柚皮素纳米脂质载体及其制备方法与应用

摘要

本发明提供柚皮素纳米脂质载体及其制备方法与应用。柚皮素纳米脂质载体包括柚皮素和纳米脂质载体；采用旋转蒸发法制备柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括磷脂、三月桂酸甘油酯、中链甘油三酯和聚氧乙烯蓖麻油；采用乳化蒸发‑低温固化法制备柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸和普朗尼克F68。本发明中柚皮素纳米脂质载体具有高包封率和载药量，能提高柚皮素的口服生物利用度。采用乳化蒸发‑低温固化法制备的柚皮素纳米脂质载体相比于游离柚皮素和对比文件3柚皮素纳米脂质体，具有更强的跨肠上皮细胞单层转运效率和更高的小肠吸收效果。因此，在较低剂量下即可对非酒精性脂肪肝具有较强的抑制作用。

权利要求

1.一种柚皮素纳米脂质载体，包括柚皮素和纳米脂质载体；

采用旋转蒸发法制备所述柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括磷脂、三月桂酸甘油酯、中链甘油三酯和聚氧乙烯蓖麻油；

所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

柚皮素与所述磷脂、所述中链甘油三酯、三月桂酸甘油酯和聚氧乙烯蓖麻油的质量比依次为21：60 240：20 80：4 16：90 230；

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采用乳化蒸发-低温固化法制备所述柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸和普朗尼克F68；

所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

柚皮素与磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸和普朗尼克F68的质量比依次为25：40~

160：20 80：20 80：20 80: 200 600。

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2.一种采用旋转蒸发法制备权利要求1中柚皮素纳米脂质载体的方法，包括如下步骤：

1）将柚皮素、磷脂、三月桂酸甘油酯和中链甘油三酯溶于溶剂中，混合，然后除去所述溶剂，得到混合物；

2）将步骤1）得到的所述混合物用水性介质和聚氧乙烯蓖麻油水化，进行冰浴探头超声，得到柚皮素纳米脂质载体。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤1）中，所述溶剂为氯仿和/或甲醇；

所述柚皮素的质量与所述溶剂的体积之比为1 g：100 400 mL；

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步骤1）中除去所述溶剂采用减压旋蒸的方法，所述减压旋蒸的温度为37 40 ℃。

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4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤2）中，所述水性介质为纯水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液；

所述柚皮素的质量与所述水性介质的体积之比为1 g：100 300 mL；

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所述探头超声的时间为15 20 min；

~

所述探头超声的振幅为满输出功率振幅的80 100%。

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5.一种采用乳化蒸发-低温固化法制备权利要求1中柚皮素纳米脂质载体的方法，包括如下步骤：

1’）将柚皮素、磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸和油酸溶于溶剂中，得到混合物；

2’）将步骤1）得到的所述混合物和含普朗尼克F68的水性介质混合形成乳剂，进行冰浴沉积固化得到柚皮素纳米脂质载体。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：步骤1’）中，所述溶剂为无水乙醇；

所述柚皮素的质量与所述溶剂的体积之比为1 g：100 400 mL；

~

所述水性介质中普朗尼克F68的质量百分含量为1 3%。

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7.根据权利要求5所述方法，其特征在于：步骤2’）中，所述乳剂的形成方法用机械法-磁力搅拌法，温度为70 75 ℃；

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所述水性介质为纯水或缓冲溶液，

所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液；

所述柚皮素的质量与所述水性介质的体积之比为1 g：100 800 mL。

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8.根据权利要求4或7所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.002 0.02 M。

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9.权利要求1所述的柚皮素纳米脂质载体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述非酒精性脂肪肝为炎症性非酒精性脂肪肝。

说明书

柚皮素纳米脂质载体及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及柚皮素纳米脂质载体及其制备方法以及其在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

