合成δ-生育三烯酚重组酿酒酵母菌株及构建方法及用途

摘要

本发明公开了合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株及构建方法及用途，方法为：将外源基因hpd,hpt和vte1整合到酿酒酵母BY4742菌株的基因组rDNA位点，得到重组菌株VE01；在重组菌株VE01基因组δ位点整合thmg1基因和ggppssa基因，得到重组菌株VE02，本发明构建的一种合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株，能够以葡萄糖为碳源重头合成δ‑生育三烯酚，代替植物提取的方法。这种利用微生物合成δ‑生育三烯酚的方法的操作简便，同时能得到产量高的δ‑生育三烯酚。

权利要求

1.合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：将外源基因hpd、hpt和vte1整合到酿酒酵母BY4742菌株的基因组rDNA位点，得到重组菌株VE01；在重组菌株VE01基因组δ位点整合thmg1基因和ggppssa基因，得到重组菌株VE02；所述hpd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述hpt基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述vte1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述thmg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述ggppssa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.权利要求1的方法构建的合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株。

3.权利要求2的合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株生产δ‑生育三烯酚的用途，其特征是包括如下步骤：将权利要求2的合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE02在发酵培养基中培养发酵，获得δ‑生育三烯酚，所述发酵培养基的配方为35.66g/L葡萄糖、24.46g/L蛋白胨、14.01g/L酵母浸粉，余量为水。

说明书

合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株及构建方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物合成技术领域，更具体的说是涉及一种合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株及构建方法。

背景技术

[0002] 维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。早在20世纪20年代就被人们发现，Evans和他的同事在研究生殖过程中发现，
酸败的猪油可以引起大鼠的不孕症。在1936年分离出结晶体，1938年被瑞士化学家人工合
成。维生素E包含一组八个结构相关的生育酚(tocopherols)和生育三烯酚
(tocotrienols)，早期，因为生育三烯酚相比生育酚来说有很低的生物活性，对其研究较
少。近来研究表明，生育三烯酚具有生育酚所没有的功能，如神经元保护作用以及降低胆固
醇等作用。且生育三烯酚具有较强的抗肿瘤活性,可以在体外及体内抑制肿瘤细胞增殖,诱
导肿瘤细胞凋亡,阻滞细胞周期和抑制血管生成。具有很好的临床应用前景。δ‑生育三烯酚
是维生素E的一种异构体，由于其潜在的多样化生物医学应用，例如抗癌活性，预防骨质疏
松症和降低胆固醇，最近受到了广泛关注。

[0003] 到目前为止，根据关于维生素E市场前景的报告，市场上维生素E约80％来自化学合成，20％来自植物或种子的提取。然而，化学合成维生素E的过程中使用了有毒的催化剂，
使得该过程对环境不友好，不可持续。然而，δ‑生育三烯酚主要是从油棕和大米中提取的，
很少有人对其微生物的生物合成进行研究。工程酿酒酵母可以作为生产δ‑生育三烯酚的替
代和有前途的方式，代替植物中的提取方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株。

[0005] 本发明的第二个目的是提供一种合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株的构建方法。

[0006] 本发明的第三个目的是重组酿酒酵母菌株生产δ‑生育三烯酚的用途。

[0007] 本发明的技术方案概述如下：

[0008] 合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：将外源基因hpd,hpt和vte1整合到酿酒酵母BY4742菌株的基因组rDNA位点，得到重组菌株VE01；在重组
菌株VE01基因组δ位点整合thmg1基因和ggppssa基因，得到重组菌株VE02,所述hpd基因的
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；hpt基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；vte1基因的核
苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；thmg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；ggppssa基因
的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

[0009] 上述方法构建的合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株。

[0010] 合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株生产δ‑生育三烯酚的用途，包括如下步骤：将权利要求2的合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE02在发酵培养基中培养发酵，获得
δ‑生育三烯酚，所述发酵培养基的配方为35.66g/L葡萄糖、24.46g/L蛋白胨、14.01g/L酵母
浸粉，余量为水。

[0011] 本发明的优点：

[0012] 本发明构建的一种合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株，能够以葡萄糖为碳源重头合成δ‑生育三烯酚，代替植物提取的方法。这种利用微生物合成δ‑生育三烯酚的方法的
操作简便，同时能得到产量高的δ‑生育三烯酚。

