模仿淋巴结的解剖和生理结构的微流体装置及芯片实验室转让专利
申请号 : CN201880064025.4
文献号 : CN111246941B
文献日 : 2022-01-04
发明人 : 杰里米·西蒙·提欧 , 切萨雷·斯特凡尼尼 , 阿玛·阿卜杜拉 , 比森·萨马兰 , 阿雅·香提
申请人 : 哈利法科学技术大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于模仿淋巴结的解剖和生理结构的微流体装置,包括:对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域的第一通道;以及对应于淋巴结的网状网络的第二通道,与所述第一通道相邻;
位于所述装置内中心的对应于淋巴结副皮质的下空腔;
位于所述装置内中心的对应于淋巴结的滤泡的上空腔;其中所述下空腔和所述上空腔被水平成排的微柱隔开,所述第一通道和所述第二通道被第一组圆形分布的微柱隔开,并且所述第二通道通过第二组圆形分布的微柱与所述上空腔和所述下空腔隔开;
入口孔和出口孔,其中所述入口孔和所述出口孔允许将流体注入到所述装置内并通过所述装置;以及
实心的半圆形突起,位于所述入口孔和所述上空腔之间并限定所述上空腔的顶部边界,其中所述半圆形突起的直径与所述水平成排的微柱的长度相同,并且所述微柱和所述半圆形突起的布置降低了流体从所述上空腔和所述下空腔体中入口孔流出的速度。
2.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述装置在所述第一通道、所述第二通道、所述上空腔和所述下空腔中直接填充有细胞成分。
3.根据权利要求1所述的微流体装置,还包括用于将所述装置密封至支撑基座的外表面。
4.根据权利要求3所述的微流体装置,其中所述支撑基座是玻璃支撑基座。
5.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述装置由选自由玻璃、硅、聚硅氧烷、光学透明的聚合物组成的组中的材料制成。
6.根据权利要求5所述的微流体装置,其中所述聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
7.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述第一通道的宽度小于所述第二通道的宽度。
8.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述微柱的直径至少为0.45毫米。
9.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述微柱的高度为1.5毫米。
10.根据权利要求1所述的微流体装置,其中水凝胶分别包含在所述装置的所述第一通道、所述第二通道、所述下空腔和所述上空腔内。
11.根据权利要求10所述的微流体装置,其中所述水凝胶是I型胶原水凝胶。
12.根据权利要求1所述的微流体装置,其在所述上空腔中具有B细胞,并且在所述下空腔中具有T细胞。
13.根据权利要求1所述的微流体装置,其中从微柱到微柱的间隔为0.2毫米。
14.根据权利要求1所述的微流体装置,还包括半圆形内壁。
15.根据权利要求1所述的微流体装置,其中所述第一通道沿着所述半圆形内壁定位。
16.根据权利要求6所述的微流体装置,其中所述上空腔和所述下空腔中的水凝胶是细胞外基质,其包含B细胞和T细胞组织所需的趋化因子。
17.根据权利要求16所述的微流体装置,其中所述趋化因子选自CXCL13、CXCL12、CCL21和CCL19或其组合。
18.一种包括用于模仿淋巴结的解剖和生理结构微流体装置的芯片实验室,其中所述微流体装置包括:
对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域的第一通道;
对应于淋巴结的网状网络的第二通道,与所述第一通道相邻;
位于所述装置内中心的对应于淋巴结副皮质的下空腔;
