一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用

摘要

本发明公开了一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用，提供了一种在高浓度醇溶液反应体系下仍能维持高度酶活的羰基还原酶，该酶产自定点突变的乳杆菌属菌株，用于将(3S)‑4‑苯基‑2‑丁酮衍生物还原为(2S,3S)‑2‑羟基‑4‑苯基丁烷衍生物；在底物、异丙醇和酶液的反应体系中，不需要添加其他助溶剂，可大大提高底物浓度，从而提高酶催化反应的转化率和产物的手性纯度。从而保证了反应体系分离更简单，其可用于地瑞那韦中间体的制备。

权利要求

1.一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶，其为SEQ ID No.1、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9任意一条氨基酸序列。

2.一种组合物，包含如权利要求1所述的羰基还原酶。

3.编码如权利要求1所述羰基还原酶的基因。

4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求3所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求4所述的表达载体。

6.如权利要求1所述的羰基还原酶在用于将式（I）所示的底物转化为式（II）所示的目标产物上的应用，其中，R为氨基保护基团。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将底物、羰基还原酶和过量的醇溶液在含有再生供氢辅因子的缓冲液中进行生物酶催化反应。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述醇溶液为异丙醇。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述羰基还原酶在含有不超过60% (m/V) 浓度醇溶液的反应体系下进行酶催化反应，24小时后的转化率不低于95%，所述目标产物的de值不低于99.5%。

10.根据权利要求6-9任意一项所述的应用，其特征在于：所述再生供氢辅因子为NAD+/NADP+，NAD+/NADP+的摩尔浓度为0.1 1.0 mmol/L。

~

11.根据权利要求6-9任意一项所述的应用，其特征在于：所述羰基还原酶催化反应的温度为25-50℃，缓冲液的pH为7.0 9.0。

~

12.根据权利要求6-9任意一项所述的应用，其特征在于：所述底物的投料浓度为100~

400g/L，所述羰基还原酶与底物的质量比为0.03 0.1:1。

~

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述醇溶液为异丙醇，异丙醇浓度为20~

50% (m/V)，底物的投料浓度为80 200g/L，催化反应24小时后底物的转化率不低于99%，所~述目标产物的de值不低于99.9%。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述氨基保护基团选自叔丁基羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙氧羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、邻硝基苯磺酰基、对硝基苯磺酰基、苯甲酰基、三苯甲基、2,4-二甲氧基苄基的任意一种。

说明书

一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物酶催化领域，具体地说涉及一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用。

背景技术

[0002] 地瑞那韦（darunavir）商品名为Prezista®，是由强生公司冰岛分公司Tibotec研发的一种非肽类HIV蛋白酶抑制剂（PI），是目前6种蛋白酶抑制剂（沙奎那韦，利托那韦，茚地那韦，萘非那韦，安瑞那韦及ABT378/r）中生物利用度最高的，通过阻断从受感染的宿主细胞表面释放新的、成熟的病毒粒子的形成过程，抑制病毒的蛋白酶而起作用。地瑞那韦具有较强的体外抑制病毒活性，包括对目前常用的PI具有耐药性的HIV菌株。在优化的背景治疗（Optimized Background Regimens）方案的随机临床试验中，地瑞那韦显示出了优于对照组的病毒学和免疫学反应。2006年6月，FDA批准地瑞那韦与其他抗逆转录病毒药物联合用于治疗HIV感染的成年患者。2007年3月地瑞那韦在欧盟的27个成员国上市。

[0003] 目前地瑞那韦主要通过式III化合物（化学名称：(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷）为中间体制备得到，该分子结构复杂，化学合成污染严重且难度较高。该结构存在两个手性中心，其中一个手性中心来源于天然的苯丙氨酸，另一个手性中心可将前手性的酮还原成手性醇，从而引入BOC-环氧化物上的第二个手性中心。若引入的第二个手性中心为R构型，则产物为(2R,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷，该构型为R,S型，是合成阿扎那韦重要中间体；若引入的第二个手性中心为S构型，则产物为式III化合物，该构型为S,S型，因此可考虑将式IV化合物（化学名称：(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮）通过还原反应获得。

