一种血清自身抗体联合检测的方法

摘要

本发明属于肿瘤相关标志物诊断或检测技术领域，具体地说，是关于自身抗体或自身抗体的检测试剂在制备诊断肿瘤的产品中的应用以及血清自身抗体联合检测的方法。本方法使用的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。本发明将抗原蛋白包被在固相载体上，通过检测信号分子强度，能够测出与蛋白有亲和力的自身抗体的水平。本方法可以很好地区分癌症与健康人，提供了以自身抗体为指标进行癌症筛选的一个优化方法。

权利要求

1.自身抗体或自身抗体的检测试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用，所述的自身抗体选自下列任一种抗原蛋白组合的自身抗体：(1)CTAG1A，ANXA1，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

(2)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

(3)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，GAGE7，p53，ETHE1；

(4)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53；或(5)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

2.权利要求1所述的应用，所述的自身抗体为IgG和/或IgA。

3.权利要求1所述的应用，所述的自身抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE或IgD。

4.权利要求1所述的应用，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

5.权利要求1所述的应用，所述的肺癌选自肺腺癌，肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌。

说明书

一种血清自身抗体联合检测的方法

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤相关标志物诊断或检测技术领域，具体地说，是关于自身抗体或自身抗体的检测试剂在制备诊断肿瘤的产品中的应用以及血清自身抗体联合检测的方法。

背景技术

[0002] 根据世界卫生组织数据显示，2018年，全球新患癌症人数达1810万人，960万人因癌症死亡。2018年全球发生209万例肺癌新病例，在所有癌症类型中排名第一。根据国家癌症中心2017年的统计数据，肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中都排第一。发病率在男性中位列第一(20.27％)，在女性中发病率为14.94％仅次于乳腺癌(17.07％)。死亡率在男性和女性中都占据第一位，分别为23.89％何17.70％。据预测，2015年至2030年，中国的肺癌死亡率可能会增加约40％。

[0003] 肺癌在组织学上可分为两大类：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC约占诊断出肺癌的79％，包括腺癌，鳞状细胞癌和大细胞癌。尽管近年来针对肺癌的靶向疗法和免疫疗法取得了巨大进步，但外科切除，辅助放疗和/或化疗仍然是早期治疗NSCLC患者的首选方法。尽管近年来所有癌症的存活率都有所提高，但肺癌的存活率仍处于较低水平。在2012-2015年，男性肺癌的存活率为16.8％，比存活率最高的甲状腺癌低
62.5％，女性的存活率也仅在为25.1％。肺癌的低存活率和诊断技术的局限性相关，大多数肺癌患者在诊断时被发现处于晚期，失去了最佳的治疗时机。当前，胸部高分辨率(或小剂量)计算机断层扫描(LDCT)是唯一可有效降低肺癌早期死亡率的筛查试验。许多地区建立了LDCT免费筛查高危人群的项目。美国曾有一项研究表明，LDCT筛查具有较好的肺癌早筛潜力，或许可将肺癌高危人群的死亡率降低20％。但临床转化仍然是问题。LDCT的问题还在于较高的假阳性率一定程度上会导致过度诊断。重复暴露于放射线也可能会导致潜在的健康危害。因此，发现用于早期肺癌诊断的非侵入性血清学生物标记物将大大有利于肺癌的干预和预防。采用基于生物标志物的初始筛选后进行LDCT或将生物标志物测试与LDCT相结合的方法成为了更好的肺癌诊断手段。

[0004] 人们在100多年前就察觉到了机体的免疫系统对肿瘤可能有防治的作用。肿瘤的生长伴随着一些带有抗原性性质的物质产生。这些物质不再被机体当作“自身”，而是被当作抗原对待。免疫系统会产生抗体去消灭这些抗原。这些抗体叫做自身抗体。自身抗体自上世纪70年代被发现以来，人们已经鉴别出了成百上千种自身抗体。肿瘤相关自身抗体检测为癌症检测提供了一种替代方法。这种方法有望通过在癌症患者血清内检测到高表达(相对于健康人和良性肿瘤)的自身抗体来实现。当前的在临床中运用得比较多的是肿瘤相关抗原，例如碳水化合物抗原(CA)125，CA19-9，癌胚抗原(CEA)和α胎儿蛋白(AFP)。这些标志物在血清中的含量是随着肿瘤大小的增长而增高的，所以肿瘤相关抗原在癌症早期的灵敏度和特异性都非常差，并且在感染、良性肿瘤或者妊娠中可能出现假阳性结果。自身抗体在肿瘤发生的早期产生，可在出现临床症状之前五年被检测到。在癌症早期，检测出来的肿瘤相关抗原的信号非常弱，但由于自身抗体的浓度远远高于抗原，所以检测自身抗体相当于得到了一个放大的信号。自身抗体在血液循环中的半衰期达到了30天，在体外也比其他的标志物要稳定。自身抗体检测具有经济合算、操作简便等优点。自身抗体检测可以直接在现有的临床检测平台利用存档的血清实现。