背景技术

[0002] 柚皮素(Naringenin,NGN)是一种广泛存在于芸香科等植物中的天然黄酮类化合物，具有抗非酒精性脂肪肝的作用，但由于柚皮素属于难溶性药物，口服给药后在胃肠道中的溶出较低，导致药物损失与浪费，影响柚皮素的临床疗效及应用。目前已有药学研究者致力于通过制剂技术提高柚皮素溶解度的研究。已经报道的剂型包括固体分散剂、多室脂质体、β-环糊精复合物、磷脂复合物、纳米自乳化给药体系、可降解纳米粒等。上述剂型都在一定程度上提高了NGN的溶解度和口服生物利用度，但依然存在很多问题有待解决。如：制备过程中的有机溶剂残留；液体制剂的储存稳定性；表面活性剂的口服安全性，粒径过大等。

[0003] 纳米脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)是20世纪90年代发展而来的一种新型纳米制剂，是以具有生理相容性和生物可降解的、高熔点的固体和液体脂质为骨架材料，制备而成的纳米尺度的载药系统。NLC是在固态脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)的基础上发展而来的。SLN仅由固态脂质组成，单一的脂质成分形成整齐而紧密的晶格，载药量低；在储存过程中，固态脂质易发生由α晶形向β晶形的转化，导致药物泄露。NLC的改进之处在于将常温下的液态脂质加入到固态脂质中，增加了载体的晶体混乱度，从而提高药物的载药量。

[0004] 基于纳米脂质载体的优良特性，我们构建了柚皮素的纳米脂质载体剂型(NGN-NLC)，以期改善柚皮素的溶解和吸收特性，减少药物使用剂量，达到相同的治疗效果。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种柚皮素纳米脂质载体及其制备方法与应用。本发明通过将柚皮素制成柚皮素纳米脂质载体，能提高柚皮素的口服生物利用度。

[0006] 本发明所提供的柚皮素纳米脂质载体，包括柚皮素和纳米脂质载体；

[0007] 采用第一种方法(法1)旋转蒸发法制备所述柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括磷脂、三月桂酸甘油酯、中链甘油三酯和聚氧乙烯蓖麻油；

[0008] 所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

[0009] 柚皮素与所述磷脂、所述中链甘油三酯、三月桂酸甘油酯和聚氧乙烯蓖麻油的质量比依次可为21：60～240：20～80：4～16：90～230，具体可为21:6 0:20:4:230；

[0010] 采用第二种方法(法2)乳化蒸发-低温固化法制备所述柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸和普朗尼克F68；

[0011] 所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

[0012] 柚皮素与磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸和普朗尼克F68的质量比依次可为25：40～160：20～80：20～80：20～80:200～600，具体可为25：40：20：20：20：600；

[0013] 本发明还提供了一种采用旋转蒸发法制备上述柚皮素纳米脂质载体的方法(法1)，所述方法包括如下步骤：

[0014] 1)将柚皮素、磷脂、三月桂酸甘油酯和中链甘油三酯溶于溶剂中，混合，然后除去所述溶剂，得到混合物；

[0015] 2)将步骤1)得到的所述混合物用水性介质和聚氧乙烯蓖麻油水化，进行冰浴探头超声，得到柚皮素纳米脂质载体；

[0016] 上述制备方法中，所述溶剂可为氯仿和/或甲醇；

[0017] 所述柚皮素的质量与所述溶剂的体积之比可为1g：100～400mL，具体可为1g：238～310mL或1g：150～350mL或1g：238mL。

[0018] 本发明中，所述溶剂具体可为氯仿和甲醇的混合溶剂。其中，氯仿和甲醇的体积比可为为1:0.5～2，具体可为2:1。

[0019] 上述制备方法中，步骤1)中除去所述溶剂采用减压旋蒸的方法，所述减压旋蒸的温度可为37～40℃，具体可为37℃、40℃或37～40℃。

[0020] 上述制备方法中，所述水性介质可为纯水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水；

[0021] 所述磷酸盐缓冲液的pH值可为7.4，所述磷酸盐缓冲液的浓度可为0.002～0.02M，具体可为0.01M；

[0022] 所述柚皮素的质量与所述水性介质的体积之比可为1g：100～300mL。

[0023] 上述制备方法中，所述探头超声是在冰水浴中进行；

[0024] 所述探头超声的时间可为15～20min，具体可为15min、20min或15～20min；

[0025] 所述探头超声的振幅可为满输出功率振幅的80～100％；具体可为80％、100％或80～100％。

[0026] 采用第二种方法(法2)乳化蒸发-低温固化法制备所述柚皮素纳米脂质载体时，所述纳米脂质载体包括固体脂质(磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸)、液体脂质(油酸)和普朗尼克F68；

