一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202010102128.4
文献号 : CN111257554B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 杨婷 , 王怡婷 , 王建华
申请人 : 东北大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在于,所述荧光免疫探针的制备方法包括以下步骤:
(1)g‑C3N4粉末的合成:将1‑5g双氰胺于氧化铝坩埚中,盖上盖子并用铝箔纸包裹密封,‑1
放入马弗炉中,以3℃min 的速度升温至550℃并保持2h;待反应物冷却至室温取出,所得淡黄色固体即为g‑C3N4,用玛瑙研钵将所述g‑C3N4研磨成均匀固体粉末,备用;
(2)硼酸修饰:取4‑羧基苯硼酸和HBTU于无水DMF中,搅拌使其溶解,并在50℃下继续搅拌30‑60min,得到混合物;随后向所述混合物中加入所述g‑C3N4和DIEA,50℃下继续搅拌12‑
16h完成反应;将反应后的产物离心收集,并依次用无水乙醇和二次水各清洗2‑3次,60℃下烘干得BCN;
(3)用超声辅助液体剥离法将所述BCN剥离成BCN纳米片BCNNS:取所述BCN于锥形瓶中,‑1
加入二次水配成浓度为1mg mL 的悬浮液;之后连续超声10h;随后将超声所得奶白色悬浮液在3000rpm转速下离心15min,收集上清;将所述上清在14000rpm转速下离心10min,收集‑1
沉淀,即为BCNNS;将所述BCNNS冷冻干燥后称重,配成0.2mg mL 的BCNNS分散液,备用;
‑1
(4)抗体标记:将抗体用含0.5‑2%BSA的PBS溶液稀释至10‑100μg mL ,且所述含0.5‑‑1
2%BSA的PBS溶液的pH为7.2‑7.6,取50μL所述抗体加入到100μL 0.2mg mL BCNNS分散液‑1
中,混合均匀后在室温下振荡反应10min,随后继续加入50μL的1‑10μmol L 葡萄糖溶液,在室温下振荡8‑20min,得到混合体系;最后将所述混合体系在14000rpm转速下离心10min,保留下层沉淀并重悬于200μL PBS中,即得到抗体标记的BCNNS,即为Ab‑BCNNS。
2.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述双氰胺的用量为3g。
3.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述4‑羧基苯硼酸(4‑CPBA)、HBTU和DIEA的反应摩尔比为1:1~1.5:1~3。
4.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在于,步骤(2)中硼酸修饰的具体参数为:取166mg 4‑羧基苯硼酸和400mg HBTU于30mL无水DMF中,搅拌使其溶解,并在50℃下继续搅拌30min,得到混合物;随后向所述混合物中加入
100mg所述g‑C3N4和0.5mL DIEA,50℃下继续搅拌12h完成反应。
5.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述连续超声的功率为800W。
6.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在‑1
于,步骤(4)中所述抗体稀释方法为将所述抗体用含0.5%BSA的PBS溶液稀释至10μg mL ,且所述含0.5%BSA的PBS溶液的pH为7.4。
7.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在‑1
于,步骤(4)中所述葡萄糖溶液的浓度为1μmol L 。
8.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针的制备方法,其特征在‑1
于,步骤(4)中所述加入50μL的1‑10μmol L 葡萄糖溶液,在室温下振荡的时间为10min。
9.一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针,其特征在于,所述免清洗通用型ELISA荧光免疫探针采用权利要求1‑8任意一项所述的方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针,其特征在于,所述免清洗通用型ELISA荧光免疫探针应用于具有特异抗体的目标物检测。
说明书 :
一种免清洗通用型ELISA荧光免疫探针及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