[0005] 对于单一的抗原蛋白，其自身抗体仅在10％-30％的病人中出现，作为诊断工具而言，灵敏度较低。这可能和肿瘤的异质性和免疫反应的多样性相关。即使对于同一种癌症，不同患者的免疫系统反应也不尽相同，因此有必要结合多种自身抗体，在维持较高的特异性的前提下，提高检测的灵敏度。近年来，很多研究倾向于检测一系列自身抗体来进行癌症诊断。例如，Zhang等建立了一个含有七个自身抗体标志物的组合(14-3-3ζ,c-Myc,MDM2,NPM1,p16,p53 and cyclin B1)来检测肺癌患者和健康对照血清中相应自身抗体水平。结果显示该组合可将灵敏度提高至68.9％，将特异性提高至79.5％。他们同时也检测了一系列肺癌患者在被确诊前的血清，发现在肺癌确诊前四年多即可检测到升高的自身抗体水平。灵敏度和特异性分别为76.0％和73.2％(Dai,Liping,et al."Autoantibodies against tumor-associated antigens in the early detection of lung cancer."Lung Cancer99(2016):172-179.)。

[0006] 肿瘤相关抗原的自身抗体可先于临床症状几个月甚至几年出现明显增加。自身抗体经过B细胞增殖的多级放大，比抗原更容易被检测到。多种自身抗体同时检测解决了单一自身抗体低灵敏度的问题，为癌症的早期诊断和术后监测提供了一个高特异性、高灵敏度的方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种诊断肿瘤的标志物，所述的标志物为自身抗体，通过检测自身抗体实现对肿瘤患者早期的诊断。解决了以抗原蛋白作为诊断标志物特异性和灵敏度差的问题，而且可以在临床症状出现前五年诊断出来，为癌症的早期诊断和术后检测提供了一种高特异性、高灵敏度的方法。

[0008] 为了达到以上目的，本发明提供了自身抗体或自身抗体的检测试剂在制备诊断肿瘤的产品中的应用，所述的自身抗体选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。

[0009] 其中，所述的两种以上可以为两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。

[0010] 优选的，所述的自身抗体为IgG和/或IgA。进一步优选的，所述的自身抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE或IgD。

[0011] 优选的，所述的自身抗体选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的五种、六种、七种或八种的组合。

[0012] 优选的，所述的检测试剂包括抗原蛋白，所述的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。

[0013] 其中，所述的两种以上可以为两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。

[0014] 进一步优选的，所述的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的五种、六种、七种或八种的组合。

[0015] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的自身抗体选自下列任一种组合：

[0016] (a)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；

[0017] (b)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，ANXA1；

[0018] (c)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，MAGEA4；

[0019] (d)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，GAGE7；

[0020] (e)ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0021] (f)CTAG1A，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0022] (g)CTAG1A，ANXA1，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0023] (h)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0024] (i)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，GAGE7，p53，ETHE1；

[0025] (j)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；

[0026] (k)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，ETHE1；

[0027] (l)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53；或

[0028] (m)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0029] 优选的，所述的肿瘤为肺癌。所述的肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。进一步优选包括但不限于肺腺癌，肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌。

[0030] 本发明还提供了一种诊断肿瘤的产品，所述的产品包括自身抗体的检测试剂，所述的自身抗体选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。

[0031] 其中，所述的两种以上可以为两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。

[0032] 优选的，所述的自身抗体为IgG和/或IgA。进一步优选的，所述的自身抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE或IgD。

[0033] 优选的，所述的自身抗体选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的五种、六种、七种或八种的组合。

[0034] 优选的，所述的检测试剂包括抗原蛋白，所述的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。

[0035] 其中，所述的两种以上可以为两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。

[0036] 进一步优选的，所述的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的五种、六种、七种或八种的组合。

[0037] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的自身抗体选自下列任一种组合：

[0038] (a)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；

[0039] (b)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，ANXA1；

[0040] (c)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，MAGEA4；

[0041] (d)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，GAGE7；

[0042] (e)ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0043] (f)CTAG1A，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0044] (g)CTAG1A，ANXA1，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0045] (h)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0046] (i)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，GAGE7，p53，ETHE1；

[0047] (j)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；

[0048] (k)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，ETHE1；

[0049] (l)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53；或

[0050] (m)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0051] 优选的，所述的肿瘤为肺癌。所述的肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。进一步优选包括但不限于肺腺癌，肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌。

