一种添加醇类物质促进红曲菌生产红曲黄色素的方法

摘要

本发明公开了一种添加醇类物质促进红曲菌生产红曲黄色素的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过在红曲菌发酵初期添加醇类物质，促进红曲菌菌体量增加及红曲色素合成。该方法操作简单，经济高效，不污染环境，且不会改变色素的结构，不增加额外的人工和设备，仅通过较低的附加投入，就可以提高红曲黄色素的合成，使红曲黄色素的色价达415U/mL，具有重大的经济效益。

权利要求

1.一种促进红曲菌发酵生产红曲黄色素的方法，其特征在于，在红曲菌的发酵初始或者发酵过程中加入醇类物质；所述醇类物质为乙醇、异丙醇或其混合物；

所述发酵是在液态环境下发酵；

所述醇类物质的添加量为发酵体系总体积的3％‑6％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇类物质的添加时机为液态发酵培养开始后0‑96h内。

3.一种红曲黄色素的发酵方法，其特征在于，以红曲菌为发酵微生物，在发酵初始或者发酵过程中加入占发酵体系总体积的3％‑6％的醇类物质，发酵4～8d；所述醇类物质为乙醇、异丙醇或其混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红曲菌是能够产红曲黄色素的红曲菌，包括但不限于紫色红曲菌(Monascus purpureus)sjs‑6、紫色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 40225、紫色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 40937、紫色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 5042、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.4701、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.4652、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.465、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.4649。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵是在转速为150‑250r/min，温度

25‑35℃条件下。

6.根据权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，所述方法是接种红曲菌种子液于液态发酵培养基中进行发酵；在液态发酵培养开始后0～96h内加入醇类物质。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述液态发酵培养基含有玉米淀粉20‑

80g/L，硫酸铵3‑10g/L，硝酸钠2‑6g/L，硫酸镁0.5‑1.5g/L，磷酸二氢钾0.5‑1.5g/L，磷酸氢二钾0.5‑1.5g/L，氯化钙0.1‑0.5g/L。

8.权利要求1‑7任一所述方法在制备红曲黄色素及含有红曲黄色素的食品添加剂中的应用。

说明书

一种添加醇类物质促进红曲菌生产红曲黄色素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种添加醇类物质促进红曲菌生产红曲黄色素的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

[0002] 目前，微生物发酵法和植物抽提法为生产天然黄色素的两种主要方法。植物来源的天然黄色素如：栀子黄色素、红花黄色素、姜黄色素、玉米黄色素、桔皮黄色素、南瓜黄色
素等，这些植物来源的色素在生产过程中面临各方面的局限性，一方面抽提过程中要采用
有机试剂，成本较高，产量及应用受限，另一方面其季节性很强，其生产在季节的影响下会
导致设备的利用率低下，造成资源浪费。相反，利用微生物发酵法生产天然黄色素基本安全
无毒，具有十分广阔的发展前景。

[0003] 为提高红曲黄色素生产水平，国内外文献报道的论文或专利关注的重点主要集中在高产红曲菌种的诱变筛选方面，但收效不大。例如泰国Yongsmith的科研团队从20世纪90
年代以来通过诱变选育到了单产黄色素的红曲菌，应用于液态发酵和固态发酵生产红曲黄
色素。该菌株生产的红曲黄色素的最大吸收峰对应的波长是370nm。但液态发酵法黄色素生
产水平非常低，至今尚未实现工业化生产。该菌固态发酵12天生产的红曲黄(米)色价达到
2224.63U/gdw，虽然色素生产水平较高，但发酵时间过长。国内周波等人通过诱变选育出了
红曲黄色素产生菌，该菌株生产的红曲黄色素的最大吸收峰对应的波长是410nm，液态发酵
7天的发酵液黄色素色价值仅达110U/mL。以上几例由于发酵色素浓度偏低，发酵时间偏长，
均不符合工业化生产的要求。

[0004] 发明人所在的实验室在发明专利“一种偶联原位萃取发酵红曲黄色素的双液相发酵方法”(专利号201410116854.6)中，通过设计合理的碳氮源组分、控制培养基中游离氨基
酸的含量以及双液相发酵体系，将合成的红曲黄色素迅速富集到脂溶性溶剂中(所述脂溶
性溶剂主要指甘油酯类物质)，从而大大提高红曲黄色素的生产效率。但是在实际生产过程
中，发现脂类物质成本较高，从酯类物质中进一步分离提取色素也是一个难点，而且酯类物
质难以重复利用，后处理步骤复杂。本发明不需要在发酵过程添加萃取剂，仅通过在发酵培
养基中加入醇类物质，即可增加红曲菌的菌体量，大幅度促进红曲菌黄色素的合成，具有重
要的研究和应用价值。

