一种促进微生物脱氮的方法转让专利
申请号 : CN202010137636.6
文献号 : CN111233141B
文献日 : 2021-08-27
发明人 : 陈银广 , 张芷琪
申请人 : 同济大学
摘要 :
本发明公开了一种促进微生物脱氮的方法，通过脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌的协同作用来促进微生物脱氮。本发明具有缩短反硝化进程，提高反硝化速率，减少中间产物积累，无二次污染等特点。
权利要求 :
1.一种促进微生物脱氮的方法，其特征在于，通过脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌的协同作用来促进微生物脱氮；
所述通过脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌的协同作用来促进微生物脱氮的过程，至少包括以下步骤：
提供一反应器；
向所述反应器中加入培养基和微量元素并进行灭菌处理，获得灭菌后的培养基体系；
制备脱氮副球菌悬液和费氏丙酸杆菌悬液；
向所述灭菌后的培养基体系中，加入所述脱氮副球菌悬液和所述费氏丙酸杆菌悬液，来促进微生物脱氮；
所述培养基的成分包括碳源和无机盐；
所述碳源为葡萄糖，所述葡萄糖在单独容器中灭菌，所述碳源的浓度3 5g/L，所述无机~
盐的组成包括1.08 7.2g/L的硝酸钾、0.5g/L氯化铵、0.07 0.1g/L硫酸镁、0.5 4.65g/L磷~ ~ ~
酸氢二钠和1 2.44g/L磷酸二氢钾；
~
所述培养基中的碳氮比为10 16；
~
所述脱氮副球菌的初始OD600为0.02 0.03，所述费氏丙酸杆菌的初始OD600为0.001~ ~
0.15。
2.根据权利要求1所述的促进微生物脱氮的方法，其特征在于，所述反应器为无菌厌氧瓶。
3.根据权利要求1所述的促进微生物脱氮的方法，其特征在于，所述微量元素的组成包括乙二胺四乙酸二钠、七水合硫酸亚铁、氯化锰、钼酸钠、氯化铜晶体和氯化锌。
4.根据权利要求1所述的促进微生物脱氮的方法，其特征在于，所述灭菌后的培养基体系的pH为6.8 7.4。
~
5.根据权利要求1所述的促进微生物脱氮的方法，其特征在于，所述微生物脱氮的过程中温度为20 40℃。
~
说明书 :
一种促进微生物脱氮的方法
技术领域
[0001] 本发明属于废水处理技术领域，具体涉及一种促进微生物脱氮的方法。
背景技术
[0002] 氮污染是一个具有挑战性的全球环境问题。目前除氮的方法中，由于物理和化学方法去除硝酸盐较为昂贵，且容易产生二次污染问题，因此，利用生物方法去除水中的硝酸
盐污染，日益受到人们的重视，而且生物法去除硝酸盐污染更为高效和便利。然而，实际的
生物反硝化过程较慢，而且还会存在一些硝酸盐还原过程有毒有害中间产物的积累，如亚
硝酸盐和一氧化二氮。研究发现，外加碳源如甲醇、乙醇或乙酸盐以及电子传递，可以促进
反硝化菌快速进行脱氮，但是，不断施加额外电能，势必提高了污水脱氮的成本和操作难
度，外加碳源会增加工艺成本，而且，存在碳源投加过量造成二次污染的隐患。生物硝酸盐
的去除受环境和操作参数的影响，例如碳源，pH值和温度。
盐污染，日益受到人们的重视，而且生物法去除硝酸盐污染更为高效和便利。然而，实际的
生物反硝化过程较慢，而且还会存在一些硝酸盐还原过程有毒有害中间产物的积累，如亚
硝酸盐和一氧化二氮。研究发现，外加碳源如甲醇、乙醇或乙酸盐以及电子传递，可以促进
反硝化菌快速进行脱氮，但是，不断施加额外电能，势必提高了污水脱氮的成本和操作难
度，外加碳源会增加工艺成本，而且，存在碳源投加过量造成二次污染的隐患。生物硝酸盐
的去除受环境和操作参数的影响，例如碳源，pH值和温度。
发明内容
[0003] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种促进微生物脱氮的方法，通过脱氮副球菌P.denitrificans和费氏丙酸杆菌的协同作用来还原硝酸盐，该方法具
有缩短反硝化进程，提高反硝化速率，减少中间产物积累，无二次污染等特点。
有缩短反硝化进程，提高反硝化速率，减少中间产物积累，无二次污染等特点。
[0004] 为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的，本发明提供一种促进微生物脱氮的方法，通过脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌的协同作用来促进微生物
脱氮。
脱氮。
[0005] 在一实施例中，所述通过脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌的协同作用来促进微生物脱氮的过程，至少包括以下步骤：
[0006] 提供一反应器；
[0007] 向所述反应器中加入培养基、含有硝酸盐的母液和微量元素并进行灭菌处理，获得灭菌后的培养基体系；
[0008] 制备脱氮副球菌悬液和费氏丙酸杆菌悬液；
[0009] 向所述灭菌后的培养基体系中，加入所述脱氮副球菌悬液和所述费氏丙酸杆菌悬液，来促进微生物脱氮。
[0010] 在一实施例中，所述反应器为无菌厌氧瓶。
[0011] 在一实施例中，所述培养基的成分包括碳源和无机盐。
[0012] 在一实施例中，所述碳源为葡萄糖，所述葡萄糖在单独容器中灭菌。
[0013] 在一实施例中，所述无机盐的组成包括0～7.2g/L的硝酸钾、0～0.5g/L氯化铵、0～0.1g/L硫酸镁、0.5～4.65g/L磷酸氢二钠和1～2.44g/L磷酸二氢钾。
[0014] 在一实施例中，所述微量元素的组成包括乙二胺四乙酸二钠、七水合硫酸亚铁、氯化锰、钼酸钠、氯化铜晶体和氯化锌。
[0015] 在一实施例中，所述脱氮副球菌的初始OD600为0.02～0.03，所述费氏丙酸杆菌的初始OD600为0.001～0.15。
[0016] 在一实施例中，所述灭菌后的培养基体系的pH为6.8～7.4。
[0017] 在一实施例中，所述微生物脱氮的过程中温度为20～40℃。
[0018] 在本发明中，在脱氮副球菌P.denitrificans反硝化过程中，加入费氏丙酸杆菌，通过两种菌的协同作用，加快反硝化进程，提高反硝化速率，减少中间产物的积累。本发明
与常见的利用物理、化学等提高反硝化效率的方法相比，不仅节约成本，而且产生的有害中
间产物少、二次污染小。
与常见的利用物理、化学等提高反硝化效率的方法相比，不仅节约成本，而且产生的有害中
间产物少、二次污染小。
附图说明
[0019] 图1为本发明一实施例中的方法流程示意图。
具体实施方式
[0020] 以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体
实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背
离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实
施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的
具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验