[0027] 所述磷脂为蛋磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、牛胆酸钠、β-谷甾醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种；

[0028] 柚皮素与磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸和普朗尼克F68的质量比依次可为25：40～160：20～80：20～80：20～80:200～600，具体可为25：40：20：20：20：600。

[0029] 本发明还提供了一种采用乳化蒸发-低温固化法制备上述柚皮素纳米脂质载体的方法(法2)，所述方法包括如下步骤：

[0030] 1’)将柚皮素、磷脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸和油酸溶于溶剂中，混合，得到混合物；

[0031] 2’)将步骤1)得到的所述混合物和含普朗尼克F68的水性介质混合形成乳剂，进行冰浴沉积固化得到柚皮素纳米脂质载体；

[0032] 上述制备方法中，所述溶剂为无水乙醇；

[0033] 所述柚皮素的质量与所述溶剂的体积之比可为1g：100～400mL，具体可为1g：238～313mL或1g：150～350mL。

[0034] 上述制备方法中，步骤2’)中，所述乳剂的形成方法可用机械法-磁力搅拌法，温度为70～75℃，具体可为75℃、70℃或70～75℃。

[0035] 上述制备方法中，所述水性介质可为纯水或缓冲溶液，

[0036] 所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水；

[0037] 所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.002～0.02M，具体可为0.01M；

[0038] 所述柚皮素的质量与所述水性介质的体积之比可为1g：100～800mL。

[0039] 所述水性介质中普朗尼克F68的质量百分含量可为1～3％；

[0040] 本发明所述柚皮素纳米脂质载体的包封率可为92～100％，具体可为94.5±0.5％或99.9±0.1％；

[0041] 本发明所述柚皮素纳米脂质载体的载药量高于20％，具体可为22.5±1.7％或23.7±0.4％。

[0042] 本发明所述柚皮素纳米脂质载体在制备治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

[0043] 本发明所述柚皮素纳米脂质载体抗NAFLD的最低有效剂量小于等于50mg·kg-1·day-1，更具体可为12.5mg·kg-1·day-1或50mg·kg-1·day-1。

[0044] 所述应用中，所述非酒精性脂肪肝为炎症性非酒精性脂肪肝，如：MCD饮食诱导的非酒精脂肪肝。

[0045] 本发明具有以下优点：

[0046] 本发明所涉及的柚皮素纳米脂质载体的制备方法简便、易于控制和操作、清洁安全、无有毒有机溶剂残留，且可连续化批量生产；

[0047] 所制得的柚皮素纳米脂质载体平均粒度均一，载药量高，稳定性好，相比于之前已有报道的两篇柚皮素纳米脂质载体的文章(对比文件1[1]和对比文件2[2])，本发明中所述处方因脂质成分或制备方法不同，较之前已发表文章中所陈述的处方有更高的药物包封率和载药量。

[0048]

[0049] [1]李静静.柚皮素纳米结构脂质载体的处方优化和初步评价[J].中草药,2015,46(2):211-215.

[0050] [2]Raeisi S,Chavoshi H,Mohammadi M,et al.Naringenin-loaded nano-structured lipid carrier fortifies oxaliplatin-dependent apoptosis in HT-29 cell line[J].Process Biochemistry,2019,83:168-175.

