多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面的应用

摘要

一种基于微流控技术制备的高均一性多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面应用，属于材料科学技术领域。本发明通过光刻技术与等离子刻蚀方法构筑Y字形微通道，通过微流体液滴技术制备高均一性明胶微球，将明胶微球置于多巴胺Tris‑HCl缓冲溶液中，利用多巴胺碱性条件下自我聚合为聚多巴胺性质，使明胶表面形成高黏附聚多巴胺涂层。该方法操作简单，不涉及复杂昂贵的制备技术。相对于传统裸漏的明胶表面，经多巴胺处理后的明胶微球能很好地促进神经细胞的黏附与分化，这对于提高细胞移植后存活率，后期组织治疗效果具有深远意义。

权利要求

1.一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其步骤如下：(1)4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体的制备：将8～15g明胶与1～2g的4‑(二甲氨基)吡啶溶于40～60℃、80～150mL的二甲基亚砜中，待充分溶解后，在N2保护的环境下向其中加入3～5mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应60～80小时后取出倒入渗析带，在30～50℃下去离子水渗析2～4天，将得到的渗析液冻干后放入‑90～‑70℃环境保存，得到4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体；

(2)微流体液滴芯片制备：微流体液滴芯片经基片处理、旋涂光刻胶、紫外掩模版曝光、等离子刻蚀、聚二甲基硅氧烷翻模、孔道键合步骤制备得到；孔道结构由水相入口及水相输运孔道、油相入口及两条对称分布在水相输运孔道两侧、距离水相输运孔道最大平行距离为6～8mm的油相输运孔道、液滴出口及液滴输运孔道三部分组成，其中水相入口与油相入口距离为8～10mm，水相入口与液滴出口距离为2～3cm，单条油相输运孔道与水相输运孔道交叉处的夹角为60°，油相入口、水相入口和液滴出口在同一直线上，孔道高度为50～100μm；水相输运孔道为宽度100～200μm，长度6～8mm的直线型孔道；油相输运孔道为宽度100～

200μm，长度2～3cm的折线型孔道；液滴输运孔道为宽度300～500μm，长度3～4cm的正弦曲线型孔道；

(3)将步骤(1)所获得的明胶预聚体与光引发剂2959溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中，质量分数分别为5～10％与0.5～1％，作为水相从微流体液滴芯片的水相入口通入，流速为200μL～1000μL/h；将油相从油相入口通入，流速为400μL/h～2000μL/h；液体通入后，水相与油相在孔道交叉处相遇进而发生微乳化，水相被油相切割形成微米级液滴，经液滴输运孔道由液滴出口流出，得到明胶预聚体微球；

(4)将步骤(3)得到的明胶预聚体微球经紫外光灯曝光3min～5min后，依次经矿物油、含有TWEEN 20的PBS溶液、PBS溶液清洗，然后加入到多巴胺的Tri‑HCl缓冲溶液中浸泡12h～72h，取出后再经PBS溶液充分清洗后，得到多巴胺修饰的明胶微球，进而用于细胞接种。

2.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)所使用的明胶为猪皮明胶或鱼皮明胶，所使用的渗析带材质为纤维素，截留分子量为8000～15000Da。

3.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中光刻胶为AZ5214、BP212‑37s或BP212‑45，显影液为光刻胶配套显影液；紫外曝光灯波长为365nm，功率为30～100w。

4.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中等离子体刻蚀的刻蚀气压为6mTorr，刻蚀温度10℃，刻蚀功率为RF为50W，ICP为100W，刻蚀时间为2～3min，刻蚀深度为100～150μm；使用的刻蚀气体为氧气、三氟甲烷/六氟化硫、三氟甲烷/氩气之一。

5.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(3)中油相是加SPAN80的矿物油，SPAN80的质量分数为10％～20％；或是加卵 磷脂的玉米油，卵磷脂的质量分数为1.5～3.0％。

