用重组微生物治疗炎性皮肤疾病的方法和组合物

摘要

本发明提供了用于治疗炎性皮肤疾病的分离的质粒、重组微生物、试剂盒和方法。

权利要求

1.能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其进一步包含第三编码序列，所述第三编码序列包含能够表达输出信号的基因。

3.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其中所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的表达是在启动子的控制下。

4.根据权利要求3所述的重组微生物，其中所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的排列是在框架内。

5.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列可操作地连接至启动子。

6.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述重组微生物是细菌或细菌的组合。

7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述多肽是丝聚合蛋白或其变体。

8. 根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

9.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物选自双歧杆菌属（Bifidobacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）或酒球菌属（Oenococcus）或它们的组合。

10. 根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物是表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。

11.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物分泌丝聚合蛋白融合蛋白。

12.一种核酸，其包含编码根据权利要求1所述的多肽的核酸序列。

13. 一种生产活生物治疗组合物的方法，所述方法包括：(a)用以下序列转染细胞：(i)第一编码序列，其包含能够表达治疗性多肽的核酸序列，和(ii)第二编码序列，其包含能够表达细胞穿透肽的核酸序列；和(b)使所述转染的细胞产生治疗性多肽融合蛋白；和

(c)得到所述活生物治疗组合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括(iii)用第三编码序列转染所述细胞，所述第三编码序列包含能够表达输出信号的核酸序列。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列排列在单个质粒中。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的排列可操作地连接至启动子。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞选自，其中所述微生物选自双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属或酒球菌属或它们的组合。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞是表皮葡萄球菌。

19.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗性多肽融合蛋白是丝聚合蛋白融合蛋白或其变体。

20.通过根据权利要求13-19中任一项所述的方法得到的组合物。

21. 根据权利要求20所述的组合物，其包含药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体选自水溶液、乳剂、乳膏剂、洗剂、凝胶或软膏剂。

22.一种包含重组微生物的活生物治疗组合物，其中所述重组微生物包含(i)第一编码序列，其包含能够表达治疗性多肽的核酸序列；

(ii)第二编码序列，其包含能够表达细胞穿透肽的核酸序列；

(iii)第三编码序列，其包含能够表达输出信号的核酸序列；和(iiv)启动子，其可操作地连接至所述第一编码序列、所述第二编码序列和所述第三编码序列；

其中所述第一编码序列、第二编码序列和第一编码序列能够表达丝聚合蛋白融合产物或其变体。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述重组微生物是表皮葡萄球菌。

24.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述输出信号将所述丝聚合蛋白融合产物或其变体输出所述重组微生物。

25.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述细胞穿透肽促进所述丝聚合蛋白融合产物或其变体进入人角质形成细胞。

26.根据权利要求22所述的组合物，其包含药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体选自水溶液、乳剂、乳膏剂、洗剂、凝胶或软膏剂。

27.一种试剂盒，其包含根据权利要求22-26中任一项所述的组合物和使用说明书。

28.一种治疗皮肤疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据权利要求

1-12或20-25中任一项所述的组合物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述皮肤疾病是特应性皮炎。

说明书

用重组微生物治疗炎性皮肤疾病的方法和组合物

[0001] 相关申请本申请要求2017年9月5日提交的美国临时申请62/554,271和2018年6月15日提交的美国临时申请62/685,687的优先权，它们二者的整个内容通过引用整体并入本文。

[0002] 发明背景特应性皮炎（AD）或湿疹是一种慢性的、瘙痒的、炎性皮肤疾病，其影响全世界5-20％的儿童(Williams, H.等人. J Allergy Clin. Immunol. 1999;103(1 Pt 1):125-138)，并且在许多成年人中也很普遍。特应性皮炎的流行正在增加，某种形式的特应性皮炎影响11%的美国人口(Shaw, T.E.等人. J Invest Dermatol. 2011;131(1):67-73)，或约3500万人，仅在美国就造成50亿美元的直接损失。该疾病的主要特征是干燥的、鳞状的、发痒的皮肤。尽管特应性皮炎在世界范围内的患病率正在上升并且其疾病负担很重，但是很少有针对性的且有效的治疗选择。值得注意的是，最常用的治疗方法包括广泛的非特异性的方案，包括、但不限于皮肤保湿、漂白浴、紫外线治疗、饮食干预、抗微生物药、抗组胺药、全身性免疫调节剂以及局部皮质类固醇的施用(Hoare, C.等人. Health Technol. Assess. 2000;
4(37):1-191)。但是，尽管有这些众多选择，但很少能提供持久的症状缓解，并且特应性皮炎复发在大多数个体中常见。此外，2013年国家卫生与健康调查揭示，特应性皮炎患者承受了显著的相关负担，与非特应性皮炎患者相比，他们报告了更高水平的健康护理资源（健康护理提供者/ER就诊）、更低的健康相关的生活质量和几乎两倍的工作生产力损失。此外，特应性皮炎患者具有显著更高的变态反应(46%相对于20%)、哮喘(22%相对于8%)、焦虑(43%相对于21%)和抑郁症(37%相对于21%)患病率(Whiteley, J.等人. Current Medical 
Research and Opinion. 2016:1-32)。因此，考虑到特应性皮炎给我们的健康护理系统带来的巨大负担，存在大量未得到满足的需求。

[0003] 最近的研究已经阐明了特应性皮炎的病理生理学，并已经揭示了皮肤屏障缺陷在许多情况下是特应性皮炎发作的主要原因，这导致经皮失水(TEWL或TWL)以及增加的抗原和病原体暴露。同时，特应性皮炎经常特征在于生态失调（或微生物失衡，其严重程度与疾病严重程度相关；参见Kong, H. H.等人.Genome research. 2012;22(5):850-859；和图1）（这是特应性皮炎的一个显著特征）和皮肤微生物组的多样性缺乏，在特应性皮炎发作和未经治疗的皮肤中，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）占主导地位。最后，在病灶和非病灶皮肤中存在激活的炎性应答，其尤其由IL-4/IL-13引起，具有主要的T辅助细胞2型特性(TH2)，指示向TH2-加权特性的系统转换(Sidbury, R.等人.Current allergy and asthma reports. 2017;17(7):42)。因此，理想的特应性皮炎治疗应同时解决所有这些根本原因，即皮肤屏障缺乏、生态失调和激活的皮肤免疫应答。本发明解决了这些原因。

[0004] 经工程改造的益生菌是一种基于利用皮肤微生物组进行治疗的新颖方案。值得注意的是，经工程改造的益生菌与其它药物递送方法相比具有重要的优点，因为它将在患者的皮肤上建立驻留，并连续地且稳定地原位递送治疗性蛋白。此外，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, SE)的某些菌株已经表现出对皮肤的重要有益免疫调节作用和抗病原作用，它们与特应性皮炎疾病表型和严重程度有关。此外，由于丝聚合蛋白在皮肤屏障中的作用以及减少经皮失水和改善皮肤水合作用的能力，丝聚合蛋白（其为从丝聚合蛋白原衍生出的结构蛋白）的递送进一步增强了治疗方案。本发明具有以下惊人的优点：提供了使用遗传工程改造的表皮葡萄球菌重组菌株作为皮肤药物递送系统来治疗皮肤疾病（例如特应性皮炎）的方法和组合物(例如，AZT-01)，所述皮肤药物递送系统分泌人丝聚合蛋白以解决特应性皮炎的病理生理学。一旦应用于皮肤，对皮肤的稳定定居以及随后丝聚合蛋白的原位分泌可以解决该疾病。本发明的益处包括它作为非甾体类治疗选择的安全性，它由于本发明的丝聚合蛋白分泌的益处与表皮葡萄球菌的局部应用的益处的组合而产生的效力，以及它在甚至低应用频率下（不超过每天1次）在治疗上有效的能力。

[0005] 因此，本发明解决了对炎性皮肤疾病（诸如特应性皮炎）的有效治疗的长期寻找的需求。本发明还是首次报道的共生皮肤细菌的证明之一，所述共生皮肤细菌可以分泌治疗性蛋白质来治疗皮肤疾病。

发明内容

[0006] 本发明涉及用于治疗炎性皮肤疾病的方法和组合物，其包含经工程改造的微生物作为活性成分，所述微生物能够表达治疗上有关的重组融合多肽(即蛋白、肽或氨基酸)。

[0007] 在第一方面，本发明表征了能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因。在一个有关的实施方案中，所述重组微生物进一步包含含有能够表达输出信号的基因的第三编码序列。在另一个实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的表达是在启动子的控制下。在其它实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的排列是在框架内。在另一个有关的实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列可操作地连接至启动子。在一个实施方案中，所述重组微生物是细菌或细菌的组合。在另一个实施方案中，所述多肽是丝聚合蛋白或其变体。在其它实施方案中，所述微生物选自双歧杆菌属（Bifidobacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）或酒球菌属（Oenococcus）或它们的组合。在其它实施方案中，所述重组微生物是表皮葡萄球菌。在另一个实施方案中，所述微生物分泌丝聚合蛋白融合蛋白。在一个实施方案中，所述多肽包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 1具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 2具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 3具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 4具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 5具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 
6具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 7具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%、99%或100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 8具有至少约80%、
81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO: 9具有至少约80%、81%、82%、
83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。

[0008] 在另一个方面，本发明表征了一种用于生产活生物治疗组合物的方法，所述方法包括：(a)用以下序列转染细胞：(i)第一编码序列，其包含能够表达治疗性多肽的核酸序列，和(ii)第二编码序列，其包含能够表达细胞穿透肽的核酸序列；和(b)使所述转染的细胞产生治疗性多肽融合蛋白；和(c)得到所述活生物治疗组合物。在一个有关的实施方案中，所述方法还包括：(iii)用第三编码序列转染所述细胞，所述第三编码序列包含能够表达输出信号的核酸序列。在另一个实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列排列在单个质粒中。在另一个实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的排列可操作地连接至启动子。在其它实施方案中，所述细胞选自，其中所述微生物选自双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属或酒球菌属或它们的组合。在另一个实施方案中，所述细胞是表皮葡萄球菌。在其它实施方案中，所述治疗性多肽融合蛋白是丝聚合蛋白融合蛋白或其变体。

[0009] 在另一个方面，本发明表征了包含核酸序列的核酸，所述核酸序列编码本文任一个方面或实施方案所述的多肽。

[0010] 在另一个方面，本发明表征了通过本文公开或描述的方法中的任一种得到的组合物。在一个有关的实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体选自水溶液、乳剂、乳膏剂、洗剂、凝胶或软膏剂。

[0011] 在另一个方面，本发明表征了包含重组微生物的活生物治疗组合物，其中所述重组微生物包含(i)第一编码序列，其包含能够表达治疗性多肽的核酸序列；(ii)第二编码序列，其包含能够表达细胞穿透肽的核酸序列；(iii)第三编码序列，其包含能够表达输出信号的核酸序列；和(iiv)启动子，其可操作地连接至所述第一编码序列、所述第二编码序列和所述第三编码序列；其中所述第一编码序列、第二编码序列和第一编码序列能够表达丝聚合蛋白融合产物或其变体。在一个有关的实施方案中，所述重组微生物是表皮葡萄球菌。在另一个实施方案中，所述输出信号将所述丝聚合蛋白融合产物或其变体输出所述重组微生物。在另一个实施方案中，所述细胞穿透肽促进所述丝聚合蛋白融合产物或其变体进入人角质形成细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体选自水溶液、乳剂、乳膏剂、洗剂、凝胶或软膏剂。