[0052] 本发明进一步提供了一种自身抗体的检测方法，所述的自身抗体选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。

[0053] 其中，所述的两种以上可以为两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。

[0054] 优选的，所述的自身抗体为IgG和/或IgA。进一步优选的，所述的自身抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE或IgD。

[0055] 进一步优选的，所述的自身抗体选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的五种、六种、七种或八种的组合。

[0056] 优选的，所述的自身抗体选自下列任一种组合：

[0057] (a)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；

[0058] (b)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，ANXA1；

[0059] (c)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，MAGEA4；

[0060] (d)CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，GAGE7；

[0061] (e)ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0062] (f)CTAG1A，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0063] (g)CTAG1A，ANXA1，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0064] (h)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；

[0065] (i)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，GAGE7，p53，ETHE1；

[0066] (j)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；

[0067] (k)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，ETHE1；

[0068] (l)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53；或

[0069] (m)CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0070] 优选的，所述的检测方法包括将抗原蛋白固定于固相载体上。其中，所述的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的两种以上的组合。其中，所述的两种以上可以为两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。进一步优选的，所述的抗原蛋白选自CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1中的五种、六种、七种或八种的组合。

[0071] 优选的，所述固相载体包括但不限于酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合。

[0072] 优选的，所述抗原蛋白的固定方法包括直接包被法和间接包被法。其中，直接包被法是将抗原蛋白直接固定于固相载体上。间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上。

[0073] 优选的，所述的检测方法包括可见光显色法、化学发光法或荧光发光法等的信号检测。

[0074] 优选的，所述的检测试剂还包括有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液等。

[0075] 优选的，其用途为肿瘤诊断；进一步优选的，所述检测方法在肺癌辅助诊断中的用途。

[0076] 优选的，所述的肿瘤为肺癌。所述的肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。进一步优选包括但不限于肺腺癌，肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌。

[0077] 本发明所述的抗原蛋白可以为天然或人工合成。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原蛋白为人工合成的，具体步骤为，以含目的基因的克隆质粒为模板，PCR扩增所需基因片段，将其导入大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达、纯化获得。本发明所述的自身抗体可以为人或非人动物的血清、血浆、组织间隙液、脑脊液或尿液中的自身抗体。所述的非人动物为非人哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、猴子、斑马鱼、猪、鸡、兔子等。

[0078] 本发明所述的“产品”包括但不限于试剂盒，所述的试剂盒中包含抗原蛋白与自身抗体反应所需的试剂，还包括固相载体及抗原蛋白与固相载体结合所需的试剂，也包括洗脱未结合物质的试剂等常规选择的试剂。

[0079] 本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。优选的，所述的肿瘤为肺癌。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为肺腺癌，肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌。

[0080] 本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。

[0081] 本发明提供了一种新的癌症检测方法，通过检测多个自身抗体来提高检测的灵敏度和特异性，为临床上癌症筛查和辅助诊断提供了可能；操作方便简单，成本低廉，且能以血清作为检测样品，对患者伤害很低。本发明具备良好的应用前景。

[0082] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0083] 以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0084] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

[0085] 图1：肺癌患者与健康对照中多种自身抗体的水平对比，其中，图1A为CTAG1A；图1B为ANXA1；图1C为MAGEA4；图1D为ELAVL4；图1E为UCHL1；图1F为GAGE7；图1G为p53；图1H为ETHE1。

[0086] 图2：肺癌患者与健康对照血清浆中自身抗体ROC分析图，其中图2A为CTAG1A；图2B为ANXA1；图2C为MAGEA4；图2D为ELAVL4；图2E为UCHL1；图2F为GAGE7；图2G为p53；图2H为ETHE1。

[0087] 图3：不同抗原组合在肺癌和健康患者中的ROC分析图，其中图3A为CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；图3B为CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，ANXA1；图3C为CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，MAGEA4；图3D为CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，GAGE7；图3E为ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；图3F为CTAG1A，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；图3G为CTAG1A，ANXA1，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；图3H为CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1；图3I为CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，GAGE7，p53，ETHE1；图3J为CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1；图3K为CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，ETHE1；图3L为CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53；图3M为CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

具体实施方式

[0088] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0089] 实施例1重组抗原蛋白表达及纯化

[0090] 以含目的基因的克隆质粒为模板，通过PCR扩增获得所需基因片段。所述的CTAG1A，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:1所示；所述的ANXA1，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:2所示；所述的MAGEA4，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:3所示；所述的所述的ELAVL4，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4所示；所述的UCHL1，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:5所示；所述的GAGE7，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:6所示；所述的p53，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:7所示；所述的ETHE1，其氨基酸序列可以如SEQ ID NO:8所示。