[0005] 目前红曲菌发酵产红曲黄色素的合成途径仍然没有得到深入的研究，采用普通的液态发酵培养基成分，很难达到高产红曲黄色素的目的。原位萃取发酵虽然切实有效，但是
萃取剂成本高，而且难以重复利用，后处理步骤复杂。

发明内容

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种促进红曲菌发酵生产红曲黄色素的方法，所述方法是在红曲菌的发酵初始或者发酵过程中加入醇类物质。

[0007] 在一种实施方式中，所述发酵是在液态环境下发酵。

[0008] 在一种实施方式中，所述红曲菌是能够产红曲黄色素的红曲菌，包括但不限于紫色红曲菌(Monascus purpureus)sjs‑6、紫色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 40225、紫
色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 40937、紫色红曲菌(Monascus purpureus)CICC 
5042、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.4701、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 
3.4652、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 3.465、红色红曲菌(Monascus ruber)CGMCC 
3.4649。

[0009] 在一种实施方式中，所述醇类物质包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或其混合物；所述醇类物质可促进红曲菌生长和次级代谢产物合成，大幅提高红曲菌对黄色素的合成能力和
产率。

[0010] 在一种实施方式中，所述醇类物质的添加量为发酵体系总体积的1％‑10％(v/v)。

[0011] 在一种实施方式中，所述醇类物质的添加时机为液态发酵培养开始后0～96h内。

[0012] 本发明的第二个目的是提供一种红曲黄色素的发酵方法，以红曲菌为发酵微生物，在发酵初始或者发酵过程中加入占发酵体系总体积的1％‑10％的醇类物质，发酵至少
4d；所述醇类物质为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。

[0013] 在一种实施方式中，所述发酵是在转速为150‑250r/min，温度25‑35℃条件下，发酵培养至少4d。

[0014] 在一种实施方式中，所述发酵是在转速为180，温度30℃条件下，发酵培养8d。

[0015] 在一种实施方式中，所述发酵持续8d。

[0016] 在一种实施方式中，所述方法是接种红曲菌种子液于液态发酵培养基中进行发酵；在液态发酵培养开始后0～96h内加入醇类物质。

[0017] 在一种实施方式中，所述液态发酵培养基是采用含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，含有玉米淀粉20‑80g/L，硫酸铵3‑10g/L，硝酸钠2‑6g/L，硫酸镁0.5‑1.5g/L，
磷酸二氢钾0.5‑1.5g/L，磷酸氢二钾0.5‑1.5g/L，氯化钙0.1‑0.5g/L。

[0018] 本发明还要求保护所述方法在制备红曲黄色素中的应用。

[0019] 在一种实施方式中，所述方法用于制备食品着色剂。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] 本发明通过添加醇类物质，增大红曲菌红曲色素的合成。该方法操作简单，经济高效，不污染环境，且不会改变色素的结构，不增加额外的人工和设备，仅通过较低的附加投
入，就可以提高红曲黄色素的合成，使红曲黄色素的色价达415U/mL，具有重大的经济效益。

附图说明

[0022] 图1：添加醇类物质促进红曲菌液态发酵生产红曲黄色素。

具体实施方式

[0023] 色价为色素浓度的一种表示方法，大小等于稀释倍数与稀释后的色素溶液在其吸收峰处对应的OD值的乘积，单位为U/mL。

[0024] 用无水乙醇对待测溶液稀释适当倍数(将OD值控制在0.2‑0.8之间)，并以无水乙醇的吸光度为空白对照在200‑600nm范围内进行全波长扫描，测定330‑450nm之间峰值的OD
值。

[0025] 黄色素色价(U/mL)＝OD410 nm×总稀释倍数。

[0026] 实施例1：不同菌株发酵生产色素

[0027] 种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0028] 发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0029] (1)种子液的制备