6.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)中球清洗过程中全程无菌，球清洗过程中，用细胞筛网冲洗或用离心的方式清洗。

7.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)中接种的细胞是神经元细胞、胚胎干细胞或神经干细胞。

8.如权利要求1所述的一种多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)多巴胺的Tris‑HCl缓冲溶液中，多巴胺的质量分数为2～4mg/mL，Tris‑HCl缓冲溶液浓度为

10～100mM。

9.一种多巴胺修饰的明胶微球，其特征在于：是由权利要求1～8任何一项所述的方法制备得到。

10.权利要求9所述的多巴胺修饰的明胶微球在制备细胞微载体材料中的应用。

说明书

多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方

面的应用

技术领域

[0001] 本发明属于材料科学技术领域，具体涉及一种基于微流控技术制备的高均一性多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面应用。该微载体基于多巴胺超
黏附性，实现了细胞高运载效率，进一步促进了神经前体细胞的分化与功能表达。

背景技术

[0002] 帕金森综合症是一种常见的神经系统退行性疾病，主要由腹侧中脑多巴胺神经元坏死引起。相关研究表明，将多巴胺神经元注入到患者中脑，能起到明显的治疗效果，显著
提高患者的运动能力。但由于细胞在移植过程中，细胞处于游离状态及注射过程中针头剪
切力的存在，会极大降低细胞在组织中存活率。目前经临床审批通过的神经元绝大多数是
由胚胎干细胞悬浮分化诱导所得，其自身增殖分化过程均为悬浮状态，不贴附于材料，这进
一步增加了移植难度。因此，开发一种可注射、促进神经元黏附、提高其体内存活率的微凝
胶是研究人员需要解决的首要问题。

[0003] 微流控技术是将数十到数百个微米级孔道集成，向其注入少量液体，对其进行系统的操控和控制，微流体液滴是基于微流控技术，构筑“Y、T、十字”等微结构孔道，向孔道内
通入不相溶的两相，通过局部乳化方式高效生产微米级凝胶微球，由于其可注射性，广泛应
用于细胞运载等生物领域。目前微流体液滴所生产的微凝胶表面性质单一，绝大多数为裸
漏的凝胶表面，一些自我悬浮增殖克隆的细胞，如胚胎干细胞、神经干细胞等，裸漏的微凝
胶不能为其提供很好的黏附表面位点。

[0004] 在贻贝黏附蛋白的启发下，从2007年起，聚多巴胺作为一种简单高效改进表面功能的镀膜广泛被人们使用。多巴胺是含有邻苯二酚还有氨基的化合物，在碱性条件下邻苯
二酚会转化为醌自我聚合形成聚多巴胺，赋予材料极强的细胞黏附能力。近年来，聚多巴胺
涂层由于其极强的黏附性能被广泛应用在生物领域，但在高均一性明胶微球表面镀多巴胺
提高细胞运载能力的报道极为少见。

[0005] 基于上述问题，本发明基于微流体液滴技术，利用多巴胺高黏附性，制备了可注射、促进细胞贴附、分化又能提高其移植后存活率的可以用作细胞微载体的多巴胺明胶微
球。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种基于微流体液滴技术室温条件下制备的高效负载神经细胞的高均一性多巴胺修饰的明胶微球、制备方法及其在作为细胞微载体方面应用。随着
多巴胺修饰时间的增加，明胶微载体对神经细胞的黏附能力有显著的提升，并对神经细胞
分化也有明显的促进作用。

[0007] 本发明涉及光刻技术与等离子刻蚀方法构筑Y字形、水油两相孔道夹角为 60°的微通道，在水油两相孔道中分别通入不互溶的两相分别是甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预
聚体和混有SPAN80的矿物油，经紫外光固化，清洗后加入到多巴胺的Tris‑HCl缓冲溶液中
进行多巴胺镀膜修饰。整个过程操作简单，不涉及复杂昂贵的制备技术。本发明主要通过微
流体液滴技术构筑高均一性明胶微球，经多巴胺修饰后很好地促进神经细胞的黏附与分
化。

