分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用转让专利
申请号 : CN201911224500.2
文献号 : CN111269889B
文献日 : 2021-06-04
发明人 : 吴建祥 , 郭丽倩 , 吴佳瑜 , 钱亚娟 , 周雪平
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种分泌抗番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus，ToMMV)单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用。以提纯的ToMMV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗ToMMV单抗的杂交瘤细胞株2D6，其保藏号为CGMMC NO.18846。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10‑8，其与ToMMV发生特异性免疫反应，而不与同属的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)反应。利用2D6单抗建立检测番茄植株中ToMMV的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue print‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/mL)。分泌ToMMV高质量单抗杂交瘤细胞株的创制及该病毒血清学检测方法的建立为ToMMV的诊断和检测、流行病学调查及科学防控提供物质和技术支撑。
权利要求 :
1.一种分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6，其特征在于能分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMC NO.18846。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株2D6分泌的番茄斑驳花叶病毒单抗，其特征在‑8
于该单抗腹水间接ELISA效价达10 ，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，该单抗与番茄斑驳花叶病毒17.5 kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测感染ToMMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释，单位为重量/体积，g/mL。
说明书 :
分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
背景技术
[0002] 番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)是帚状病毒科(Viraviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的一个新种，基因组为正义单链RNA。ToMMV的基因组包含四个开放阅读框，
与烟草花叶病毒一样，它表达四种蛋白质，编码1个126kD和1个183kD复制需要的蛋白，还编
码1个30kD的运动蛋白和1个17.5kD的外壳蛋白。2013年该新病毒在墨西哥番茄上首次被发
现，随后在美国、以色列、巴西、西班牙等地的番茄上检出该病毒，我国云南省与海南省的番
茄也受到该病毒的侵染。
与烟草花叶病毒一样，它表达四种蛋白质，编码1个126kD和1个183kD复制需要的蛋白，还编
码1个30kD的运动蛋白和1个17.5kD的外壳蛋白。2013年该新病毒在墨西哥番茄上首次被发
现，随后在美国、以色列、巴西、西班牙等地的番茄上检出该病毒，我国云南省与海南省的番
茄也受到该病毒的侵染。
[0003] ToMMV可危害多种茄科作物，所致病害症状主要表现为植株矮化、叶片褪绿斑驳扭曲，引起严重的产品损失。该病毒具较高的稳定性，可在病残体中存活较长时间，并可附着
在种表或以病残体混杂在种子中实现远距离传播，易经机械摩擦在植株间传染。我国主要
茄科作物，如番茄、辣椒、烟草等多采用育苗移栽的方式栽培，部分番茄(如圣女果)还采用
嫁接育苗，加之田间管理过程中需经多次打杈、整枝、上架及采果等操作，因此，该病毒一旦
传入极易扩散流行。关于该病毒的发生规律、传播途径、病毒检测技术及病毒基因组功能的
研究甚少。
在种表或以病残体混杂在种子中实现远距离传播，易经机械摩擦在植株间传染。我国主要
茄科作物，如番茄、辣椒、烟草等多采用育苗移栽的方式栽培，部分番茄(如圣女果)还采用
嫁接育苗，加之田间管理过程中需经多次打杈、整枝、上架及采果等操作，因此，该病毒一旦
传入极易扩散流行。关于该病毒的发生规律、传播途径、病毒检测技术及病毒基因组功能的
研究甚少。
[0004] 为了调查我国多种茄科植物的该病害的发生情况、强化我国ToMMV检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测ToMMV经济有效、高通量的实用检测技术。与常规的指示
植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模
检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性
高质量的病毒抗体。本发明以纯化的ToMMV病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分
泌ToMMV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测ToMMV的高通量的血清
学方法及试剂盒，从而为我国ToMMV的检测诊断、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、组
培生产、抗性育种、科学防控建立等提供物质和技术支持。
植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模
检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性
高质量的病毒抗体。本发明以纯化的ToMMV病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分
泌ToMMV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测ToMMV的高通量的血清
学方法及试剂盒，从而为我国ToMMV的检测诊断、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、组
培生产、抗性育种、科学防控建立等提供物质和技术支持。
发明内容
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。
[0006] 分泌番茄斑驳花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株2D6，它能特异性分泌抗番茄斑驳花叶病毒的单抗，杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会
普通微生物中心，保藏号为CGMMC NO.18846。
普通微生物中心，保藏号为CGMMC NO.18846。
[0007] 一种所述的杂交瘤细胞分泌的番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，抗ToMMV病毒单克‑8