附图说明

[0013] 图1为酿酒酵母中的δ‑生育三烯酚合成路径。

[0014] 图2为合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE01产量图。

[0015] 图3为合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE02产量图。

[0016] 图4为发酵条件优化后重组酿酒酵母菌株VE02合成δ‑生育三烯酚产量图。

具体实施方式

[0017] 原始菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742，于2016年9月在ATCC官网购买(https://www.atcc.org/products/all/201389.aspx)。

[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0019] 实施例1

[0020] 合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株的构建方法,包括如下步骤：利用rDNA位点特异性同源重组的方法将外源基因hpd,hpt和vte1三个基因的表达盒整合到酵母
(Saccharomyces cerevisiae BY4742)基因组rDNA位点，得到重组菌株VE01。

[0021] 在重组菌株VE01基因组δ位点整合thmg1基因和ggppssa基因，得到重组菌株VE02。

[0022] hpd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；hpt基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；vte1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；thmg1基因的核苷酸序列如SEQ ID 
NO.10所示；ggppssa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

[0023] 具体步骤为：

[0024] (1)合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE01的构建方法，包括如下步骤：

[0025] 从NCBI数据库获得Pseudomonas putida KT2440来源的基因hpd，Synechocystis sp.PCC6803来源的基因hpt和Arabidopsis thaliana(拟南芥)来源的基因vte1的氨基酸序
列，通过密码子优化人工合成这三个基因的序列，同时构建三个基因的表达盒，

[0026] hpd基因表达盒使用Ppgk1启动子和Tpgk1终止子(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4)，

[0027] hpt基因表达盒使用Ptef1启动子和Ttpi1终止子(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5)，

[0028] vte1基因表达盒使用Ppgk1启动子和Tcyc1终止子(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6)，

[0029] 通过同源重组的方法，向酿酒酵母rDNA位点导入，hpd基因表达盒,hpt基因表达盒和vte1基因表达盒，得到合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE01。

[0030] (2)合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE02的构建方法，包括如下步骤：

[0031] 从NCBI数据库获得Saccharomyces cerevisiae BY4742来源的基因thmg1基因，通过人工合成得到该核苷酸序列(SEQ ID NO.10)，

[0032] 从NCBI数据库获得来自Sulfolobus acidocaldarius基因ggppssa的氨基酸序列，通过密码子优化人工合成这个基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)，

[0033] 构建这两个基因的表达盒，

[0034] thmg1基因表达盒使用Ppgk1启动子和Tpgk1终止子(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4)，

[0035] ggppssa基因表达盒使用Ptdh1启动子和Ttef1终止子(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.12)，通过同源重组的方法，向酿酒酵母δ位点导入thmg1基因表达盒和ggppssa基因表达
盒，得到合成δ‑生育三烯酚重组酿酒酵母菌株VE02(见图1)。

[0036] 1、模块的构建

[0037] 同源臂rDNA‑up和rDNA‑down均来自酿酒酵母BY4742基因组；筛选标记基因URA3来自质粒pRS426(购自Addgene,Inc.WWW.addgene.org)。

[0038] 以酿酒酵母BY4742基因组为模板，以rDNAup‑F(SEQ ID NO.13)，rDNAup‑R‑Tcyc1(SEQ ID NO.14)以及Ttpi1‑rDNAdown‑F(SEQ ID NO.15)，rDNAdown‑R(SEQ ID NO.16)为引
物，分别扩增同源臂rDNA‑up(SEQ ID NO.17)和rDNA‑down(SEQ ID NO.18)；

[0039] 以vte1‑Tcyc1‑F(SEQ ID NO.19)，Tcyc1‑R‑rDNAup(SEQ ID NO.20)以及URA3‑Ppgk1‑F(SEQ IDNO.21)，Ppgk1‑R‑vte1(SEQ ID NO.22)为引物，分别扩增启动子Ppgk1(SEQ 
ID NO.1)和终止子Tcyc1(SEQ ID NO.6)；

[0040] 以Tpgk1‑Ptef1‑F(SEQ ID NO.23)，Ptef1‑R‑hpt(SEQ ID NO.24)以及hpt‑Ttpi1‑F(SEQ ID NO.25)，Ttpi1‑R‑rDNAdown(SEQ ID NO.26)为引物，分别扩增启动子Ptef1(SEQ 
ID NO.2)和终止子Ttpi1(SEQ ID NO.5)；

