一种可用于疾病标志物检测的质谱免疫分析方法及应用转让专利
申请号 : CN201811441432.0
文献号 : CN111239402B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 白玉 , 徐姝婷 , 刘虎威
申请人 : 北京大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种检测非诊断目的的目标蛋白的质谱免疫分析方法,包括以下步骤:
1)将浓度为c1,c2,…,cn的标准蛋白样品和待测样品x1,x2,…,xm分别滴加在固定了识别单元的芯片表面进行目标蛋白识别和捕获,其中m、n为自然数,代表样品序号;
2)将步骤1)捕获到目标蛋白后的芯片浸入质谱标记探针的分散液中,利用质谱标记探针标记蛋白,所述质谱标记探针包括贵金属纳米粒子内核及通过巯基与贵金属形成M‑S键自组装在贵金属纳米粒子表面的核酸适配体和质谱信号分子,其中M代表贵金属元素,所述核酸适配体是5’端或3’端巯基修饰的核酸适配体,且能够特异性结合目标蛋白;所述质谱信号分子是分子量在1500Da以内,结构通式如式I所示的有机小分子:式I中,n为6‑15的整数,m为0‑8的整数,R为具有质谱增敏能力、分子量在50‑1000Da的基团;
3)利用芯片电喷雾离子化装置解离步骤2)处理后芯片上质谱标记探针中的质谱信号分子,并进行质谱检测;
4)在步骤3)的质谱结果中,以质谱信号分子或其碎片的质核比的平均信号强度T和相同时间内的内标物或其碎片的质核比的平均信号强度S的比值R=T/S作为定量依据,利用标准蛋白样品的检测结果获得线性方程,并计算待测样品中目标蛋白的浓度。
2.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,在步骤1)中,所述芯片为能够导电的固态薄片,其一端的形状是顶角为30°~60°的等腰三角形,在该等腰三角形中与两腰相切的圆形区域为蛋白捕获区域,在该区域内镀金并修饰上能够识别目标蛋白的识别单元;将一定体积的样品溶液滴加在所述蛋白捕获区域,在一定温度条件下孵育一段时间,然后清洗芯片,除去未识别成分。
3.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,步骤1)中所述识别单元为抗体或核酸适配体,通过共价连接固定在芯片表面。
4.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,在步骤2)中所述质谱标记探针中,所述贵金属纳米粒子是金纳米粒子或银纳米粒子,直径为20~30nm。
5.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,步骤2)中所述质谱标记探针采用“一锅反应法”制备:向贵金属纳米粒子的水溶液中先加入核酸适配体的水溶液,室温下避光反应10‑16h;再向该体系中加入质谱信号分子溶液,室温下避光反应10‑16h;离心洗涤,除去未结合的核酸适配体和质谱信号分子;制备过程中,贵金属纳米粒子与核酸适配体的摩尔比为1:50‑1:200,贵金属纳米粒子与质谱信号分子的摩尔比为1:1000‑1:10000。
6.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,在式I所示的质谱信号分子中,R基为下述a)至f)所述基团之一:
a)式II所示结构:
式II中,x为1‑5的整数,R1、R2、R3相同或不同,为C1~C4的短链烷基;
b)式III所示结构:
式III中,R1、R2、R3相同或不同,为C1~C4短链烷基;R4代表苯基上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;
c)式IV所示结构:
式IV中,R1代表吡啶基上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;式I中的酯基与式IV的连接位置在吡啶基的1N原子上,或者连接在2C、3C、4C、5C或6C位上;
d)式V所示结构:
式V中,R1代表喹啉基上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;式I中的酯基与式V的连接位置在喹啉基的1N原子上,或着连接在2C,3C,4C,5C,6C,7C或8C位上;
