一种小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法转让专利
申请号 : CN202010083022.4
文献号 : CN111264468B
文献日 : 2022-01-28
发明人 : 贾欢欢 , 陈梅丽 , 吴玉娥 , 赵维波 , 曾业文 , 黄韧
申请人 : 广东省实验动物监测所
摘要 :
本发明公开了一种小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，旨在提供一种能在SPF级环境下成批量造模，且与临床症状一致、方法简单、成模率高、价格便宜的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法；其技术方案依次包括下述步骤：1)SPF级3～4周龄HLA‑B27转基因小鼠雌雄各半，12h明暗交替，适应性饲养5天；2)将自发AS食蟹猴粪便代谢物经滤过滤除菌后，灌肠步骤1)中的SPF级HLA‑B27小鼠，在SPF级环境下饲养，灌肠后的第11周检查，评价；属于生物技术领域。
权利要求 :
1.一种小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)SPF级3～4周龄HLA‑B27转基因小鼠雌雄各半，12h明暗交替，SPF级环境下适应性饲养5天；
2)将自发AS食蟹猴粪便代谢物经过滤除菌后，灌肠步骤1)中的SPF级HLA‑B27小鼠，在SPF级环境下饲养，灌肠后的第11周检查，评价。
2.根据权利要求1所述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，饲养环境：温度20～26℃，相对湿度40～70％。
3.根据权利要求1所述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述的粪便代谢物通过下述方法制得的：取确诊的自发强直性脊柱炎食蟹猴新鲜粪便20g，置于无菌的
50mL离心管，加入无菌注射生理盐水40mL，震荡混匀，30min，使用200目筛粗过滤，之后使用
0.22μm滤膜过滤，得到澄清液体。
4.根据权利要求1所述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述的小鼠灌肠前，禁食不禁水过夜，以清空肠道；取粪便代谢产物用9号灌胃针每只灌肠0.5mL，提起尾巴倒置10min，之后放下，正常活动、饲养，每周1次，持续10周。
5.根据权利要求1所述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述的模型评价方法
(1)动物大体观察：每日观察动物的一般状态，是否驼背、关节是否肿大、关节活动度是否异常；
(2)影像学检查：35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，使用X光或CT检查动物椎体、四肢关节是否出现软骨损伤、韧带钙化、骨赘、骨性强直；
(3)血液学指标评价：35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，腹主动脉采血，EDTA2K抗凝采血管采血100μL进行血常规相关指标检测和分析；不抗凝采血200μL，1000g离心
10min，分离血清，进行C反应蛋白含量，及血生化相关指标检测和分析。
6.根据权利要求5所述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述血常规检验指标为白细胞含量、血小板含量、血红蛋白含量。
7.根据权利要求5所述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述血生化相关指标为白蛋白含量、球蛋白含量和碱性磷酸酶含量。
说明书 :
一种小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种动物模型的构建方法，具体涉及一种小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 强直性脊柱炎(AS，ankylosing spondylitis)是以脊柱为主要病变部位的慢性病，累及骶髂关节，是一种自身免疫性疾病。AS多发于青少年男性，具有一定的家族聚集性。