隆抗体腹水间接ELISA效价达10 ，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒
17.5kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检
测感染ToMMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/
mL)。
隆抗体腹水间接ELISA效价达10 ，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒
17.5kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检
测感染ToMMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/
mL)。
[0008] 抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体能与番茄斑驳花叶病毒有特异性免疫反应，而不与感染烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、感染番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病
毒、黄瓜花叶病毒病叶和健康植物组织发生免疫反应。
毒、黄瓜花叶病毒病叶和健康植物组织发生免疫反应。
[0009] 抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0010] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株能分泌大量抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue
print‑ELISA血清学检测方法及其免疫学试剂盒能高度特异、灵敏、准确地检测番茄斑驳花
叶病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测番茄斑驳花叶病毒，对操作人员的技术要
求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效
地用于田间番茄斑驳花叶病毒的检测诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因
组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。
print‑ELISA血清学检测方法及其免疫学试剂盒能高度特异、灵敏、准确地检测番茄斑驳花
叶病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测番茄斑驳花叶病毒，对操作人员的技术要
求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效
地用于田间番茄斑驳花叶病毒的检测诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因
组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。
附图说明
[0011] 图1为dot‑ELISA方法检测ToMMV的灵敏度分析；
[0012] 图2为ACP‑ELISA(A)、dot‑ELISA(B)和Tissue print‑ELISA(C)和RT‑PCR(D)检测田间番茄样品中ToMMV结果。2D图中的M代表1kb的DNAMarker。
[0013] g2和h2分别为感染ToMMV病叶阳性对照和健康番茄叶片阴性对照，其他样品为田间样品。
[0014] 生物保藏
[0015] 分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：
100101，保藏号为CGMMC NO.18846。
100101，保藏号为CGMMC NO.18846。
具体实施方式
[0016] 分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMC
NO.18846，它能分泌抗番茄斑驳花叶病毒的单抗。
NO.18846，它能分泌抗番茄斑驳花叶病毒的单抗。
[0017] 一种所述的杂交瘤细胞分泌番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，该单抗腹水间接‑8
ELISA效价达10 ，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒17.5kDa的外壳蛋
白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测感染番茄斑驳花
叶病毒的病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1∶40,960和1∶20,480倍稀释(w/v，g/mL)。
ELISA效价达10 ，抗体类型及亚类为IgG2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒17.5kDa的外壳蛋
白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测感染番茄斑驳花
叶病毒的病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1∶40,960和1∶20,480倍稀释(w/v，g/mL)。
[0018] 抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体能与番茄斑驳花叶病毒有特异性免疫反应，而不与感染烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、感染番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病
毒、黄瓜花叶病毒病叶和健康植物组织发生免疫反应。
毒、黄瓜花叶病毒病叶和健康植物组织发生免疫反应。
[0019] 抗番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0020] 本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测ToMMV的高通量
的血清学方法可成功应用于田间ToMMV的检测诊断，从而为我国ToMMV病检测和诊断、组培
的生产、科学防控提供物质和技术支持。
的血清学方法可成功应用于田间ToMMV的检测诊断，从而为我国ToMMV病检测和诊断、组培
的生产、科学防控提供物质和技术支持。
[0021] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0022] 一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0023] 1.免疫原及检测抗原的制备
[0024] 用以下操作步骤提纯病毒粒子：
[0025] 1)将组织匀浆器在冰上预冷；
[0026] 2)称取感染ToMMV的番茄病叶组织200g，加入400mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01M Na‑EDTA和0.1％巯基乙醇，pH 7.5)，在组织匀浆器中匀浆5‑10min使植物组织
充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6,000rpm离心20min去除植物残渣；