志物的检查,对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程的监控能够起到一定的帮助作
用。
定(ELISA)由于其良好的选择性和灵敏度、简单的操作手法、以及可外带测试等优势在临床
分析、药物分析、毒物分析等领域得到了广泛应用。但是,ELISA检测过程中涉及到涂板、洗
涤、封闭、孵育、检测等多个步骤,不仅劳动强度大、试剂用量多,而且耗时长,导致诊断延
迟,所以应用结果较差。
法等。然而,这些新开发的方法通常需要复杂的化学反应机制,所以这些方法还需要进一步
的改进和完善才能实现广泛应用。
发明内容
选择性检测,通过改变Ab‑BCNNS中的标记抗体,可实现对不同目标抗原的选择性检测。
密封,放入马弗炉中,以3℃min 的速度升温至550℃并保持2h;待反应物冷却至室温取出,
所得淡黄色固体即为g‑C3N4,用玛瑙研钵将所述g‑C3N4研磨成均匀固体粉末,备用;
拌12‑16h完成反应;将反应后的产物离心收集,并依次用无水乙醇和二次水各清洗2‑3次,
60℃下烘干得BCN;
瓶中,加入二次水配成浓度为1mg mL 的悬浮液;之后连续超声10h;随后将超声所得奶白色
悬浮液在3000rpm转速下离心15min,收集上清;将所述上清在14000rpm转速下离心10min,
‑1
收集沉淀,即为BCNNS;将所述BCNNS冷冻干燥后称重,配成0.2mg mL 的BCNNS分散液,备用;
取50μL所述抗体加入到100μL 0.2mg mL BCNNS分散液中,混合均匀后在室温下振荡反应
‑1
10min,随后继续加入50μL的1‑10μmol L 葡萄糖溶液,在室温下振荡8‑20min,得到混合体
系;最后将所述混合体系在14000rpm转速下离心10min,保留下层沉淀并重悬于200μLPBS
中,即得到抗体标记的BCNNS,即为Ab‑BCNNS。
后向所述混合物中加入100mg所述g‑C3N4和0.5mL DIEA,50℃下继续搅拌12h完成反应。
(pH 7.4)稀释至10μg mL 。
测样本与探针溶液混合体积比为1:4,混合均匀后在37℃水浴中孵育20min,随后在330nm激
发下测定混合液的荧光光谱,记录440nm处的荧光强度,带入标准曲线即可算出样本中目标
物的浓度。
饰的石墨相氮化碳纳米片(BCNNS),再将Ab标记到BCNNS上,可得到强荧光的Ab‑BCNNS复合
材料(ON),随着目标抗原的加入,Ab‑BCNNS复合材料的荧光发生猝灭现象(OFF),基于这种
ON‑OFF现象,即可实现对目标抗原的特异性检测;而且通过改变Ab‑BCNNS中的标记抗体,即
可实现对不同目标抗原的选择性检测。
定结果;反应快速,仅需20分钟孵育即可获得结果。
光免疫探针。
酸修饰的氮化碳室温孵育即可,和传统ELISA的孔板包被步骤一样简单,但又比孔板包被快
了很多(孔板包被需要12h,此方法只需要30min)。
附图说明
同浓度cTnI(0‑100ng mL )混合后的荧光光谱图;
‑1
mL );
浓度Mb(0‑100ng mL )混合后的荧光光谱图;
‑1
);
同浓度CK‑MB(0‑10ng mL )混合后的荧光光谱图;
‑1
mL );
浓度CEA(0‑100ng mL )混合后的荧光光谱图;
‑1
);
同浓度BPA(0‑5mg mL )混合后的荧光光谱图;
‑1
mL );
的血清样本圆形代表阴性,正方形代表低阳性,三角形代表高阳性;
清样本圆形代表阴性,正方形代表低阳性,三角形代表高阳性;
度的血清样本圆形代表阴性,正方形代表低阳性,三角形代表高阳性。
具体实施方式
实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获
得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
包裹密封,放入马弗炉中,以3℃min 的速度升温至550℃并保持2h;待反应物冷却至室温取
出,所得淡黄色固体即为g‑C3N4,用玛瑙研钵将所述g‑C3N4研磨成均匀固体粉末,备用;
和0.5mL DIEA,50℃下继续搅拌12h完成反应;将反应后的产物离心收集,并依次用无水乙
醇和二次水各清洗2‑3次,60℃下烘干得BCN;
悬浮液在3000rpm转速下离心15min,收集上清;将所述上清在14000rpm转速下离心10min,
‑1
收集沉淀,即为BCNNS;将所述BCNNS冷冻干燥后称重,配成0.2mg mL 的BCNNS分散液,备用;
抗体加入到100μL 0.2mg mL BCNNS分散液中,混合均匀后在室温下振荡反应10min,随后继
‑1
续加入50μL的1μmol L 葡萄糖溶液,在室温下振荡10min,得到混合体系;最后将所述混合
体系在14000rpm转速下离心10min,保留下层沉淀并重悬于200μLPBS中,即得到抗体标记的