随着时间的推移，AS患者会出现脊柱及外周关节强直，最终导致脊柱僵直变形，致畸致残，
对患者生存质量造成严重影响。目前对于AS仍没有较好的治疗方案，常以消炎止痛为主，常
用药包括非甾体抗炎药、传统抗风湿药、生物制剂等，但这些药物无法逆转AS导致的韧带钙
化及骨性强直，且长期使用会引起严重的不良反应。
随着时间的推移，AS患者会出现脊柱及外周关节强直，最终导致脊柱僵直变形，致畸致残，
对患者生存质量造成严重影响。目前对于AS仍没有较好的治疗方案，常以消炎止痛为主，常
用药包括非甾体抗炎药、传统抗风湿药、生物制剂等，但这些药物无法逆转AS导致的韧带钙
化及骨性强直，且长期使用会引起严重的不良反应。
[0003] 强直性脊柱炎疾病动物模型现状：AS疾病动物模型是研究AS发病机制和药物开发的重要载体。随着AS研究的深入，目前已经构建了多种动物模型，这些疾病动物模型的构建
对AS的研究起到了重要作用，但仍有一定得缺陷。
对AS的研究起到了重要作用，但仍有一定得缺陷。
[0004] 现有AS疾病动物模型包括以下几种：
[0005] (1)HLA‑B27/人β2m双转基因大、小鼠模型。优点：该模型发病动物表现出明显的外周关节炎症、骨赘及关节强直。缺点：①并未表现出稳定的脊柱关节受累；②该模型在SPF级
环境下不发病，转移至普通环境下才开始发病，发病率不足50％。③该模型造模周期长、技
术要求高、步骤复杂、价格昂贵，最为关键的是随着动物年龄的增长，症状反而变轻。
环境下不发病，转移至普通环境下才开始发病，发病率不足50％。③该模型造模周期长、技
术要求高、步骤复杂、价格昂贵，最为关键的是随着动物年龄的增长，症状反而变轻。
[0006] (2)炎症相关动物模型，如蛋白聚糖诱导的脊柱炎(proteoglycan‑induced spondylitis,PGIL)小鼠模型和内质网氨基肽酶1敲除(endoplasmic reticulum
aminopeptidase,ERAP1‑/‑)小鼠模型等。优点：①PGIL小鼠模型早期出现外周关节炎，后期
出现外周及脊柱关节的畸形、强直和功能受限，病理上表现为早期的滑膜炎、软骨侵蚀和后
期的关节软骨细胞增殖导致的关节融合。②ERAP1‑/‑小鼠模型不但出现自发性中轴关节强
直、脊柱炎症和全身性骨质疏松。③此类模型操作简便，周期短，症状明显。缺点：AS是与人
类白细胞抗原B27密切相关的疾病，炎症诱导的动物模型表现出更少的基因限制性，与临床
AS有别，且成模率不稳定。
aminopeptidase,ERAP1‑/‑)小鼠模型等。优点：①PGIL小鼠模型早期出现外周关节炎，后期
出现外周及脊柱关节的畸形、强直和功能受限，病理上表现为早期的滑膜炎、软骨侵蚀和后
期的关节软骨细胞增殖导致的关节融合。②ERAP1‑/‑小鼠模型不但出现自发性中轴关节强
直、脊柱炎症和全身性骨质疏松。③此类模型操作简便，周期短，症状明显。缺点：AS是与人
类白细胞抗原B27密切相关的疾病，炎症诱导的动物模型表现出更少的基因限制性，与临床
AS有别，且成模率不稳定。
[0007] (3)自发性动物模型。①DBA/1小鼠是国际公认的筛选和研究治疗关节炎的动物模型。优点是：造模方法简便；缺点是周期长，且只有雄性动物发病。②进行性强直(ank/ank)
小鼠模型，在临床表现、放射学和病理学上与人类AS相似，可出现中轴关节和外周关节的强
直，关节周围软组织纤维化、骨化和关节强直；②缺点：ank/ank基因纯合子鼠因常染色体隐
形异常，致鼠自发性进行性强直，导致疾病得素不明。尽管模型鼠的X射线改变与AS非常相
似，但是这种强直是非炎症性的，与人临床AS有异。
小鼠模型，在临床表现、放射学和病理学上与人类AS相似，可出现中轴关节和外周关节的强
直，关节周围软组织纤维化、骨化和关节强直；②缺点：ank/ank基因纯合子鼠因常染色体隐
形异常，致鼠自发性进行性强直，导致疾病得素不明。尽管模型鼠的X射线改变与AS非常相
似，但是这种强直是非炎症性的，与人临床AS有异。
[0008] AS与人白细胞表面抗原B27(HLA‑B27)强相关，HLA‑B27是AS最主要的遗传危险因素，约90％的患者HLA‑B27阳性。早在19世纪80年代，就有学者对HLA‑B27转基因小鼠AS模型
