一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用

摘要

本发明涉及一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用，属于生物医学工程领域和微生物工程领域。本发明在基于大肠杆菌胞内表达系统，对链球菌溶血素成熟蛋白全序列的核酸序列进行优化设计，在链球菌溶血素蛋白的两端分别融合GSSSSHHHHHHHHSS(GSHS)和SSHHHHHHSS(SHS)多肽片段后，表达蛋白的活性产量达到5×107HU/mL，蛋白产量达到4mg/mL，胞内占比可达40％。该质粒及工程菌具有实现链球菌溶血素成熟蛋白全序列表达，活性蛋白表达量高、蛋白稳定性好、蛋白抗原性正常(在非变性状态下，抗原性正常)、对宿主生长影响小等五个方面的综合优势。

权利要求

1.一种链球菌溶血素蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述链球菌溶血素蛋白的基因。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述链球菌溶血素蛋白或含有权利要求2所述基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体以pET-28a(+)为出发载体。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体pET-28a(+)中的Thrombin和第二个His-tag被删除。

6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌能够表达权利要求1所述链球菌溶血素蛋白，或表达权利要求2所述基因，或含有权利要求3～6任一所述表达载体。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以大肠杆菌为宿主。

9.一种制备权利要求1所述链球菌溶血素蛋白的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求7或8任一所述的工程菌为发酵菌株进行发酵产蛋白。

10.权利要求1所述链球菌溶血素蛋白或权利要求2所述基因或权利要求3～6任一所述表达载体或权利要求7～8任一所述工程菌在链球菌溶血素蛋白生产、链球菌溶血素蛋白抗体制品制备中的应用。

说明书

一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用，属于生物医学工程领域和微生物工程领域。

背景技术

[0002] 链球菌溶血素蛋白是链球菌感染过程中的重要致病因子，能引起人和动物细胞膜产生穿孔，具有抗原性，能刺激人体产生抗体，抗体过量产生会导致关节等部位异常。

[0003] 在链球菌感染检测中，链球菌溶血素蛋白标品是一种重要试剂，在市场和临床中具有广泛的需求，在国内外制备的链球菌溶血素蛋白免疫试剂盒中，链球菌溶血素蛋白标品是链球菌溶血素蛋白免疫试剂盒的重要组分，目前国际上制备链球菌溶血素蛋白的产率较低。

[0004] 目前，链球菌溶血素蛋白来源一是通过天然链球菌提取，但产量较低；二是通过大肠杆菌重组表达。链球菌溶血素全长成熟蛋白不与有关标签融合表达的研究显示，表达蛋白稳定性好，在蛋白变性和非变性状态下均显示抗原性，但蛋白表达量低，为0.3mg/mL。之后，由于研究人员发现天然链球菌溶血素全蛋白的前77个氨基酸组成的肽段部分对大肠杆菌毒性较大，可能有抑制表达的效果，因而采取了表达其第77号氨基酸后续多肽片段的策略，总体蛋白表达量最大可达到3mg/mL，缺点是表达蛋白的比活相对较低，非活性蛋白较多，溶血活性产量为2.4×106HU/mL，说明表达的胞内蛋白有效折叠差，而且该表达的上清蛋白样品在-20和-80℃低温下直接保存的稳定性差，容易变性。为了进一步提高SLO的活性蛋白表达产量，前人用一种果胶酸裂解酶作为融合标签与77号氨基酸后续片段共同表达，表达产量达到4mg/mL，将酶活产量提高达4×107HU/mL，蛋白的产量胞内占比可达38％，但由于较大融合标签带来的的空间位阻作用，导致蛋白在非变性状态下，抗原决定基团暴露受影响，抗原性受到屏蔽。

[0005] 因此，目前还是缺少同时具备高活性蛋白表达、蛋白产品稳定性好和抗原性正常等条件的SLO表达工程菌。另外，在链球菌引起的疾病中，病原体释放的SLO必然是含全序列氨基酸的溶血素成熟蛋白，所以为医学临床SLO抗体检测提供的SLO蛋白还是含全序列氨基酸比较合理，所以优化全序列氨基酸的溶血素成熟蛋白的技术在临床上的价值高于优化77氨基酸后的溶血素蛋白片段，本专利提供满足表达链球菌溶素的全序列成熟蛋白、具备高活性蛋白表达、蛋白产品稳定性好和抗原性正常等条件的SLO表达工程菌，更合理和临床应用意义更大。