[0012] 在另一个方面，本发明表征了一种试剂盒，其包含本文公开或描述的组合物中的任一种和使用说明书。

[0013] 在另一个方面，本发明表征了一种治疗皮肤疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本文公开或描述的组合物中的任一种的组合物。在另一个实施方案中，所述皮肤疾病是特应性皮炎。

[0014] 附图简述图1A-F描绘了葡萄球菌种类与特应性皮炎之间的关系。图1A显示了按无治疗（trt）和间歇性治疗爆发分组的在肘前和腘皱褶(AcPC, n=12)中的特应性皮炎中的金黄色葡萄球菌的平均比例的纵向趋势。图1B显示了在AcPc中的金黄色葡萄球菌的比例和Shannon多样性指数。偏相关（针对AcPc疾病状态进行调整）。图1C显示了在AcPc中的表皮葡萄球菌的平均比例的纵向趋势。图1D显示了每个部位(AcPc、掌前臂[Vf]、鼻孔[N])的金黄色葡萄球菌比例与客观SCORAD的相关性。偏相关（针对疾病状态进行调整）。图1E显示了按无治疗和间歇性治疗爆发分组的特应性皮炎中的纵向Shannon多样性趋势(n = 12, Ac)。图1F特应性皮炎微生物组进展假设。（*）提出的皮肤微生物多样性的变化、葡萄球菌的比例和疾病严重程度之间的关联。

[0015] 图2A描绘了如本文所述的基于表皮葡萄球菌的蛋白递送系统的示意图。构建体设计包含启动子、核糖体结合位点(RBS)、输出信号、丝聚合蛋白表达序列和细胞穿透肽序列。图2B显示了可调节地控制蛋白表达的某些启动子的表征（使用GFP作为报道物）。图2C显示了用于蛋白从SE中输出的输出信号的表征（GFP用作报道物）。图2D显示了由表皮葡萄球菌产生的人丝聚合蛋白、由表皮葡萄球菌产生的小鼠丝聚合蛋白和完整小鼠皮肤的蛋白质印迹分析（使用抗-小鼠丝聚合蛋白抗体）。

[0016] 图3A-3D描绘了在重构的人表皮(RHE)中的产生GFP的表皮葡萄球菌的表征。图3A显示了在施用表皮葡萄球菌-GFP之后2小时，约25µm的RHE的荧光和光波长重叠。图3B-3D显示了在施用dermaroller然后局部施用表皮葡萄球菌-GFP以后2小时，RHE的荧光和光波长重叠。深度为0µm图3B，50µm图3C，和70µm图3D。

[0017] 图4A-4E描绘了小鼠中SE-GFP定居的特征。图4A-4C显示了在表达GFP的表皮葡萄球菌治疗后3天，小鼠皮肤的体内双光子显微术。图4A 25µm和图4B 50µm，为未剃毛的小鼠耳皮肤的深度；和图4C 80µm，为在剃毛的背部皮肤上的深度。图4D是在SE-GFP应用后小鼠的背部皮肤的光学显微术。图4E是在SE-GFP应用后小鼠的背部皮肤的光学显微术。

[0018] 图5A-5K描绘了使用50µg GFP作为RHE中的报道物，具有和不具有RMR信号的蛋白的表征。图5A-5D示出了在30分钟(图5A、图5C、图5E、图5G)或60分钟(图5B、图5D、图5F、图5H)时，具有RMR信号(图5C、图5D)或没有RMR信号(图5A、图5B)的局部应用的GFP的双光子图像。将图像编译为投影到2D平面上的Z-堆叠。(图5E至图5H) 3D表面分析以检查蛋白渗透到RHE中的深度。（图5I至图5N）使用光(图5L至图5N)或荧光(图5I至图5K)波长的GFP (图5K、图N)、GFP + RMR (图5J、图5M)或媒介物(图5I、图5L)的共焦图像。

[0019] 图6描绘了16S rRNA测序的实验概要。

[0020] 图7的图显示了整个人丝聚合蛋白(hFLG)序列(Uniprot P20930)随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0021] 图8的图显示了整个小鼠丝聚合蛋白(mFLG)序列(NCBI参照序列:  XP_017175331.1)随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0022] 图9的图显示了具有结构域9和10的单元区段、开始于氨基酸1400-1800的hFLG区域随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0023] 图10的图显示了在hFLG中从氨基酸位置1400至氨基酸位置1800的hFLG[9-10](1429-1774)随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0024] 图11的图显示了hFLG [9-10] (1429-1777)的开始和结束位置随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0025] 图12的图显示了从一个低疏水性点至下一个低疏水性点(由箭头指示)随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0026] 图13显示了人丝聚合蛋白二聚体hFLG[3-4]、hFLG[5-6]、hFLG[7-8]、hFLG[9-10]、hFLG[11-12]、hFLG[13-14]、hFLG[15-16]、hFLG[17-18]、hFLG[19-20]、hFLG[21-22]的比对。

[0027] 图14的图显示了在37℃以1µg/孔2h的背景FLG结合(非特异性结合- NSB)。

[0028] 图15的图显示了hFLG区段与人胼胝角蛋白的结合(除去了NSB)。

[0029] 图16的图显示了IgY抗-hFLG的滴定。

[0030] 发明详述I. 概述和定义
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (1994年第2版); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编, 1988); The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger等人(编), Springer Verlag (1991)；和Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有说明，否则本文中使用的下述术语具有在下面赋予它们的含义：
冠词“a”和“an”在本文中用于表示一个或超过一个(即至少一个)该冠词的语法对象。
作为例子，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。

[0031] 术语“包括”在本文中用于表示短语“包括、但不限于”，且与其可互换使用。

[0032] 术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”，且与其可互换使用，除非上下文另外清楚地指出。

[0033] 术语“诸如”在本文中用于表示短语“诸如但不限于”，且与其可互换使用。

[0034] 除非明确地做出相反说明，否则本文中使用的下述术语具有下述含义：本文中使用的术语“异常皮肤病症”或“皮肤疾病”（例如，炎性皮肤疾病）表示与人皮肤的正常或基线状况相比，通常不希望的或有害的皮肤状态或状况。异常皮肤病症的例子包括：银屑病、痤疮、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、表皮松解性角化过度、脂溢性皮炎、湿疹、干燥皮肤、变态反应、疹、紫外线刺激的皮肤、洗涤剂刺激的皮肤（包括由在洗涤剂中使用的酶和分子以及月桂基硫酸钠引起的刺激）、皮肤变薄（例如老年人和儿童的皮肤）、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、脓疱病、白癫风、脱发和多毛症。

[0035] 本文中使用的术语“患者”或“受试者”表示人或动物（在动物的情况下，更典型地是哺乳动物，诸如驯化的哺乳动物，或动物，诸如家禽动物和鱼类以及其它海产食品或淡水食品生物），其将接受本发明的治疗和组合物。这样的患者或受试者将被认为需要本发明的药物组合物，或者需要治疗、预防异常皮肤病症或皮肤疾病（例如，炎性皮肤疾病）或减小其风险的方法。

[0036] 本文中使用的术语“治疗有效量”表示，当单独地或组合地施用以治疗、预防疾病状态或病症例如异常皮肤病症或皮肤疾病(例如，炎性皮肤疾病)或减小其风险时，药物活性化合物、活生物治疗组合物、化合物或组合物的组合的量，或者由经一种或多种工程改造的细菌菌株递送的药物活性化合物（例如一种或多种皮肤治疗剂）的量。该术语也表示药物组合物的量，所述药物组合物含有一种活性化合物或多种化合物的组合或一种或多种经工程改造的递送药物活性化合物的细菌菌株。例如，有效量表示在施用给接受者患者或受试者的制剂中存在的化合物的量，或由其中存在的一种或多种经工程改造的细菌菌株(或重组细菌菌株)递送的化合物的量，所述量足以引起生物活性，例如，用于治疗或预防异常皮肤病症或皮肤疾病(例如，炎性皮肤疾病)的活性。

[0037] 本文中使用的短语“药学上可接受的”表示这样的活性化合物、材料、一种或多种经工程改造的细菌菌株、组合物、载体和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。本文中使用的术语“治疗”表示提供治疗干预以治愈或改善异常皮肤病症。

[0038] 本文中使用的术语“预防”表示完全地或几乎完全地阻止异常皮肤病症发生，例如当患者或受试者易患异常皮肤病症或处于感染异常皮肤病症的风险中时。预防还可以包括抑制异常皮肤病症，即阻止其发生。

[0039] 本文中使用的术语“减小……的风险”表示降低异常皮肤病症发生的可能性或概率，例如当患者或受试者易患异常皮肤病症或处于感染异常皮肤病症的风险中时。

[0040] 本文中使用的术语“经工程改造的细菌菌株”或“重组细菌菌株”表示通过将在生物体外部制备的DNA引入细菌菌株中而已经被“遗传修饰”或“工程改造”的细菌菌株。例如，含有新基因或其它核酸序列的质粒向细菌中的引入将允许所述细菌表达那些基因或其它核酸序列。可替换地，可以将含有新基因或其它核酸序列的质粒引入细菌中，然后整合到所述细菌的基因组中，其中所述细菌将表达那些基因或其它核酸序列。

[0041] 本文中使用的术语“载体”、“载体系统”或“媒介物”表示适合用于递送、含有或“携带”药物活性成分或其它物质的相容物质，所述药物活性成分或其它物质用于在局部应用组合物中施用给患者或受试者。在本文中有用的载体应是药学上可接受的。在本文中有用的载体和媒介物包括本领域已知的任何这样的物质，它们是无毒的并且不会以有害方式与包含它的制剂的其它组分相互作用。术语“水性的”表示含有水或在施用于皮肤或粘膜组织后变得含水的制剂。“载体”的其它例子包括水、低级醇、高级醇、多元醇、单糖、二糖、多糖、烃油、脂肪和油、蜡、脂肪酸、硅油、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、有机硅表面活性剂以及这样的载体的基于水的混合物和基于乳剂的混合物。

[0042] 本文中使用的术语“多肽”或“蛋白”表示由在链中键合在一起的氨基酸残基组成的生物分子或大分子。本文所用多肽的定义意图涵盖由一个或多个氨基酸残基长链组成的蛋白（通常较高分子量）和几个氨基酸的小肽（通常较低分子量）。在其它实施方案中，单个氨基酸，尽管在技术上不是多肽，但也被认为在本发明的范围内。

[0043] 本文中使用的术语“活生物治疗产品”(或LBP)表示含有细菌、酵母和/或其它微生物的候选产品。

[0044] 为了本发明的目的，术语“分离的”表示已经从其原始环境（其天然存在的环境）中移出的生物学材料(细胞、核酸或蛋白)。例如，在植物或动物中以天然状态存在的多核苷酸不是分离的，但是与它天然存在的相邻核酸分离的相同多核苷酸被认为是“分离的”。