进行了探索，但HLA‑B27转基因小鼠并不发生炎性病变。HLA‑B27小鼠只有与β2‑微球蛋白整
合后才能表现出AS症状，此外该模型只有在普通级环境下才发病，研究发现肠道菌群及其
代谢物在其中起了至关重要的作用。临床研究也发现AS患者多数有肠道感染病史，60％～
70％的AS患者出现肠炎。
进行了探索，但HLA‑B27转基因小鼠并不发生炎性病变。HLA‑B27小鼠只有与β2‑微球蛋白整
合后才能表现出AS症状，此外该模型只有在普通级环境下才发病，研究发现肠道菌群及其
代谢物在其中起了至关重要的作用。临床研究也发现AS患者多数有肠道感染病史，60％～
70％的AS患者出现肠炎。
[0009] 申请人通过两年多的研究，从流行病学、影像学、血液学及免疫学等多个方面，确诊了57只自发AS食蟹猴。该模型动物表现为驼背、关节肿大僵直、关节活动度下降；多发于
青少年食蟹猴，发病率约为0.25％，并具有一定的家族聚集性；影像学检查也发现明显的脊
柱和骶髂关节受累；炎症指标C反应蛋白显著升高；血常规指标白细胞计数、血小板含量、血
红蛋白含量均出现显著性改变，而血液学指标ALP、GLOB、TP及ALB水平均出现明显的改变；
上述改变均与临床AS表现一致。
青少年食蟹猴，发病率约为0.25％，并具有一定的家族聚集性；影像学检查也发现明显的脊
柱和骶髂关节受累；炎症指标C反应蛋白显著升高；血常规指标白细胞计数、血小板含量、血
红蛋白含量均出现显著性改变，而血液学指标ALP、GLOB、TP及ALB水平均出现明显的改变；
上述改变均与临床AS表现一致。
发明内容
[0010] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种能在SPF级环境下成批量造模，且与临床症状一致、方法简单、成模率高、价格便宜的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法。
[0011] 一种小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，依次包括下述步骤：
[0012] 1)SPF级3～4周龄HLA‑B27转基因小鼠雌雄各半，12h明暗交替，适应性饲养5天；
[0013] 2)将自发AS食蟹猴粪便代谢物经滤过滤除菌后，灌肠步骤1)中的SPF级HLA‑B27小鼠，在SPF级环境下饲养，灌肠后的第11周检查，评价。
[0014] 优选的，上述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，饲养环境：温度20～26℃，相对湿度40～70％。
[0015] 优选的，上述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，所述的粪便代谢产物通过下述方法制得的：取新鲜粪便20g，置于无菌的50mL离心管，加入无菌注射生理盐水40mL，震荡
混匀，约30min，使用200目筛粗过滤，之后使用0.22μm滤膜过滤，得到澄清液体。
混匀，约30min，使用200目筛粗过滤，之后使用0.22μm滤膜过滤，得到澄清液体。
[0016] 优选的，上述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，所述的动物灌肠前，禁食不禁水过夜，以清空肠道；取粪便代谢产物用9号灌胃针每只灌肠0.5mL，提起尾巴倒置10min，之
后放下，正常活动、饲养，每周1次，持续10周。
后放下，正常活动、饲养，每周1次，持续10周。
[0017] 优选的，上述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，所述的模型评价方法
[0018] (1)动物大体观察：每日观察动物的一般状态，如是否驼背、关节是否肿大、关节活动度是否异常；
[0019] (2)影像学检查：35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，使用X光或CT检查动物椎体、四肢关节是否出现软骨损伤、韧带钙化、骨赘、骨性强直；
[0020] (3)血液学指标评价：35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，腹主动脉采血，EDTA2K抗凝采血管采血100μL进行血常规相关指标检测和分析；不抗凝采血200μL，1000g离