[0008] 本发明所述的一种基于微流体液滴技术制备的高均一性多巴胺修饰的明胶微球的制备方法，如图1所示，其步骤如下：

[0009] (1)4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体的制备：将 8～15g明胶与1～2g的4‑(二甲氨基)吡啶溶于40～60℃、80～150mL的二甲基亚砜中，待充分溶解
后，在N2保护的环境下向其中加入3～5mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应60～80小时后取
出倒入渗析带，在30～50℃下去离子水渗析2～4天，将得到的渗析液冻干后放入‑90～‑70
℃环境保存，得到4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体；

[0010] (2)微流体液滴芯片制备：微流体液滴芯片经基片处理、旋涂光刻胶、紫外掩模版曝光、等离子刻蚀、聚二甲基硅氧烷(PDMS)翻模、孔道键合等步骤制备得到，具体参见David 
A.Weitz et al.Small,1702955,14,(2018)]；孔道结构如图1(a)所示，由水相入口及水相
输运孔道(宽度为100～200μm，长度为6～8mm 的直线型孔道)、油相入口及两条对称分布在
水相输运孔道两侧、距离水相输运孔道最大平行距离为6～8mm的油相输运孔道(宽度为100
～200μm，长度为2～3cm 的折线型孔道)、液滴出口及液滴输运孔道(宽度为300～500μm，长
度为3～4cm 的正弦曲线型孔道，此结构有利于液滴稳定；正弦曲线方程的具体参数对液滴
的制备结果无大的影响，只要是相类似的波浪形图案就能起到稳定球的作用，能减轻后面
的球对前面球的冲击)三部分组成，其中水相入口与油相入口距离为 8～10mm，水相入口与
液滴出口距离为2～3cm，单条油相输运孔道与水相输运孔道交叉处的夹角为60°，油相入
口、水相入口和液滴出口在同一直线上，孔道高度为50～100μm(两条油相孔道与液滴输送
孔道类似于Y字形结构)；

[0011] (3)将步骤(1)所获得的明胶预聚体与光引发剂2959溶于磷酸缓冲溶液 (PBS)中，质量分数分别为5～10％与0.5～1％，作为水相从微流体液滴芯片的水相入口通入，流速为
200μL～1000μL/h；将含有SPAN80的矿物油(CAS号为 8020‑83‑5)作为油相从油相入口通
入，流速为400μL/h～2000μL/h，矿物油中 SPAN80的质量分数为10％～20％；液体通入后，
水相与油相在孔道交叉处相遇进而发生微乳化，水相被油相切割形成微米级液滴，经液滴
输运孔道由液滴出口流出，得到明胶预聚体微球；

[0012] (4)将步骤(3)得到的明胶预聚体微球经紫外光灯曝光3min～5min后，依次经矿物油、含有TWEEN 20的PBS溶液(TWEEN 20的体积分数为0.5～1％)、 PBS溶液清洗，然后加入
到多巴胺的Tris‑HCl缓冲溶液中(多巴胺的质量分数为 2～4mg/mL，Tris‑HCl缓冲溶液浓
度为10～100mM)浸泡12h～72h，取出后再经PBS 充分清洗后，得到本发明所述的用于细胞
载体的多巴胺修饰的明胶微球，进而用于细胞接种。

[0013] 步骤(1)所使用的明胶为猪皮明胶或鱼皮明胶，所使用的渗析带材质为纤维素，截留分子量为8000～15000Da。

[0014] 步骤(2)中光刻胶为AZ5214、BP212‑37s、BP212‑45等，显影液为光刻胶配套显影液；紫外曝光灯波长为365nm，功率为30～100w。