[0045] “分离的核酸分子”（例如，分离的启动子）是与存在于核酸的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括从基因组DNA所天然结合的染色体分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸分子不含有天然地侧接该核酸分子所源自的生物的基因组DNA中的核酸分子的序列。

[0046] 本发明提供了用于治疗或预防皮肤疾病的皮肤定居细菌，其在遗传上被改变以表达重组治疗性多肽（图2）。与用于治疗皮肤疾病的现有技术方法相比，使用遗传工程改造的蛋白产生细菌具有多个优点。治疗性蛋白能够治疗导致皮肤病症的缺陷的根本原因。此外，细菌能够自我复制，同时保留插入的基因以连续产生治疗性蛋白。

[0047] 本发明提供了在遗传上被改变以表达人丝聚合蛋白的皮肤定居细菌，例如，表皮葡萄球菌。与使用丝聚合蛋白补充相比，使用遗传工程改造的丝聚合蛋白产生细菌具有多个优点。首先，细菌能够自我复制，同时保留插入的丝聚合蛋白基因。其次，表皮葡萄球菌通常存在于皮肤上，并已经被证实会抑制金黄色葡萄球菌（在AD爆发中在皮肤菌群中占主导地位的相同属的细菌种）的生长。

[0048] II. 本发明的方法和组合物本发明提供了用于治疗或预防皮肤疾病的皮肤定居微生物（例如，细菌），其在遗传上被改变以表达重组治疗性多肽（图2）。与用于治疗皮肤疾病的现有技术方法相比，使用遗传工程改造的蛋白产生微生物（例如，细菌）具有多个优点。治疗性蛋白能够治疗导致皮肤病症的缺陷的根本原因。此外，微生物（例如，细菌）能够自我复制，同时保留插入的核酸(例如，基因)以连续产生治疗性蛋白。

[0049] 本发明提供了在遗传上被改变以表达治疗性蛋白（例如，人丝聚合蛋白）的皮肤定居微生物（例如，细菌，例如，表皮葡萄球菌）。与使用丝聚合蛋白补充相比，使用遗传工程改造的丝聚合蛋白产生微生物（例如，细菌）具有多个优点。首先，微生物（例如，细菌）能够自我复制，同时保留插入的丝聚合蛋白核酸序列(例如，基因)。其次，表皮葡萄球菌通常存在于皮肤上，并已经被证实会抑制金黄色葡萄球菌（在特应性皮炎爆发中在皮肤菌群中占主导地位的相同属的细菌种）的生长。

[0050] 细菌菌株本发明提供了能够表达重组治疗性蛋白的在遗传上被改变的微生物，例如，细菌。宽范围的微生物适合用于用在本发明中。例子包括、但不限于非病原性的和共生的细菌。适合用于用在本发明中的细菌包括、但不限于双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属（例如，表皮葡萄球菌）、乳杆菌属（例如，嗜酸乳杆菌（L. acidophilus））、片球菌属、明串珠菌属或酒球菌属。在本发明的某些实施方案中，所述细菌是表皮葡萄球菌。在本发明的优选实施方案中，要使用的表皮葡萄球菌菌株不能产生生物膜。不能产生生物膜的表皮葡萄球菌菌株的一个这样的例子是表皮葡萄球菌菌株ATCC 12228。但是，在本发明的再其它的实施方案中，可以使用在皮肤上发现的其它有关的或类似的物种。

[0051] 治疗性蛋白本发明提供了能够表达重组治疗性蛋白的在遗传上被改变的微生物，例如，细菌。

[0052] 在某些实施方案中，本公开内容涉及包括丝聚合蛋白多肽氨基酸序列的治疗性蛋白。在某些实施方案中，本公开内容涉及包括丝聚合蛋白多肽氨基酸序列和细胞穿透多肽氨基酸序列的治疗性蛋白。在某些实施方案中，本公开内容涉及包括丝聚合蛋白多肽氨基酸序列、细胞穿透多肽氨基酸序列和分泌信号或输出信号多肽序列的治疗性蛋白。本文中使用的“多肽”通常在本文中定义为表示约2个至约10,000个或更多个氨基酸残基的肽序列。术语“氨基酸”不仅包括天然地合成的蛋白中的20种常见氨基酸，而且包括任何经修饰的、罕见的或合成的氨基酸。本领域普通技术人员熟知经修饰的、罕见的或合成的氨基酸。

[0053] 本发明的多肽可以具有相对于天然序列的氨基酸的缺失和/或置换；因此，考虑将具有缺失的序列、具有置换的序列以及具有缺失和置换的序列包括在本发明的多肽中。在某些实施方案中，这些多肽可以进一步包括插入或添加的氨基酸，诸如接头。

[0054] 置换或替代变体通常在蛋白内的一个或多个位点处含有一个氨基酸对另一个氨基酸的交换，并且可以被设计以调节多肽的一个或多个特性，特别是增加其效力或特异性。这种置换优选是保守的，也就是说，一个氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替换。保守置换是本领域众所周知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸盐至谷氨酸盐；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸盐至天冬氨酸盐；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

[0055] 除缺失或置换外，所述多肽可以具有一个或多个残基的插入。这可以包括一个或多个氨基酸残基的添加。

[0056] 氨基酸置换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了前述各种特征的示例性置换是本领域技术人员众所周知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

[0057] 丝聚合蛋白在某些实施方案中，本公开内容涉及包括丝聚合蛋白多肽氨基酸序列的治疗性蛋白。
在本发明的优选实施方案中，所述治疗性蛋白包含人丝聚合蛋白。人丝聚合蛋白由编码丝聚合蛋白(FLG)的人基因表达。丝聚合蛋白是由分化角质形成细胞产生的蛋白，并具有将角蛋白纤丝聚集为细胞骨架的功能，所述细胞骨架与其它组分组合地构成角质化的细胞包膜。FLG是位于染色体lq21上的大基因，其产生丝聚合蛋白原，即一种不溶性的多蛋白，其被蛋白水解以释放功能性丝聚合蛋白单体(Armengot-Carbo等人. 2014)。本发明的治疗性蛋白（以及即表达该蛋白的基因）可以来自任何哺乳动物。非限制性的例子包括、但不限于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、狗、灵长类动物或人基因序列。

[0058] 预期被包括在本发明的多肽、组合物和方法中的丝聚合蛋白氨基酸序列可以得自任何来源。例如，丝聚合蛋白氨基酸可以得自天然来源或可以化学合成。丝聚合蛋白氨基酸序列可以来自任何物种。例如，它可以是哺乳动物丝聚合蛋白氨基酸序列。非限制性例子包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、狗、猫、灵长类动物或人氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列是人氨基酸序列。在下表1中列出了丝聚合蛋白的非限制性例子。

[0059] 表1在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列包括在表1中列出的氨基酸序列中的任一个。在特定实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列包括Gen Bank登记号NP_002007.1 (SEQ ID NO:1)。

[0060] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列包括在表1中列出的氨基酸序列中的任一个的20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、150、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340个或更多个连续氨基酸，或可从其中衍生出的任何氨基酸范围，只要所述丝聚合蛋白氨基酸序列当缀合至细胞穿透肽和/或输出或分泌信号时至少保留与相同细胞穿透肽和/或输出或分泌信号缀合的天然丝聚合蛋白氨基酸序列的某些功能。

[0061] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与天然丝聚合蛋白氨基酸序列具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或可从其中衍生出的任何序列同一性百分比范围。在一个实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列是选自表1的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。

[0062] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 2具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0063] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 3具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0064] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 4具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0065] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 5具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0066] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 6具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0067] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 7具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0068] 在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 8具有至少约80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%序列同一性。

[0069] 在某些实施方案中，所述人丝聚合蛋白共有序列是如SEQ ID NO: 9所示的共有序列，且表示由在hFLG[3-4]、hFLG[5-6]、hFLG[7-8]、hFLG[9-10]、hFLG[11-12]、hFLG[13-14]、hFLG[15-16]、hFLG[17-18]、hFLG[19-20]、hFLG[21-22]中最频繁出现的氨基酸形成的序列。

[0070] SEQ ID NO: 9在某些实施方案中，所述丝聚合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO: 9具有至少约80%、81%、
82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。

[0071] “序列同一性”被定义为，在比对序列并在必要时引入缺口以达到最大序列同一性百分比以后，并且不考虑将任何保守置换作为序列同一性的一部分，在候选序列中与天然多肽序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性百分比值可以由Altschul等人(1997)定义的NCBI BLAST2.0软件产生。将参数设置为默认值，但错配的惩罚例外，将其设置为-1。

[0072] 在本发明的优选实施方案中，所述治疗性蛋白包含重组融合蛋白，其包含可操作地连接至细胞穿透蛋白(CPP)的丝聚合蛋白。在本发明的其它实施方案中，所述治疗性蛋白包含重组融合蛋白，其包含可操作地连接至输出或分泌信号的丝聚合蛋白，所述输出或分泌信号允许所述重组丝聚合蛋白从微生物(例如，细菌)中输出。在另一个实施方案中，所述治疗性蛋白包含重组融合蛋白，其包含可操作地连接至细胞穿透蛋白(CPP)和输出或分泌信号的丝聚合蛋白。

[0073] 此外，本文阐述的多肽可以在氨基酸序列的N-端或C-端包含任何数目的另外氨基酸残基的序列，其包括丝聚合蛋白氨基酸序列和细胞穿透蛋白(CPP)和/或输出或分泌信号。例如，在氨基酸序列的N-端、C-端、或N-端和C-端二者处可能存在约3个至约10,000个或更多个氨基酸残基的氨基酸序列，其包括丝聚合蛋白氨基酸序列和细胞穿透肽和/或输出或分泌信号。

[0074] 分泌信号分泌信号或输出信号是蛋白上的肽序列，其促进蛋白通过分泌途径的输出，这最终导致蛋白从细胞中分泌出来。在本发明中，促进蛋白（诸如包含丝聚合蛋白的蛋白）从微生物(例如，细菌细胞)输出的任何分泌信号被预见到作为分泌信号。

[0075] 细胞穿透肽细胞穿透肽是在体内促进或介导生物分子（例如，蛋白）的递送的肽序列，而无需使用任何受体并且不会引起任何明显的膜损伤。促进进入皮肤角质形成细胞的细胞穿透肽被预见到作为本发明的细胞穿透肽。

[0076] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含丝聚合蛋白多肽氨基酸序列。

[0077] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 1具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0078] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 2具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0079] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 3具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0080] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 4具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0081] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 5具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0082] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 6具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0083] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 7具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0084] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 8具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0085] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 9具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0086] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 2具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0087] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 3具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0088] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 4具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0089] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 5具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0090] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 6具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0091] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 7具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0092] 根据一些实施方案，本公开内容提供了一种能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含表达载体，所述表达载体包含与SEQ ID NO: 8具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

[0093] 核酸本发明包括核酸，所述核酸包括编码本发明的重组多肽的核酸序列。本发明的一些实施方案包括一种核酸，所述核酸包括编码如上所述的多肽的核酸序列。其它实施方案包括编码丝聚合蛋白氨基酸序列的核酸。丝聚合蛋白氨基酸序列是本文所述的任何丝聚合蛋白氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸被包含在表达载体中。术语“核酸”是本领域众所周知的。本文中使用的“核酸”通常表示包含核苷碱基的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即，链)。核苷碱基包括，例如，在DNA (例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA (例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，各自作为术语“核酸”的亚属。术语“寡核苷酸”表示
3至约100个核苷碱基长度的分子。术语“多核苷酸”表示至少一个大于约100个核苷碱基长度的分子。