位于所述装置内中心的对应于淋巴结的滤泡的上空腔,其中所述下空腔和所述上空腔被水平成排的微柱隔开,所述第一通道和所述第二通道被第一组圆形分布的微柱隔开,并且所述第二通道通过第二组圆形分布的微柱与所述上空腔和所述下空腔隔开;
入口孔和出口孔,其中所述入口孔和所述出口孔允许将流体注入到所述装置内并通过所述装置;
实心的半圆形突起,位于所述入口孔和所述上空腔之间并限定所述上空腔的顶部边界,其中所述半圆形突起的直径与所述水平成排的微柱的长度相同,并且所述微柱和所述半圆形突起的布置降低了流体从所述上空腔和所述下空腔体中入口孔流出的速度;以及玻璃支撑基座。
19.根据权利要求18所述的芯片实验室,所述微流体装置密封至所述玻璃支撑基座。
20.根据权利要求18所述的芯片实验室,其中所述微流体装置由选自玻璃、硅、聚硅氧烷和光学透明聚合物的材料制成。
21.根据权利要求20所述的芯片实验室,其中所述聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
22.根据权利要求18所述的芯片实验室,其中所述第一通道的宽度小于所述第二通道的宽度。
23.根据权利要求18所述的芯片实验室,其中所述微柱的直径为至少0.45毫米。
24.根据权利要求18所述的芯片实验室,其中所述微柱的高度为1.5毫米。
25.根据权利要求18所述的芯片实验室,其在所述上空腔中具有B细胞,并且在所述下空腔中具有T细胞。
26.根据权利要求18所述的芯片实验室,其中从微柱到微柱的间隔为0.2毫米。
27.根据权利要求18所述的芯片实验室,其中所述上空腔和所述下空腔中的水凝胶是细胞外基质,其包含B细胞和T细胞组织所需的趋化因子。
28.根据权利要求27所述的芯片实验室,其中所述趋化因子选自CXCL13、CXCL12、CCL21和CCL19或其组合。
说明书 :
模仿淋巴结的解剖和生理结构的微流体装置及芯片实验室
技术领域
背景技术
统:先天免疫系统和适应性免疫系统。天生的免疫系统构成第一道防线;它对抗原类型具有
非特异性,包括:1)物理屏障,例如皮肤;2)化学防御,例如胃中的酸;以及3)吞噬性白细胞,
例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤细胞诱导的细胞攻击。另一方面,适应性免疫系统
对抗原类型具有特异性,并且包括称为T细胞和B细胞的淋巴细胞。与抗原接触后立即激活
的先天免疫系统不同,适应性免疫系统在新近遇到的情况下需要一定的时间才能对病原体
做出反应。尽管先天性免疫系统和适应性免疫系统看起来可能不同或极为不同,但是它们
紧密地联系在一起。某些类型的抗原呈递细胞,即巨噬细胞和树突状细胞(DC)介导两个子
系统之间的相互作用。DC将抗原呈递给T细胞,从而激活它们。活跃的T细胞又触发B细胞,导
致产生可以破坏病原体的抗原特异性抗体。DC与T细胞的接触及其随后的相互作用通常发
生在淋巴结中,淋巴结是椭圆形的器官,分布在整个淋巴系统中,可以作为过滤器从体内清
除异物和癌细胞。
促进它们之间的相互作用。淋巴结的基本功能和解剖单位是淋巴小叶。淋巴结由多处淋巴
小叶组成,周围被充满液体的鼻窦包围,并被囊包封。淋巴小叶有两个主要腔室:滤泡和副
皮质。滤泡容纳B细胞,而副皮质容纳T细胞和DC。淋巴结内淋巴细胞和DC的定位和组织主要
受趋化因子、粘附分子和细胞外基质(ECM)蛋白控制。淋巴结环境可最贴切地描述为几乎没
有ECM的密集细胞环境。淋巴结的ECM排列成一个开放的网状纤维系统,称为网状网络。副皮
质的网状网络比滤泡中的网状网络更密集。它为APC‑淋巴细胞相互作用提供结构支持和指
导。网状纤维主要由I型胶原和III型胶原组成,并通过β1整联蛋白支持一层称为成纤维网
状细胞(FRC)的基质细胞的附着。FRC包裹着网状纤维,并通过紧密的结合复合物彼此结合,
形成“活的基质”,T细胞和DC粘附在其上。FRC覆盖了大约90%的网状纤维,其组织产生了一
个导管系统,该导管系统充当过滤器,小的可溶性抗原(<70 kDa)可以在其中穿过。FRC不仅
是结构支持,因为它们在促进淋巴细胞迁移和调节T细胞活化中起着至关重要的作用。由于