[0015] 步骤(2)中等离子体刻蚀的刻蚀气压为6mTorr，刻蚀温度10℃，刻蚀功率为RF为50W，ICP为100W，刻蚀时间为2～3min，刻蚀深度为100～150μm。使用的刻蚀气体为氧气、三
氟甲烷/六氟化硫、三氟甲烷/氩气等单独气体或多组分混合气体。

[0016] 步骤(3)中油相既可以是矿物油加SPAN80(SPAN80质量分数为10％～20％)，也可以是玉米油加卵 磷脂(卵 磷脂质量分数为1.5～3.0％)，成球过程中室温操作即可，不需
要辅助加热装置。

[0017] 步骤(4)中球清洗过程中需要全程保证无菌，球清洗过程中，既可以用细胞筛网冲洗，也可以用离心清洗的方式。

[0018] 步骤(4)中接种的细胞既可以是神经元细胞，也可以是胚胎干细胞、神经干细胞、神经前体细胞均具有很好的促进黏附的效果。

[0019] 与现有技术相比，本发明的优点如下：

[0020] 1、本发明操作简单，简单的孔道设计就可以高效的生产明胶微球，明胶经 4‑(二甲氨基)吡啶处理后，室温成液相状态，成球过程中不需要额外的辅助加热装置，使整个操
作过程更加简洁。

[0021] 2、本发明所生产的多巴胺修饰的明胶微球，整体尺寸均一性强，微球粒径跨度大，可实现20μm～400μm明胶微球的生成。

[0022] 3、本发明所生产的多巴胺修饰的明胶微球，相对于裸漏的明胶微球，极大的促进了胚胎干细胞，神经干细胞等一系列细胞的黏附，这对于后期体内细胞移植治疗，提高存活
率具有明显的促进作用。

[0023] 本发明芯片简单，可重复清洗使用，不需要额外的加热装置辅助，降低了操作难度，表面镀多巴胺明胶微球相对于裸漏的明胶微球能明显促进自我悬浮克隆的细胞黏附，
这对于后期体内移植细胞提高治疗效果具有明显的积极作用。

附图说明

[0024] 图1：(a)为微流体液滴芯片的结构示意图，由一层含有孔道结构的PDMS 及载玻片键合得到，由水相入口及水相输运孔道、油相入口及油相输运孔道、液滴出口及液滴输运孔
道三部分组成；(b)为微流体液滴芯片生产微球过程照片，如图所示，水相输运孔道、油相输
运孔道及液滴输出孔道交汇处有一段长度为 600μm，宽度为300μm的矩形孔道，此矩形孔道
相对于液滴输出孔道有轻微的收缩，能增大油相对水相的剪切作用，使乳化效果更好；(c)
为紫外光引发聚合后明胶微球在油相中的照片，说明聚合后的明胶微球整体均一性强(标
尺：300μm)。

[0025] 图2：明胶经4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰后的核磁谱图，谱图中标记的a、b、c分别对应着甲基丙烯酸甘油酯的特征官能团，说明甲基丙烯酸缩水甘油酯成功
修饰到明胶分子骨架结构上。

[0026] 图3：(a)水和明胶溶液的粘度值曲线(横坐标为剪切频率，纵坐标为粘度值大小)；(b)明胶相流速为200μL/h时随油相流速增加微球粒径下降折线图(横坐标为油相流速，纵
坐标为明胶微球直径大小)；(c)明胶相流速200μL/h、油相流速800μL/h时的明胶微球直径
分布柱状图；统计数据总量n为100，平均直径Mean为95.12μm，标准差sd为1.035，变异系数
C.V.为1.1％，柱状图经高斯函数拟合，从标准差及变异系数得出微球直径分布紧凑，整体
均一度高(横坐标为明胶微球直径，纵坐标为明胶微球数量)。