[0094] 这些定义表示单链或双链核酸分子。双链核酸通过完全互补结合而形成，尽管在某些实施方案中，双链核酸可以通过部分或基本互补结合而形成。因此，核酸可以包括双链分子，其包含特定序列的一个或多个互补链或“补体”，通常包含分子。如本文所用，单链核酸可以由前缀“ss”表示，而双链核酸可以由前缀“ds”表示。

[0095] 遗传构建体本发明利用标准的分子生物学技术，例如，在(Sambrook等人. 2001)中描述的那些。用于本发明的遗传构建体的一个例子是pAZT，其是基于pJB38（一种等位基因交换大肠杆菌-葡萄球菌穿梭载体），进一步包含在质粒上的其它设计特征以改善功能性(Bose, J.L.等人.Applied and environmental microbiology.  2013;79(7):2218-2224)。使用标准的分子生物学技术，通过将编码治疗性蛋白的基因的cDNA插入限制位点来构建质粒（图2）。所述插入物进一步包含由启动子驱动的编码序列。这样的启动子可以是组成型的或诱导型的。
诱导型启动子的例子包括被化合物（诸如醇、糖、金属或四环素）或被物理因素（诸如光或高温）活化的那些。

[0096] 人FLG的mRNA序列具有Genebank登记号NM_002016。通过将FLG cDNA的一部分插入pJB38的限制性位点来构建质粒pAZT。所述插入物含有由启动子驱动的核酸编码序列。所述构建体进一步包含编码分泌信号和细胞穿透肽的核酸序列，从而产生重组丝聚合蛋白融合蛋白。

[0097] 重组细菌菌株的应用应该理解，要治疗的皮肤疾病可以是与皮肤有关的任何疾病或障碍。在优选的实施方案中，所述障碍选自特应性皮炎、银屑病、痤疮、变应性接触性皮炎、表皮松解性角化过度、脂溢性皮炎、湿疹、干燥皮肤、变态反应、疹、紫外线刺激的皮肤、洗涤剂刺激的皮肤（包括由在洗涤剂中使用的酶和分子以及月桂基硫酸钠引起的刺激）、皮肤变薄（例如老年人和儿童的皮肤）、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、脓疱病、白癫风、脱发和多毛症，根据本发明可以施用的蛋白的例子优选地是真核蛋白。这些蛋白包括、但不限于单个氨基酸、小肽和大蛋白。更具体地，编码在本发明中可用作重组治疗性蛋白的蛋白的基因包括、但不限于以下：
白介素基因家族的成员，包括、但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-
10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15及编码其受体拮抗剂的基因。在本发明中也涵盖编码造血生长因子的基因，所述造血生长因子包括、但不限于促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子、白血病抑制因子和血小板生成素。也涵盖编码神经营养因子的基因，所述神经营养因子包括、但不限于神经生长因子、脑衍生的神经营养因子和睫状神经营养因子。另外，包括编码干扰素的基因，所述干扰素包括、但不限于IFN-α、IFN-β和IFN-γ。在本发明中进一步涵盖编码趋化因子（诸如细胞因子的C-C家族和C-X-C家族）的基因，编码激素（诸如胰岛素原和生长激素）的基因，以及编码溶血栓酶（包括组织型纤溶酶原激活物、链激酶、尿激酶或其它酶诸如胰蛋白酶抑制剂）的基因。本发明还包括编码组织修复因子、生长和调节因子的基因，所述生长和调节因子包括、但不限于制瘤素M、血小板-衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子、骨形态形成蛋白、胰岛素-样生长因子、降钙素和转化生长因子α和β。进一步涵盖的基因包括编码结构蛋白的基因，所述结构蛋白包括丝聚合蛋白、肌动蛋白、胶原蛋白、微纤维蛋白、弹性蛋白或硬蛋白。

[0098] 制剂进一步显而易见的是，根据本发明使用的制剂可以包含任何药学有效量的遗传工程改造的微生物，例如，细菌，以产生治疗有效量的期望多肽，例如，按重量计至少约0.01%、约
0.05%、约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1.0%、约1.5%、约2.0%、约3.0%、约4.0%、约5.0%、约6.0%、约7.0%、约8.0%、约9.0%、约10.0%、约
11.0%、约12.0%、约13.0%、约14.0%、约15.0%、约16.0%、约17.0%、约18.0%、约19.0%、约
20.0%、约25.0%、约30.0%、约35.0%、约40.0%、约45.0%、约50.0%或更多的遗传工程改造的微生物，例如，细菌，其上限是约90.0重量%的遗传工程改造的微生物，例如，细菌。

[0099] 在一个替代实施方案中，根据本发明使用的制剂可以包含，例如，按重量计至少约0、01%至约30%、约0.01%至约20%、约0.01%至约5%、约0.1%至约30%、约0.1%至约20%、约0.1%至约15%、约0.1%至约10%、约0.1%至约5%、约0.2%至约5%、约0、3%至约5%、约0.4%至约5%、约
0.5%至约5%、约1%至约5%或更多的遗传工程改造的微生物，例如，细菌。

[0100] 用于用在本发明中的局部制剂可以呈适合施用到身体表面的任何形式，诸如乳膏剂、洗剂、喷雾剂、溶液、凝胶、软膏剂、糊剂、硬膏剂、涂剂、生物粘附剂、混悬剂、乳剂等，和/或可以制备成含有脂质体、胶束和/或微球。这样的制剂可以与闭合的覆盖层组合使用以便在施用到身体表面时和其后将从身体表面蒸发的水分维持在制剂内。所述制剂可以包含活生物治疗组合物，并且可以包含至少一种遗传工程改造的微生物，例如，经工程改造的细菌菌株，其产生重组多肽。该经工程改造的活生物治疗组合物可以将所述多肽直接递送到皮肤用于治疗或预防异常皮肤病症和/或皮肤疾病(例如，炎性皮肤疾病)。

[0101] 局部制剂包括这样的制剂：其中将任何其它活性成分溶解或分散在本领域已知的皮肤病学媒介物中，例如水性或非水性凝胶、软膏剂、油包水或水包油乳剂。这样的媒介物的组分可以包含水、水性缓冲溶液、非水性溶剂(诸如乙醇、异丙醇、苯甲醇、2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇、丙二醇、丙二醇单月桂酸酯、糖原质或甘油)、油(例如矿物油诸如液状石蜡，天然的或合成的甘油三酯诸如MIGLYOL，或硅油诸如聚二甲基硅氧烷)。取决于制剂的性质及其预期用途和施用位点，使用的皮肤病学媒介物可以含有选自以下的一种或多种组分(例如，当制剂为水性凝胶时，除了水之外的组分)：增溶剂或溶剂(例如β-环糊精，诸如羟丙基β-环糊精，或醇或多元醇诸如乙醇、丙二醇或甘油)；增稠剂(例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲纤维素或卡波姆)；胶凝剂(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)；防腐剂(例如苯甲醇、苯扎氯铵、氯己定、氯丁醇、苯甲酸酯、山梨酸钾或EDTA或其盐)；和pH缓冲剂(诸如磷酸二氢盐和磷酸氢盐的混合物，或柠檬酸和磷酸氢盐的混合物)。

[0102] 药学上可接受的载体也可以掺入本发明的制剂中，并且可以是本领域常规使用的任何载体。其例子包括水、低级醇、高级醇、多元醇、单糖、二糖、多糖、烃油、脂肪和油、蜡、脂肪酸、硅油、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、有机硅表面活性剂以及这样的载体的基于水的混合物和基于乳剂的混合物。术语“药学上可接受的”或“药学上可接受的载体”在本文中用于表示这样的化合物或组合物：其可以掺入药物制剂中，而不引起不希望的生物学效应或不希望的与制剂的其它组分的相互作用。本文中使用的“载体”或“媒介物”表示适合用于掺入局部应用组合物中的载体材料。在本文中有用的载体和媒介物包括本领域已知的任何这样的材料，其为无毒的并且不以有害方式与包含它的制剂的其它组分相互作用。术语“水性的”表示含有水或在施用到皮肤或粘膜组织之后变得含有水的制剂。

[0103] 乳膏剂基质是可水洗的，并且含有油相、乳化剂和水相。油相也被称为“内部”相，通常由矿脂和脂肪醇（诸如鲸蜡基或硬脂醇）构成。尽管非必然地，所述水相经常在体积上超过油相，并且通常含有保湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的表面活性剂。

[0104] 洗剂是要无摩擦地施用到皮肤表面的制品，并且通常是液体或半液体制剂，其中颗粒(包括活性剂)存在于水或醇基质中。洗剂经常是固体的悬浮液，优选地包含水包油型的液体油性乳剂。洗剂是本文中用于治疗大身体区域的优选制剂，因为更流体的组合物容易施用。通常必须将洗剂中的不溶物质精细粉碎。洗剂通常含有助悬剂（以产生更好的分散体）以及可用于将活性剂定位并维持活性剂与皮肤接触的化合物，例如，甲基纤维素、羧甲基-纤维素钠等。溶液是如下制备的均质混合物：将一种或多种化学物质(溶质)溶解在液体中，使得溶解的物质的分子分散在溶剂的分子中。溶液可以含有其它药学上或化妆上可接受的化学物质以缓冲、稳定或保存溶质。用于制备溶液的溶剂的常见实例是乙醇、水、丙二醇或任意其它可接受的媒介物。当然众所周知，凝胶是半固体混悬型系统。单相凝胶含有大体上均匀地分布在载体液体(其通常为水性的，但优选地也含有醇和任选的油)中的有机大分子。优选的有机大分子，即胶凝剂，是交联的丙烯酸聚合物诸如“卡波姆”家族的聚合物，例如，可以在Carbopol商标下商业获得的羧基聚烯烃。也优选的是亲水聚合物诸如聚氧化乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维质聚合物诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和甲基纤维素；树胶诸如黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。为了制备均匀的凝胶，可以加入分散剂诸如醇或甘油，或可以通过研磨、机械混合或搅拌或其组合来分散胶凝剂。也如本领域众所周知的，软膏剂是通常基于矿脂或其它石油衍生物的半固体制剂。本领域技术人员会明白，要使用的具体软膏基质是将提供许多合乎需要的特征（例如，润肤性等）的软膏基质。正如其它载体或媒介物，软膏基质应当是惰性的、稳定的、无刺激性的和不敏感的。如在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版(Easton, PA: Mack Publishing Co., 1995)中在第1399-1404页所解释的，软膏基质可以分组为4类：油性基质、可乳化基质、乳剂基质和水溶性基质。油性软膏基质包括，例如，植物油、获自动物的脂肪和获自石油的半固体烃类。

[0105] 可乳化软膏基质也被称作可吸收的软膏基质，其含有很少的水或不含有水，且包括例如硫酸羟基三硬脂酸甘油酯、无水羊毛脂和亲水矿脂。

[0106] 乳剂软膏基质是油包水(W/O)乳剂或水包油(O/W)乳剂，并包括例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏基质从不同分子量的聚乙二醇制备；关于进一步的信息参见Remington: The Science and Practice of Pharmacy。