方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背
离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实
施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的
具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验
方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0021] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和
科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发
明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现
本发明。
科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发
明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现
本发明。
[0022] 本发明通过在脱氮副球菌P.denitrificans反硝化的过程中加入费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii，通过两种菌的相互作用加快反硝化进程，提高了反
硝化速率，在实现硝酸盐生物还原的情况下，减少中间产物的积累。
硝化速率，在实现硝酸盐生物还原的情况下，减少中间产物的积累。
[0023] 请参阅图1所示，本发明提供一种促进微生物脱氮的方法，至少包括以下步骤：
[0024] S1、提供一反应器；
[0025] S2、向所述反应器中加入培养基、含有硝酸盐的母液和微量元素并进行灭菌处理，获得灭菌后的培养基体系；
[0026] S3、制备脱氮副球菌悬液和费氏丙酸杆菌悬液；
[0027] S4、向所述灭菌后的培养基体系中，加入所述脱氮副球菌悬液和所述费氏丙酸杆菌悬液，来促进微生物脱氮。
[0028] 具体的，在步骤S1中，所述反应器例如为无菌厌氧瓶。
[0029] 具体的，在步骤S2中，所述培养基的成分包括碳源和无机盐。所述碳源的浓度0g/L～5g/L。所述碳源例如为葡萄糖，所述葡萄糖在单独容器中灭菌。所述无机盐的组成包括0
～7.2g/L的硝酸钾、0～0.5g/L氯化铵、0～0.1g/L硫酸镁、0.5～4.65g/L磷酸氢二钠和1～
2.44g/L磷酸二氢钾。所述微量元素的组成包括乙二胺四乙酸二钠、七水合硫酸亚铁、氯化
锰、钼酸钠、氯化铜晶体和氯化锌。灭菌处理用高压蒸汽灭菌。用氢氧化钠NaOH和盐酸HCl调
节体系的pH至6.8～7.4，然后采用无菌培养容器的封口膜密封反应器，进行20～25分钟灭
菌处理。
～7.2g/L的硝酸钾、0～0.5g/L氯化铵、0～0.1g/L硫酸镁、0.5～4.65g/L磷酸氢二钠和1～
2.44g/L磷酸二氢钾。所述微量元素的组成包括乙二胺四乙酸二钠、七水合硫酸亚铁、氯化
锰、钼酸钠、氯化铜晶体和氯化锌。灭菌处理用高压蒸汽灭菌。用氢氧化钠NaOH和盐酸HCl调
节体系的pH至6.8～7.4，然后采用无菌培养容器的封口膜密封反应器，进行20～25分钟灭
菌处理。
[0030] 具体的，在步骤S3中，所述脱氮副球菌的初始OD600为0.02～0.03，所述费氏丙酸杆菌的初始OD600为0.001～0.15。所述生物还原硝酸盐的过程中的温度条件为20～40℃，所述
生物还原硝酸盐的过程中的温度对反应至关重要，会影响微生物菌的活性。在所述培养基
中，含有硝酸盐的母液的硝酸盐浓度为0～1000mg/L。在有氧条件下用灭菌的100‑200mL LB
培养基培养脱氮副球菌到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基
培养费氏丙酸杆菌到OD600为0.8～1.0。将培养好的脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌，用磷酸盐
缓冲液洗菌三次后浓缩。所述的LB培养基成分包括：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/
LNaCl。所述的费氏丙酸杆菌培养基成分包括：50.0g/L玉米浆、20g/L葡萄糖、4.0ml/L
0.1％CoCl2溶液、2.0g/L K2HPO4·H2O、1.5g/L KH2PO4、2.0g/L(NH4)2SO4，用3M KOH及3M HCl
调节pH至6.8‑7.0。
生物还原硝酸盐的过程中的温度对反应至关重要，会影响微生物菌的活性。在所述培养基
中，含有硝酸盐的母液的硝酸盐浓度为0～1000mg/L。在有氧条件下用灭菌的100‑200mL LB
培养基培养脱氮副球菌到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基
培养费氏丙酸杆菌到OD600为0.8～1.0。将培养好的脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌，用磷酸盐
缓冲液洗菌三次后浓缩。所述的LB培养基成分包括：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/
LNaCl。所述的费氏丙酸杆菌培养基成分包括：50.0g/L玉米浆、20g/L葡萄糖、4.0ml/L
0.1％CoCl2溶液、2.0g/L K2HPO4·H2O、1.5g/L KH2PO4、2.0g/L(NH4)2SO4，用3M KOH及3M HCl
调节pH至6.8‑7.0。
[0031] 具体的，在步骤S4中，配制250‑500g/L葡萄糖在110～115℃下灭菌15～20分钟，葡萄糖是单独进行灭菌的。在100～200mL灭菌后的培养基体系中加入例如0～2mL灭好菌的葡
萄糖，最后分别加入0.4～5mL浓缩好的脱氮副球菌悬液和0.04～6mL费氏丙酸杆菌悬液，进
行生物还原硝酸盐。所述微生物脱氮的过程中温度为20～40℃。
萄糖，最后分别加入0.4～5mL浓缩好的脱氮副球菌悬液和0.04～6mL费氏丙酸杆菌悬液，进
行生物还原硝酸盐。所述微生物脱氮的过程中温度为20～40℃。
[0032] 具体的，在步骤S4中，将反硝化微生物脱氮副球菌P.denitrificans和费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii分别单独接种到反硝化培养基作为对照实验，置于
20～40℃摇床上，进行硝酸盐的生物还原实验，设置对照组有利于增强实验结果的可靠性。
培养过程中使用一次性无菌注射器间隔一定时间从厌氧瓶取样，样品通过0.22μm滤膜过滤
进行硝酸盐和亚硝酸盐的测定。
20～40℃摇床上，进行硝酸盐的生物还原实验，设置对照组有利于增强实验结果的可靠性。
培养过程中使用一次性无菌注射器间隔一定时间从厌氧瓶取样，样品通过0.22μm滤膜过滤
进行硝酸盐和亚硝酸盐的测定。