e)式VI所示结构:
式VI中,R1、R2相同或不同,为氢或C1~C4的短链烷基;R3代表苯基上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;式I中的酯基与式VI的连接位置在苯基的邻位、间位或对位;
f)式VII所示结构:
式VII中,R1、R2、R3、R4相同或不同,为氢或C1~C4的短链烷基;R5代表1C、3C和/或4C位上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;R6代表5C、7C和/或8C位上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;R7代表9C、10C、11C、12C或13C位上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;式I中的酯基与式VII的连接位置在苯基的9C、10C、11C、12C或13C位上。
7.如权利要求6所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,所述质谱信号分子的结构如式VIII、式IX或式X所示:
8.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,步骤3)中所述芯片电喷雾离子化装置为一种常压敞开式的质谱离子化装置,包括双层毛细管组成的电喷雾管,对准待测芯片上的蛋白捕获区域;芯片上质谱标记探针中的质谱信号分子在电喷雾管喷出的喷雾溶剂的作用下解离下来,进入质谱仪进行检测;所述喷雾溶剂中含有一定量的内标物,用于内标法定量。
9.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,步骤4)包括:
4‑1)在所获得的质谱图的总离子流色谱图中,分别提取质谱信号分子或其碎片的质核比的提取离子流色谱图,以及内标物或其碎片的质核比的提取离子流色谱图,获得每个芯片从检测开始持续一段时间的质谱信号分子或其碎片的质核比的平均信号强度Tc1,Tc2,...,Tcn和Tx1,Tx2,...,Txm,以及相同时间内的内标物或其碎片的质核比的平均信号强度Sc1,Sc2,...,Scn和Sx1,Sx2,...,Sxm;计算Tc与Sc的平均信号强度比值Rc:Rc1=Tc1/Sc1,Rc2=Tc2/Sc2,...,Rcn=Tcn/Scn;计算Tx与Sx的平均信号强度比值Rx:Rx1=Tx1/Sx1,Rx2=Tx2/Sx2,...,Rxm=Txm/Sxm;
4‑2)以c1,c2,…,cn为横坐标值,Rc1,Rc2,...,Rcn为纵坐标值作图,对图中数据点进行线性拟合,得到线性方程;
4‑3)将Rx1,Rx2,...,Rxm带入线性方程,计算得到待测样品中目标蛋白浓度x1,x2,…,xm。
10.如权利要求1所述的质谱免疫分析方法,其特征在于,利用该质谱免疫分析方法对多种目标蛋白同时进行检测,步骤1)中的芯片表面固定对应这些目标蛋白的多种识别单元,步骤2)中芯片浸入多种质谱标记探针等体积混合的分散液中,不同质谱标记探针表面结合的质谱信号分子质核比相差1以上。
说明书 :
一种可用于疾病标志物检测的质谱免疫分析方法及应用
技术领域
志物检测中的应用。
背景技术
为主的各种疾病的生物标志物,例如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等,为临床诊
断、病理分析和预后评估提供重要的参考指标。蛋白质分子的检测主要借助基于抗原抗体
相互识别的免疫分析方法,代表性的免疫分析方法为酶联免疫吸附测定(ELISA),即利用抗
原与抗体的特异性识别将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测
定。通常在免疫分析中,蛋白质的含量都会通过标记物信号来反应,常用的标记信号主要是
酶、荧光分子、化学发光剂、多种纳米粒子等,由此产生的信号能够通过荧光检测或电化学
检测等进行定量。该类免疫分析方法通常能够实现高灵敏、快速检测,但是也受到光漂白、
信号重叠、背景干扰等问题的限制,因此在信号稳定性、多目标检测及定量准确性等方面还