充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6,000rpm离心20min去除植物残渣；
[0027] 3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％Triton X‑100、4％PEG(分子量为6,000)和0.1M NaCl，然后4℃搅拌过夜；
[0028] 4)11,000rpm离心15min后去上清；
[0029] 5)用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6,000rpm离心15min后将上清收集于烧杯中于4℃放置，沉淀再悬浮、离心，重复3次；
[0030] 6)将上述离心上清液合并，33,000rpm超速离心100min；
[0031] 7)所得沉淀用PB悬浮后8,000rpm离心15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离心，重复3次；
[0032] 8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取30％蔗糖加到超离管的底部形成蔗糖垫，33,000rpm超速离心100min；
[0033] 9)所得沉淀用20mL的0.01M PB(含0.01M MgCl2，pH 7.5)悬浮，33,000rpm超速离心100min，去除蔗糖垫；
[0034] 10)所得沉淀用0.01M PB悬浮，所得悬浮液即为病毒提纯液；
[0035] 11)病毒提纯液经3％磷钨酸(pH 6.7)负染后，置于JEOL JEM‑1200EX电镜下观察发现大量高纯度的ToMMV杆状病毒粒子。
[0036] 2.免疫动物
[0037] 用提纯的ToMMV病毒粒子免疫9周龄BALB/c雌性小鼠：以在60μL/只的双抗生理盐水中加入40μL/只的ToMMV病毒粒子为病毒抗原，与等体积即100μL/只弗氏完全佐剂混合，
充分乳化后经腹腔加皮下注射200μL/只，间隔3周，第二次取20μL/只ToMMV病毒粒子加入80
μL/只的双抗生理盐水的病毒抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，腹腔注射200μ
L/只，3周后用与第一次免疫相同体积的病毒抗原进行腹腔注射，第三次免疫后3天取脾细
胞进行融合。
充分乳化后经腹腔加皮下注射200μL/只，间隔3周，第二次取20μL/只ToMMV病毒粒子加入80
μL/只的双抗生理盐水的病毒抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，腹腔注射200μ
L/只，3周后用与第一次免疫相同体积的病毒抗原进行腹腔注射，第三次免疫后3天取脾细
胞进行融合。
[0038] 3.细胞融合
[0039] 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按11:1的比例在无血清的RPMI‑1640(Gibco)培养基中混匀，1,500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在
37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1,500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI‑1640培养
基终止融合后1,500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板
中，于37℃5％CO2的细胞培养箱中培养。
37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1,500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI‑1640培养
基终止融合后1,500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板
中，于37℃5％CO2的细胞培养箱中培养。
[0040] 4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及细胞克隆
[0041] 细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第12天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底15％以上时，以感染ToMMV的番茄病叶粗提液为包被抗原用间接ELISA方法
筛选抗体阳性孔，共获135个分泌ToMMV的阳性孔。对135阳性孔的抗体进行特异性和灵敏度
分析，筛选出17个特异性和灵敏度较好的细胞孔，进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分
泌抗ToMMV高度特异和灵敏单抗的杂交瘤细胞株2D6，即前述保藏号为CGMMC NO.18846的杂
交瘤细胞株。经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌
抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
筛选抗体阳性孔，共获135个分泌ToMMV的阳性孔。对135阳性孔的抗体进行特异性和灵敏度
分析，筛选出17个特异性和灵敏度较好的细胞孔，进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分
泌抗ToMMV高度特异和灵敏单抗的杂交瘤细胞株2D6，即前述保藏号为CGMMC NO.18846的杂
交瘤细胞株。经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌
抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
[0042] 5.单克隆抗体腹水制备及纯化
[0043] 取12周龄BALB/c雄性小鼠，腹腔注射0.4mL降植烷，7‑10天后腹腔注入7×105个杂交瘤细胞，注射杂交瘤细胞后6‑10天可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8,000rpm离
心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。
心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。
[0044] 取1倍体积腹水加2倍体积0.85％生理盐水稀释，室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液(pH 7.0)，4℃过夜，12,000rpm离心20min，2mL 0.85％生理盐水悬浮沉淀，在4℃
0.85％生理盐水中透析24h后即获纯化的单抗，‑80℃保存。
0.85％生理盐水中透析24h后即获纯化的单抗，‑80℃保存。
[0045] 6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
[0046] 将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果分析2D6单抗亚类为IgG2a、κ轻链。以提纯的病毒粒子为抗
‑8
原，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10 。
‑8
原，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10 。