[0027] 图4：(a)水相明胶微球显微镜照片(标尺：300μm)；(b)经多巴胺修饰后明胶微球显微镜照片(标尺：300μm)；(c)明胶微球的扫描电镜照片；(d) 经多巴胺修饰后明胶微球的扫
描电镜照片。结果表明经多巴胺修饰后，明胶微球整体吸光度增强，骨架微结构无明显改
变。

[0028] 图5：(a)明胶微球与神经前体细胞共混培养的显微镜照片，裸漏的明胶表面不支持神经前体细胞黏附，细胞更倾向于自我悬浮生长；(b)经多巴胺修饰12h后的明胶微球与
神经前体细胞共混培养的显微镜照片；(c)经多巴胺修饰24h 后的明胶微球与神经前体细
胞共混培养的显微镜照片；(d)经多巴胺修饰48h 后的明胶微球与神经前体细胞共混培养
的显微镜照片；结果表明，伴随着多巴胺修饰时间的延长，多巴胺明胶微球对神经细胞的黏
附能力逐渐增强。(标尺： 100μm)

[0029] 图6：(a)明胶微球与神经前体细胞共混培养时的细胞存活率柱状图(横坐标为细胞直径，纵坐标为细胞数量)，所合成的多巴胺明胶微球对细胞无明显毒害作用(图中仅有
直径约为4～5μm的部分细胞凋亡)；(b)神经前体细胞在正常悬浮培养(图中‘D17 1’标注)
和多巴胺明胶微球共混培养(图中‘材料2’标注)两种环境下，神经相关因子表达柱状对比
图(横坐标为基因名称，1为正常培养组，2为材料组。纵坐标为相关基因表达水平，)，相对于
传统培养方式，多巴胺明胶微球对神经元成熟分化具有明显的促进作用。所使用的多巴胺
明胶微球，直径为95μm～100μm，多巴胺处理时间为48h，培养天数为17d。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。

[0031] 实施例1：4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体的合成

[0032] 取10g猪皮明胶、1g 4‑(二甲氨基)吡啶加入到250mL三颈瓶中，向其中加入100mL二甲基亚砜，放置40℃水浴锅中，待充分溶解后，在N2保护下用玻璃注射器向其中缓慢滴入
4mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应两天后取出倒入渗析带(纤维素，截留分子量为
12000Da)，在40℃环境下去离子水渗析3天，每天更换去离子水三次，3天后将渗析液倒入烧
杯中，液氮冷冻后冻干，放入‑80℃环境下封存，得到4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油
酯修饰的明胶预聚体。

[0033] 实施例2：基底材料(孔道脱模时需要一个模板基底，称之为孔道模板基底；孔道健合时需要一个键合基底，称之为键合基底)的制备

[0034] 孔道模板基底为硅片(玻璃、硅片亦可)，键合基底为载波片，均用玻璃刀修剪至2.5cm×5cm；将上述基底依次加入正己烷、丙酮、乙醇、去离子水中超声 5min钟后取出，用
滴管吸干剩余的去离子水，加入适当体积的强氧化清洗液(质量分数为98％浓硫酸和质量
分数为30％过氧化氢的混合溶液，两者体积比为7： 3)，放在加热台上120℃加热1h后取下
放置室温，用去离子水充分清洗后保存在乙醇相中备用。