存在诸多限制。
应差、谱图解析困难等问题。将免疫分析与质谱检测相结合的质谱免疫的方法则充分结合
了两者的优势,一方面利用免疫分析将大分子蛋白质的检测转化为标记信号的检测,解决
蛋白质质谱检测灵敏度不足的问题,另一方面利用质谱定量准确、分辨率高的优势,能够同
时对多目标物进行定量分析。
需要具有经济型、可拓展性及普适性,能够用于快速、高灵敏、高通量的多蛋白免疫分析。文
献(R.Du,L.Zhu,J.Gan,Y.Wang,L.Qiao and B.Liu.Anal.Chem.,2016,88,6767‑6772和
J.R.Lee,J.Lee,S.K.Kim,K.P.Kim,H.S.Park and W.Yeo.Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,
9518–9521)中报道了目前典型的能够应用于质谱免疫方法的标记探针及质谱免疫分析方
法,然而由于探针需要借助激光实现解离,大大增加了质谱免疫的分析成本及仪器需求,同
时激光解离产生多种形式的信号,分散了标记信号的放大效果,影响检测灵敏度。文献
(S.Chen,Q.Wan and A.K.Badu‑Tawiah.J.Am.Chem.Soc.,2016,138,6356‑6359)中报道了
能够利用化学手段解离的标记探针及成本低廉的纸喷雾免疫方法,但该探针结构单一、制
备复杂、可拓展性不强,而且信号放大效果不佳,使得该质谱免疫方法不能满足目前临床诊
断中的检测灵敏度的需求。
发明内容
性高、检测装置简单、检测灵敏度高的质谱免疫分析方法,能够实现血清等实际样品中蛋白
标志物的快速、高灵敏的分析。
处理等步骤,具体如下:
S键(M=Au,Ag等贵金属)自组装在贵金属纳米粒子表面的核酸适配体及质谱信号分子;
作为定量依据,利用标准蛋白样品的检测结果获得线性方程,并计算待测样品中目标蛋白
的浓度。
定温度(如37℃)条件下孵育一段时间(通常为30min‑1h);孵育后清洗芯片,以除去未识别
成分,其中清洗芯片通常采用磷酸盐缓冲溶液。对于样品中目标蛋白标志物含量测定,需要
测定的样品通常包括:将蛋白质标准品溶于磷酸盐缓冲溶液后配制的一系列浓度c1,c2,…,
cn的标准溶液,可选5‑10种浓度的标准溶液,每种浓度不少于三个平行样品;待测样品x1,
x2,…,xm,每种浓度不少于三个平行样品。
需求,将薄片上与该等腰三角形两腰相切的圆形区域作为蛋白捕获区域,在该区域内通过
粒子溅射、电化学沉积等方式镀金并修饰上能够识别目标蛋白的识别单元,优选的识别单
元例如抗体、核酸适配体等等。
原子以上的巯基烷酸,浓度为0.1‑10mg/mL,避光放置12h以上;清洗后再将该区域浸泡在N‑
(3‑二甲氨基丙基)‑N’‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)的混合溶液
中,两者浓度均为10‑50mg/mL,且EDC浓度不低于NHS浓度,反应30min;清洗后将该区域浸泡
在抗体的磷酸盐缓冲溶液中,4℃孵育12h以上,将抗体共价结合在芯片上,优选的抗体固定
浓度为0.1mg/mL。对于核酸适配体固定,优选5’端或3’端HS‑(CH2)6‑巯基修饰核酸适配体,
可以是脱氧核糖核酸适配体或核糖核酸适配体,将镀金区域浸泡在核酸适配体的三羟甲基
氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液中,4℃孵育12h以上,将核酸适配体共价结合在芯片上,优选的核
酸适配体固定浓度为50μmol/L。蛋白捕获芯片可以先行制备,并在4‑8℃条件下保存备用。
用磷酸盐缓冲溶液清洗芯片,再用水清洗芯片,以除去未结合成分,清洗后晾干以备质谱检
测。
粒子表面的核酸适配体及质谱信号分子。
再向该体系中加入质谱信号分子溶液(质谱信号分子预先溶解于其非质子型良溶剂中,例
如乙腈),室温下避光反应10‑16h;离心洗涤3‑5遍,除去未结合的适配体和质谱信号分子;
最后将纳米粒子分散在磷酸盐缓冲溶液中。
通过柠檬酸三钠和硼氢化钠还原硝酸银的方法,纳米粒子粒径优选为20nm‑30nm。
适配体可预先与1mg/mL的三氯乙基磷酸酯溶液室温下避光反应1‑12h,还原易被氧化的巯
基。贵金属纳米粒子与核酸适配体的摩尔比可选择为1:50‑1:200。