发明内容

[0006] 本发明针对缺乏能够高效表达稳定性和抗原性俱佳的链球菌溶血素成熟蛋白全序列的质粒和工程菌，难以综合解决链球菌溶血素蛋白重组表达在成熟全序列表达、对宿主生长有影响、表达量低、稳定性低和抗原性缺失等方面的多种问题，提供了一种溶血素融合蛋白 GSHS-SLO-SHS及其表达质粒与应用。

[0007] 本发明提供了一种能够在大肠杆菌中高效表达的、蛋白稳定性与抗原性俱佳的链球菌溶血素蛋白，具有稳定性与抗原性俱佳，含GSSSSHHHHHHHHSS(GSHS)和SSHHHHHHSS(SHS) 的双Tag，含有链球菌溶血素成熟蛋白氨基酸全序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 本发明提供了编码链球菌溶血素蛋白的基因GSHS-SLO-SHS，所述基因核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明提供了一种表达所述链球菌溶血素蛋白或含有所述编码链球菌溶血素蛋白基因的表达载体。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pET-28a(+)为出发载体。

[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体pET-28a(+)中的第二个His-tag和Thrombin 序列被删除。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0013] 本发明提供了一种表达所述链球菌溶血素蛋白GSHS-SLO-SHS的工程菌或细胞系。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述工程菌或细胞系是以大肠杆菌为宿主，pET-28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

[0015] 本发明提供了一种制备链球菌溶血素蛋白的方法，所述方法是以表达链球菌溶血素蛋白 GSHS-SLO-SHS的工程菌或细胞系为发酵菌株进行发酵产蛋白。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述方法为将所述工程菌或细胞系接种在含80～200μg/mL 卡那霉素的LB培养基中35～40℃培养过夜(12h～15h)，后接入TB发酵液体培养基，35～40℃培养到细菌OD600到0.7～1.0，用0.3～0.6mM IPTG诱导，降温至20～30℃培养，表达40～50h，得到发酵液，将发酵液进行纯化即得到链球菌溶血素蛋白。

[0017] 本发明提供了一种所述溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS在SLO蛋白生产、SLO抗体检测、SLO抗体制品制备等领域的应用。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 综合解决了链球菌溶血素成熟蛋白全序列重组表达过程中的成熟蛋白全序列表达、影响宿主细胞生长、表达量低和稳定性差等问题。

[0020] (1)提供了一种链球菌溶血素成熟蛋白全序列表达方法，本发明优化设计并合成了溶血素融合基因GSHS-slo-SHS，构建了含该GSHS-slo-SHS融合基因的表达质粒和含该表达质粒的工程菌，该工程菌可以表达溶血素融合蛋白(GSHS-SLO-SHS)。

[0021] (2)GSHS-SLO-SHS对宿主细胞群体生长影响低。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS对宿主细胞毒性低，25℃条件下表达48h后，GSHS-slo-SHS/pET-28(a) 工程菌OD600可以达到2.5，高于SLO独立表达的工程菌(OD600：1.60)；说明GSHS-SLO-SHS 蛋白对宿主细胞群体生长影响低。

[0022] (3)本发明的工程菌表达的溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS具有较高溶血活性和蛋白产量。表达蛋白的活性产量达到5×107HU/mL，蛋白产量达到4mg/mL，胞内占比可达40％，而SLO全序列独立表达，表达产量低于0.3mg/mL。

[0023] (4)GSHS-SLO-SHS蛋白的稳定性良好。蛋白制品可在-80℃条件下保存2年以上，稳定性保持在80％，SLO胞内独立表达，其蛋白纯化后在-80℃条件下保存时间1年，稳定性保持在40％。