[0033] 本发明中硝酸盐的浓度例如采用紫外分光光度法，紫外可见分光光度计UV‑1800。
[0034] 本发明亚硝酸盐的浓度例如采用N‑(1‑萘基)‑乙二胺光度法，紫外可见分光光度计UV‑1800。
[0035] 在本发明中，一氧化二氮的浓度采用顶空气相色谱法测定气相色谱，测试条件如下：该气相色谱配有定量环手动进样，进样体积为1mL，采用十通阀和六通阀切换进气并将
其他气体排出检测器，进样口温度为105℃。含有两根不锈钢填充柱(Porapak Q，填充直径
为80‑100目)，预柱(长×内径为1×2mm)，分离柱柱长为3m，内径为2mm；采用的毛细柱柱长
为1m，直径为0.32mm，柱温为100℃。采用的载气为95％Ar+5％CH4的混合气体，柱内流速为
25mL/分钟，尾吹流速为50mL/分钟。N2O气体采用ECD检测器，检测器温度为300℃。升温程序
如下：初始温度为80℃，保持4分钟，随后以8℃/分钟的速度升至120℃，保持2分钟，再以30
℃/分钟的速度升至180℃保留2分钟。
其他气体排出检测器，进样口温度为105℃。含有两根不锈钢填充柱(Porapak Q，填充直径
为80‑100目)，预柱(长×内径为1×2mm)，分离柱柱长为3m，内径为2mm；采用的毛细柱柱长
为1m，直径为0.32mm，柱温为100℃。采用的载气为95％Ar+5％CH4的混合气体，柱内流速为
25mL/分钟，尾吹流速为50mL/分钟。N2O气体采用ECD检测器，检测器温度为300℃。升温程序
如下：初始温度为80℃，保持4分钟，随后以8℃/分钟的速度升至120℃，保持2分钟，再以30
℃/分钟的速度升至180℃保留2分钟。
[0036] 为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种促进微生物脱氮的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0037] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系A。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/LKNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下用灭菌的100～200mL LB培养基培养脱氮副球菌
P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，培养
费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的脱
氮副球菌P.denitrificans和费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗
菌三次后浓缩到40mL。在100mL灭菌后的培养基体系A中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄
糖浓度为5g/L，最后向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使
OD600为0.02～0.03，再加入90～200μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，
使最终OD600为0.002～0.003。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系A。
得灭菌后的培养基体系A。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/LKNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下用灭菌的100～200mL LB培养基培养脱氮副球菌
P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，培养
费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的脱
氮副球菌P.denitrificans和费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗
菌三次后浓缩到40mL。在100mL灭菌后的培养基体系A中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄
糖浓度为5g/L，最后向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使
OD600为0.02～0.03，再加入90～200μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，
使最终OD600为0.002～0.003。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系A。
[0038] 对体系A进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高72.1％且提前2小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累，一氧化
二氮积累率降低68.2％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对
照。
二氮积累率降低68.2％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对
照。
[0039] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系B。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基培
养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生物
P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到40mL。
在100mL所述灭菌后的培养基体系B中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为5g/L，最
后，向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02～
0.03，再加入800～1100μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600
为0.02～0.03。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系B。
得灭菌后的培养基体系B。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基培
养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生物