[0047] 7.单克隆抗体的特异性检测
[0048] 用感染烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的病叶粗提液包被ELISA板，以番茄健康叶片和烟草健康叶片粗提液作阴性对照，以感染ToMMV的番
茄病叶粗提液为阳性对照，用间接ELISA方法分析单抗的特异性。间接ELISA方法的步骤：上
述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:30比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被
液匀浆，8,000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h；PBST洗涤3次
后用3％的脱脂奶粉封闭30min；加入1:5,000倍稀释的单抗100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗
涤3次后加:1:8 000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/
孔，37℃孵育1h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30‑60min，3mol/L氢氧化钠终止反应后，用
酶标仪读取OD405的值，与阴性OD值比值大于3.0的样品为阳性。结果发现，2D6单抗对ToMMV
有强阳性免疫反应，而与感染ToMV、TMV、CMV的病叶和健康烟草和番茄的植物组织粗提液均
无任何免疫反应。
茄病叶粗提液为阳性对照，用间接ELISA方法分析单抗的特异性。间接ELISA方法的步骤：上
述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:30比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被
液匀浆，8,000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h；PBST洗涤3次
后用3％的脱脂奶粉封闭30min；加入1:5,000倍稀释的单抗100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗
涤3次后加:1:8 000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/
孔，37℃孵育1h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30‑60min，3mol/L氢氧化钠终止反应后，用
酶标仪读取OD405的值，与阴性OD值比值大于3.0的样品为阳性。结果发现，2D6单抗对ToMMV
有强阳性免疫反应，而与感染ToMV、TMV、CMV的病叶和健康烟草和番茄的植物组织粗提液均
无任何免疫反应。
[0049] 二、检测ToMMV血清学方法的建立
[0050] 1检测ToMMV的ACP‑ELISA检测方法
[0051] 1.1ACP‑ELISA方法的步骤：
[0052] 1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液继续匀浆3min，5.000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，以感染ToMMV的番茄叶片组织作为阳性对
照，以健康番茄叶片组织作阴性对照，4℃包被过夜或37℃包被2h；
照，以健康番茄叶片组织作阴性对照，4℃包被过夜或37℃包被2h；
[0053] 2)用PBST洗ELISA板3次，每次3min，之后每孔加入250μL封闭液(含3％脱脂奶的PBS)，37℃封闭0.5‑1h；
[0054] 3)弃ELISA板中封闭液，PBST洗涤3次后，用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃孵育1‑2h；
[0055] 4)弃ELISA板中单抗稀释液，PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃反应1‑2h；
[0056] 5)PBST洗涤4次，每次3min。加PNPP底物于室温显色30‑60min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或3M氢氧化钠终止反应后用Bio‑Rad 680酶标仪测OD405，以P/N>
3.0作为阳性判断标准。
3.0作为阳性判断标准。
[0057] 1.2检测ToMMV ACP‑ELISA方法的建立
[0058] 采用方阵试验确定ACP‑ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用1:30倍稀释的(w/v,g/mL)ToMMV病叶粗提液作为抗原包被ELISA板；ELISA板横向每列加入1:1,000‑1:512,
000倍比稀释的ToMMV单抗反应1h，PBST洗涤后ELISA板纵向每行加入1:1,000‑1:512,000倍
比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康番茄植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3
次重复，确定ACP‑ELISA的最适抗体工作浓度。结果显示2D6单抗以1:5,000倍稀释和AP标记
的羊抗鼠IgG二抗以1:8,000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测ToMMV的
ACP‑ELISA方法。
000倍比稀释的ToMMV单抗反应1h，PBST洗涤后ELISA板纵向每行加入1:1,000‑1:512,000倍
比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康番茄植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3
次重复，确定ACP‑ELISA的最适抗体工作浓度。结果显示2D6单抗以1:5,000倍稀释和AP标记
的羊抗鼠IgG二抗以1:8,000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测ToMMV的
ACP‑ELISA方法。
[0059] 1.3ACP‑ELISA方法的特异性和灵敏度
[0060] 以感染ToMMV的番茄病叶和健康番茄叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染TMV番茄病叶、感染ToMV番茄病叶、感染番茄斑萎病毒(TSWV)病叶、感染番茄黄化
曲叶病毒(TYLCV)病叶、感染番茄黑环病毒(TBRV)病叶、感染CMV黄瓜病叶、健康番茄叶片作
为检测样品，重复实验三次，分析ToMMV单抗及建立的ACP‑ELISA方法的特异性。在抗体最适
工作浓度下，该方法检测感染ToMMV的病叶呈强阳性反应，而检测感染TMV、ToMV、TSWV、
TYLCV、TBRV、CMV植物叶片、健康番茄叶片粗提液呈阴性反应，且OD值差异极显著，说明该方
法和单抗的特异性好。
曲叶病毒(TYLCV)病叶、感染番茄黑环病毒(TBRV)病叶、感染CMV黄瓜病叶、健康番茄叶片作
为检测样品，重复实验三次，分析ToMMV单抗及建立的ACP‑ELISA方法的特异性。在抗体最适
工作浓度下，该方法检测感染ToMMV的病叶呈强阳性反应，而检测感染TMV、ToMV、TSWV、
TYLCV、TBRV、CMV植物叶片、健康番茄叶片粗提液呈阴性反应，且OD值差异极显著，说明该方