[0051] 本发明的柚皮素纳米脂质载体改善了柚皮素的溶解和吸收特性，能减少药物使用剂量，提高药物口服生物利用率，达到更好的治疗效果。相较于我们前期已授权的柚皮素纳米脂质体(NGN-NL)的专利[3]，NGN-NLC2具有更高的包封率和载药量，并具有更优的抗NAFLD的作用。

[0052]

[0053]

[0054] [3]《柚皮素的用途、柚皮素纳米脂质体及其制备方法与应用》，专利号ZL 2016 1 0353469.2，发明人：祁荣、陈聪。

附图说明

[0055] 图1为柚皮素纳米脂质载体的粒径分布图。图1A为本发明法1制备的柚皮素纳米脂质载体的粒径分布图；图1B为本发明法2制备的柚皮素纳米脂质载体的粒径分布图。

[0056] 图2为柚皮素、本发明法1和法2制备的柚皮素纳米脂质载体的体外释放曲线。

[0057] 图3为柚皮素、本发明法1和法2制备的柚皮素纳米脂质载体在C57BL/6小鼠体内的血浆总柚皮素浓度-时间曲线图。

[0058] 图4为小鼠血清ALT和AST水平。图4A为ALT水平；图4B为AST水平。n＝5。***表示与Control组比较，p<0.001；#、##、###表示与MCD组比较，p<0.05，p<0.01，p<0.001。

[0059] 图5为小鼠肝脏形态学切片油红O染色结果图。图5A为Control组；图5B为MCD模型组；图5C为MCD+NGN 50组；图5D为MCD+NGN 100组；图5E为MCD+NGN-NLC1 12.5组；图5F为MCD+NGN-NLC1 50组；图5G为MCD+NGN-NLC2 12.5组。

[0060] 图6为小鼠肝脏脂质抽提结果。n＝5。***表示与Control组比较，p<0.001；#表示与MCD组比较，p<0.05。

[0061] 图7为MDCK细胞药物转运实验结果。n＝3。*，**，***表示与NGN组比较，p<0.05，p<0.01，p<0.001；#表示与NGN-NLC1组比较，p<0.05；&为与NGN-NLC2组比较，p<0.05。

[0062] 图8为大鼠小肠肠囊翻转实验结果。图5A为回肠组；图5B为空肠组。n＝3。*，**，***表示与NGN组比较，p<0.05，p<0.01，p<0.001；#、##表示与NGN-NLC1组比较，p<0.05，p<0.01；&为与NGN-NLC2组比较，p<0.05。

具体实施方式

[0063] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

[0064] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0065] 实施例1、柚皮素纳米脂质载体的制备(方法1)

[0066] 准确称取0.021g柚皮素、0.060g大豆磷脂、0.020g中链甘油三酯，0.004g三月桂酸甘油酯，加入3.3mL氯仿和1.7mL甲醇，充分溶解，37℃水浴条件下减压旋转蒸发除去溶剂，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入含230mg的聚氧乙烯蓖麻油的3mL 0.01M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，于冰浴下超声15min(满振幅的80％)得到本发明柚皮素纳米脂质载体1(NGN-NLC1)。

[0067] 实施例2、柚皮素纳米脂质载体的制备(方法2)

[0068] 准确称取0.025g柚皮素、0.040g大豆磷脂、0.020g硬脂酸，0.020g单硬脂酸甘油酯，0.020g油酸加入2mL乙醇，充分溶解，加入含3％的普朗尼克F68的20mL 0.01M磷酸盐缓-1冲液(pH＝7.4)中，于75℃下形成乳剂，直至柚皮素浓度为8.3mg·mL 。于冰浴下沉积固化
1h得到本发明柚皮素纳米脂质载体2(NGN-NLC2)。

[0069] 实施例3、柚皮素纳米脂质载体的应用

[0070] 1、柚皮素纳米脂质载体的质量评价

[0071] 粒径测定：取本发明实施例1适量NGN-NLC1，采用Malvern Zeta电位仪测定其粒径，测得粒径为(120.8±1.9)nm；取本发明实施例2适量NGN-NLC2，采用Malvern Zeta电位仪测定其粒径，测得粒径为(147.5±7.4)nm，其粒径分布图如图1所示。

[0072] 包封率EE(％)测定：

[0073] (1)HPLC法建立柚皮素标准曲线：

[0074] 色谱条件：测定仪器：LC-15型高效液相色谱仪(日本岛津公司)(配有紫外检测器)；色谱柱：C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇/0.2％磷酸水＝71:29(V/V)；体积流量为0.7mL·min-1；进样量为20μL，检测波长289nm。