P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到40mL。
在100mL所述灭菌后的培养基体系B中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为5g/L，最
后，向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02～
0.03，再加入800～1100μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600
为0.02～0.03。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系B。
[0040] 对体系B进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高90.8％且提前4小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累，一氧化
二氮积累率降低87.5％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对
照。
二氮积累率降低87.5％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对
照。
[0041] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系C。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系C中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为5g/
L，最后，向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02～
0.03，再加入40～60μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600为
0.001～0.0015。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系C。
得灭菌后的培养基体系C。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系C中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为5g/
L，最后，向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02～
0.03，再加入40～60μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600为
0.001～0.0015。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系C。
[0042] 对体系C进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为75.9％，速率比对照组降低36.7％，最终亚硝酸盐积累率增高25.9％，一氧化二氮积累率仅降低12.8％。
反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
[0043] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系D。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100m所述L灭菌后的培养基体系D中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为5g/
L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02
～0.03，再加入2～6mL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600为
0.1～0.15。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系D。
得灭菌后的培养基体系D。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100m所述L灭菌后的培养基体系D中，加入2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为5g/
L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02
～0.03，再加入2～6mL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600为
0.1～0.15。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系D。
[0044] 对体系D进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高25.4％且提前1.5小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累，但一
氧化二氮积累率仅降低21.4％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基
作为对照。
氧化二氮积累率仅降低21.4％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基
作为对照。
[0045] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系E。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系E中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入90～200μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.002～0.003。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系E。
得灭菌后的培养基体系E。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系E中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入90～200μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.002～0.003。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系E。