氨基、二乙氨基)等电正性基团或强质子亲和基团中的一种或多种,并优选为具有芳环共轭
结构的分子基团。
醇链组成的链状结构,能够提高信号分子在纳米粒子表面自组装的效率,增加信号分子在
纳米粒子表面的结合数量;结构另一端为通过酯键连接的R基结构。
酯基与式III的连接位置可以在苯基的邻位、间位或对位;R4的连接位置可以在苯基上其他
未取代位点。
3C、4C、5C或6C位上,R1的连接位置可以在吡啶基上未取代N原子上或其他未取代C原子上。
4C,5C,6C,7C或8C位。R1的连接位置可以在喹啉基上未取代N原子上或其他未取代C原子上。
可以在苯基的邻位、间位或对位,R3的连接位置可以在苯基上其他未取代位点。
7C和/或8C位上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基;R7代表9C、10C、11C、12C或
13C位上的一个或多个取代基,为氢或C1~C4的短链烷基。式I中的酯基与式VII的连接位置
可以在苯基的9C、10C、11C、12C或13C位上。
实现,大量质谱信号分子自组装在贵金属纳米粒子上标记在每个目标蛋白上,制备过程中,
纳米粒子与质谱信号分子的摩尔比为可选择为1:1000‑1:10000。二级放大通过质谱信号分
子在质谱源内碰撞诱导裂解实现,质谱信号分子在质谱源内碰撞诱导裂解中均在酯键位置
发生断裂,碎裂产生R基碎片,进一步聚集质谱标记信号。
多蛋白目标物的同时标记和检测。
纳米粒子、核酸适配体和质谱信号分子制备的摩尔比为1:120:5000。
值,等待质谱信号稳定,将晾干后的待测芯片放置在芯片轨道上,芯片排成一列,尖端朝向
一致,均朝向质谱入口,通过轨道运动将芯片传送至质谱入口前的固定位置,记录芯片检测
过程中的质谱数据,每个芯片的检测过程在2min内完成。需要测定的样品包括:标准蛋白
c1,c2,…,cn的一系列浓度标准溶液,依次按照步骤1)、步骤2)操作制备的待测芯片,每个浓
度的芯片不少于三个;待测样品x1,x2,…,xm依次按照步骤1)、步骤2)操作制备的待测芯片,
每个浓度的芯片不少于三个。
殊化学试剂的辅助。质谱信号分子在解离和质谱源内碰撞诱导裂解后,能产生多步信号放
大的效果。该装置在检测中包括以下主要参数:电压值可选2kV‑4kV,鞘气压力可选0.1‑
0.5MPa,溶剂流速可选1‑15μL/min,溶剂种类可选甲醇/乙腈/水按比例混合并添加一定浓
度的甲酸、乙酸或氨水等,电喷雾管2距离蛋白检测区域的垂直距离可选2‑6mm,芯片尖端距
离质谱入口的水平距离可选0‑4mm,源内裂解电压值可选0‑100V。
开的化合物,例如,采用R基如式VII所示的式I分子为质谱信号分子时,可选择的内标物为
结晶紫、甲基紫等化合物,内标物在喷雾溶剂中的浓度可选0.05‑0.5μmol/L。获得的质谱图
中,质谱信号分子或其碎片的质核比为待测样品信号,内标物质或其碎片的质核比为内标
信号。
雾管距离蛋白检测区域的垂直距离设为0,芯片尖端距离质谱入口的水平距离设为2.5mm,
源内裂解电压设为100V。在获得的质谱图中,质谱信号分子式VIII产生的质核比为m/z=
443.2,内标物结晶紫产生的质核比为m/z=340.2。
测定值,用于定量分析;对于一种目标蛋白,对所有标准溶液和待测样品所取平均信号强度
时间相同。质谱信号分子或其碎片的质核比在所取平均信号强度的时间终点已回到基线
值,而内标物或其碎片的质核比在检测过程中信号保持稳定。数据分析具体包括:
个芯片从检测开始持续一段时间(如1min)的质谱信号分子或其碎片的质核比的平均信号
强度(Tc1,Tc2,...,Tcn;Tx1,Tx2,...,Txm),和相同时间内的内标物或其碎片的质核比的平
均信号强度(Sc1,Sc2,...,Scn;Sx1,Sx2,...,Sxm)。计算Tc与Sc的平均信号强度比值Rc:Rc1
=Tc1/Sc1,Rc2=Tc2/Sc2,...,Rcn=Tcn/Scn;计算Tx与Sx的平均信号强度比值Rx:Rx1=Tx1/
Sx1,Rx2=Tx2/Sx2,...,Rxm=Txm/Sxm。
选择的质谱信号分子种类繁多,且由于质谱的高质量分辨率,质核比有微小差异的质谱信
号分子都能够在质谱图的轻易分开,各信号之前不会相互干扰,因此确保了本发明中的质
谱免疫分析方法在多蛋白标志物同时检测中的应用。