[0004]

[0005] 目前(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷主要通过化学反应制备得到。欧洲专利EP1081133B1（优先权日1999年8月31日）公开了以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为原料，采用三叔丁氧基氢化铝锂或二异丁基氢铝等铝盐还原，收率为92%。上述化学合成方法均存在污染严重、溶剂回收困难、反应条件苛刻等问题。

[0006] 生物催化法合成具有反应操作简单、成本低、条件温和、能耗小、环境友好和产品光学纯度高等优势，因此受到越来越多的关注。羰基还原酶类(EC1.1.1.184)的某些酶可用于立体选择性转化前立体异构的醛或酮底物为对应的手性醇产物，但还可以催化逆反应，即醇底物被氧化为相应的酮/醛产物。其对酮和醛的还原以及醇的氧化需要辅因子，其中最常见的为NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）或NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）以及用于氧化反应的NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）或NADP+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。NADH和NADPH充当电子供体，而NAD+和NADP+充当电子受体。由于辅因子成本较高，现有技术常选用葡萄糖或异丙醇作为电子供体驱使辅因子循环，而葡萄糖或异丙醇被氧化为相应的葡萄糖酸或丙酮，而酮底物一般被还原为相应的目的醇产物。

[0007] 中国专利CN102482648B公开了选用来源于Novosphingobium aromaticivorans羰基还原酶基因构建工程菌催化(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，底物浓度100g/L，收率大于95%，产物非对映体过量de大于99.9%，但该专利只提供了制备RS构型的技术，而非SS构型。对于SS构型的生物制备，中国专利CN104745649A公开了采用(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，底物投加浓度为50g/L，通过助溶剂和表面活性剂助溶，促进转换体系流动性，增加底物与酶接触面积，若不加助溶剂，转化体系流动性变差，进而影响转化率。但该技术方案为了助溶，体系内容额外添加的甲苯、吐温60等物质不利于产品最后分离提纯，因此产品纯度只有99%。

[0008] 中国专利CN104745649A同样公开了SS构型的生物酶制备方法，但该方法的转化体系选用葡萄糖作为供氢体系，底物浓度100g/L，反应体系几乎全为水相，由于底物及SS构型产物均难溶于水，随着投加底物浓度的提高，且不加助溶剂，体系流动性会逐渐变差，转化率逐渐下降，进而限制底物浓度投加量，难以用于工业化生产。

[0009] 值得注意的是，目前本领域大部分以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物产(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1–氯-2-羟基-4-苯基丁烷生物催化技术中，底物浓度投加量一般无法超过100g/L，或需要额外增加助溶剂使体系带入其他杂质，进而影响SS构型产物分离纯化及纯度。

发明内容

[0010] 发明目的：本发明的目的是提供一种在高浓度醇溶液反应体系下维持高度酶活的羰基还原酶，可用于将(3S)-4-苯基-2-丁酮衍生物还原为(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物；本发明还有一个目的是提供包含前述羰基还原酶的组合物；本发明还有一个目的是提供编码前述羰基还原酶的基因序列；本发明还有一个目的是提供一种含有前述基因序列的表达载体；本发明还有一个目的是提供包含前述表达载体的宿主细胞，本发明还有一个目的是提供前述羰基还原酶制备(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的应用。

[0011] 技术方案：本发明的一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶，其含有与SEQ ID No.1所示序列同源性不低于90%的氨基酸序列。其作为羰基还原酶可将(3S)-4-苯基-2-丁酮衍生物还原为(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物，尤其是在生物催化体系含有高浓度醇溶液的情况下，仍然能维持良好的酶催化效率。