[0041] 以质粒PRS426为模板，Ppgk1‑URA3‑F(SEQ IDNO.27)和URA3‑R‑Ppgk1(SEQ ID NO.28)为引物，扩增标记基因URA3(SEQ ID NO.29)，所用序列见序列表。

[0042] 本发明所用PCR酶为全式金生物科技有限公司的Fast Pfu聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2.5μL；dNTP(10mM)，5μL；5×Pfu 
Buffer，10μL；Fast Pfu聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐至50μL。在PCR仪上设置扩增程序。
扩增条件为95℃预变性2min(1个循环)；95℃变性20sec、退火55℃20sec、72℃延伸30s(35
个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。

[0043] 将上述扩增得到的7个片段与人工合成的基因片段hpd(SEQ ID NO.7),hpt基因(SEQ ID NO.8),vte1基因的核苷酸序(SEQ ID NO.9),Ppgk1启动子(SEQ ID NO.1)和Tpgk1
终止子(SEQ ID NO.4)这5个片段混合，通过BM无缝连接试剂盒(博迈德生物科技有限公司)
拼接成一个大片段。每个片段的摩尔比为1:1，片段总量达到1μg，连接体积如下，DNA片段10
μL,2×Seamless Cloning Mix 10μL。在PCR仪上设置连接程序。连接条件为50℃50min，16
℃10min。

[0044] 通过PCR得到的片段，调整浓度在500ng，使用LiAc/鲑鱼精子DNA/PEG方法将其转化为感受态酵母。在不添加尿嘧啶的情况下，单个菌落在SC‑drop琼脂平板上生长(20g/L葡
萄糖，2g/L氨基酸混合物，6.7g/L不含氨基酸的酵母氮碱基，20g/L琼脂用于固体平板)。在
30oC下孵育36h后，将菌落在30oC，200rpm的酵母蛋白ept葡萄糖(YPD)培养基(20g/L葡萄
糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L琼脂固体培养基)中培养过夜。构建得到重组菌
株VE01。

[0045] 以酿酒酵母BY4742基因组为模板，以deltaup‑F(SEQ ID NO.30)，deltaup‑R‑LEU(SEQ ID NO.31)以及Ttef1‑deltadown‑F(SEQ ID NO.32)，deltadown‑R(SEQ ID NO.33)为
引物，分别扩增同源臂delta‑up(SEQ ID NO.34)和delta‑down(SEQ ID NO.35)；

[0046] 以LEU‑Ppgk1‑F(SEQ ID NO.36)，Ppgk1‑R‑thmgr(SEQ ID NO.37)以及thmg1‑Tpgk1‑F(SEQ ID NO.38)，Tpgk1‑R(SEQ ID NO.39)为引物，分别扩增启动子Ppgk1(SEQ ID 
NO.1)和终止子Tpgk1(SEQ ID NO.4)；

[0047] 以Tpgk1‑Ptdh1‑F(SEQ ID NO.40)，Ptdh1‑R‑ggppssa(SEQ ID NO.41)以及ggppssa‑Ttef1‑F(SEQ ID NO.42)，Ttef1‑R‑deltadown(SEQ ID NO.43)为引物，分别扩增
启动子Ptdh1(SEQ ID NO.3)和终止子Ttef1(SEQ ID NO.12)；

[0048] 以质粒PRS425为模板，deltaup‑LEU‑F(SEQ IDNO.44)和LEU‑R‑Ppgk1(SEQ ID NO.45)为引物，扩增标记基因LEU(SEQ ID NO.46)，所用序列见序列表。

[0049] 将上述7个PCR扩增得到的片段和人工合成的thmg1基因，ggppssa基因片段通过BM无缝连接试剂盒(博迈德生物科技有限公司)拼接成一个大片段。每个片段的摩尔比为1:1，
片段总量达到1μg，连接体积如下，DNA片段10μL,2×Seamless Cloning Mix 10μL。在PCR仪
上设置连接程序。连接条件为50℃50min，16℃10min。

[0050] 通过PCR得到的片段，调整浓度在500ng，使用LiAc/鲑鱼精子DNA/PEG方法将其转化为感受态酵母。在不添加尿嘧啶的情况下，单个菌落在SC‑drop琼脂平板上生长(20g/L葡
萄糖，2g/L氨基酸混合物，6.7g/L不含氨基酸的酵母氮碱基，20g/L琼脂用于固体平板)。在
30oC下孵育36h后，将菌落在30oC，200rpm的酵母蛋白ept葡萄糖(YPD)培养基(20g/L葡萄
糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L琼脂固体培养基)中培养过夜。构建得到重组菌
株VE02.