[0075] 建立标准曲线得到回归方程如下：

[0076] A＝127956C+38999，R2为0.9999，

[0077] 上式中，A为峰面积，C为柚皮素浓度(μg·mL-1)。

[0078] (2)包封率和载药量的测定

[0079] 分别取所制得的NGN-NLC1和NGN-NLC2溶液10μL，加入甲醇，超声(频率：40kHz，功率：100W)破乳10min。稀释一定倍数后于上述色谱条件下进样20μL，根据峰面积及标准曲线，计算纳米脂质载体NGN总药量。分别取所制得的NGN-NLC1和NGN-NLC2溶液200μL，经超速离心(21130×g，0.5h，4℃)后，精密吸取上清液10μL，用流动相稀释至一定浓度后，进样20μL，根据峰面积及标准曲线，计算纳米脂质载体处方中所包封的药量。可以根据公式：包封率＝包封的药量/总药量×100％计算柚皮素纳米脂质载体包封率。根据公式：载药量＝[纳米脂质载体中药物量/载体总量]×100％，计算柚皮素纳米脂质载体的载药量。测得本发明实施例1中NGN-NLC1的包封率为99.9±0.1％，载药量为23.7±0.4％；NGN-NLC2的包封率为94.5±0.5％，载药量为22.5±1.7％。

[0080] 2、柚皮素纳米脂质载体体外释药曲线

[0081] 分别将本发明实施例1和实施例2的浓度为0.5mg·mL-1NGN-NLC1和NGN-NLC2溶液2mL置于透析袋中，透析袋两端扎牢，置于37℃恒温的100mL释放介质中，摇床速度为
100rpm。分别于0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0h取透析袋外释放介质1.5mL，同时补充等量相同温度下的新鲜释放介质。HPLC法检测各个时间点的释放介质中NGN的含量。以累积释放百分数为纵坐标，时间为横坐标，绘制柚皮素纳米脂质载载体的体外释放曲线图，如图2所示。

[0082] 由图2可知，本发明柚皮素纳米脂质载体1的体外释药结果表明NGN-NLC1在最初4h内释药率达到68.57±0.15％，随后缓慢释放，24h累计释放达到86.2±0.36％；本发明柚皮素纳米脂质载体2的体外释药结果表明NGN-NLC2在最初4h内释药率达到66.1±6.06％，随后缓慢释放，24h累计释放达到85.5±5.4％。

[0083] 3、柚皮素纳米脂质载体药代动力学研究

[0084] 25±2g雄性C57BL/6小鼠18只，分三组，每组6只。给药前禁食12h，自由饮水。两组小鼠分别一次性灌胃相当于50mg·kg-1剂量的柚皮素或12.5mg·kg-1NGN-NLC1或12.5mg·-1kg NGN-NLC2。两组小鼠分别于0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24h眼眶取血约
0.1mL，置于肝素离心管中，4000rpm离心10min，分离上清液，测定血药浓度。药时曲线如图3所示，计算药动学参数，药动学参数结果如表1所示。

[0085] 表1小鼠单次灌胃柚皮素或其纳米脂质载体的药代动力学参数(Mean±SD，n＝3)[0086]

[0087] *p<0.05,**p<0.01,表示与NGN原料药相比；#p<0.05,表示与NGN-NLC1相比。

[0088] 由表1可知，本发明NGN-NLC1和NGN-NLC2在12.5mg·kg-1时达到了与游离柚皮素50mg·kg-1相同或更好的生物利用度，表明本发明柚皮素纳米脂质载体能改善柚皮素的口服生物利用度；NGN-NLC2的t1/2/h与NGN-NLC1相比有显著性差异，表明NGN-NLC2显著延长了NGN的体内半衰期。

[0089] 4、柚皮素纳米脂质载体对蛋氨酸胆碱缺乏饮食(methionine choline deficient diet,MCD diet)诱导的小鼠非酒精性脂肪肝的抑制作用