[0012] 所述羰基还原酶是通过对CX-LAC II菌株的基因进行定点突变获得的。该菌株于2020年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CGMCC)，保藏编号NO.19432，经鉴定为谷糠乳杆菌（Lactobacillus farraginis），兼性厌氧，在MRS固体培养基，菌落凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为3.0 mm±1.0 mm。 显微镜下，革兰氏染色阳性，一般呈短杆状，排成链，通常不运动。CX-LAC II含有基因序列如SEQ ID No.3所示。所述的定点突变包括对CX-LAC II氨基酸序列第8位、第173位、第190位、第226位的氨基酸进行定向突变。
具体地说，是将第8位的K突变为N，第173位的D突变为E，第190位的Y突变为P，第226位的I突变为N。

[0013] 上述的CX-LAC II菌株也具备优秀的羰基还原能力，但对高浓度醇溶液并不耐受。对上述四个位点的突变让人意想不到地获得了对高浓度醇溶液耐受的菌株，使其应用在工业化生物酶催化制备(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的过程中，可在更高浓度的底物和醇溶液中维持活性，进一步提高其转化效率。

[0014] 所述羰基还原酶对应的氨基酸序列，在保持95%同源性的情况下，某些氨基酸可由其他理化性质接近的氨基酸替代，仍然维持一定的羰基还原能力和醇溶液高浓度耐受的效果。

[0015] 本发明的一种组合物，尤其指酶组合物，其包含前述的羰基还原酶，以及其他已公开的羰基还原酶或葡萄糖脱氢酶，联合应用于(2S,3S)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备。其具有优秀的羰基还原能力和高浓度醇溶液耐受的效果。

[0016] 本发明还请求保护编码所述羰基还原酶的基因序列。作为优选的实施方式，其为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，用于编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

[0017] 基于上述基因序列，可利用现有的基因工程技术构建表达载体，所述表达载体选用包括但不限于pET、pGEX、pMAL的任意一种，优选pET-28质粒。

[0018] 利用前述的表达载体加入感受态的宿主细胞，获得相应的表达菌株。所述宿主细胞选用包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种。大肠杆菌细胞生长繁殖速度快且BL21(DE3)适用于高效表达外源基因，因此优选大肠杆菌作为宿主细胞。

[0019] 本发明所述的2-羟基-4-苯基丁烷衍生物如式II所示，碳链1号位连接用于有机合成的取代卤族元素，优选为Cl；碳链3号位连接有氨基及其保护基团；其中，2号位和3号位为手性中心，其为SS构型，即本发明所述的目标产物。式I所示化合物为本发明酶催化底物(3S)-4-苯基-2-丁酮衍生物。

[0020]

[0021] 上述化合物I和化合物II中的氨基保护基团R选自叔丁基羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙氧羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、邻(对)硝基苯磺酰基、苯甲酰基、三苯甲基、2,4-二甲氧基苄基。

[0022] 本发明所述的羰基还原酶具有三个特性：其一，具备优秀的羰基还原酶活性；其二，酶催化特异性强，获得手性纯度优异的SS构型产物；第三，相较于其他羰基还原酶，对高浓度底物和醇溶液的耐受性更强。

[0023] 如式V所示，底物在羰基还原酶和NADH/NADPH作为供氢体的作用下，将底物中羰基还原为羟基并产生NAD+/NADP+，体系中的异丙醇作为供氢体在酶催化作用下被氧化丙酮，并伴随NADH/NADPH生成，从而实现辅因子再生循环。所述的醇溶液选用包括但不限于异丙醇、甲醇、乙醇、正丁醇的任意一种或多种的组合。优选采用异丙醇，异丙醇不仅是优秀的供氢体，可参与到供氢辅因子的再生循环，同时也是优秀的助溶剂，有利于将底物浓度提高到200g/L甚至更高。而甲醇、乙醇相较于异丙醇极性较大，对酶活损伤高于异丙醇；正丁醇极性较小，水溶性小，使产物后分离工艺复杂化。