[0046] 对体系E进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高37.9％，但亚硝酸盐积累率增加35.7％。反硝化微生物P.denitrificans单独接
种到反硝化培养基作为对照。
种到反硝化培养基作为对照。
[0047] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系F。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下用，灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系F中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入800～1100μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最
终OD600为0.02～0.03。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系F。
得灭菌后的培养基体系F。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下用，灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系F中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入800～1100μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最
终OD600为0.02～0.03。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系F。
[0048] 对体系F进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高18.5％，但亚硝酸盐积累率增加0.2％。反硝化微生物P.denitrificans单独接
种到反硝化培养基作为对照。
种到反硝化培养基作为对照。
[0049] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系G。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系G中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入40～60μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.001～0.0015。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系G。
得灭菌后的培养基体系G。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系G中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入40～60μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.001～0.0015。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系G。
[0050] 对体系G进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高155％，亚硝酸盐积累率降低66.4％。反硝化微生物P.denitrificans单独接种
到反硝化培养基作为对照。
到反硝化培养基作为对照。
[0051] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系H。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系H中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入2～6mL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.1～0.15。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系H。
得灭菌后的培养基体系H。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
2.16g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系H中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入2～6mL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.1～0.15。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系H。
[0052] 对体系H进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高52.8％，亚硝酸盐积累率仅减少2.8％。反硝化微生物P.denitrificans单独接
种到反硝化培养基作为对照。
种到反硝化培养基作为对照。
[0053] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系I。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系I中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入90～200μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.002～0.003。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系I。
得灭菌后的培养基体系I。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系I中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入90～200μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.002～0.003。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系I。
[0054] 对体系I进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高32.8％且提前2小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累。反硝化
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