[0090] (1)6周龄的雄性C57BL/6小鼠，平均体重20g，随机分成四组，正常组(Control组)给予普通繁殖饲料喂饲7天，同时每天灌胃PBS 200μL；模型组给予单纯MCD饲料喂饲7天诱导非酒精性脂肪肝模型，同时每天采用PBS 200μL灌胃(MCD组)；药物组给予单纯MCD饲料喂饲7天，同时每天分别灌胃给予50mg·kg-1或100mg·kg-1NGN原料药(MCD+NGN 50组或MCD+NGN 100组)；12.5mg·kg-1或50mg·kg-1NGN-NLC1(MCD+NGN-NLC1 12.5组或MCD+NGN-NLC1 50组)；12.5mg·kg-1NGN-NLC2(MCD+NGN-NLC2 12.5组)。7天后，所有小鼠牺牲后取材。

[0091] (2)小鼠取材

[0092] 上述(1)中小鼠连续给药7天后，过夜禁食，称重，并用毛细管内眦取血，分离血清用于测定谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)。麻醉小鼠致死，完整分离小鼠肝脏，称量肝脏总重。然后所取肝脏分别用于形态学分析、肝脏脂质抽提。

[0093] 肝脏血清学检测结果显示(如图4所示)，MCD饮食诱导下，小鼠血清的AST和ALT水平显著升高，预示小鼠肝脏收受到损伤。给予柚皮素100mg·kg-1对肝脏ALT、AST的升高有一定抑制作用，而本发明将柚皮素包载于纳米脂质载体中后，其保护肝脏的效果更为显著。

[0094] (3)组织形态学实验方法

[0095] 上述(2)中取材肝脏后，小心取一部分新鲜肝组织放入4％多聚甲醛溶液中固定，固定2h后取出，转移至20％蔗糖溶液中，过夜后包埋于OCT中，放入液氮中冷冻，肝脏组织进行冰冻切片，每片厚度7μm。对小鼠肝脏冰冻切片进行油红O染色，通过染色深浅定性判断肝细胞内脂质沉积量的多少；通过肝脏组织脂质抽提测定其TG含量，对肝脏内脂质水平进行定量。

[0096] (4)小鼠肝脏冰冻切片油红O染色

[0097] 冰冻切片用PBS冲洗3min，2次；4％多聚甲醛固定10min；双蒸水浸泡2min，3次；60％异丙醇10min(脱水)；油红O染色30min；60％异丙醇中迅速洗数次去除浮色；双蒸水冲洗数次(保存在水中即可)；苏木精染细胞核1min；双蒸水冲洗数次；90％甘油封片，显微镜下观察拍照。

[0098] 油红O染料配制方法：0.5％储存液(母液)由1g油红O粉末加入200mL异丙醇制成。60％工作液是将母液(6份)加入双蒸水中(4份)，激烈震荡，静置10min，过滤后使用。(现用现配，2h内用完)

[0099] 4％多聚甲醛配制方法：称取4g多聚甲醛，加入0.01M 100mL的PBS，60℃水浴过夜，溶解。

[0100] 如图5所示，肝脏切片油红O染色结果显示，与正常组相比，MCD模型组小鼠肝脏内脂质沉积显著，柚皮素原料药对肝脏脂质沉积有一定降低效果，NGN-NLC1和NGN-NLC2增加了柚皮素对肝脏脂质沉积的抑制作用，说明NGN-NLC1和NGN-NLC2通过提高柚皮素的口服生物利用度增加柚皮素对肝脏脂质沉积的抑制作用。

[0101] (5)小鼠肝脏脂质抽提

[0102] 另取一块新鲜肝组织，称重，放入1mL预冷的PBS中匀浆，将匀浆液转移至10mL干净、干燥的玻璃管中，加入2：1的氯仿/甲醇4mL，充分涡旋30s后，4℃，2000rpm，离心30min。将上层水相转移至新玻璃管中称为水相管，转移下层有机相至另一套新玻璃管中称为有机相管。往水相管中加入氯仿/甲醇3mL，充分涡旋30s，4℃，2000rpm，离心30min。将下层有机相转移至有机相管中，置通风橱内用氮气吹干。加入3％TritonX-100(v-v)500μL溶解，反复吹打，恒温50℃摇床震荡30min，使脂质溶解，测定总甘油三脂(TG)含量。以TG含量比脂质抽提的肝脏重量，作为样品肝脏内脂质的含量。