心10min，分离血清，进行C反应蛋白含量，及血生化相关指标检测和分析。
心10min，分离血清，进行C反应蛋白含量，及血生化相关指标检测和分析。
[0021] 进一步的，上述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述血常规检验指标为白细胞含量、血小板含量、血红蛋白含量。
[0022] 进一步的，上述的小鼠强直性脊柱炎模型的构建方法，其特征在于，所述血生化相关指标为白蛋白含量、球蛋白含量和碱性磷酸酶含量。
[0023] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具体如下技术优点:
[0024] 1、本发明提供的技术方案采用HLA‑B27转基因小鼠灌肠自发AS食蟹猴粪便代谢物，可使HLA‑B27小鼠在不与β2‑微球蛋白整合时，也能出现明显的AS症状，有效解决了目前
的研究发现HLA‑B27转基因小鼠并不能表现出AS相关症状，只有与β2‑微球蛋白整合后才能
出现AS相关表型的问题。
的研究发现HLA‑B27转基因小鼠并不能表现出AS相关症状，只有与β2‑微球蛋白整合后才能
出现AS相关表型的问题。
[0025] 2、本发明提供的技术方案将自发AS食蟹猴粪便代谢物经0.22μm滤膜过滤除菌后，灌肠SPF级HLA‑B27小鼠，保证了实验期间动物可以饲养在SPF级环境下；有效解决了目前的
研究发现HLA‑B27/人β2m双转基因大、小鼠模型在SPF级环境下并不表现为AS症状，只有将
动物置于普通级环境下才出现AS相关表型，但是目前全国已全面取消普通级动物和普通级
饲养设施，而广泛的药理、毒理、药效学研究需要在SPF级环境中开展的技术困扰。本发明提
供的技术方案初步实现了HLA‑B27小鼠在SPF级环境下大量造模，改变了HLA‑B27/人β2m双
转基因大、小鼠模型只有在普通级环境下发病的缺陷。
研究发现HLA‑B27/人β2m双转基因大、小鼠模型在SPF级环境下并不表现为AS症状，只有将
动物置于普通级环境下才出现AS相关表型，但是目前全国已全面取消普通级动物和普通级
饲养设施，而广泛的药理、毒理、药效学研究需要在SPF级环境中开展的技术困扰。本发明提
供的技术方案初步实现了HLA‑B27小鼠在SPF级环境下大量造模，改变了HLA‑B27/人β2m双
转基因大、小鼠模型只有在普通级环境下发病的缺陷。
[0026] 3、本发明提供的技术方案使HLA‑B27小鼠的AS发病率达到100％，极大提高了成模率；是目前HLA‑B27/人β2m小鼠模型的发病率的两倍多；并在SPF级环境下成批量造模，且与
临床症状一致、方法简单、成模率高、价格便宜。
临床症状一致、方法简单、成模率高、价格便宜。
附图说明
[0027] 图1是椎体(腰椎)X光检查结果；
[0028] 图2是膝关节X光检查结果；
[0029] 图3C反应蛋白检测结果；
[0030] 图4血常规及血生化检测结果。
具体实施方式
[0031] 下面结合结合具体实施方式和附图说明对发明的权利要求做进一步的详细说明，但不够成对本发明的任何限制。
[0032] 1、实验动物
[0033] SPF级3～4周龄HLA‑B27转基因小鼠20只，雌雄各半，饲养环境：温度20～26℃，相对湿度40～70％，12h明暗交替。
[0034] 2、实验分组
[0035] 对照组：HLA‑B27小鼠10只，雌雄各半，灌肠无菌生理盐水，0.5mL/只，每周1次，持续10周，SPF级饲养环境下正常饲养，于灌肠后第11周检查；
[0036] 模型组：HLA‑B27小鼠10只，雌雄各半，灌肠粪便代谢产物，0.5mL/只，每周1次，持续10周，SPF级饲养环境下正常饲养，于第11周检查；
[0037] 3、粪便代谢产物制备
[0038] (1)供体动物
[0039] 依据美国风湿病协会1984年修订的强直性脊柱炎诊断标准，通过X光、CT及MRI影像学方法确诊的AS食蟹猴。
[0040] (2)粪便代谢产物制备
[0041] 取新鲜粪便(2h内)20g，置于无菌的50mL离心管，加入无菌注射生理盐水40mL，震荡混匀，约30min，使用200目筛粗过滤，之后使用0.22μm滤膜过滤，得到澄清液体，现配现
用，或置于‑20℃、‑80℃冰箱保存。
用，或置于‑20℃、‑80℃冰箱保存。