[0055] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系J。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系J中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入800～1100μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最
终OD600为0.02～0.03。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系J。
得灭菌后的培养基体系J。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系J中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入800～1100μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最
终OD600为0.02～0.03。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系J。
[0056] 对体系J进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高32.3％且提前2小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累。反硝化
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
[0057] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系K。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系K中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入40～60μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.001～0.0015。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系K。
得灭菌后的培养基体系K。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下，用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微
生物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，
培养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生
物P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到
40mL。在100mL所述灭菌后的培养基体系K中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为
3g/L，最后，向培养基中，分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为
0.02～0.03，再加入40～60μL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终
OD600为0.001～0.0015。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系K。
[0058] 对体系K进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高32.4％且提前4小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累。反硝化
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
[0059] 请参阅表1，在一实施例中，在无菌厌氧瓶中，加入培养基和1mL微量元素，用NaOH和HCl调节体系的pH至7.2，采用无菌培养容器封口膜密封，在温度121℃下灭菌20分钟，获
得灭菌后的培养基体系L。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微生
物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，培
养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生物
P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到40mL。
在100mL所述灭菌后的培养基体系K中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为3g/L，
最后向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02～
0.03，再加入2～6mL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600为0.1
～0.15。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系L。
得灭菌后的培养基体系L。其中，培养基成分包括无机盐和碳源，其中无机盐的组成包括
1.08g/L KNO3，0.5g/L NH4Cl，0.07～0.1g/L MgSO4，2～4.65g/L Na2HPO4，1～2.44g/L
KH2PO4。微量元素构成(g/L)包括：Na2‑EDTA(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、MnCl2·4H2O
(0.02)、Na2MoO4·2H2O(0.242)、CuCl2·2H2O(0.135)和ZnCl2(0.34)。再配制250g/L葡萄糖
在115℃下灭菌15分钟。预先在有氧条件下用灭菌的100～200mL LB培养基培养反硝化微生
物P.denitrificans到OD600为1.8～2.0，在厌氧条件下，用灭菌的费氏丙酸杆菌培养基，培
养Propionibacterium freudenreichii到OD600为0.8～1.0。将预先培养好的反硝化微生物
P.denitrificans和Propionibacterium freudenreichii，用PBS洗菌三次后浓缩到40mL。
在100mL所述灭菌后的培养基体系K中，加入1.2ml灭好菌的葡萄糖，使葡萄糖浓度为3g/L，
最后向培养基中分别加入400～600μL浓缩好的P.denitrificans悬液，使OD600为0.02～
0.03，再加入2～6mL浓缩好的Propionibacterium freudenreichii悬液，使最终OD600为0.1