[0103] 如图6所示，小鼠肝脏脂质抽提结果与油红O染色结果一致，模型组小鼠肝脏内TG水平显著升高，柚皮素原料药100mg·kg-1对TG含量具有显著降低作用，本发明50mg·kg-1NGN-NLC1和12.5mg·kg-1NGN-NLC2显著降低了小鼠肝脏内TG的含量。

[0104] 4、柚皮素纳米脂质载体的体外吸收实验

[0105] (1)MDCK细胞药物转运实验

[0106] 在Transwell的小室(聚碳酸酯膜滤器上(孔径为3.0μm大小，1.12cm2的生长面积))中接种0.5mL密度为4×105细胞/cm2的MDCK细胞。通过测定跨上皮细胞膜电阻(TEER)来2
确认细胞是否已形成单层，直至TEER值达到350～400(Ω·cm)时，可用于上皮细胞转运研究。

[0107] 分别以HBSS为溶剂将NGN，NGN-NLC1、NGN-NLC2或柚皮素纳米脂质体(NGN-NL)配成500μL 200μM的供试品溶液，并分别加入小室中，然后将1.5mL HBSS添加到小室外侧。
Transwell板在37℃和5％CO2中孵育，分别在1和3h在小室外侧吸取液体0.2mL，同时补充相应体积的空白HBSS。然后通过HPLC分析所收集样品中NGN的浓度，每个样品平行重复测定三次。

[0108] 跨膜转运系数(Papp)的计算公式为：Papp＝(δQ/δt)/(A×C0)cm×s-1[0109] 其中δQ/δt是每秒跨MDCK单层细胞转运的药物量(mol·s-1)，A是聚碳酸酯薄膜的表面积(1.13cm2)，C0是小室内初始药物浓度。

[0110] 如图7所示，MDCK细胞药物转运实验结果显示，跨上皮细胞单层转运吸收的效率NGN-NLC2＞NGN-NL>NGN-NLC1>NGN。

[0111] (2)大鼠小肠肠囊翻转吸收实验

[0112] 取300g左右健康SD雄性大鼠，实验前禁食不禁水12h，采用10％水合氯醛麻醉后，打开腹腔，从胃幽门以下10cm开始向下取24cm为空肠，从回盲瓣以上5cm开始向上取24cm为回肠。用0℃台氏液灌流冲洗，直至流出液不再浑浊，基本无肠内容物为止。剥离肠段表面的肠系膜和脂肪，将空肠和回肠分为每段长度8cm。将肠管一端结扎于自制塑料套管上，用手指轻柔地将肠管翻转使黏膜面朝外，用4℃台氏液冲洗后，结扎另一端，使之形成囊状肠管。

[0113] 将其放入已盛有2mL空白台氏液的试管中，将管放入37℃恒温水浴中，平衡5min后，用注射器向不同肠管内分别注入1mL空白台氏液，并将肠管外的2mL台氏液替换成分别以台氏液为溶剂配成的含2mg·mL-1的NGN、NGN-NLC1、NGN-NLC2或NGN-NL的供试品溶液，同时开始计时，分别于15、30、45和60min从肠管中取样0.2mL，同时补充相同体积的空白台氏液，采用HPLC分析所收集的样品中NGN的浓度，每个样品平行重复测定三次。

[0114] 如图8所示，大鼠小肠肠囊翻转实验结果表明，不同剂型的NGN在小肠的回肠段和空肠段的吸收量均为：NGN-NLC2＞NGN-NL>NGN-NLC1>NGN。表明NGN-NLC2的小肠吸收最好，优于NGN-NLC1，也优于我们之前已授权的NGN-NL专利。