BCNNS,即为Ab‑BCNNS。
弱荧光的硼酸修饰的g‑C3N4纳米片(BCNNS),再将Ab标记到BCNNS上,可得到强荧光的Ab‑
BCNNS复合材料(ON),随着目标抗原的加入,Ab‑BCNNS复合材料的荧光发生猝灭现象(OFF),
基于这种ON‑OFF现象,通过改变BCNNS上标记的抗体,即可实现对不同目标抗原的特异性检
测;基于此荧光探针的免疫检测,与传统ELISA相比,操作简单,只需一步,即可获得测定结
果;反应快速,仅需20分钟孵育即可。
白(Mb)和肌酸激酶同工酶MB(CK‑MB)进行检测。
‑1
随着cTnI加入浓度的增大(0‑100ng mL ),体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在
‑1
440nm处的荧光强度,得到趋势图如图3所示。经计算可知,在0.01‑5ng mL 浓度范围内,
cTnI浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图3插图),计算得线性回归方程为:F
‑1 ‑1 2
=‑791.8CcTnI+6427(0.01‑5ng mL ,即0.4‑209nmol L ;R =0.9934)。检出限为121fmol
‑1
L (3σ/s,n=11)。
‑1
Mb加入浓度的增大(0‑100ng mL ),体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处的
‑1
荧光强度,得到趋势图如图5所示。经计算可知,在0.01‑5ng mL 浓度范围内,Mb浓度与体系
荧光强度之间存在良好的线性关系(图5插图),计算得线性回归方程为:F=‑943.8CMb+7544
‑1 ‑1 2 ‑1
(0.04‑20ng mL ,即2.4‑1198nmol L ;R=0.9937),检出限为515fmol L (3σ/s,n=11)。
‑1
到,随着CK‑MB加入浓度的增大(0‑10ng mL ),体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在
‑1
440nm处的荧光强度,得到趋势图如图7所示。经计算可知,在0.01‑5ng mL 浓度范围内,CK‑
MB浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图7插图),计算得线性回归方程为:F=‑
‑1 ‑1 2 ‑1
1012CCK‑MB+7387(0.02‑6ng mL ,即0.23‑70nmol L ;R =0.9911),检出限为74fmol L (3
σ/s,n=11)。
‑1
着CEA加入浓度的增大(0‑100ng mL ),体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处
‑1
的荧光强度,得到趋势图如图9所示。经计算可知,在0.01‑5ng mL 浓度范围内,CEA浓度与
体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图9插图),计算得线性回归方程为:F=‑890.5CCEA
‑1 ‑1 2 ‑1
+6599(0.02‑8ng mL ,即0.11‑45nmol L ;R=0.9968),检出限为23fmol L (3σ/s,n=
11)。
‑1
到,随着BPA加入浓度的增大(0‑5mmL ),体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm
‑1
处的荧光强度,得到趋势图如图11所示。经计算可知,在0.01‑5ng mL 浓度范围内,BPA浓度
与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图11插图),计算得线性回归方程为:F=‑
‑1 2 ‑1
1144CBPA+6186(20‑500nmol L ;R=0.9728),检出限为6.8nmol L (3σ/s,n=11)。
440nm处的荧光强度,并计算出每个人血清样本中cTnI的含量。同时用商品化的cTnI酶联免
疫试剂盒对同一批血清样本进行测试,以cTnI酶联免疫试剂盒对血清样本的测试值为横坐
标,本实验的荧光免疫分析法对血清样本的测试值为纵坐标,得到两种方法的线性相关图
(图12),从图上可以看出,两种方法检测结果的相关性较好,说明本实验的荧光免疫分析法
对血清样本中cTnI检测的准确度较好。
(Mb:图13,CK‑MB:图14)。从结果可知,当以Mb和CK‑MB为目标物时,本实验的荧光免疫分析
法依然有着良好的准确性,综上,说明本方法可以实现人血清中三中心肌标志物的准确检
测。本方法不仅可以实现所试验的三种心肌标志物的检测,也可以推广至其他有对应抗体
的目标物的检测。