[0024]

[0025] 在本发明的优选实施方式中所述再生供氢辅因子为NAD+/NADP+，NAD+/NADP+的摩尔浓度为0.1 1.0 mmol/L。~

[0026] 所述重组羰基还原酶催化反应的温度为25-50℃，优选反应温度为30-45℃，反应体系中的缓冲液pH为7.0 9.0，以保证有效酶活，优选为100 mmol/L的磷酸钾或磷酸钠钠缓~冲液，pH为8.0。

[0027] 所述底物的投料浓度为100 400g/L，所述羰基还原酶与底物的质量比为0.03~ ~0.1:1。

[0028] 所述反应体系中还加入镁离子，用于提高酶催化活力。提供镁离子的试剂可选用包括但不限于硝酸镁、氯化镁、硫酸镁的任意一种或多种的组合，优选用硫酸镁。镁离子浓度为0.01 0.05mol/L，优选为0.02mol/L。~

[0029] 本发明所述的羰基还原酶在含有不超过60% (m/V) 浓度醇溶液的反应体系下进行酶催化反应，24小时后的转化率不低于95%，所述目标产物的de指不低于99.5%。

[0030] 作为优选实施方式，所述醇溶液选用异丙醇，异丙醇浓度为20 50% (m/V)，底物的~投料浓度为80 200g/L，催化反应24小时后底物的转化率不低于99%，所述目标产物的de指~
不低于99.9%。

[0031] 需要说明的是，本发明所述的质量体积百分比 (m/V) 的单位为kg/L。

[0032] 技术效果：本发明利用定点突变获得的菌株发酵获得生物酶，其对高浓度异丙醇的耐受性显著高于其他菌株，从而适用于基于高浓度异丙醇生物酶催化体系的地瑞那韦中间体制备方法。高浓度的异丙醇一方面可作为辅因子供氢体用于辅因子循环再生，另一方面可充当助溶剂，进一步提高底物投加浓度。

[0033] 该方法无需引入其他助溶剂等杂质，整个过程操作方便、产物分离更简单。酶催化结束后的转化液利用连续浓缩结晶的方式获得高手性纯度以及高杂质纯度的优质产品，地瑞那韦中间体手性纯度不低于99.95%，产品收率不低于95%。

附图说明

[0034] 图1为实施例1羰基还原酶CXP I氨基酸序列与其他代表性羰基还原酶的对比图；

[0035] 图2为实施例1构建的pET-28a(+)-CX I质粒图谱；

[0036] 图3为实施例1的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-CX I诱导表达后还原酶CXP I粗酶液的SDS-PAGE电泳图；

[0037] 图4为实施例8反应6 h液相图谱；

[0038] 图5为实施例8反应24 h液相图谱。

具体实施方式

[0039] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

[0040] 实施例1

[0041] 羰基还原酶CXP I，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，含253个氨基酸组成的多肽链，通过对CX-LAC II菌株的基因进行定点突变获得的。

[0042] CX-LAC II菌株于2020年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号3院3号，保藏编号NO. 19432，经鉴定为谷糠乳杆菌（Lactobacillusfarraginis），兼性厌氧，在MRS固体培养基，菌落凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为3.0 mm±1.0 mm。 显微镜下，革兰氏染色阳性，一般呈短杆状，排成链，通常不运动。CX-LAC II含有基因序列CX II如SEQ ID No.3所示。

[0043] 对CX II的基因序列进行定点突变设计，将其第24位的碱基A突变为T，第519位的碱基T突变为A，第568-570位的碱基TAT突变为CCG，第678位的碱基T突变为A，获得如SEQ ID No.2所示的编码羰基还原酶CXP I的基因序列CX I。与此同时，对CX II通过定点突变额外获得另外四个基因序列CX III、CX IV、CX V、CX VI。然后委托杭州擎科生物进行基因合成，并进行密码子优化，共获得包含CX II在内的六条核苷酸序列。