[0051] 2、发酵方法

[0052] 种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，余量为水；

[0053] 发酵培养基：35.66g/L葡萄糖、24.46g/L蛋白胨、14.01g/L酵母浸粉，余量为水。

[0054] 对照组：将重组菌株VE02接入5mL种子培养基30oC,200转/分，培养20h，再将这5mL培养基转接到30mL新鲜的种子培养基中，调整菌密度，使最终菌密度在OD600nm下为0.1，
30oC,200转/分，培养72h，取培养液用于产物分析。

[0055] 实验组：将重组菌株VE02接入5mL种子培养基30oC,200转/分，培养20h，再将这5mL培养基转接到30mL新鲜的发酵培养基中，调整菌密度，使最终菌密度在OD600nm下为0.1，
30oC,200转/分，培养72h，取培养液用于产物分析。

[0056] 3、产物分析

[0057] δ‑生育三烯酚的提取和分析：分别将对照组和实验组30mL培养液在4oC 8000rpm/min下离心10分钟以得到细胞沉淀，并用双蒸馏水(ddH2O)洗涤两次以除去残留的培养基。
然后，加入7ml双蒸馏水悬浮细胞，再加入7ml酸洗玻璃珠(0.4‑0.6mm)和15ml分析级丙酮。
在室温，5000rpm的涡旋下摇动30分钟，然后在4oC，8000rpm的条件下离心10分钟,得到上清
液。将上清液在真空旋转蒸发仪中蒸发，并将残余物溶于乙腈(1mL)。使用具有UV检测器的
Waters  2695HPLC仪器，通过高效液相色谱法(HPLC)进行分析。将溶液过滤并注入
RP18Lichrospher100分析柱(5μm，150x4.6 mm，Merck，Germany)中，以δ‑生育三烯酚(纯度
≥98％，加拿大多伦多研究化学公司)作为标注品。流动相为乙腈，其中包含0.1％v/v三氟
乙酸(TFA)，总流速为0.6mL/min，色谱图在292nm下检测，柱温为30oC，见图2、图3和图4。

[0058] 前体尿黑酸和香叶基香叶基焦磷酸酯分析：分别取对照组和实验组各1ml培养液，并以12000rpm离心10分钟以得到上清液。用ddH2O稀释10倍，并使用0.2μm无机滤膜过滤。最
后，与δ‑生育三烯酚相同的HPLC分析方法，以尿黑酸(HGA)(纯度≥98％，Sigma‑Aldrich，中
国)作为标注品。香叶基香叶基焦磷酸酯分析是通过检测香叶基香叶基焦磷醇进行的。我们
将1ml己烷分别添加到1ml对照组和实验组的培养液中，并使用涡旋在5000rpm下混合10分
钟。在12000rpm离心10分钟后，对己烷层进行采样，并通过FULI自动进样器将1μl注入配备
有熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm内径，0.25mm DB‑5MS，J&W Scientific，Folsom，CA)的
FULI9790 GC。以标准GGOH(纯度≥95％；中国上海阿拉丁)为对照。

[0059] 4、结果

[0060] 在这项研究中，我们首先将三个必需基因(hpd，hpt和vte1)整合到起始菌株酿酒酵母BY4742基因组的rDNA位点中，得到了菌株VE01。但是，未检测到δ‑生育三烯酚，并且对
前体的检测显示香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)也没检测到，仅检测到尿黑酸(HGA)。为了提
高香叶基香叶基焦磷酸酯的产量，我们通过delta位点整合将thmg1和ggppssa基因整合到
酵母菌株VE01基因组中，获得了重组菌株VE02，重组菌株VE02在种子培养基中培养，得到
1.39mg/L的δ‑生育三烯酚，为了进一步提高δ‑生育三烯酚的产量，我们通过优化调整后的
发酵培养基，最终获得了δ‑生育三烯酚的产量提高(3.56mg/L)，比以前的培养基高约2.6
倍。总之，最终获得了3.56mg/L的δ‑生育三烯酚。