[0024] (5)GSHS-SLO-SHS蛋白抗原活性正常。

具体实施方式

[0025] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

附图说明

[0026] 图1为设计的GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)质粒结构图。

[0027] 图2为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)酶切鉴定图；泳道1为DNA Marker，泳道2为 GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/pET-28a，泳道3为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)双酶切。

[0028] 图3为重组表达GSHS-SLO-SHS的SDS-PAGE图谱；泳道1为蛋白Marker，泳道2为 GSHS-slo-SHS/pET-28a的胞内上清。

[0029] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

[0030] TB培养基：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO412.54 g/L，KH2PO4 2.31 g/L。

[0031] LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

[0032] 实施例1双Tag(GSHS和SHS)融合的链球菌溶血素成熟蛋白全序(GSHS-SLO-SHS)基因GSHS-SLO-SHS基因设计与表达质粒设计

[0033] 在编码溶血素融合蛋白基因SLO核苷酸的5’端和3’端分别添加多肽GSHS (GSSSSHHHHHHHHSS)和SHS(SSHHHHHHSS)，在基因上游添加NocⅠ位点序列，在基因下游加上BamHⅠ序列。

[0034] 化学合成如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，将合成的片段与PMD18T载体酶切后(酶切位点NocⅠ和BamHⅠ)连接得到连接产物；将连接产物转化至DH5α(具体转化步骤参见全式金DH5α说明书)，转化产物涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)得到单克隆转化子，挑取单克隆至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定，将鉴定通过的菌液提取质粒(步骤详见OMEGA质粒提取试剂盒)，质粒酶切鉴定和测序验证，得到质粒 GSHS-slo-SHS/PMD18T。

[0035] 菌落PCR所用引物：

[0036] F1：5’ATGGGCTCTT CTTCTTCTCA CC3’，SEQ ID NO.5；

[0037] R1：5’TTAAGAAGAG TGGTGGTGGT GGTGGTGAG3’，SEQ ID NO.6。

[0038] 实施例2GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)表达载体构建

[0039] 实现融合基因在大肠杆菌中表达的载体是pET-28a(+)，但对构架有较大改变，不使用 pET-28a(+)的二个His-tag和Thrombin序列(质粒结构如图1所示，载体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，将pET-28a(+)质粒和GSHS-slo-SHS/PMD18T用NocⅠ和BamHⅠ进行酶切，将酶切产物切胶回收得到回收产物，将回收产物再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经过37℃培养过夜(12h～14h)得到单克隆转化子，挑取单克隆至含100μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定(所用引物同实施例1中的F1和R1)，将鉴定通过的菌液提取质粒，质粒酶切鉴定(见图 2)和测序验证。鉴定得到的菌株命名为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/DH5α，质粒命名为 GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)。

[0040] 实施例3GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达工程菌构建

[0041] 将GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，再在100μg/mL卡那霉素的 LB平板，经过37℃培养过夜(12h～14h)得到单克隆转化子，挑取单克隆至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落PCR鉴定 (所用引物同实施例1中的F1和R1)并进行测序验证，将验证得到单克隆转化子命名为 GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/BL21(DE3)。

[0042] 转化步骤：使用热激转化法：

[0043] (1)将10μL连接产物导入100μl BL21感受态细胞；

[0044] (2)冰浴15-30min；

[0045] (3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

[0046] (4)加入800μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

[0047] (5)5000rpm离心2min收菌；

[0048] (6)移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含100μg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右，得到单克隆菌落。

[0049] 实施例4溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS表达

[0050] 摇瓶发酵：将GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/BL21(DE3)构建的工程菌分别接种在含100μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜(12h～14h)，后接入TB发酵液体培养基，37℃培养到细菌OD600到0.8，最佳表达条件为用0.5mM IPTG诱导，降温至25℃培养，表达
48h，得到发酵液。

[0051] 蛋白的纯化：将发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM 磷酸钠、0.5mM NaCl、20mM咪唑、1％甘油，用HCl调pH至7.4)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间 4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗蛋白液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

[0052] 准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液(500mmol/L NaCl，50mM PBS调节pH至6.0)pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗蛋白液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，获得达到电泳纯的目的蛋白。