[0042] 4、动物灌肠
[0043] 动物灌肠前，禁食不禁水过夜，以清空肠道；取粪便代谢产物(冰箱冻存需室温放置0.5～1h解冻)，用9号灌胃针每只灌肠0.5mL，提起尾巴倒置10min，之后放下，正常活动、
饲养。
饲养。
[0044] 5、模型评价方法
[0045] (1)动物大体观察：每日观察动物的一般状态，如是否驼背、关节是否肿大、关节活动度是否异常等。
[0046] (2)影像学检查：35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，使用X光检查动物椎体是否出现软骨损伤、韧带钙化、骨赘、骨性强直等。
[0047] (3)血液学指标评价：35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，腹主动脉采血，EDTA2K抗凝采血管采血100μL进行血常规相关指标(白细胞计数、血小板含量、血红蛋白含
量)检测和分析，不抗凝采血200μL，1000g离心10min，分离血清，进行炎症指标C反应蛋白及
血生化相关指标(白蛋白、球蛋白、碱性磷酸酶)检测和分析。
量)检测和分析，不抗凝采血200μL，1000g离心10min，分离血清，进行炎症指标C反应蛋白及
血生化相关指标(白蛋白、球蛋白、碱性磷酸酶)检测和分析。
[0048] 6、结果评价
[0049] 动物大体观察：模型组动物出现明显的驼背，关节肿大，活动状态变差。
[0050] 影像学检查：与对照组动物比较，模型组动物腰椎出现明显的韧带钙化、骨赘等，膝关节出现明显的关节面粗糙、锯齿样改变，这些结果与临床AS表现一致，参阅图1和图2，
其中，图1中的箭头表示韧带钙化、骨赘；图2中箭头表示软骨侵蚀，关节面呈锯齿样改变。
其中，图1中的箭头表示韧带钙化、骨赘；图2中箭头表示软骨侵蚀，关节面呈锯齿样改变。
[0051] 血液学检查：与对照组动物比较，模型组动物C反应蛋白(CRP)水平显著升高，与临床AS患者表现一致。结果见图3。注图3中：**表示P＜0.01。模型动物白细胞计数(WBC)、血小
板含量(PLT)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、球蛋白(GLOB)均显著升高，血红蛋白(HGB)
含量显著下降。这些结果与临床AS患者表现一致。结果见图4。注图4中：**表示P＜0.01，***
表示P＜0.001。
板含量(PLT)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、球蛋白(GLOB)均显著升高，血红蛋白(HGB)
含量显著下降。这些结果与临床AS患者表现一致。结果见图4。注图4中：**表示P＜0.01，***
表示P＜0.001。
[0052] 总而言之，本发明通过对HLA‑B27转基因小鼠灌肠自发AS食蟹猴粪便提取液，以建立一种新型的强直性脊柱炎小鼠模型。目前的研究发现HLA‑B27转基因小鼠并不能表现出
AS相关症状，只有与β2‑微球蛋白整合后且置于普通级动物饲养环境动物才能表现出AS相
关症状。目前全国已经取消普通级小鼠及其饲养设施，且药理、药效、毒理学研究的实验动
物均需饲养在SPF及以上级别设施，因此目前HLA‑B27/人β2m双转基因大、小鼠使用受限。而
本发明提取自发AS食蟹猴粪便代谢物后，经过滤除菌，之后灌肠HLA‑B27转基因小鼠，可极
大提高HLA‑B27转基因小鼠成模率，并在SPF级环境下成批量造模。且与临床症状一致、方法
简单、成模率高、价格便宜。
AS相关症状，只有与β2‑微球蛋白整合后且置于普通级动物饲养环境动物才能表现出AS相
关症状。目前全国已经取消普通级小鼠及其饲养设施，且药理、药效、毒理学研究的实验动
物均需饲养在SPF及以上级别设施，因此目前HLA‑B27/人β2m双转基因大、小鼠使用受限。而
本发明提取自发AS食蟹猴粪便代谢物后，经过滤除菌，之后灌肠HLA‑B27转基因小鼠，可极
大提高HLA‑B27转基因小鼠成模率，并在SPF级环境下成批量造模。且与临床症状一致、方法
简单、成模率高、价格便宜。
[0053] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些都不会影响本发明实施的效果
和专利的实用性。
和专利的实用性。