[0044] 通过NCBI数据库的对比，本发明羰基还原酶的氨基酸序列与目前已知的乳杆菌属羰基还原酶（Lactobacillus sp.）的同源性在80%左右，请参考图1所示，图1展示了CXP I氨基酸序列与NCBI数据库中其他代表性羰基还原酶的区别，其中，“Lactobacillus”来自NCBI Reference Sequence: WP_035179998.1；PDB:1NFR_A、PDB:1ZJY_A、PDB:2HSD_A来自PDB数据库。进一步分析可知CXP I与其他羰基还原酶均具有典型的短链脱氢酶家族的2个功能域：辅酶结合域保守序列GXXXGXG及催化保守序列YXXXK（“X”代表任意一种氨基酸），可预期其具备羰基还原的效果。

[0045] 分别对上述CX I - CX VI六条基因分别连接在pET-28a(+)载体上，获得对应的重组质粒。图2展示了pET-28a-CX I重组质粒的图谱。将2μL重组质粒溶液加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30分钟后，45℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟后将菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养及平板上，37℃培养18小时后挑取单克隆菌落至4mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，220 rpm培养12小时，获得对应的六种羰基还原酶表达菌株。

[0046] 分别将上述六种表达菌株接入各自的4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，180 rpm培养12小时后，将菌液全部接种至600mL TB液体培养基中，37℃，180 rpm培养至OD600至2左右，加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，25℃诱导16h。然后5000 rpm离心
20分钟收集含羰基还原酶的菌体，将30g菌体用70g磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）重悬，超声破碎后即得到6种羰基还原酶粗酶液CXP I、CXP II、CXP III、CXP IV、CXP V、CXP VI。

[0047] 将上述6种粗酶液稀释适当倍数，与5×样品缓冲液以4:1（体积比）的比例混合后，100℃水浴中加热3-5min，使蛋白质充分变性，加样电泳。电泳完毕后，凝胶经染色脱色步骤获得酶蛋白电泳凝胶图。图3为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-CX I诱导表达后还原酶CXP I粗酶液的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准品，1号是诱导前的破碎上清液，2号是诱导后的破碎上清液，蛋白大小约29 kDa，与理论值相符。

[0048] 实施例2

[0049] 本实施例还提供了与SEQ ID NO.1所示序列同源性不低于90%的两条氨基酸序列SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，其基于CX-LAC II的CX II基因进行定点突变，突变规则应至少包括将第8位的K突变为N，第173位的D突变为E，第190位的Y突变为P，第226位的I突变为N。同时，突变时应保留辅酶结合域保守序列GATLGIG（CXP II氨基酸序列第14-20位）及催化保守序列YNASK（CXP II氨基酸序列第156-160位）。同时，需保留190-220位氨基酸残基，该区域在蛋白结构中形成环状结构，可用于与底物结合环。

[0050] 实施例3

[0051] 以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，利用实施例1获得的六种羰基还原酶粗酶液进行酶活实验。六种羰基还原酶的名称、核苷酸序列和对应突变位点如表1所示：

[0052]

[0053] 配制反应体系如下：50 mL体系：加入1g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，加入不同浓度异丙醇，40℃搅拌，加入2.4 g硫酸镁，130 mg NAD+，用磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0）定容至50 mL，加入1g粗酶液。反应24 h，高效液相色谱HPLC检测转化率及de值。结果如表2所示，可见CXP I 在60% (m/V)异丙醇浓度下可正常转化至底物几乎耗尽，且产物de值较高。而其他羰基还原酶虽也表现出优秀的de值，但在异丙醇浓度超过40% (m/V)时活性显著降低，导致转化率大幅下降甚至被酶活被完全抑制。

[0054]