[0107] 糊剂是半固体剂型，其中活性剂悬浮在合适的基质中。取决于基质的性质，糊剂分为脂肪糊剂或从单相水性凝胶制成的那些。脂肪糊剂中的基质通常是矿脂或亲水矿脂等。从单相水性凝胶制成的糊剂通常掺入羧甲纤维素等作为基质。

[0108] 增强剂是亲脂性共增强剂，通常被称作“塑化”增强剂，即具有在约150-1000范围内的分子量、小于约1重量%、优选地小于约0.5重量%和最优选地小于约0.2重量%的水溶性的增强剂。塑化增强剂的Hildebrand溶解度参数δ是在约2.5至约10的范围内，优选地在约5至约10的范围内。优选的亲脂增强剂是脂肪酸酯、脂肪醇和脂肪醚。具体的和最优选的脂肪酸酯的实例包括月桂酸甲酯、油酸乙酯、丙二醇单月桂酸酯、丙烯甘油二月桂酸酯(propylene glycerol dilaurate)、甘油单月桂酸酯、甘油单油酸酯、正癸酸异丙酯和肉豆蔻酸辛基十二烷基酯。脂肪醇包括例如硬脂醇和油醇，而脂肪醚包括这样的化合物：其中二醇或三醇优选C2-C4烷二醇或三醇被一个或两个脂肪醚取代基取代。额外的渗透增强剂是局部药物递送领域的普通技术人员已知的，和/或在相关文本和文献中描述。参见，例如，Percutaneous penetration Enhancers, Smith等人编(CRC Press, 1995) (通过引用整体并入本文)。

[0109] 除上文鉴定的那些之外，在本发明的组合物中可以包括各种其它添加剂。这些包括、但不限于抗氧化剂、收敛剂、香料、防腐剂、软化剂、颜料、染料、保湿剂、推进剂和遮光剂，以及其存在可为药学上或在其它方面需要的其它种类的材料。任选的用于包含在本发明的制剂中的添加剂的典型例子如下：防腐剂诸如山梨酸酯；溶剂诸如异丙醇和丙二醇；收敛剂诸如薄荷醇和乙醇；软化剂诸如聚亚烷基甲基葡萄糖苷；保湿剂诸如甘油；乳化剂诸如硬脂酸甘油酯、PEG-100硬脂酸酯、聚甘油基-3羟基月桂基醚,和聚山梨酯60；山梨醇和其它多羟基醇诸如聚乙二醇；遮光剂诸如辛基甲氧基肉桂酸酯(作为Parsol MCX市售可得)和丁基甲氧基苯甲酰基甲烷(在商业名称Parsol 1789下可得)；抗氧化剂诸如抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、ε-生育酚、ζι-生育酚、ΖΛ- 生育酚、η-生育酚和视黄醇(维生素A)；精油、神经酰胺、必需脂肪酸、矿物油、植物油(例如，大豆油、棕榈油、牛油树脂的液体级分、葵花籽油)、动物油(例如，全氢角鲨烯)、合成的油、硅油或蜡(例如，环甲硅油和聚二甲基硅氧烷)、氟代油(通常全氟聚醚)、脂肪醇(例如，鲸蜡醇)和蜡类(例如，蜂蜡、巴西棕榈蜡和石蜡)；皮肤感觉修饰剂；和增稠剂和结构化剂诸如膨胀粘土和可在Carbopol商标下市售获得的交联羧基聚烯烃。其它添加剂包括有益剂诸如调理皮肤(具体地，角质层中皮肤的上层)和通过延缓其含水量降低来保持其柔软和/或保护皮肤的那些材料。这样的调理剂和保湿剂包括，例如，吡咯烷羧酸和氨基酸；有机抗微生物剂诸如2,4,4'-三氯-2-羟基二苯醚(三氯生)和苯甲酸；抗炎剂诸如乙酰基水杨酸和甘草次酸；抗脂溢剂诸如视黄酸；血管扩张剂诸如烟酸；黑色素生成抑制剂诸如曲酸；及其混合物。进一步的其它活性剂包括，例如，α羟基酸、α酮酸、聚合羟基酸、保湿剂、胶原、海洋提取物和抗氧化剂诸如抗坏血酸(维生素C)、α-生育酚(维生素E)、β-生育酚、γ-生育酚、6-生育酚、ε-生育酚、ζι-生育酚、ζ2-生育酚、η-生育酚和视黄醇(维生素A)和/或其药学上可接受的盐、酯、酰胺或其它衍生物。一种优选的生育酚化合物是α-生育酚。额外的试剂包括能够改善皮肤组织中的氧供应的那些，如例如在Gross等人, WO 94/00098和Gross等人, WO 94/
00109（均转让给Lancaster Group AG，通过引用整体并入本文）中所描述的。还可以包括遮光剂和紫外吸收化合物。这样的遮光剂和紫外吸收化合物的非限制性例子包括氨基苯甲酸(PABA)、阿伏苯宗、西诺沙酯、二羟苯宗、胡莫柳酯、薄荷醇邻氨基苯甲酸酯、奥克立林、辛基甲氧基肉桂酸酯、水杨酸辛酯、羟苯甲酮、帕地马酯O、苯基苯并咪唑磺酸、舒利苯酮、二氧化钛、水杨酸三乙醇胺、氧化锌、恩索利唑、meradiraate、奥西诺酯、奥替柳酯和奥克立林。参见标题21第1章子章节D第352部分"Sunscreen drug products for over-the-counter human use"，其以其整体并入本文。其它实施方案可以包括多种非致癌的、非刺激性的愈合材料，其促进用本发明的制剂治疗。这样的愈合材料可以包括营养物、矿物质、维生素、电解质、酶、草药、植物提取物、腺或动物提取物或可以加入制剂中以促进皮肤病症愈合的安全治疗剂。

[0110] 本发明涵盖与在化妆品领域常规使用的那些等效的量的这些各种添加剂，且范围为例如局部制剂的总重量的约0.01%至约20%。

[0111] 本发明的制剂还可以包括常规添加剂诸如遮光剂、芳香剂、着色剂、稳定剂、表面活性剂等。在某些实施方案中，还可以加入其它试剂，诸如抗微生物剂，以防止在储存时变质，即抑制微生物诸如酵母和霉菌的生长。

[0112] 用于本发明的合适抗微生物剂包括、但不限于选自以下的那些：对羟基苯甲酸的甲基和丙基酯(即对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、苯甲酸钠、山梨酸、咪脲和它们的组合。在其它实施方案中，还可以加入其它试剂，诸如阻遏物和诱导物，即，抑制(即葡萄糖)或诱导(即木糖)目标多肽的产生。只要与制剂的功能相容并且不干扰制剂的功能，就可使用这样的添加剂。

[0113] 所述制剂还可以含有减轻刺激的添加剂以最小化或消除由要施用的化学实体或组合物的其它组分引起的皮肤刺激或皮肤损伤的可能性。

[0114] 合适的减轻刺激的添加剂包括，例如：α-生育酚；单胺氧化酶抑制剂，别是苯基醇诸如2-苯基-1-乙醇；甘油；水杨酸盐；抗坏血酸；离子载体诸如莫能星；两亲胺；氯化铵；N-乙酰半胱氨酸；辣椒辣素；和氯喹。若存在，减轻刺激的添加剂可以以有效减轻刺激或皮肤损伤的浓度掺入组合物中，通常占制剂的不超过约20重量%，更通常不超过约5重量%。在某些实施方案中可以掺入本制剂中并因此与活性剂一起局部施用的其它合适的药理学活性剂包括但不限于以下：改善或根除色素沉着的或非色素沉着的老年斑、角化病和皱纹的试剂；抗微生物剂；抗细菌剂；止痒剂和抗干燥剂；抗炎剂；局部麻醉剂和镇痛剂；皮质类固醇；维A酸类；维生素；激素；和抗代谢药。局部药理学活性剂的一些实例包括阿昔洛韦、两性霉素、氯己定、克霉唑、酮康唑、益康唑、咪康唑、甲硝唑、米诺环素、制霉菌素、新霉素、卡那霉素、苯妥英、对氨基苯甲酸酯、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯、羟苯甲酮、二羟苯宗、生育酚、醋酸生育酚、二硫化硒、巯氧吡啶锌、苯海拉明、普莫卡因、利多卡因、普鲁卡因、红霉素、四环素、克林霉素、克罗米通、氢醌和它的单甲基和苄基醚、萘普生、布洛芬、色甘酸、视黄醇、棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、煤焦油、灰黄霉素、雌二醇、氢化可的松、氢化可的松21-乙酸酯、氢化可的松17-戊酸酯、氢化可的松17-丁酸酯、黄体酮、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、曲安奈德、醋酸氟轻松、丙酸氯倍他索、米诺地尔、双嘧达莫、二苯基乙内酰脲、过氧苯甲酰和5-氟尿嘧啶。可以将乳膏剂、洗剂、凝胶、软膏剂、糊剂等铺展在受影响的表面上并轻轻揉搓。溶液可以以相同的方式施用，但更通常将会用滴管、拭子等施用并小心地施用到受影响的区域。

[0115] 施用方案将取决于许多可容易地确定的因素，诸如病症的严重程度和它对初次治疗的应答性，但是通常不会涉及每天超过一次施用。普通技术人员可以容易地确定要施用的制剂的最适量、施用方法和重复率。一般而言，考虑将会在每周一次或两次直到每天一次的范围内施用本发明的制剂。

[0116] III. 本发明的方法和试剂盒治疗方法
本发明提供了用于治疗皮肤疾病的方法，其中所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用遗传工程改造的微生物，例如，遗传工程改造的细菌，其能够表达本发明的重组治疗性融合蛋白，由此治疗所述受试者。在一个优选的实施方案中，所述疾病是特应性皮炎。在另一个优选的实施方案中，所述重组治疗性融合蛋白包含丝聚合蛋白。在其它实施方案中，所述重组治疗性融合蛋白包含可操作地连接至细胞穿透肽的丝聚合蛋白。在其它实施方案中，所述重组治疗性融合蛋白可操作地连接至输出信号。

[0117] 试剂盒本发明也提供了试剂盒。在一个方面，本发明的试剂盒包含(a)本发明的组合物和(b)其使用说明书。在另一个方面，本发明的试剂盒包含(a)本发明的活生物治疗组合物中的任一种和(b)其使用说明书。说明书可以包括如何应用、施用、使用和维持所述组合物的解释。
本发明的组合物如上所述。在某些实施方案中，本发明的组合物是如上所述的经工程改造的能够表达治疗上有关的重组融合多肽的微生物。在优选的实施方案中，所述组合物包含经工程改造的细菌（例如，表皮葡萄球菌），其能够表达包含丝聚合蛋白的重组融合多肽。

[0118] 在某些实施方案中，试剂盒可以包括密闭容器。容器的非限制性例子包括瓶子、金属管、层压管、塑料管、分配器、加压容器、隔离容器、包装、隔室、口红容器、紧凑容器、可以容纳化妆品组合物的化妆品罐、或其它类型的容器，诸如注射或吹模铸的塑料容器，在其中保留分散体或组合物或期望的瓶子、分配器或包装。容器的其它示例包括玻璃或塑料管形瓶或瓶子。试剂盒和/或容器可以包括在其表面上的标记。所述标记例如可以是单词、短语、缩写、图片或符号。