片需浸入多种质谱标记探针等体积混合的分散液中,不同质谱标记探针表面结合的质谱信
号分子质核比相差1以上。例如使用R基如式VII所示的式I分子系列物作为质谱信号分子,
其中n=11,m=0,R1~R7使用不同基团。
在质谱检测过程中离子化效率低、质谱响应低的问题;通过质谱标记探针标记蛋白质分子,
使大量的质谱信号分子标记在一个蛋白质分子上,在数量上放大了检测信号;通过质谱检
测中的源内诱导裂解实现一种质谱信号分子解离后多种质核比形式的汇集,进一步实现放
大信号的聚集。
面的高效解离,装置结构简单,成本低廉。采用自动化控制的样品轨道,能够实现大量样品
芯片的快速、高通量筛查。
附图说明
具体实施方式
1.5mm圆形区域中利用离子溅射沉积了20nm厚的金层作为蛋白捕获区域。
=7.4,含100mmol/L氯化钠和5mmol/L氯化镁)中,适配体序列为:5’‑SH‑(CH2)6‑GTG GTT
GGT GTG GTT GG‑3’(SEQ ID No:1)。在湿润环境下,4℃避光孵育16h,孵育后用三羟甲基氨
基甲烷‑盐酸缓冲溶液洗涤两次,除去未结合的适配体。制备得到用于凝血酶测定的芯片备
用。
SH‑(CH2)6‑GTA GCC GTG GTA GGG CAG GTT GGG GTG ACT‑3’(SEQ ID No:2),室温下避光
反应16h。在向体系中加入100μL浓度为100μmol/L的质谱信号分子乙腈溶液,质谱信号分子
结构如式Ⅱ所示。室温下继续避光反应12h。6000rpm离心15min,弃去上清液,再分散在水
中,离心洗涤2次,最后分散在2mL磷酸盐缓冲溶液(10mmol/L,pH=7.4)中,制备得到特异性
识别凝血酶的质谱标记探针,备用,制备得到的质谱标记探针的透射电子显微镜图片见图
3。
2μL待测样品:6个标准蛋白溶液,3个待测血浆样品,1个空白对照磷酸缓冲溶液,每个样品
平行滴加在3个芯片上,在湿润环境下,37℃避光孵育1h。用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次,除去
未结合成分。
使用添加0.1%甲酸的甲醇溶液,流速设为5μL/min,电喷雾管距离蛋白检测区域的垂直距
离设为0,芯片尖端距离质谱入口的水平距离设为2.5mm,源内裂解电压设为100V。在喷雾溶
剂中添加0.12μmol/L的结晶紫作为内标。
算。对于1fmol/L‑100pmol/L的标准凝血酶蛋白溶液,在标准凝血酶蛋白溶液浓度10fmol/
L‑100pmol/L之间,信号强度比值与浓度对数呈现线性关系,Rc=0.572lg c(fmol/L)‑
2
0.353(R =0.998)(图5),将血浆样品测定结果的Rx值带入方程计算得到三个血浆样品中
凝血酶含量为104fmol/L,185fmol/L,96fmol/L。
度50mg/mL的EDC水溶液中,室温反应30min,去离子水清洗一遍,将该区域浸在2μL浓度为
0.1mg/mL的anti‑CA125的磷酸盐缓冲溶液中,4℃避光孵育12h,再用磷酸盐缓冲溶液洗涤
两次得到抗体固定的芯片,备用。
CCC GCG‑3’(SEQ ID No:3),其余步骤与实施例1(1)中相同,得到质谱标记探针,备用。
品:6个标准蛋白溶液,3个待测血清样品,1个空白对照磷酸缓冲溶液,每个样品平行滴加在
3个芯片上,在湿润环境下,37℃避光孵育1h。用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次,除去未结合成
分。
L的结晶紫作为内标。
在标准CA125蛋白溶液浓度0.2U/mL‑40U/mL之间,信号强度比值与浓度呈现线性关系,Rc=
2
0.0322c(U/mL)+0.198(R=0.995)(图6),将血清样品测定结果的Rx值带入方程计算得到
三个血清样品中CA125含量为13.8U/mL,30.2U/mL,38.0U/mL。
去上清液,再加水分散离心洗涤两次,最后分散在2mL水中。将分别修饰了式VIII、式IX、式X
的金纳米粒子分散液按照体积比1:1:1混合。
分子能够清晰分辨,其中,式VIII的质谱信号为m/z=443.2、式IX的质谱信号为m/z=
387.2、式X的质谱信号为m/z=415.2,三种信号相互之间无信号干扰,满足多蛋白标志物同
时检测的需求。