～0.15。置于30℃恒温摇床上，厌氧培养24小时，获得体系L。
[0060] 对体系L进行硝酸盐的生物还原实验，结果表明，硝酸盐的去除率为100％，速率比对照组提高63.1％且提前4小时达到硝酸盐去除率100％，最终没有亚硝酸盐积累。反硝化
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
微生物P.denitrificans单独接种到反硝化培养基作为对照。
[0061] 表1本发明一些实例数据对比表
[0062]
[0063]
[0064] 表2.本发明另一些实例数据对比表
[0065]
[0066] 根据表1、表2和实施例中的数据分析得出，当脱氮副球菌的浓度确定了之后，再加入一定浓度的费氏丙酸杆菌可以加快硝酸盐的还原，特别是，在硝酸盐含量为300mg/L、葡
萄糖浓度为5g/L、脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌初始OD600比例为1:1或1:0.1时，可
以显著加快反硝化，比单独的脱氮副球菌对照组提前3‑5个小时完成反硝化，反硝化速率分
别提高90.8％和72.1％，且中间产物积累低。虽然，当在硝酸盐含量为300mg/L、葡萄糖浓度
为3g/L、脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌初始OD600比例为1:0.05时，反硝化速率提高
了155％，但是该条件下存在亚硝氮的积累。选用葡萄糖作为碳源是因为费氏丙酸杆菌培养
基碳源，一般选择葡萄糖，且葡萄糖是脱氮副球菌最合适的碳源。pH选择7.2、温度选择30
℃，都在两种微生物的最佳条件范围内，因此培养环境达到了两种菌的最佳状态。本发明发
现碳氮比在10～16时，该方法加快反硝化效果较明显，碳氮比过高会降低促进效果且可能
会造成出水COD浓度过高。碳源过高还可能导致丙酸杆菌产生过多的丙酸，改变培养体系的
pH，对脱氮副球菌生长有抑制作用。碳氮比过低可能导致硝酸盐生物还原碳源不足或者导
致亚硝酸盐积累，其中，在碳氮比在10左右的情况下，脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌
初始OD600比例为1:0.05时，促进效果最佳且缩短了达到硝酸盐去除率100％所需的时间，而
菌种比例过高会降低促进效果，因为微生物的生长需要消耗一定量的碳源。碳氮比在16左
右的情况下，脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌初始OD600比例为1:1和1:0.1时，促进效
果较好且缩短了达到硝酸盐去除率100％所需的时间，而菌种比例过高或过低都会降低促
进效果。因此，两种菌的初始OD600比例需要在一定的范围内，才可以实现明显加快反硝化。
在本发明中，一定比例的混菌可以加快反硝化是因为脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌之间存在
种间互营，共同完成能量的代谢。研究发现细胞间接触以节能的方式促进种间电子转移。增
加电子传递将提高反硝化效率和碳源利用率，并减少有毒有害中间产物的积累。
萄糖浓度为5g/L、脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌初始OD600比例为1:1或1:0.1时，可
以显著加快反硝化，比单独的脱氮副球菌对照组提前3‑5个小时完成反硝化，反硝化速率分
别提高90.8％和72.1％，且中间产物积累低。虽然，当在硝酸盐含量为300mg/L、葡萄糖浓度
为3g/L、脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌初始OD600比例为1:0.05时，反硝化速率提高
了155％，但是该条件下存在亚硝氮的积累。选用葡萄糖作为碳源是因为费氏丙酸杆菌培养
基碳源，一般选择葡萄糖，且葡萄糖是脱氮副球菌最合适的碳源。pH选择7.2、温度选择30
℃，都在两种微生物的最佳条件范围内，因此培养环境达到了两种菌的最佳状态。本发明发
现碳氮比在10～16时，该方法加快反硝化效果较明显，碳氮比过高会降低促进效果且可能
会造成出水COD浓度过高。碳源过高还可能导致丙酸杆菌产生过多的丙酸，改变培养体系的
pH，对脱氮副球菌生长有抑制作用。碳氮比过低可能导致硝酸盐生物还原碳源不足或者导
致亚硝酸盐积累，其中，在碳氮比在10左右的情况下，脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌
初始OD600比例为1:0.05时，促进效果最佳且缩短了达到硝酸盐去除率100％所需的时间，而
菌种比例过高会降低促进效果，因为微生物的生长需要消耗一定量的碳源。碳氮比在16左
右的情况下，脱氮副球菌初始OD600与费氏丙酸杆菌初始OD600比例为1:1和1:0.1时，促进效
果较好且缩短了达到硝酸盐去除率100％所需的时间，而菌种比例过高或过低都会降低促
进效果。因此，两种菌的初始OD600比例需要在一定的范围内，才可以实现明显加快反硝化。
在本发明中，一定比例的混菌可以加快反硝化是因为脱氮副球菌和费氏丙酸杆菌之间存在
种间互营，共同完成能量的代谢。研究发现细胞间接触以节能的方式促进种间电子转移。增
加电子传递将提高反硝化效率和碳源利用率，并减少有毒有害中间产物的积累。
[0067] 在本发明中，在脱氮副球菌P.denitrificanss反硝化过程中加入费氏丙酸杆菌，通过两种菌的相互作用，加快反硝化进程，提高反硝化速率，减少中间产物的积累。与常见
的利用物理、化学等提高反硝化效率的方法相比，不仅节约成本，而且产生的有害中间产物
少、二次污染小
的利用物理、化学等提高反硝化效率的方法相比，不仅节约成本，而且产生的有害中间产物
少、二次污染小
[0068] 此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另
有说明；还应理解，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而
非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，
在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
有说明；还应理解，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而
非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，
在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0069] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完
成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完
成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。