在淋巴结内,细胞会爬行但无法游泳,因此需要一条行进的道路,因此,已知是淋巴细胞粘
附受体配体的ECM蛋白在FRC的外表面表达。此外,网状纤维的间距和方向极大地影响淋巴
细胞的迁移速率。
部,B细胞堆积在滤泡DC(FDC)中,形成密集的网络,B细胞在其中搜寻抗原。遇到抗原时,B细
胞不会立即受到刺激。相反,它们会随着时间积累抗原,提示“多轮抗原获取”。DC是APC,其
识别和处理来自组织的抗原,并将其呈递给淋巴结中的T细胞。与淋巴结相关的DC可以分为
两大类:常驻DC和迁移DC。常驻细胞位于紧邻FRC导管的淋巴结的T细胞区(副皮质)。他们迅
速从淋巴液中吸收可溶性抗原,并将其呈递给淋巴细胞。另一方面,迁徙DC通过携带高浓度
加工抗原的传入淋巴管从组织到达淋巴结。然后将它们定位在HEV附近,以增加遇到幼稚淋
巴细胞的可能性。
窦:被膜下淋巴窦(SCS),小梁窦,髓质淋巴窦,通过这些窦得到清洁,最后通过传出淋巴管
将淋巴结留在肺门处。FRC位于SCS附近,它们可以在那里捕获抗原并将抗原从淋巴液转运
到附近的APC。特别地,淋巴结通常具有一个传出管和多个传出管。这使淋巴结可以充当“沉
淀池”,为淋巴细胞提供足够的时间来识别抗原并与APC相互作用。
AstraZeneca, Eli Lilly, GlaxoSmithKline and Pfizer公司的企业内部研究的结论是,
尽管改进的分析方法和实验方法提高了药物代谢和药代动力学特征,但由于功效和安全性
而导致的失败仍维持损耗率。已通过并被认为具有商业利润的药物估计开发成本为17亿美
元。在开发链中一个被忽视的关键方面是候选药物对我们免疫系统的影响。缺乏对此方面
的深入研究,并且它可能会通过大量了解我们对药物的免疫生理学的机理来释放大量知
识,以节省高成本并降低损耗率。
潜在的副作用并限制发现。另外,当前药物领域的最新革命也是药物工业中的最新支柱,是
使用免疫细胞进行基于细胞的药物递送,这比许多其他递送系统优越,并且具有广泛的适
用性。类似地,需要对这种修饰的免疫细胞进行进一步的评估,因为引入细胞载体以递送药
物可能会破坏自然的生理状况或加剧已经患病的组织。
生物学研究,以降低试剂成本并最大化来自珍贵样品的信息,同时在其微环境中提供细胞
的时空动态。
“人工免疫系统”(US 8288159 B2)中。William Warren等人介绍了一个完整的人工免疫系
统,该系统包括三个等效组织:a)等效皮肤b)等效淋巴组织和c)等效血管网络,所有这些均
被封闭在具有受控环境的生物反应器中。通过磁性微珠和纳米珠控制细胞(主要是树突细
胞)从一种等效组织到另一种等效组织的运动。但是,添加微/纳米珠可能会人为地引起不
必要的免疫反应,并可能最小化该系统在机理研究中的有效性。对于等效的淋巴组织,提出
了以下设计:(1)使用BioAssembly Tool的数字印刷淋巴结的模型图像,其中通过微球释放
T和B细胞引诱剂来维持不同的T和B细胞区域,以及(2)封闭在多孔容器中的T和B细胞填充
的微载体。尽管第一种设计的方法,即生物打印是很有前途的,但使用微球来引导T细胞和B
细胞的组织可能会诱导不必要的免疫反应,从而影响系统的保真度。另一方面,第二种设计
并未紧密模仿体内淋巴结的解剖结构,并且由于它们位于微载体上,似乎限制了不同细胞
类型之间的相互作用。
个3D生发中心(包含毛囊DC、B细胞和T细胞)嵌入或固定在工程组织构造中组成,该组织构
造可以由胶原蛋白、明胶、透明质酸或其他ECM材料制成。他们的方法包括将载有抗原的滤
泡DC置于含有幼稚淋巴细胞的工程组织结构中,以诱导免疫反应。但是,该系统具有许多缺
点。首先,缺少淋巴结的重要成分,如被膜下淋巴窦、网状网络和副皮质、淋巴结滤泡。结果,
US 8,003,387 B2仅限于体液免疫反应的研究,而不是细胞介导的免疫反应的研究。其次,
将载有细胞的抗原手动放入等效淋巴样器官中,在本例中为GC,而在体内,抗原则通过淋巴
液进入淋巴结,并且在淋巴结的整个过程中它们可能被淋巴细胞捕获,随后开始免疫反应。
第三,在US 8,003,387 B2中公开的发明限于静态条件并且不支持流动。
