孵箱培养4～
7d，然后改用HT 培养基培养。

[0066] 细胞融合24h后，加3倍量HAT培养液进行第一次筛选。2周后改用 HT培养液维持培养，再过2周，则可换成一般培养液进行培养。

[0067] 二、阳性杂交瘤细胞的筛选

[0068] 取AMH重组蛋白或者BSA偶联的对应的多肽，用含包被缓冲液 (0.05mol/L pH 9.6PBS)稀释，最终浓度为1μg/ml，100μl/孔加入96孔板中；将偶联后融合蛋白免疫原稀释
成至1μg/ml，100μl/孔加入96孔板中。置4℃过夜，弃包被液，洗涤包被的酶标板3次拍干。

[0069] 每孔加入5％BSA 200μl，37℃孵育约2h拍干。密封4度备用。

[0070] 待杂交瘤克隆细胞密度长至25％～50％，按无菌细胞培养上清液，取 50μl加入融合蛋白免疫原包被的酶标板中。设立空白对照(用细胞培养基原液作空白对照，测定板和对
照板各1孔)。4℃低温过夜，反复洗涤酶标板3次，拍干。

[0071] 每孔分别加入100μl的1:10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗于酶标板中，37℃孵育1h。弃二抗，反复洗涤酶标板3次，拍干。

[0072] 避光配制TMB底物显色液，100μl/孔，37℃下避光显色20min。

[0073] 每孔分别80μl的2mol/L H2SO4，在酶标仪的450nm波长下，检测酶标板所有孔A450值。

[0074] 以测定孔(融合蛋白合成肽包被)A450值大于对照孔(超纯水包被) A450值2.1倍为阳性作为判断标准。

[0075] 三、阳性杂交瘤细胞的克隆

[0076] 采用有限稀释法的程序进行克隆化培养。预先制备饲养层细胞，取4 只小鼠的腹腔巨噬细胞，每只小鼠的腹巨噬细胞均铺2.5块96孔聚苯乙烯细胞培养板，共铺10块。对阳
性杂交瘤细胞进行亚克隆。吸弃培养基，用无血清1640吹打孔中的细胞至15ml离心管中，补
加1640培养至1ml，吹打后取50ul用于计数。计数后，加入相应体积的1640培养基将细胞梯
度稀释成60个/ml，30个/ml，15个/ml，7.5个/ml，并铺板，每个梯度铺2列 (16孔)，置于C02
温箱培养7～10天。之后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此反复3
～5次，直至达100％阳性孔时即可。

[0077] 本实施例共克隆得到6株阳性杂交瘤细胞，分别为AMH‑1、AMH‑2、 AMH‑3、AMH‑4、AMH‑5、AMH‑6；其中使用42～54aa肽片段没有制得有效的阳性杂交瘤细胞株，使用273～
285aa肽片段制备得到AMH‑5和AMH‑ 3，使用439～451aa肽片段(RGRDPRGPGRAQR)制备得到
AMH‑1、 AMH‑2和AMH‑6，使用494～506肽片段制备得到AMH‑4杂交瘤细胞。其中，杂交瘤细胞
株AMH‑1和AMH‑3所分泌抗体稳定性最高，并且AMH‑1 相对于AMH‑3分泌得到的单克隆抗体
特异性最好。因此，仅将杂交瘤细胞株AMH‑1于2020年1月21日保藏在中国典型培养物保藏
中心，保藏地址：武汉，保藏编号为CCTCC NO:C202035。

[0078] 实施例4单克隆抗体的制备及效价的检测

[0079] 预先腹腔注射0.5ml液体石腊于BALB/c小鼠2只，2周后，分别在小鼠腹腔内接种上6
述约10个AMH‑1和AMH‑3杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆
抗体。接种细胞7～10天后可见小鼠腹腔膨隆产生腹水，待腹水尽可能多时处死小鼠，用注
射器抽取可见淡黄色腹水，可反复抽取数次，腹水中即可获得大量单克隆抗体。将新鲜采集
的腹水(或冻存的腹水)以1500r/min的速度离心15分钟，取上层清澈的腹水，加入等体积
pH7.2巴比妥缓冲盐水进行稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末的比例加
入相应量的二氧化硅，混和均匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，除
去脂质等，即可得澄清的腹水，AMH‑1杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作anti‑amh‑1， AMH‑
3杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作anti‑amh‑2。

[0080] 采取间接ELISA法，兔抗人IgG抗体100μL/孔包板，将含anti‑amh‑1 和anti‑amh‑2的上清在另一块板上用PBS作系列倍比稀释，以PBS为阴性对照，以及空白培养基为空白对
照。酶标仪测定其A450值，以形成明显梯度的阳性反应的最高稀释倍数作为抗体的效价，具
体见下表。

[0081] 表1为ELISA检测抗anti‑amh‑1单克隆抗体效价

[0082]

[0083] 表2为ELISA检测抗anti‑amh‑2单克隆抗体效价

[0084]

[0085] 注：OD450(即A450)≥2.1以上为阳性；

[0086] 本实施例中制备得到的两个单克隆抗体anti‑amh‑1和anti‑amh‑2，经过间接ELISA检测，得到其效价分别为1：12000和1：1600。anti‑amh‑1效价高出了一个数量级，因此
有更加的免疫效果。

[0087] 实施例5单克隆抗体特异性分析

[0088] 采用间接ELISA法，用BL21(DE)3菌体蛋白、卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、重组抗人苗勒管激素(rAMH)和人卵巢组织总蛋白 (阳性对照)分别包被酶标板，检测杂交
瘤细胞培养上清，测定抗体与这些蛋白的交叉反应OD450值，判断抗体的特异性，具体如下
表。