[0091] 将质粒载体pET-21a(+)用BamHI和EcoRI酶切进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit回收载体大片段。PCR产物同样用BamHI和EcoRI双酶切后回收，在重组酶作用下连接入载体。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志(抗氨苄)作筛选，挑取单斑，获得的重组质粒采用菌落PCR和测序鉴定确认包含正确的外源片段。

[0092] 将上述获得的包含抗原片段的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，获得的重组抗原蛋白经Ni-NTA柱和分子筛两步纯化后用Bradford法定量，采用SDS-PAGE鉴定确认抗原蛋白表达、纯化和定量结果，将获得的抗原蛋白储存，备用。

[0093] 实施例2多个自身抗体联合检测

[0094] 一、临床样本

[0095] 选取肺癌患者160例，健康对照107例，基本信息如表1所示：

[0096] 表1

[0097]

[0098] 二、检测原理

[0099] 酶标孔板上固定有实施例1制备获得的CTAG1A、ANXA1、MAGEA4、ELAVL4、UCHL1、GAGE7、p53和ETHE1抗原蛋白，加血清孵育后，血清中各抗原蛋白对应自身抗体(主要包括IgG、IgA型抗体，也有一些其它类型的抗体)会结合上去，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再加入抗人IgG辣根过氧化物酶标记二抗孵育后，洗去未结合二抗，加入辣根过氧化物酶底物，待底物显色后，通过酶标仪检测，信号的强弱与自身抗体的数量呈正相关。

[0100] 三、方法

[0101] 本部分所用到的试剂如表2所示：

[0102] 表2

[0103]

[0104]

[0105] 1)包被抗原蛋白：用包被缓冲液将蛋白稀释，在聚苯乙烯板的反应孔中分别加入稀释后的蛋白50ng/孔，4℃过夜；

[0106] 2)复温：将酶标板从4℃冰箱取出，置于室温复温半小时，洗涤四次。

[0107] 3)封闭：加封闭液,37℃孵育一小时,洗涤两次；

[0108] 4)加入血清样本：加入1:200稀释的血清样品，放置于侧摆摇床12rpm室温孵育2.5h,洗涤四次(血清需提前放置于4℃冻融，稀释后的血清先震荡混匀再加样)；

[0109] 5)加酶标抗体：于各反应孔中，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG(4μg/ml)。放置于侧摆摇床12rpm室温避光孵育1小时，洗涤两次；

[0110] 6)加显色底物：于各反应孔中加入50μl临时配置的TMB底物溶液；

[0111] 7)终止：待孔中液体变蓝后，于各反应孔中加入25μl 2M H2SO4；

[0112] 8)上机读数：在TECAN F50酶标仪中测量0D 450的读数，并保存数据。

[0113] 选取不同的抗原组合如下：

[0114] 1.CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1。

[0115] 2.CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，ANXA1。

[0116] 3.CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，MAGEA4。

[0117] 4.CTAG1A，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1，GAGE7。

[0118] 5.ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0119] 6.CTAG1A，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0120] 7.CTAG1A，ANXA1，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0121] 8.CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0122] 9.CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，GAGE7，p53，ETHE1。

[0123] 10.CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，p53，ETHE1。

[0124] 11.CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，ETHE1。

[0125] 12.CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53。

[0126] 13.CTAG1A，ANXA1，MAGEA4，ELAVL4，UCHL1，GAGE7，p53，ETHE1。

[0127] 不同抗原组合的特异性及敏感性如表3所示：

[0128] 表3

[0129]

[0130] 四、结果分析

[0131] 1.根据现有的样本分析显示，肺癌患者血浆中的CTAG1A(图1A)、ELAVL4(图1D)、UCHL1(图1E)、p53(图1G)和ETHE1(图1H)自身抗体的表达水平与健康对照组有显著统计学差异。

[0132] 2.在肺癌组与健康组单指标自身抗体ROC分析(图2)中，在特异性为90％时，CTAG1A(图2A)、ELAVL4(图2D)和p53(图2G)的灵敏度较好，分别为35.4％、23.3％和32.3％。

[0133] 3.在不同抗原组合鉴定肺癌和健康人的ROC分析(图3)中，在特异性为90％时，通过组合不同抗原，相较于单指标，灵敏度可见明显提升。其中组合7、8、9、12和13，在特异性为90％时，灵敏度分别为51.7％、52.4％、51.7％、52.0％和51.7％，均在50％以上。

[0134] 由以上结果可知，通过本方法测定血清样本中的自身抗体水平，能够鉴定肺癌和健康人。将不同的自身抗体指标联合起来，有助于提高癌症诊断的检出率和准确性。本方法在临床辅助诊断上具有良好的应用前景。