[0035] 实施例3：孔道模板的制备

[0036] 在作为孔道模板基底的硅片表面预先旋涂一层六甲基硅氧烷(旋涂条件为 2000rpm，45s)，然后在其表面继续旋涂一层AZ5214光刻胶(旋涂条件为1500rpm， 45s，厚度
为3μm)，旋涂后热台120℃烘干165s，将得到的匀胶硅片置于与所用微流体液滴芯片孔道结
构相同的掩版下紫外曝光28s，取出后放置光刻胶配套显影液下显影25s(曝光的的光刻胶
被去除)，去离子水冲洗后氮气吹干，得到表面含有图案化光刻胶的硅片基底。然后置于等
离子刻蚀机腔体中，刻蚀时间为 3min(刻蚀气压为6mTorr，刻蚀温度10℃，刻蚀功率为RF为
50W，ICP为100W)。取出后放入丙酮超声5min，去离子水冲洗吹干，放入等离子体清洗机清洗
5min，使表面富有羟基，再通过气相沉积法接枝1H，1H，2H，2H‑过氟辛基三氯硅烷增加表面
疏水性，获得“Y”字形结构的孔道模板。配置聚二甲基硅氧烷预聚体 (PDMS)与交联剂质量
比为10：1的预聚体溶液，充分搅拌后真空脱气0.5h，灌入已获得的孔道模板中，放置60℃烘
箱固化5h后取出，将PDMS从硅孔道模板上缓慢揭起，用打孔器分别在水相入口、油相入口和
液滴出口按压打孔(孔的直径为2mm)从而获得“Y”字形结构的PDMS孔道。

[0037] 水相输运孔道的宽度为150μm，长度为7mm；油相输运孔道的宽度为150μm，长度为2.5cm；液滴输运孔道的宽度为400μm，长度为3.5cm；水相入口与油相入口距离为9mm，水相
入口与液滴出口距离为2.5cm，单条油相输运孔道与水相输运孔道交叉处的夹角为60°，油
相入口、水相入口和液滴出口在同一直线上，孔道高度为80μm。油相输运孔道为两条，对称
分布在水相输运孔道两侧、距离水相输运孔道最大平行距离为7mm。

[0038] 实施例4：微液滴孔道键合

[0039] 将实施例4获得的“Y”字形结构的PDMS孔道与作为键合基底的载波片放置等离子体清洗机中，将PDMS孔道面和载玻片朝上清洗5min，取出后立即将 PDMS孔道面与载波片基
底清洗面贴合，缓慢赶出(因为两相贴合的过程中中间会留有一些气泡，所以需要缓慢挤
压，将气泡赶出)气泡，放置120℃加热台上去除孔道与硅片基底之间的水分，使孔道键和更
充分。

[0040] 实施例5：明胶微球合成

[0041] 取4‑(二甲氨基)吡啶与甲基丙烯酸甘油酯修饰的明胶预聚体0.5g、2959光引发剂0.025g，加入5mL的PBS，70℃水浴加热溶解；同时室温下配置矿物油溶液(含有质量分数为
20％的SPAN80)，待溶解充分后，用注射器吸取，用注射泵调节至水相流速为200μL/h，油相
流速为800μL/h，注入对应孔道入口；开始生产明胶微球，待微球生产稳定后，液滴出口处插
入聚四氟乙烯管开始收集，用培养皿接收。放置紫外曝光机中，培养皿距离紫外灯距离为
15cm，曝光5min后取出(紫外曝光灯波长为365nm，功率为1000mw)。经矿物油、含有TWEEN 20 
的PBS溶液(TWEEN 20体积分数为0.5％)、PBS溶液充分清洗后置于无菌PBS 溶液中备用。

[0042] 实施例6：多巴胺明胶微球的制备

[0043] 将实施例5已清洗好的明胶微球离心后去除上层液体，用注射器吸取4mL明胶微球，加入到50mL多巴胺Tris‑HCl缓冲溶液中(多巴胺质量分数为2mg/mL， Tris‑HCl缓冲溶
液浓度为10mM)，放置摇床中，每隔24h更换多巴胺溶液，时间节点为24h、48h和72h。明胶微
球取出后，用PBS冲洗后，放置PBS溶液中浸泡两天，去除里面残留的聚多巴胺分子，从而得
到多巴胺修饰的明胶微球。

[0044] 实施例7：神经细胞接种

[0045] 将已制备好的多巴胺修饰的明胶微球静止，取底部紧密堆积微球1mL，向其中注入5000个神经元细胞(北京动物所提供，经胚胎干细胞诱导所得)，共混均匀后培养。