[0055] 注：表中每格数据表示“转化率%/de值%”；“-”表示未检测；“-de值%”表示产物主要构型为RS型。

[0056] 对实施例2所述的CX VII和CX VIII两条核苷酸序列，采用前述相同的方法获得的羰基还原酶粗酶液，按照本实施例的试验方法验证其对高浓度异丙醇的耐受性，在不超过60% (m/V) 浓度异丙醇溶液的反应体系下进行酶催化反应，24小时后的转化率不低于95%，所述目标产物的de指不低于99.5%。

[0057] 实施例4

[0058] 本发明通过提供具备高浓度醇溶液耐受的羰基还原酶，从而提高了体系中异丙醇的投入量，其作为优秀的底物溶剂和辅因子再生循环的供氢体，可进一步提高底物浓度，促使转化率突破现有技术的极限，得以进一步提高。

[0059] 在1L催化体系中，加入80g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，2.4 g硫酸镁，60g葡萄糖，130 mg NAD+，再用碳酸钠溶液将pH调至7.0，40℃搅拌，加入20 g葡萄糖脱氢酶，4 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。反应用碳酸钠溶液维持pH 7.5左右，反应40h后，经检测反应体系中的仍残酸70%底物，转化率只有30%。

[0060] 转化过程中发现随着反应进行，由于底物和产物均难溶于水，后期体系中转化液流动性极差，难以搅拌，底物与酶接触面积变小，可能导致转化率偏低，因此考虑加入助溶剂。

[0061] 如在前述反应体系的基础上，进一步15%(m/V)不同类型的助溶剂（乙酸乙酯、吐温80、甲苯、DMSO、异丙醇其中一种）。反应用碳酸钠溶液维持pH 7.5左右，反应24h后，经检测加入乙酸乙酯和异丙醇反应体系效果最好，加入异丙醇体系转化率为51%，乙酸乙酯体系转化率55%，但上述两组反应24 h仍残留较多底物。

[0062] 转化过程中发现随着反应进行，由于底物和产物均难溶于水，且随着反应进行中需适时补加碳酸钠溶液以维持pH，使水相体积进一步扩大，同时稀释助溶剂浓度，因此仍有较多底物残留，因此放弃选用葡萄糖作为辅因子供氢转化工艺，考虑选用以异丙醇作为辅因子供氢。

[0063] 实施例5

[0064] 在1L催化体系中，加入80g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，200 g异丙醇，40℃搅拌，加入750 g磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 g硫酸镁，130 mg NAD+或NADP+，加入4 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，以及0.5%(v/v)乙酸乙酯，开始反应。反应24h后，经检测转化体系转化率为99.5%，产物de值大于99.9%。

[0065] 实施例6

[0066] 在1L催化体系中，加入200 g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，200 g异丙醇，40℃搅拌，加入750 g磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 g硫酸镁，
130 mg NAD+或NADP+，加入10 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。反应30h后，经检测转化体系转化率为54.9%，产物de值大于99.9%。通过对比实施例5与实施例
6可知，将底物浓度提高到200 g/L，20%异丙醇助溶效果明显变差，导致底物转化率偏低。

[0067] 实施例7

[0068] 在1L催化体系中，加入200 g (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，500 g异丙醇，40℃搅拌，加入450 g磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 g硫酸镁，
130 mg NAD+或NADP+，加入10 g上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。反应24h后，经检测底物转化率为99.5 %，产物de值大于99.9%。由此可知将异丙醇浓度提高至
50% (m/V)，底物几乎耗尽。

[0069] 实施例8

[0070] 在1000L催化体系中，加入200 kg (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮，500 kg异丙醇，40℃搅拌，加入450 kg磷酸钾或钠缓冲液（100 mmol/L，pH8.0），2.4 kg硫酸镁，130 g NAD+或NADP+，加入10 kg上述实施例1获得的羰基还原酶CXP I粗酶液，开始反应。图4为反应6 h液相图谱，图5为反应24 h液相图谱。反应24 h后，经检测转化体系转化率为99.5%，产物de值大于99.9%。