[0030] 选紫色红曲菌sjs‑6(公开于名称为《Efficient Biosynthesis of Natural Yellow Pigments by Monascus purpureus in a Novel Integrated Fermentation 
System》的论文中)、紫色红曲菌CICC 40225、紫色红曲菌CICC 40937、紫色红曲菌CICC 
5042，和红色红曲菌CGMCC 3.4701、红色红曲菌CGMCC 3.4652、红色红曲菌CGMCC 3.465、红
色红曲菌CGMCC 3.4649为摇瓶菌种，活化后分别接种到种子液培养基，在转速为180r/min，
7
温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d，使菌浓达到1×10CFU/mL。

[0031] (2)发酵培养

[0032] 将步骤(1)制备的处于对数生长期的红曲菌种子液以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养
7d。结束后测得这八株菌sjs‑6、CICC 40225、CICC 40937、CICC 5042、CGMCC 3.4701、CGMCC 
3.4652、CGMCC 3.465、CGMCC 3.4649的红曲黄色素的色价分别为238U/mL、15U/mL、23U/mL、
24U/mL、42U/mL、45U/mL、66U/mL、26U/mL。

[0033] 表1不同红曲菌株对液态发酵产黄色素的影响

[0034]

[0035]

[0036] 实施例2：添加不同醇类发酵生产色素

[0037] 种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0038] 发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0039] (1)种子液的制备

[0040] 选择紫色红曲菌sjs‑6为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。

[0041] (2)发酵培养

[0042] 处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，在第3天时
分别加入培养体系体积2％(v/v)无菌水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇、1‑辛
醇。结束后测得的红曲黄色素的色价分别为220U/mL、201U/mL、304U/mL、108U/mL、240U/mL、
94U/mL、111U/mL、82U/mL。

[0043] 表2添加不同醇类对红曲菌sjs‑6产黄色素的影响

[0044]

[0045] 实施例3：乙醇不同添加量发酵生产色素

[0046] 种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0047] 发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0048] (1)种子液的制备

[0049] 选择紫色红曲菌sjs‑6为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。

[0050] (2)发酵培养

[0051] 处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，在第3天时
分别加入培养体系体积0％(即不添加)、1％、2％、3％、4％、5％、6％的乙醇。结束后测得的
红曲黄色素的色价分别为212U/mL、207U/mL、315U/mL、356U/mL、325U/mL、290U/mL、211U/
mL。

[0052] 表3乙醇不同添加量对红曲菌sjs‑6产黄色素的影响

[0053]

[0054] 实施例4：不同时间添加3％乙醇发酵生产色素

[0055] 种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0056] 发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0057] (1)种子液的制备

[0058] 选择紫色红曲菌sjs‑6为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。

[0059] (2)发酵培养

[0060] 处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养7d，分别在第0
天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天时加入培养体系体积3％(v/v)的乙醇。结束后
测得的红曲黄色素的色价分别为410U/mL、350U/mL、348U/mL、333U/mL、372U/mL、343U/mL、
336U/mL。

[0061] 表4不同时间添加3％(v/v)乙醇对sjs‑6产黄色素的影响

[0062]

[0063] 实施例5：无添加醇类物质时，发酵不同时间红曲黄色素的产量

[0064] 种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0065] 发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0066] (1)种子液的制备

[0067] 选择紫色红曲菌sjs‑6为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。

[0068] (2)发酵培养

[0069] 处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，分别测定第0天、第1天、第2
天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天时色价。测得的红曲黄色素的色价分别为2U/
mL、6U/mL、50U/mL、81U/mL、121U/mL、210U/mL、238U/mL、235U/mL、230U/mL。

[0070] 表5不添加醇类物质发酵不同时间的结果

[0071]

[0072] 实施例6：添加乙醇时，发酵不同时间红曲黄色素的产量

[0073] 种子液培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0074] 发酵培养基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸铵4，硝酸钠2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2，磷酸氢二钾2，氯化钙0.1。

[0075] (1)种子液的制备

[0076] 选择紫色红曲菌sjs‑6为摇瓶菌种活化后接种到种子液培养基，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养2d。

[0077] (2)发酵培养

[0078] 处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，在第0天添加培养体系体积
3％乙醇(v/v)，色价之后每24h测定色价。结果显示，测得的红曲黄色素第0天、第1天、第2
天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天时的色价分别为2U/mL、6U/mL、13U/mL、32U/
mL、143U/mL、228U/mL、319U/mL、390U/mL、415U/mL，继续延长发酵时间出现菌体自溶现象。

[0079] 表6添加乙醇发酵不同时间的结果

[0080]

[0081] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。