[0119] 以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图明确地通过引用整体并入本文。实施例

[0120] 以下实施例进一步描述和证明了在本发明范围内的实施方案。实施例仅为了说明的目的而给出，不应解释为本发明的限制，因为其许多变化在不脱离本发明的精神和范围的情况下是可能的。

[0121] 实施例1：开发一种核酸构建体，其可以编码能够被输出表皮葡萄球菌细胞并然后输入人角质形成细胞的蛋白在一个实施方案中，本发明描述了重组表皮葡萄球菌菌株的制备，所述菌株能够分泌异源蛋白，因此克服了表皮葡萄球菌的遗传修饰的难处理性。由于I型和IV型限制系统在这些细菌的几乎所有菌株中的存在，以前对常见皮肤定殖者金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的功能基因分析受到了限制。这些限制系统识别来自标准克隆扩增系统（诸如DH10B大肠杆菌）的DNA中的甲基化胞嘧啶碱基。但是，使用甲基化缺陷型大肠杆菌菌株DC10B，在表皮葡萄球菌菌株ATCC12228中已经创建了几种构建体5，所述菌株是一种共生的非致病性分离株，其缺乏在表皮葡萄球菌相关的导管血流感染中涉及的ica操纵子。因此，本发明描述了在表皮葡萄球菌中的第一种已知的报道的异源蛋白表达。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种核酸质粒，其能够编码从表皮葡萄球菌细胞中输出并随后输入人角质形成细胞中的蛋白。该质粒pAZT基于pJB38 (Bose, J. L.等人. Applied and environmental microbiology.  2013;79(7):2218-2224)，一种等位基因交换大肠杆菌-葡萄球菌穿梭载体，其已被专门工程改造成具有改善功能的特征。在一个实施方案中，本发明提供了一种经工程改造的表皮葡萄球菌，其能够有效地定殖重构的表皮并且能够从 109 CFU/mL产生50µ~
g蛋白/mL (图2)。

[0122] 细胞穿透肽(CPP)尽管表皮具有强大的屏障性能，但是已经通过采用转导肽或细胞穿透肽(CPP)证明了穿过角质层的蛋白递送。由于来自疏水表面和构成角质层的连接的角质细胞层的扩散障碍而产生了该挑战。但是，通过将CPP序列连接到目标蛋白的N-端末端，除了可以促进靶蛋白的细胞内定位和胞内体/溶酶体逃逸，还可能将融合蛋白成功地递送到更深表皮中。在一个实施方案中，本发明提供了一种利用这样的方案的构建体，其包含转录衍生的细胞穿透肽(RMR)蛋白基序的HIV反式活化剂（图2）。该方案是将蛋白递送到皮肤深层以获得更高治疗效果的基础。

[0123] 安全性和“杀死开关”几乎所有用于临床应用的重组微生物的一个关键要求是防止不希望的引入其它个体
或环境的能力。为了确保经工程改造的菌株的安全性，在一个实施方案中，本发明使用了营养缺陷型菌株，其需要补充关键氨基酸（D-ala）或某些代谢基因（AlaR）才能存活，并且同时替代对抗生素抗性株进行选择的需要，后者在商业上不可行。在另一个实施方案中，本发明集成了“杀死开关”，其基于在双木糖-核糖开关启动子的诱导后的CRISPR/Cas9自我切割。
在另一个实施方案中，本发明提供了细胞计数器，其在限定的分裂次数后重组出AZT基因座，尽管该方法需要重新施用媒介物。为了确保本发明的经工程改造的表皮葡萄球菌的安全性，开发了基于CRISPR/Cas9的杀死开关，其是木糖诱导的并且被茶碱核糖开关双重调节。该方案的基础是，Cas9在给定靶向指导的情况下在染色体裂解方面极为有效，并且由于葡萄球菌缺乏规范的非同源末端连接修复途径，基因组裂解在没有同源重组模板存在下导致死亡。基于CRISPR的系统的应用还赋予了极大的特异性，因为比较基因组学可以用于设计本发明的经工程改造的表皮葡萄球菌菌株所特有的指导，使得如果通过水平基因转移将其传播至其它微生物，则所述构建体是无活性的。最后，在一个实施方案中，本发明提供了一种构建体，其被设计成表达多个CRISPR间隔物以同时靶向多个基因组区域以确保切割并通过回复变异使存活最小化。

[0124] 实施例2：使用体外模型系统确定局部应用表皮葡萄球菌的持久性和定位材料和方法
建立报道细菌
为了便于跟踪局部应用细菌，使用了表达sGFP的表皮葡萄球菌（SE）菌株。除去SecA和RMR肽，以使sGFP蛋白不会穿梭到分泌系统中，而游离sGFP不会穿透角质层。该构建体被称作SE-sGFP。

[0125] 量化并对比转化的细菌在液体培养基中的生长特征需要对转化的（重组的）表皮葡萄球菌与野生型表皮葡萄球菌竞争的能力有基本的理解。为了理解转化的细菌的生长特征以及重组的产生蛋白的细菌的生长动力学，使用标准技术量化液体培养基中的菌落形成单位(CFU)。为了确定表皮葡萄球菌-sGFP、表皮葡萄球菌-chl和野生型表皮葡萄球菌之间的生长差异，使每种菌株分别在两个一式三份的100mL培养物中各生长12小时。每小时采集1 mL样品，分别在395 nm和600 nm测量以测量sGFP的信号和细菌的总浓度。在所有样品之间对比荧光和光密度，以理解生长特征和sGFP产生。结果表明，相对于表皮葡萄球菌-Chl，蛋白生产仅略微减少了表皮葡萄球菌-GFP的竞争性生长，如通过荧光和CFU测量所确定的。

[0126] 表皮葡萄球菌-GFP和对照菌株在RHE上的生长的定量为了表征将细菌应用到皮肤上的可行性，确定了外部应用的细菌在体外皮肤模型上的生长动力学，并理解这只是这些细菌将在人皮肤上遇到的生态竞争的第一近似值。为了使培养物在运输后达到稳定，在接受分化培养物后两天开始进行测定。在不含抗生素和抗真菌剂的培养基中建立并维持RHE培养物（根据需要补充Chl），每两天将其更换。用移液器将悬浮在50％甘油中的细菌施加到RHE的中心3mm直径处。也施加带有表皮葡萄球菌-chl和表皮葡萄球菌-WT细菌的对照RHE，并与实验组一起取出。从培养物中取出后，将组织插入物匀浆化并穿过5 μm过滤器以收集细菌流过物。将细菌混悬液离心，重新悬浮于培养基中并连续稀释和铺板以确定插入物中的细菌的CFU。将所有测量值通过细菌的最大回收率归一化，如在施用后15分钟回收的CFU所确定的。

[0127] SE-GFP和对照菌株在RHE上的生长的定性表征使用RHE和Vivascope设计测定以得到关于表皮葡萄球菌-GFP定居的空间和时间信息。
将表皮葡萄球菌-GFP应用于RHE，并使用10 μm步长和激光功率的线性增加，以反射和荧光模式在2 mm x 2 mm宽和100 μm深的三个标准化区域中对样品成像。使用超声凝胶(Parker Laboratories)保持物镜和玻璃样品板之间的折射率。使用“网格/集合拼接（Grid/Collection Stitching）”在ImageJ中分析图像（图3）。

[0128] 结果表明，细菌归巢至角质层的表面和深沟，并在整个实验过程中保持恒定存在。

[0129] 重要的是，为了模拟特应性皮炎患者的受损皮肤的超结构，特意用Derma Microneedle装置穿刺RHE，以确定在受损皮肤存在下细菌的定位。结果表明，细菌定位在穿刺处的深度最大为70µm (箭头，图3 (B)-(D))。这提示局部应用的细菌能够归巢至受损皮肤的区域。

[0130] 在体内重复了这些研究。具体地，施用SE-GFP，在施用后三天对其进行光和体内双光子显微术。在不同深度，范围从小鼠耳朵的25 μm到剃毛的小鼠背部皮肤的80 μm（图4），结果表明存在持续且普遍的GFP表达，证实了表皮葡萄球菌-GFP能够定殖至角质层的最深层（10-40 μm），并进一步定居在小鼠的毛囊中。

[0131] 实施例3：使用体外模型系统表征细菌分泌的sGFP向皮肤的递送sGFP在SE中产生的表征
大量纯化的sGFP和sGFP + RMR向RHE的递送的表征
有关纯化的sGFP和sGFP+RMR的定位的数据将有助于理解：（i）sGFP+RMR是否穿透角质层；（ii）如果有穿透，则可以检测穿透多深；和（iii）穿透的动力学特征。在这里，在时间点
0、2、6、12、18和24小时施加5.0 μg/ μL的GFP +/- RMR，以确定剂量对穿透和时间的影响。
结果表明，在施用后的30分钟内，GFP被检测到与表皮-真皮连接部一样深。

[0132] 来自SE-GFP报道和对照菌株的原位分泌的sGFP蛋白的细胞隔室和穿透深度的表征该测定的目标与上述目标相似，但是关键的区别在于，该蛋白通过SE-sGFPRMR/SecA和SE-sGFPSecA原位制备，并与RHE上的对照菌株进行对比。本文所述的相同方法用于表征sGFP穿透进RHE中的动力学。Vivascope提供了关于sGFP在较大表面积上的穿透的有用信息，而IHC的应用允许更细的区分。IHC方法可以检测相对于SE肽聚糖阳性区域的GFP阳性区域，使得可以从细菌中的sGFP信号区分分泌的sGFP（图5）。

[0133] 基于非荧光的治疗性蛋白检测最终递送的治疗性蛋白不是荧光的，而且此外可能无法获得表征其向表皮递送的合适抗体。角质层胶带的蛋白质组学分析已经用于表征具有特应性皮炎(Sakabe, J.等人.The Journal of allergy and clinical immunology.  2014;134(4):957-960 e958)和鱼鳞病(Rice, R.H.等人.PloS one. 2013;8(10):e75355)的患者的体内蛋白谱的差异。此外，皮肤活组织检查的由内而外的水平截面可用于证明在穿透角质层后可鉴定出低丰度分子。

[0134] 实施例4: 评价AZT-01在小鼠（非-GLP）中的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）使用遗传特应性皮炎小鼠构建体（鳞片状尾巴小鼠）评估AZT-01的PK/PD，而在健康小鼠中评估AZT-01的PK。为了评价PD，将AZT-01局部应用于小鼠，并通过表型（红斑、水肿、剥落、干燥和经皮失水）和组织学变化（皮肤屏障重现、纤维化、CD4+ T细胞等）评估PD。为了评价PK，检查了AZT-01和丝聚合蛋白的分布，并表征了定居模式。评估了皮肤微生物组的变化。