内部结构,该内部结构限定从一个或多个入口延伸到一个或多个出口的一个或多个流体连
通路径。该模型还包含小阀门,以确保流体的单向流动。然而,对于已经通过外科手术切除
了淋巴结并且由于流体引流减少而最终导致水肿的患者,该模型已被提议作为其实际体内
淋巴结的替代。因此,该模型具有维持淋巴液的生理流速的功能,并且不包含任何细胞成
分。
养,然后对其进行灌注、充氧和喂养。生物反应器中有两个由双层膜隔开的连续灌流的细胞
培养室。尽管其具有潜力,但是该模型并未紧密模仿天然淋巴结的解剖结构,因此破坏了细
胞的免疫能力。
疫反应来防御异物,因此有必要开发一种淋巴结的体外模型,以密切模拟其微环境,从而促
进细胞间相互作用和免疫反应的机理研究,从而为新开发药物的功效、效率和毒性提供更
好的可预测性。
发明内容
体装置模仿淋巴结的解剖和生理结构。
应于淋巴结的滤泡
中微流体装置模仿淋巴结的解剖和生理结构。
结的副皮质,而位于中心的上空腔对应于淋巴结的滤泡。
附图说明
述,可以更好地理解本发明的发明。通过以下结合附图的详细描述,本发明的前述和其他方
面、特征和优点将变得清楚,其中:
具体实施方式
用相同的附图标记指代相同或相似的部件。参考所描述的附图的方向,使用诸如“顶部”、
“底部”、“正面”、“背面”、“前导”、“尾随”等方向性术语。因为本发明的实施例的组件可以以
许多不同的方向定位,所以方向术语是用于说明的目的,绝不是限制性的。应当理解,在不
脱离本发明的范围的情况下,可以利用其他实施例,并且可以进行结构或逻辑上的改变。因
此,以下详细描述不应被视为限制性的。
限制本发明。此外,本领域技术人员可以想到的本发明的各种应用及其修改也被本文描述
的一般概念所涵盖。
选定的细胞类型,特别是在人淋巴结中发现的对免疫至关重要的B细胞和T细胞。如所公开
的微流体装置允许在淋巴结模型内有足够量的气体交换以维持细胞活力。另外,所公开的
微流体装置是耐用的、坚固的并且操作非常稳健。
养的细胞,并且提供了创建精确且精心控制的化学引诱剂梯度的能力,可以用于在短期内
研究小分子微生物种群的运动性、趋化性和对抗生素产生抗药性的能力。
一通道(204)相邻的第二通道(206),其中第一通道(204)和第二通道(206)由圆形分布的微
柱(208)隔开、下空腔(210)和上空腔(212)位于装置(200)中心,其中下空腔(210)和上空腔
(212)被水平的成排微柱(214)隔开。微流体装置(200)的内壁(202)可以具有其他形状,例
如圆形、半圆形、椭圆形。
二通道(206);其中第一通道(204)和第二通道(206)由圆形分布的微柱(208)隔开,下空腔
(210)和上空腔(212)位于装置(200)的中心,其中下空腔(210)和上空腔(212)由水平的成
排微柱(214)隔开。
如第一通道(204)对应于淋巴结(100)的被膜下淋巴窦区域(108),其中大的抗原(> 70KDa)
应在其中流动。装置(200)的第二通道(206)对应于淋巴结(100)的网状网络(110)。第二通
道(206)充满特定的多孔细胞外基质,其能够捕获少量可溶性抗原,并促进迁移性DC从淋巴
液向淋巴细胞迁移。细胞外基质包括水凝胶、蛋白质或蛋白质组合,例如胶原I、胶原III、胶
原IV、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白‑1、腱生蛋白、玻连蛋白和硫酸肝素。
(214)隔开。上空腔(212)是B细胞驻留的地方,下空腔(210)是T细胞和DC驻留的地方。这两
个空腔(210、212)中的每个空腔都将被特定的细胞外基质填充,并将包含B细胞和T细胞组
织/组装所需的特定趋化因子(与B细胞组装相关联的化学引诱剂:CXCL13和与T细胞组装相
关联的化学引诱剂:CXCL12,CCL21和CCL19)。
(218)允许流体流过微流体装置(200)。
和/或引导具有不同组成和浓度的各种流体、固体或气体材料。通过PDMS微柱(208、214)实
现不同区域之间的物理分离,以允许不同组分的结合和相互作用,同时保持它们的分离。
是大约0.2mm。由半圆形内壁所限定的主体(202)的直径约为1.1cm。