[0089] 表3

[0090]

[0091] 从表3可以看出，本发明的两株单克隆抗体anti‑amh‑1和anti‑amh‑2均可以识别重组AMH蛋白(rAMH)和天然AMH蛋白(卵巢组织总蛋白)；并且不能识别BSA、OVA和宿主蛋白，
由此可见，本发明的单克隆抗体均具有较高的特异性。

[0092] 接着，对上述两株单克隆抗体进行了表位验证。使用western blot的方式，将合成的4个已知表位结合ova蛋白，提高合成的4个表位的免疫原性；进行免疫印迹检测单克隆抗
体的结合特异性。具体方法为：对合成的4 种表位抗原、纯化的rAMH蛋白抗原、天然AMH蛋白
和OVA蛋白进行 SDS‑PAGE凝胶电泳，上样量为20μg/孔，然后以200mA1h恒流湿转至 PVDF膜
上。用5％脱脂奶粉封闭1h后，用上述两株单克隆抗体作为一抗进行孵育，4℃摇床过夜。次
日，用TBST洗涤后孵育HRP标记的羊抗鼠 IgG抗体作二抗。加入二抗反应1.5h，最后加入鲁
米诺和缓冲液化学发光显色液，显影曝光。

[0093] 经验证，单克隆抗体anti‑amh‑1识别抗原表位1：439‑451aa‑ova (epitope1)，并且与卵巢卵泡组织中天然的AMH也能识别，同时也能识别重组AMH(rAMH)；具体如图1所示。
单克隆抗体anti‑amh‑2能识别rAMH 跟卵巢卵泡组织中的天然AMH，对合成的4个已知表位
和重组AMH均不反应；并且anti‑amh‑1和anti‑amh‑2均均不识别OVA蛋白和宿主蛋白；由此
可见，本发明得到的单克隆抗体anti‑amh‑1和anti‑amh‑2特异性好。

[0094] 综上，本发明的单克隆抗体anti‑amh‑1不仅很好的识别了其抗原表位 1，还可以识别天然AMH蛋白和重组rAMH蛋白，且不识别其他抗原表位和蛋白，特异性好，由于可识别
rAMH和天然AMH，预测其应用范围广，比如可以应用在血清的检测和卵巢组织的检测上；此
外，单克隆抗体1的效价更高，其反应性相对较好。因此本发明仅对分泌单克隆抗体anti‑
amh‑1 的。杂交瘤细胞进行的菌种保藏，保藏编号为CCTCC NO:C202035。

[0095] 实施例5试剂盒的构建及效果验证

[0096] 将本发明的杂交瘤细胞AMH‑1分泌的单克隆抗体anti‑amh‑1应用于化学发光免疫平台检测血清样本中AMH的浓度，但本发明单克隆抗体anti‑ amh‑1的应用并不限于此。

[0097] 试剂盒A是由试剂1和试剂2组成，具体配方如下表所示

[0098] 表4

[0099]

[0100]

[0101] 其中，试剂1的anti‑amh‑1包被在磁珠上。因此，该试剂盒anti‑amh‑1 用作捕获抗体使用；

[0102] 试剂盒B是由试剂1和试剂2组成，具体配方如下表所示

[0103] 表5

[0104]

[0105] 其中，试剂1的鼠抗人AMH单克隆抗体1包被在磁珠上。anti‑amh‑1 标记有发光物质，可以通过监测发光物质确定目标物质的浓度，因此，该试剂盒anti‑amh‑1用作检测抗体
使用。

[0106] 本实施例的鼠抗人AMH单克隆抗体1来自于华葵金配生物科技有限公司，货号为M8010‑8D1。利用上述两个试剂盒对临床样本进行检测。临床样本分别为放置室温0h、室温
5h、室温9h、室温23h、2～8℃1d、2～8℃ 3d的样本，检测结果下表所示。

[0107] 表6 anti‑amh‑1用作捕获抗体使用的试剂盒A的样本稳定性

[0108]

[0109] 表7 anti‑amh‑1用作检测抗体使用的试剂盒B的样本稳定性

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[0111] 通过表6和表7，发明人意外发现，当使用本发明杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体anti‑amh‑1用作捕获抗体时，样本在室温放置9h后，检测的数据与新鲜样本检测数据存在
10％左右的差距(检测差距)，当样本在室温放置 23h后，检测差距高达72.75％；当样本在2
～8℃下保存一天后检测，检测差距仅在10％左右，当样本在2～8℃下保存3天，检测差距增
加到高达30％左右。

[0112] 而当使用本发明杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体anti‑amh‑1用作检测抗体时，可以显著提升试剂盒检测的样本稳定性：样本在室温下保存23h或者在 2～8℃下保存3天后的
检测差距降至10％左右。

[0113] 综上，本发明制备的到的杂交瘤细胞分泌的单抗效价高，反应性好；因不仅仅可以识别明确表位，还可以识别重组AMH和卵巢组织AMH，并且不识别其他表位和蛋白，因此特异
性好、可应用范围广。此外，发明人还意外发现本发明的单抗用作检测抗体时，可进一步提
高试剂盒的检测样本稳定性，样本在室温下保存23h或者在2～8℃下保存3天后的检测结果
与新鲜样本的检测结果相差在10％以内，不影响检测准确性。

[0114] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是
意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

[0115] 本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。