[0135] 特应性皮炎小鼠模型。为了研究该方案的适用性，使用了两种模型小鼠系统：丝聚合蛋白敲除小鼠(flg-/-)和鳞片状尾巴小鼠(ft/ft)。Geha等人(Vavrova K.等人. The Journal of Invest. Dermat. 2014;134(3):746-753)对特应性皮炎模型小鼠进行了详尽综述。简而言之，flg-/-小鼠表现出干燥的鳞状皮肤。尽管天然保湿因子（它们是丝聚合蛋白降解产物）水平显著降低，但是角质层(SC)水合和经皮失水(TEWL)在flg-/- 小鼠中是正常的。抗原更有效地穿透了flg-/- SC，从而导致在半抗原诱导的接触性超敏反应中增强的应答以及抗-卵白蛋白IgG(1)和IgE的更高血清水平。这样，使用OVA抗原将小鼠耳朵敏化。

[0136] ft/ft小鼠具有两个不同的常染色体隐性突变，毛发异常(无光泽：ma)和SC层异常(鳞片状尾巴: ft)。这些小鼠即使在无特定病原体的条件下也自发发生皮炎，具有高血清IgE。鳞片状尾巴小鼠也具有在丝聚合蛋白(Flg)中的功能丧失突变，并表现出皮肤屏障异常以及增加的TEWL和SC水合。

[0137] 研究设计。在两种类型的小鼠(Flg-/-和ft/ft)中使用四个组进行研究4周。将小鼠随机分为以下治疗组：局部媒介物对照(50%甘油，50%灭菌的BHI培养基)、局部重组丝聚合蛋白(纯化的重组丝聚合蛋白，50µg/ml)、局部野生型表皮葡萄球菌(SE) (1.0x109 CFU，FLG 9在50%甘油中)和局部SE (1.0x10 CFU，在50%甘油中)。在第0、7、14和21天，将每种溶液应用于每只小鼠的相同耳朵，并且在这些天在施用适当的溶液之前评估小鼠。最终的评估发生在第28天，在该点之后，根据适当的动物方案处死小鼠。主要结果(在下面详细描述)是临床疾病评分的变化，所述变化评估了疾病表现的宏观变化。

[0138] 基于使用2.5的标准偏差、90％的能力和0.05的I型误差进行的样品大小估计，每种基因型每组需要8只小鼠，以便检测组之间临床疾病评分的4点平均变化。这意味着，该研究需要每种基因型共32只小鼠（总共64只小鼠）。

[0139] 表2. 临床结果测量主要结果：临床疾病评分。为了测量治疗对与SEFLG治疗相关的宏观和微观变化的影响，使用了基于先前研究的临床评分(参见，例如，Matsuoka H.等人.Allergy. 2003;58(2):
139-145和Kim, M.C.等人.Journal of acupuncture and meridian studies. 2013;6(2):98-109)。综合临床疾病评分是耳表面上的红斑、水肿、剥落和干燥的严重程度的总和，相应地为0(不可见)、1(轻度)、2(中度)和3(严重)。由不知晓各组的治疗状态的个体进行评分。每7天拍摄一次皮肤。另外，通过TEWL计（Khazaka Electronic）测量TEWL。最后，使用在Kawasaki（即Kawasaki, H.等人.The Journal of allergy and clinical immunology. 
2012;129(6):1538-1546.e1536）中描述的方法评估皮肤屏障的分辨率及其防止异物透过角质层（SC）的能力。将钙黄绿素二[N,N双(羧甲基)氨基甲基]荧光素(Sigma-Aldrich)与从Presome CSII-101 (Nippon Fine Chemical, Osaka, 日本)制备的脂质体混合，并局部应用至6-8周龄小鼠的区域3小时。然后除去尾巴，并迅速冷冻包埋。

[0140] 应用AZT-01后的微生物组表征。为了理解SE的添加对皮肤微生物组微生物多样性的影响，使用了组合的16S rRNA来测量微生物群落的变化。这如下完成：使用qPCR进行RT-PCR，并使用Jackson Laboratory的JAX Genomic Medicine Facility的Illumina MiSeq平台进行测序。使用Caporaso等人(Caporaso, J.G.等人. The ISME journal. 2012;6(8):1621-1624)描述的方法测量群落中细菌的相对丰度的变化。简而言之，使用棉签从皮肤收集样品，并使用rRNA提取试剂盒（Qiagen）提取rRNA，然后将其扩增、qPCR分析和测序。随后，使用生物信息学和统计方法将相似序列分组为运算分类单位(OTU)(图6)。

[0141] 使用生态学指标和群落结构分析测量了生态失调。首先，使用Shannon多样性指数（它是考虑的微生物群落的生态度量）将生态失调评估为多样性的函数，并在施用之前和之后进行了对比。此外，在治疗之前和之后对比了局部微生物组的群落结构。然后，使用统计数据诸如对比群落结构的Yue-Clayton指数，将生态失调测量为(i)相对于基线微生物组的%总偏差，和(ii)相对于我们的对照的平均群落结构的偏差。最后，在每个物种的水平上分析了微生物组趋势。在处理过程中还跟踪了每个物种的纵向动力学，以鉴别物种是否正在从群落流失。

[0142] 免疫组织化学研究。通过将AZT-01与媒介物对照进行对比，使用免疫细胞化学对丝聚合蛋白进行可视化和定量。将角质形成细胞用70%乙醇、50 mM甘氨酸固定1小时。如下执行免疫荧光染色：将抗-丝聚合蛋白第一抗体在1:200温育2小时，然后在Hoechst Stain溶液(Sigma)存在下与大鼠抗-山羊罗丹明第二抗体(Jackson Laboratory)在1:200稀释度温育。将载玻片用盖玻片固定在Gel/Mount (Biomed)中。此外，还创建了替代序列，并在RMR信号的位置进行了试验（例如，胞内体逃逸肽，诸如在Appelbaum等人. 2012（通过引用整体并入本文）(Appelbaum, J.S.等人.Chemistry & biology. 2012;19(7):819-830)中描述的那些）。

[0143] 统计分析。使用双向student T-检验评估了主要结果和/或宏观临床疾病评分的组之间的差异。使用ANOVA评估了各组之间的差异。相同的技术将用于评估TEWL和表皮的增厚。使用Mann-Whitney U检验评估了非参数连续变量的差异。最后，使用卡方检验评估了顺序变量的差异。

[0144] 关于微生物组的分析，使用定量的基于分类的Canberra距离计算了样品之间的群落变异。使用置换MANOVA进行组内相似性的判别分析。为了确定皮肤微生物群落之间是否变得更相似，我们在素食主义者中使用了具有β分散功能的β分散检验。该检验是关于方差同质性的Levene氏检验的多元模拟，并且检验了组之间的样品异质性的显著差异(Anderson, M.J.等人.Ecology Letters.  2006;9(6):683-693)。使用Holm氏校正对重要指标的P值进行了多重比较调整(Holm S. Scandinavian Journal of Statistics. 1979;
6(2):65-70)。

[0145] 免疫荧光显微术。使用免疫荧光显微术使丝聚合蛋白定位可视化。将小鼠皮肤样品固定在10％福尔马林中并石蜡包埋。将石蜡切片脱蜡，并先后用95％乙醇和甲醇过氧化氢洗涤。然后使用啮齿动物Decloaker溶液(Biocare Medical, RD913)和Biocare decloaking室通过热诱导的表位恢复（HIER）程序处理切片。在Tris pH 7.4中洗涤后，将切片在大鼠血清和FcBlock (24G2)存在下温育，然后在封闭溶液稀释的兔抗-大肠杆菌B (DAKO, B0357)存在下温育。将样品在Tris中洗涤，然后与山羊抗-兔IgG-德克萨斯红抗体(Invitrogen, T2767)一起温育。然后将组织用HOECSHT复染色，并使用Leica DM IRBE荧光显微镜成像。

[0146] 实施例5: AZT-01及其对大鼠(非-GLP)中的局部和全身炎症和免疫的影响为了评价毒理学，分析了在指定的时间点安乐死的局部处理过的大鼠的局部组织样
品、血清样品和淋巴结样品。关于炎症活性的组织学变化（例如，定量CD4+ T细胞、朗格汉斯细胞、IgE、IL-4、IFN-γ等）、以及皮肤免疫应答的活性和变化（例如，IL-4、IL-10、IL-13等的定量），分析了组织。还监测了与疗法应用有关的潜在副作用的临床症状，包括红斑、皮肤温度变化、浮肿、起泡和溃疡。

[0147] 组织学评价。将每组的切离耳在4%低聚甲醛中固定16小时，并包埋在石蜡中。随后，将6 μm切片用苏木精(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)和伊红(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) (H&E)染色。用显微镜(100X, 200X)观察真皮中的浸润淋巴细胞和纤维化。

[0148] 疾病有关的mRNA转录物定量。通过标准qPCR测定测量了与特应性皮炎的发生、发展和维持相关的基因的可变表达(AD-相关的病原性细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-13、INF-γ、IL-17、IL-10和TNF-α))。简而言之，按照生产商的说明书，使用Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)从皮肤样品分离总RNA。使用逆转录酶PCR (RT-PCR)合成了相应的cDNA。使用比较型2-ΔΔCT方法进行实时PCR，并将其归一化至甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)转录物水平。

[0149] AZT-01施用以后的免疫学变化。从细菌应用区域以及未应用细菌的区域分离细胞以研究免疫学变化。分离出角质形成细胞、表皮细胞、来自淋巴结的细胞和小肠固有层。用LIVE/DEAD可固定的蓝色死细胞染色试剂盒（Invitrogen）或用在HBSS中的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, Sigma)对单细胞悬液进行染色以排除死细胞。为了检测转录因子，根据生产商的方案使用Foxp3染色套件（eBioscience）对细胞进行染色。为了检测细胞内细胞因子，将细胞固定并用BD Cytofix/Cytoperm渗透化处理，并在BD Perm洗涤缓冲液(BD Biosciences)中染色。用购自eBioscience、BD Biosciences或Dendritics Ccorp的以下抗体对细胞染色：CD4、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、Foxp3、CD34、CD44和/或CD25。在FcBlock (eBioscience)、0.2  mg/ml纯化的大鼠IgG和1  mg/ml正常小鼠血清(Jackson Immunoresearch)存在下进行染色。如前面描述的(Lopes, L.B.等人. Pharm Res. 2005;
22(5):750-757)进行皮肤归巢标志物的染色。作为安全性的度量，通过在AZT-01应用两周后取皮肤-引流淋巴结(DLN)的样品和一只小鼠的脾脏来监测AZT-01血液传播的迹象。简而言之，将小鼠置于70%EtOH中并移至层流洁净工作台。在EtOH中放置1-2分钟后，用70µm滤网在50 mL锥形管中分离DLN和脾脏，并作为独立的样品进行处理。用500µl无菌PBS解离器官，并在BHI琼脂培养基上培养50-100 μl细胞悬浮液。

[0150] 实施例6：进行初始制剂和分析方法开发，以评价活性药物成分(API)和药物产品(DP)的拟议规范集合鉴于活生物治疗产品(LBP；例如，AZT-01)作为活性药物成分(API)或药物产品(DP)与传统小分子相比的独特性质，对于LBP的临床开发而言关键的是开发有用的制剂和实用的分析测定。将为API开发制剂以生产DP，并为API和DP稳定性二者开发分析方法以建立用于临床研究的GMP材料的规范。