使得可以实现活性的实时或记录成像,以便监测和研究体外淋巴结环境内特定生物学相互
作用的活性,例如对APC‑淋巴细胞相互作用的研究。可以将水凝胶放置在微流体装置(200)
的各个隔室内,包括第一通道(204)、第二通道(206)以及位于中心的下空腔(210)和上空腔
(212)。这可以通过在密封装置之前将水凝胶直接放置在所需的隔室中来实现。
变、修改、变化以及其他用途和应用被认为被本发明覆盖。
发明中,发明人假设淋巴结的大小固定,不包括装置壁在内大约为1.1cm。然而,使用者仍然
可以改变流速以类似于期望的状况,这等同于体内淋巴结中改变的淋巴液流入。使用者可
以增加装置中的流速以研究炎症期间的细胞反应。
体装置。制造的第一步是将CAD设计转换为G代码,这是一种数控编程语言,主要用于计算机
辅助制造中以控制自动化机床。G代码依次引导自动化机器将所需的设计(具有所需的隔室
和通道)蚀刻到聚四氟乙烯(PTFE)零件上,生成PTFE模具,然后将其用于制造基于PDMS的微
流体装置。图2B示出了基于PDMS的微流体装置,其描述了对应于体内淋巴结的各个隔室。使
用CN‑MAX 80‑45机器(TEA Technology Engineering Automation SRL,比萨)完成PTFE模
具的制造,该过程涉及四个主要步骤:1)将机器的铣刀(切割装置)放置在PTFE片的中心;2)
使用专用铣刀对PTFE片的表面进行平滑处理(以防止将PDMS倒入模具后在PDMS中形成空隙
或其他缺陷);3)用0.45毫米钻头刺破孔产生立柱;4)使用合适的铣刀制作“D”形截面和设
计的外壁,然后制造PTFE模型。
特定温度下加热。PDMS硬化后,将其从模具中取出。在PDMS块上获得了微通道的副本。然后
用氧等离子体处理PDMS装置,以将其表面从疏水性转变为亲水性,并支持水凝胶的粘附。将
嵌入选择的水凝胶中的期望细胞成分填充在装置的不同隔室中。然后,使用玻璃底座密封
装置,并使用无菌机械螺钉将其拧紧,以形成完全的密封。
的流速。
第二通道的隔室中分别注入介质以增湿环境并增强气体交换以维持细胞活力。然后将装置
中的不同位置以5倍成像。
使用以下公式计算连续切片之间每个细胞所经过的距离:
个成像过程中都保持着变化的速度,并且速度没有下降,表明这些细胞是有活力的,并且没
有发生凋亡。此外,将细胞与培养基一起放置在装置内,孵育24小时,并通过流式细胞术分
析定量其活力。结果表明,细胞在整个过程中保持活力,细胞死亡率不到9%。这证明了装置
本身的材料以及水凝胶填充、流动注射和成像的整个过程对于细胞都是安全的。
素/分钟为单位的B细胞的平均速度图可以看出,该速度没有下降到零,表明该细胞是有活
力的,并且处于连续运动中。
速和压力。
度将急剧下降。请注意,在装置的大多数部分中,速度是低到中等的。实际上,该装置的几何
形状设计为降低了上空腔和下腔(细胞区域)中流动的速度,如图所示,从而为细胞提供了
更多与同该流一起加入的物质相互作用的时间。
璃形成化学键。因此,流体被迫通过凝胶移动。该结果被实验证实了,除了观察到颗粒以3D
形式在整个凝胶中移动以外,还观察到一些纳米颗粒被困在凝胶中。
的所有细胞。
疫细胞;例如B细胞、T细胞和DC。此外,根据进行的测试,该装置可以进行足够量的气体交
换,并且可以轻松消毒以维持细胞活力并防止细胞死亡。此外,由于它可以安装在标准载玻
片中,因此可以进行实时成像,并且其设置不会分散显微镜光,从而可以产生高质量的图
像。最终,该装置耐用、坚固并且操作非常稳健,可重现,使用户友好。
预测药物在临床前和临床试验中成功的能力。因此,这既节省时间又节省成本。此外,它将
为无数免疫学应用铺平道路,从而导致生物医学研究的不断发展。
导,各种变化都是可能的。选择和描述实施例是为了最好地解释本发明的原理及其实际应
用,从而使本领域的其他技术人员能够最好地利用本发明并且具有各种修改的各种实施例
适合于预期的特定用途。应当理解,因为情况所需或权宜之计可以考虑各种省略和等同替
换,但是这种省略和替换旨在覆盖本申请或实施方式,而不背离本发明的精神或范围。