[0053] 蛋白产量的测定：参照Bradford的方法[Bradford MA.Rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein 2dyebinding.Anal Biochem,1970,72:248–254]采用考马斯亮蓝G 2 250法进行可溶性蛋白含量测定。

[0054] 以HisTRAP H.P(GE company)柱，用10倍柱体积Loading Bufffer平衡柱子，上述过滤上清液直接上柱，上样后用Loading Bufffer洗柱至OD280吸收值至基线，用Elution Buffer (20mM PBS，0.5M NaCl，300mM咪唑，Ph7.4)洗脱，收集洗脱峰，进行SDS-PAGE分析纯度，结果显示纯度达到95％。

[0055] 摇瓶发酵表达结果表明，在25℃条件下表达48h后，GSHS-slo-SHS工程菌OD600可以达到2.5。

[0056] 本发明的工程菌表达的溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS具有较高的蛋白产量，蛋白产量达到4mg/mL，胞内占比可达40％。

[0057] 实施例5溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS的融血活性测定

[0058] 溶血素融合蛋白样品可用溶液A(溶液A：36mM H3PO4，126mM NaCl，1g/L BSA(牛血清白蛋白)，pH 7.0)进行系列梯度稀释。将0.5mL的150mM 2-mercaptoethanol与1mL稀释样8
品混匀，30℃孵育15min，然后每管加0.5mL含绵羊红细胞的A溶液(1.58×10cell/mL)30℃下反应20min，离心后，用541nm检测上清中血红蛋白的浓度。

[0059] 1U定义为在该实验条件下，引起上述反应体系中红细胞溶解的最小蛋白量。

[0060] 经测定，融合蛋白GSHS-SLO-SHS具有溶血性，表达蛋白溶血活性产率为5×107HU/6
mL 培养基，前人最佳表达体系的溶血活性产率为2.4×10HU/mL培养基。

[0061] 实施例6溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS的稳定性测定

[0062] 溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS的胞内表达上清样品，可直接在-80℃保存二年，融血活性保持80％。本溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS样品在冻干保存状态下，活性持久稳定与独立表达的SLO全单蛋白一致。

[0063] 实施例7溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS抗原性鉴定

[0064] 采用免疫双向扩散法，将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。将1％agar融化后，置56℃水浴。在玻璃板上铺胶，约1.5mm厚，凝固后打孔(直径3mm)，孔间距10mm。将溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS与SLO抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，在保湿的盒内，37℃，扩散24h。采用同一抗 SLO血清，阳性对照采用天然链球菌溶血素蛋白，阴性对照使用大肠杆菌胞内上清蛋白，检测的抗原样品为用大肠杆菌表达的溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS。结果显示，天然链球菌溶血素蛋白和GSHS-SLO-SHS的抗原抗体反应结果为阳性，大肠杆菌胞内上清蛋白的抗原抗体反应结果为阴性。

[0065] 对比例1

[0066] (1)独立表达SLO工程菌的构建

[0067] 具体实施方式同实施例1～3，区别在于，将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列替换为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，构建得到单克隆转化子命名为sslo/pET-28(a+)/BL21(DE3)。

[0068] 菌落PCR所用引物：

[0069] F1：5’ATGGGCAACA AAAAAACTTT 3’，SEQ ID NO.7；

[0070] R1：5’TTTGTAGGTG ATTGAGCCAT ACGG 3’，SEQ ID NO.8。

[0071] (2)独立表达SLO工程菌表达的SLO蛋白性质测定

[0072] 具体实施方式参见实施例4，摇瓶发酵表达结果表明，在25℃条件下表达48h后，SLO 独立表达的工程菌OD600为1.60；蛋白表达产量最高为0.3mg/mL，胞内占比达0.3％。

[0073] 具体实施方式参见实施例5，测定溶血活性，表达酶活为1×106HU/mL培养基。

[0074] 具体实施方式参见实施例6，测定独立表达SLO蛋白菌株表达的蛋白的稳定性，SLO全蛋白独立表达的上清直接在-80℃保存二年，融血活性剩余40％。

[0075] 具体实施方式参见实施例7，测定独立表达SLO蛋白的抗原性，结果为阳性。

[0076] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。