[0151] 统计分析。除非另有说明，否则一式三份地进行实验，并报告均值和标准偏差。为了进行组之间的对比，使用了双向t-检验或方差分析。如果数据不是正态分布的，则将数据替换为非参数等效项（Wilcoxon秩和以及Kruskal-Wallis检验）。

[0152] 实施例7：疏水性分析人丝聚合蛋白(hFLG)由12个重复单元构成，并由细胞内蛋白酶处理以释放各个单元。
在这些单元内的序列是高度同源的。已经提出在“接头区域”切割所述单元。在这些接头区域之间的区段是各个单元，每个单元含有一对子结构域。使用在线Kite-Doolittle计算工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析了整个人丝聚合蛋白(hFLG)序列(Uniprot P20930)。随着氨基酸位置而变化的疏水性评分图显示在图7中。如在图7中所示，存在疏水性的周期性增加。Kite-Doolittle评分给出了在最高值和最低值之间的最高差异。当与图8所示的小鼠丝聚合蛋白(mFLG)序列(NCBI参照序列: XP_017175331.1)对比时，看到疏水性评分的高得多的差异。这是由于来自不同生物的蛋白的性质。

[0153] 进一步检查了感兴趣的分子区域。发现对应于更疏水区域的波峰之间的距离在人丝聚合蛋白中比在小鼠中更远。并且，发现最大疏水性在小鼠中高于在人中。

[0154] 感兴趣的是hFLG的两个特定结构域，即hFLG [结构域5-6]和[结构域9-10]。图9显示了hFLG的从氨基酸1400起始到1800的区域，并显示了结构域9和10的单元区段。还显示了在人和小鼠丝聚合蛋白共有的10个氨基酸区段(SGSQASDSEGHS)之后紧挨着的峰处的重复末端。该图的位置1444和1767处的高峰对应于FLY区段。在1679和1929处的峰是含有聚酪氨酸的区域。

[0155] 蛋白hFLG (结构域9-10) (1429-1774) (SEQ ID NO: 2)代表高至高疏水性区段。该区段在图10中示出。它含有在蛋白的两端处的FLY区段。

[0156] SEQ ID NO: 2在SEQ ID NO: 3中显示了具有N-端甲硫氨酸和C-端RMR区段的蛋白hFLG (结构域9-
10) (1429-1774)的完整序列（M和RMR带下划线）。重复的序列QSGEXSGRSXSFLYQVSXHEQSES在下面以粗体显示。

[0157] SEQ ID NO: 3发现重复FLY区段可能不是活性所需要的，且进一步，它可能是细菌的负担，并且可能是在革兰氏阳性生物体中缺乏生产的根源。

[0158] 图10的图显示了在hFLG中从氨基酸位置1400至氨基酸位置1800的hFLG[9-10](1429-1774)随着氨基酸位置而变化的疏水性评分。

[0159] 实施例8：基于疏水性分析的新蛋白结构hFLG [结构域9-10]
接着，产生具有系统性削去的N-端区域的hFLG [结构域9-10]蛋白。

[0160] 基于“U”形状（“高-低-高”）选择区段在图11中的图表明，hFLG [9-10] (1429-1777) (SEQ ID NO: 2)的开始和结束位置可能太长。因此，切割N-端FLY区段以制备hFLG [9-10] (1452-1777) (SEQ ID NO: 4)，以防止不希望的重组事件。

[0161] SEQ ID NO: 4理论pI/Mw: 10.65/36162.11。

[0162] 基于“Λ”形状（“低-高-低”）选择区段接着，进行从一个低疏水性点至下一个低疏水性点的重复序列的选择。该区段具有两个在N-端的结构域，其中FLY区域靠近序列的中间。因此，包含结构域9-10的“核心”序列位于序列的一个末端而不是中间。此外，长交集重复序列朝向该序列的C-端。这在图12中示出。

[0163] 基于上述分析，制备了基于低至低区段hFLG[9-10](1545-1869)的蛋白，如下SEQ ID NO: 5所示。

[0164] SEQ ID NO: 5理论pI/Mw: 11.00/36182.19。

[0165] 通过在hFLG[9-10] (1545-1777)中将其删除来评价具有未知功能的区段的重要性，如下SEQ ID NO: 6所示。

[0166] SEQ ID NO: 6理论pI/Mw: 10.07/26329.02。

[0167] 进一步预期，在hFLG[9-10](1452-1777) (SEQ ID NO: 2)上，N-端区域将被敲除。

[0168] 实施例9：丝聚合蛋白(M-AZT-突变蛋白-RMR)对hFLG[9-10]序列(SEQ ID NO: 1)进行了BLAST分析：
丝聚合蛋白[智人]
序列ID: NP_002007.1
长度：4061 匹配数：16
范围1: 1430-1774
将该序列与其它hFLG单元(FLG[3-4]、hFLG[5-6]、hFLG[7-8]、hFLG[11-12]、hFLG[13-
14]、hFLG[15-16]、hFLG[17-18]、hFLG[19-20]、hFLG[21-22])对比。对比了可变的氨基酸，并将最常见的氨基酸替换进[9-10]序列。

[0169] 通过多重比对，将新序列（S-FLG）与原始hFLG[9-10]序列对比，如下所示：创建了hFLG[M-AZT-突变蛋白-RMR](1-352)，如下SEQ ID NO: 8所示。

[0170] 当对比每个FLG单元时，将在SEQ ID NO: 8中以粗体显示的氨基酸修饰为最普遍的氨基酸。下表3显示了在hFLG[9-10]中的氨基酸残基和在hFLG[AZT-突变蛋白]中的相应修饰的氨基酸。在序列中重新引入Ser-Glu-Ser (SES)以与Kite-Doolittle分析比对。出于与SES相同的原因，除去了QSGESSG序列，并将其计算为无意义的。

[0171] 表3实施例10：丝聚合蛋白共有序列
通过丝聚合蛋白二聚体hFLG[3-4]、hFLG[5-6]、hFLG[7-8]、hFLG[9-10]、hFLG[11-12]、hFLG[13-14]、hFLG[15-16]、hFLG[17-18]、hFLG[19-20]、hFLG[21-22]的比对而产生人丝聚合蛋白共有序列，如在图13中所示。如SEQ ID NO: 9所示的共有序列表示从图13的比对中所示的最频繁出现的氨基酸形成的序列。

[0172] SEQ ID NO: 9实施例11：角蛋白结合测定以测量丝聚合蛋白的活性
使用角蛋白结合测定测量在SEQ ID NO 1-9所示的各种hFLG[9-10]序列的活性。

[0173] 从人胼胝中提取角蛋白：从人胼胝中提取角蛋白。将1至2克胼胝在10 mL 5mM Tris pH 7.4（含有蛋白酶抑制剂）中使用BULLET BLENDER珠子破碎机匀浆化。将匀浆化的组织在4℃以10 000 rpm离心20分钟。将得到的沉淀重新悬浮于含有8 M尿素和0.025mM β-巯基乙醇的0.05M tris pH 7.4中，并在37℃轻轻混合2小时。将尿素裂解物以10 000 rpm离心10分钟。将上清液在5mM Tris pH7.4中在4℃透析过夜，以使角蛋白纤丝逐渐组装。

[0174] 丝聚合蛋白- 角蛋白结合测定：将组装的胼胝角蛋白纤丝的等分试样（上部分）在10 000 RPM离心5分钟以除去不溶性污染物。将孔用指定量的角蛋白提取物（在包被缓冲液中稀释至200µL的终体积）在4℃包被过夜。除去包被缓冲液，将孔用200µl在PBST (PBS + 0.05%吐温20)中的5%脱脂奶粉封闭，并在37℃温育2h。除去封闭缓冲液，并加入预定量(µg)的适当的人重组丝聚合蛋白（其在PBST中稀释至200µL的终体积），并将板在37℃温育2h。将板用200µL/孔的PBST洗涤3次。为了检测丝聚合蛋白结合，将抗-丝聚合蛋白IgY鸡抗体(RL-012-001B抗体1/1000在PBST中)加至孔中。为了检测角蛋白（对照），将200µL的小鼠泛角蛋白抗体（II型AE3 Ab，在PBST中1/
500稀释）添加至指示的孔中。将第一抗体在室温在振荡下温育1h。除去第一抗体，并将板用PBST洗涤3次。向所有含有抗-鸡抗体的孔中，在PBST中以1/2000的稀释度添加缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的羊驼抗-鸡第二抗体。含有抗-角蛋白抗体的孔接受了在PBST中以1/500的稀释度的缀合了HRP的山羊抗-小鼠抗体。将板在室温在振荡下温育1小时。将板用PBST洗涤3次，并加入100ul的1-Step Ultra TMB底物。将板在室温温育直至蓝色的外观消退，15-
20分钟。通过添加100µL的2M HCL终止反应，并在分光光度计上在450-550 nm读出吸光度。

[0175] 结果显示在图14-16中，并证实，在测试的hFLG序列中存在与角蛋白的差异结合。图14的图显示了在37℃以1µg/孔持续2h的背景FLG结合。在图14中所示的结果包括非特异性结合(NSB)。图15的图显示了各种hFLG区段与人胼胝角蛋白的结合（除去了NSB）。图16的图显示了IgY抗-hFLG的滴定。如在图14-16中所示，hFLG[5-6]不结合角蛋白，而测试的各种hFLG[9-10]序列显示与角蛋白的结合。

[0176] 实施例12：分泌hFLG[9-10]的SE在小鼠中的活性将使用遗传IV小鼠模型(Flg-/-)以及野生型小鼠在体内评估产生FLG的SE的定居动力学。Flg-/-小鼠是丝聚合蛋白缺陷的，并表现出干燥的鳞状皮肤。尽管天然保湿因子（其是丝聚合蛋白降解产物）的水平显著下降，但是角质层(SC)水合和TEWL在Flg-/-小鼠中是正常的。抗原更有效地穿透Flg-/- SC，从而导致在半抗原诱导的接触性超敏反应中增强的应答以及更高的抗-卵白蛋白(OVA) IgG(1)和IgE血清水平。Flg-/-小鼠得自RIKEN 
BioResource Research Center (RIKEN BRC, Tsukuba, Ibaraki, 日本)。野生型小鼠(BALB/c)也将用于该实验中。

[0177] 在SEQ ID NO 1-9中列出的hFLG[9-10]序列将在SE中用于Flg-/-和BALB/c小鼠。将使用每种小鼠类型五组进行该研究4周。将小鼠分为以下治疗组：局部媒介物对照(50%甘油, 50%灭菌的BHI培养基)、局部野生型SE (1.0x108 CFU/cm2在50%甘油中)和每种分泌丝聚合蛋白的SE构建体(SEFLG)中的每一种的三种剂量(106、107和108 CFU/cm2在50%甘油中)。
每天将每种溶液在每只小鼠的相同耳朵和尾巴上施用持续7天，并在第7、14、30和60天评估小鼠的微生物组分析以评估定居动力学，并在第7和14天评估显微术和组织学以评估皮肤中的定位和宏观变化（例如，任何不利事件诸如炎症的迹象）等。每种小鼠类型每个组将使用12只小鼠。

[0178] 等同方案本领域技术人员会认识到或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体
实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意图由随附权利要求涵盖。