法和单抗的特异性好。
[0061] 将感染ToMMV的烟草病叶、健康番茄叶片和健康番茄叶片分别用PBS缓冲液从1:20倍至1:81,920倍(w/v,g/mL)倍比稀释，倍比稀释的粗提液依次加到ELISA板，分析ACP‑
ELISA方法检测ToMMV的灵敏度，实验重复三次。结果表明，ACP‑ELISA检测病叶的灵敏度达
到1:40,960倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。
ELISA方法检测ToMMV的灵敏度，实验重复三次。结果表明，ACP‑ELISA检测病叶的灵敏度达
到1:40,960倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。
[0062] 2dot‑ELISA检测方法的建立及其特异性和灵敏度分析
[0063] 2.1dot‑ELISA检测步骤
[0064] 1)在研钵中研磨植物组织，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.01M PBS缓冲液匀浆，5,000rpm离心3min，上清即为植物组织粗提液；
[0065] 2)点样：取2‑3μL粗提液点到硝酸纤维素(NC)膜上，同时设置健康和感染ToMMV的病叶叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照，37℃恒温箱烘干10min；
[0066] 3)NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween‑20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；然后，NC膜放入1:5,000稀释的单抗中室温孵育1h；
[0067] 5)洗膜：用PBST洗膜3次，每次3min；
[0068] 6)NC膜放入1:8,000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h后洗膜4‑5次，每次3min；
[0069] 7)显色：66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)混匀，用吸水纸把膜吸干，膜放入底物液中反应，室温
避光显色15‑20min。肉眼观察结果，当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变色时膜在自
来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。
避光显色15‑20min。肉眼观察结果，当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变色时膜在自
来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。
[0070] 2.2检测ToMMV dot‑ELISA方法的建立
[0071] 从1:1,000倍开始分别进行倍比稀释ToMMV单克隆抗体和AP标记的羊抗鼠IgG二抗，用方阵实验确定dot‑ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。实验结果表明，单
抗和酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5,000和1:8,000倍稀释，以上述抗体的最适工作浓
度建立检测植物中ToMMV的dot‑ELISA方法。
抗和酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5,000和1:8,000倍稀释，以上述抗体的最适工作浓
度建立检测植物中ToMMV的dot‑ELISA方法。
[0072] 2.3dot‑ELISA方法检测ToMMV的特异性和灵敏度
[0073] 以感染ToMMV的番茄病叶和健康番茄叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，以感染番茄斑萎病毒(TSWV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)、番茄黑环病毒(TBRV)、TMV、
ToMV番茄病叶、感染CMV黄瓜病叶以及健康番茄叶片作为检测样品，进行dot‑ELISA方法的
特异性分析。该方法检测感染ToMMV的番茄病叶粗提液呈强阳性反应，而检测感染TMV、
ToMV、TSWV、TYLCV、TBRV、CMV植物病叶以及健康番茄叶片粗提液均呈阴性反应，说明该方法
和单抗的特异性非常的好。
ToMV番茄病叶、感染CMV黄瓜病叶以及健康番茄叶片作为检测样品，进行dot‑ELISA方法的
特异性分析。该方法检测感染ToMMV的番茄病叶粗提液呈强阳性反应，而检测感染TMV、
ToMV、TSWV、TYLCV、TBRV、CMV植物病叶以及健康番茄叶片粗提液均呈阴性反应，说明该方法
和单抗的特异性非常的好。
[0074] 取感染ToMMV的番茄病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS从1:10至1:81920倍倍比稀释(w/v,g/mL)，同样对健康番茄叶片粗提液作相同处理。用dot‑ELISA方法检测感染
ToMMV病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当ToMMV病叶粗提液稀释到1:20480倍(w/v,g/mL)
时，用建立的dot‑ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:20480
倍稀释(图1)。
ToMMV病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当ToMMV病叶粗提液稀释到1:20480倍(w/v,g/mL)
时，用建立的dot‑ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:20480
倍稀释(图1)。
[0075] 3.检测ToMMV的Tissue print‑ELISA方法的建立及其田间样品检测
[0076] 3.1Tissue print‑ELISA操作步骤:
[0077] 1)样品准备：取番茄或烟草的茎秆，用刀片切一个横断面；
[0078] 2)点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染ToMMV植物组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；
[0079] 3)封闭：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween‑20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭0.5h；
[0080] 4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的ToMMV单抗中室温孵育1h；
[0081] 5)PBST洗膜3次，每次3min；
[0082] 6)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；
[0083] 7)PBST洗膜4‑5次，每次3min；
[0084] 8)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH 9.5)中加入66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，
直至阳性显色明显、阴性对照没有显色时将膜在自来水中漂洗终止反应，记录显色结果。
直至阳性显色明显、阴性对照没有显色时将膜在自来水中漂洗终止反应，记录显色结果。
[0085] 3.2Tissue print‑ELISA最适抗体工作浓度的确定及其田间样品检测
[0086] 通过常规方阵实验确定Tissue print‑ELISA中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、酶标二抗稀释度组合为Tissue print‑ELISA的最适
工作浓度。结果发现单抗2D6和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5,000和1:8,000倍时
Tissue print‑ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue
print‑ELISA方法。
工作浓度。结果发现单抗2D6和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5,000和1:8,000倍时
Tissue print‑ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue
print‑ELISA方法。
[0087] 4.血清学方法的田间样品检测应用
[0088] 用建立的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue print‑ELISA方法对2019年采自云南和海南的田间疑似发病番茄样品进行检测，检测结果发现，38个番茄检测样品中有16个样品
产生阳性反应(图2A‑2C)。样品同时用RT‑PCR方法进行分析，结果表明所有血清学方法检测
阳性样品中均扩增到ToMMV特异性基因片段，而所有血清学检测阴性的样品中均未扩增到
特异性基因片段(图2D)，PCR产物核酸测序及序列比对分析表明，RT‑PCR阳性样品确实感染
ToMMV。说明该ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue print‑ELISA方法能准确、可靠地用于植物
中ToMMV的检测。
产生阳性反应(图2A‑2C)。样品同时用RT‑PCR方法进行分析，结果表明所有血清学方法检测
阳性样品中均扩增到ToMMV特异性基因片段，而所有血清学检测阴性的样品中均未扩增到
特异性基因片段(图2D)，PCR产物核酸测序及序列比对分析表明，RT‑PCR阳性样品确实感染
ToMMV。说明该ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue print‑ELISA方法能准确、可靠地用于植物
中ToMMV的检测。
[0089] 5.番茄斑驳花叶病毒dot‑ELISA检测试剂盒
[0090] 1)试剂盒主要成分：
[0091]
[0092] 以上试剂均保存于4℃
[0093] 硝酸纤维素膜(NC)10张
[0094] 脱脂奶粉30g
[0095] 10X PBST 1瓶 100mL
[0096] 底物缓冲液1瓶 100mL
[0097] 2)检测番茄样品的操作步骤：
[0098] a.番茄植物组织称重、在研钵中研磨，按1:20‑50比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后匀浆；
[0099] b.匀浆液5,000rpm离心3min；
[0100] c.取2.5μL上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染ToMMV的番茄组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10‑20min；
[0101] d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween‑20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；
[0102] e.NC膜放入1:5,000倍稀释的单抗中室温孵育30‑60min；
[0103] f.用PBST洗膜3‑4次，每次3min；NC膜放入1:8,000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30‑60min；
[0104] g.PBST洗膜4‑5次，每次3min；
[0105] h.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显
紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。
紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。
[0106] 3)保存及有效期：
[0107] 于2‑8℃避光保存，有效期12个月。
[0108] 4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)配方：
[0109]
[0110]
[0111] 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL
[0112] 6.番茄斑驳花叶病毒Tissue print‑ELISA检测试剂盒
[0113] 1)试剂盒主要成分：
[0114]
[0115] 以上试剂均保存于4℃
[0116] 硝酸纤维素膜(NC)10张
[0117] 脱脂奶粉30g
[0118] 10X PBST 1瓶 100mL
[0119] 底物缓冲液1瓶 100mL
[0120] 2)检测番茄样品的操作步骤：
[0121] a.样品准备：取番茄的叶片或茎，将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面，嫩茎直接切成横断面；
[0122] b.点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染ToMMV组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；
[0123] c.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween‑20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；
[0124] d.NC膜放入1:5,000倍稀释的单抗中室温孵育30‑60min；
[0125] e.用PBST洗膜3‑4次，每次3min；NC膜放入1:8,000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30‑60min；
[0126] f.PBST洗膜4‑5次，每次3min；
[0127] g.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫
色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。
色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。
[0128] 3)保存及有效期：
[0129] 于2‑8℃避光保存，有效期12个月。
[0130] 4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)配方：
[0131]
[0132] 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL。