用于治疗和/或预防与造血干细胞移植有关的移植物抗宿主病和/或弥漫性肺泡出血和/或静脉闭塞性病的方法转让专利
申请号 : CN201880052958.1
文献号 : CN111278449A
文献日 : 2020-06-12
发明人 : G.A.德莫普洛斯 , T.杜德勒 , H-W.施维布尔
申请人 : 奥默罗斯公司 , 莱斯特大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种治疗患有或有风险发生移植物抗宿主病(GVHD)的人受试者的方法,包括给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。
2.权利要求1的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。
3.权利要求1的方法,其中所述抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
4.权利要求1的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。
5.权利要求1的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。
6.权利要求1的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。
7.权利要求1的方法,其中所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-
2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有或有风险发生移植物抗宿主病的人受试者。
8.权利要求1的方法,其中所述受试者之前已经历,或当前正经历,或将经历造血干细胞移植.
9.权利要求1的方法,其中所述受试者正患有急性GVHD。
10.权利要求1的方法,其中所述受试者正患有慢性GVHD。
11.权利要求1的方法,其中所述受试者正患有类固醇抵抗性GVHD。
12.权利要求1的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
13.权利要求1-12中任一项的方法,其中所述方法包括至少一周一次给予所述受试者包含剂量为1mg/kg至10mg/kg的所述MASP-2抑制性抗体的组合物。
14.一种治疗、预防或改善与移植物抗宿主病或HSCT-TMA有关的一个或多个神经学症状的方法,包括在接受造血干细胞移植之前、期间或之后,给予受试者包含有效抑制MASP-
2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。
15.权利要求14的方法,其中与移植物抗宿主病或HSCT-TMA有关的一个或多个神经学症状选自虚弱、感觉异常、四肢麻痹、感觉运动缺乏、植物神经功能不全性多神经病和/或神经源性膀胱。
16.权利要求14的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植和所述受试者正患有选自虚弱、感觉异常、四肢麻痹、感觉运动缺乏、植物神经功能不全性多神经病和/或神经源性膀胱的一个或多个神经学症状。
17.权利要求14-16中任一项的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植和正患有移植物抗宿主病。
18.权利要求14-17中任一项的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植和正患有HSCT-TMA。
19.权利要求14的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。
20.权利要求14的方法,其中所述抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
21.权利要求14的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。
22.权利要求14的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。
23.权利要求14的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。
24.权利要求14的方法,其中所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有与造血干细胞移植有关的一个或多个神经学症状的人受试者。
25.权利要求14的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
26.一种治疗患有或有风险发生弥漫性肺泡出血的人受试者的方法,包括给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。
27.权利要求26的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。
28.权利要求26的方法,其中所述抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
29.权利要求26的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。
30.权利要求26的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。
31.权利要求26的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。
32.权利要求26的方法,其中所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有或有风险发生弥漫性肺泡出血的人受试者。
33.权利要求26的方法,其中所述受试者之前已经历,或当前正经历,或将经历造血干细胞移植。
34.权利要求26的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
35.权利要求26-34中任一项的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植和正患有弥漫性肺泡出血。
36.一种治疗患有或有风险发生静脉闭塞性病的人受试者的方法,包括给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。
37.权利要求36的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。
38.权利要求36的方法,其中所述抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
39.权利要求36的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。
40.权利要求36的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。
41.权利要求36的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。
42.权利要求36的方法,其中所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有或有风险发生静脉闭塞性病的人受试者。
43.权利要求36的方法,其中所述受试者之前已经历,或当前正经历,或将经历造血干细胞移植。
44.权利要求36的方法,其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
45.权利要求36-44中任一项的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植和正患有静脉闭塞性病。
说明书 :
用于治疗和/或预防与造血干细胞移植有关的移植物抗宿主
病和/或弥漫性肺泡出血和/或静脉闭塞性病的方法
20180807;文本文件为116KB;创建于2018年8月7日,和经过EFS-Web随本说明书的申请一起提交。
Immunology,第三版,由W.E.Paul编辑,Raven Press,Ltd.,New York)。尽管补体活化对潜
在的病原体提供重要的第一线防御,但促进防护性免疫反应的补体活性也可代表对宿主的
潜在威胁(K.R.Kalli等,Springer Semin.Immunopathol.15:417-431,1994;B.P.Morgan,
Eur.J.Clinical Investig.24:219-228,1994)。例如,C3和C5蛋白水解产物募集和激活中
性粒细胞。尽管对宿主防御是必不可少的,但激活的中性粒细胞无差别地释放破坏性的酶
并可导致器官损伤。另外,补体活化可引起溶解的补体组分沉积在邻近的宿主细胞上以及
微生物靶上,导致宿主细胞溶解。
体-介导的组织损伤的重要性,强调了对有效的补体抑制性药物的需求。迄今为止,艾库组单抗(eculizumab) 一种针对C5的抗体,是唯一的补体-靶向药物,其已被批准
用于人用。然而,C5是在补体系统中位于“下游”的数个效应分子之一,并且C5的阻断并不抑制补体系统的活化。因此,与“下游”补体抑制剂相比,补体活化的起始步骤的抑制剂将具有显著的优势。
主的在先的适应性免疫反应,因此经典途径是获得性免疫系统的一部分。相比之下,凝集素和替代途径两者均不依赖于适应性免疫,并且是先天性免疫系统的一部分。
原作为称为Cl的复合物缔合。在C1q与免疫复合物结合后,Clr的Arg-Ile位点的自体蛋白水解裂解之后是Clr-介导的Cls的裂解和活化,其由此需要裂解C4和C2的能力。C4被裂解成两个片段,称为C4a和C4b,并且类似地,C2被裂解成C2a和C2b。C4b片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键和通过与激活的C2的C2a片段的非共价相互作用产生C3转化酶(C4b2a)。C3转
化酶(C4b2a)通过蛋白水解裂解成C3a和C3b亚组分来激活C3,导致产生C5转化酶
(C4b2a3b),其通过裂解C5导致形成膜攻击复合物(与C6、C7、C8和C-9组合的C5b,亦称为
“MAC”),其可破坏细胞膜,导致细胞溶解。激活形式的C3和C4(C3b和C4b)共价地沉积在外来靶标表面上,其被多个吞噬细胞上的补体受体识别。
白(H-ficolin)、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和C-型凝集素CL-11),统称为凝集素。参见J.Lu等,Biochim.Biophys.Acta 1572:387-400,(2002);Holmskov等,
Annu.Rev.Immunol.21:547-578(2003);Teh等,Immunology 101:225-232(2000))。还参见
J.Luet等,Biochim Biophys Acta 1572:387-400(2002);Holmskov等,Annu Rev Immunol
21:547-578(2003);Teh等,Immunology 101:225-232(2000);Hansen等,J.Immunol 185
(10):6096-6104(2010)。
价糖之间的相互作用非常弱,解离常数通常在单位数毫摩尔范围内。通过亲合力,即通过同时与彼此紧密靠近的多个单糖残基相互作用,MBL实现与聚糖配体紧密的特异性结合(Lee
等,Archiv.Biochem.Biophys.299:129-136,(1992))。MBL识别通常装饰微生物例如细菌、
酵母、寄生虫和某些病毒的糖模式。相比之下,MBL不识别D-半乳糖和唾液酸,次末端和末端的糖,其通常装饰在哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的"成熟的"复杂糖缀合物。认
为该结合特异性促进“外来”表面的识别和有助于保护免于“自-活化”。然而,MBL以高亲和力结合至在哺乳动物细胞的内质网和高尔基体中隔离的N-连接的糖蛋白和糖脂上的高-甘
露糖"前体"聚糖簇(Maynard等,J.Biol.Chem.257:3788-3794,(1982))。因此,损坏的细胞
是经过MBL结合的凝集素途径活化的潜在靶标。
念得到了最近报道的支持,即,在凝集素途径的已知凝集素中,仅L-纤维胶凝蛋白特异性结合至脂磷壁酸,一种在所有革兰氏阳性细菌上存在的细胞壁糖缀合物(Lynch等,
J.Immunol.172:1198-1202,(2004))。胶原凝集素(即,MBL)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列
中具有不显著的相似性。然而,这两类蛋白具有相似的结构域组织,并且像C1q一样,装配成寡聚体结构,其使多位点结合的可能性最大化。
MBL-和纤维胶凝蛋白-装饰的表面(参见Jack等,JLeukoc Biol.,77(3):328-36(2004),
Matsushita和Fujita,Immunobiology,205(4-5):490-7(2002),Aoyagi等,J Immunol,174
(1):418-25(2005)。这种调理素作用需要这些蛋白与吞噬细胞受体的相互作用(Kuhlman
等,J.Exp.Med.169:1733,(1989);Matsushita等,J.Biol.Chem.271:2448-54,(1996)),其
身份尚未确定。
Exp Med 176(6):1497-1502(1992);Ji等,J.Immunol.150:571-578,(1993))。随后确定
MASP活性事实上是两种蛋白酶的混合物:MASP-1和MASP-2(Thiel等,Nature 386:506-510,
(1997))。然而,已证实MBL-MASP-2复合物单独足以补体活化(Vorup-Jensen等,
J.Immunol.165:2093-2100,(2000))。此外,MASP-2单独以高速裂解C2和C4(Ambrus等,
J.Immunol.170:1374-1382,(2003))。因此,MASP-2是负责活化C4和C2以产生C3转化酶
C4b2a的蛋白酶。这与经典途径的C1复合物显著不同,在经典途径中两种特异性丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)的协调作用导致补体系统的活化。另外,第三种新的蛋白酶MASP-3已经分离
(Dahl,M.R.等,Immunity 15:127-35,2001)。MASP-1和MASP-3是相同基因的可变剪接产物。
发生蛋白(CUB)结构域、表皮生长因子-样结构域、第二CUB结构域、串联的补体控制蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。如在C1蛋白酶中,MASP-2的活化通过裂解邻近丝氨酸蛋白酶
结构域的Arg-I1e键发生,这将所述酶分成二硫键连接的A和B链,后者由丝氨酸蛋白酶结构域组成。
Takahashi等,Int.Immunol.11:859-863,(1999))。MAp19包括MASP-2的起始两个结构域,接着是四个独特氨基酸的额外序列。Map19的功能尚不清楚(Degn等,J Immunol.Methods,
2011)。MASP-1和MASP-2基因分别位于人第3和1号染色体上(Schwaeble等,Immunobiology
205:455-466,(2002))。
MASP和激活凝集素补体途径,如MBL一样(Dahl等,Immunity 15:127-35,(2001);
Matsushita等,J.Immunol.168:3502-3506,(2002))。凝集素和经典途径两者形成共同的C3
转化酶(C4b2a),这两个途径在该步骤处汇合。
Biochim.Biophys.Acta1572:401-413,(2002))。这样的患者显示对复发细菌和真菌感染的
易感性。在生命的早期,因为母体来源的抗体滴度减弱,在易损性的表观窗口期间,但在抗体反应的完全库发展之前,这些症状通常是明显的。该综合征经常因为MBL的胶原部分的数个位点的突变导致,其干扰MBL寡聚体的正确形成。然而,因为MBL可起不依赖于补体的调理素的作用,尚不清楚对感染的易感性增加归因于受损的补体活化的程度。
(turnover activation),其可容易地在外来或其它异常表面(细菌、酵母、病毒感染的细胞或受损组织)上被放大,所述表面缺少控制自发补体活化的适当分子元件。存在四种血浆蛋白直接参与替代途径的活化:C3、因子B和D、和备解素。
是在缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因的证据。Collard等(2000)报道了经受
氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL和在暴露于人血清时显示C3沉积(Collard等,
Am.J.Pathol.156:1549-1556,(2000))。另外,用封闭性抗-MBL单克隆抗体处理人血清抑制MBL结合和补体活化。这些发现延伸到心肌缺血-再灌注的大鼠模型,其中与用对照抗体处
理的大鼠相比,用针对大鼠MBL的封闭性抗体处理的大鼠显示在冠状动脉阻塞后显著较低
的心肌损伤(Jordan等,Circulation 104:1413-1418,(2001))。在氧化应激后MBL与血管内
皮结合的分子机制尚不清楚;最近的研究表明在氧化应激后凝集素途径的活化可通过MBL
结合血管内皮细胞角蛋白和不结合糖缀合物而被介导(Collard等,Am.J.Pathol.159:
1045-1054,(2001))。其它研究在缺血/再灌注损伤的发病机理中牵涉到经典和替代途径,
并且凝集素途径在该疾病中的作用仍有争议(Riedermann,N.C.等,Am.J.Pathol.162:363-
367,2003)。
该过程的生理学重要性通过在MASP-1/3-缺陷小鼠的血浆中缺少替代途径功能活性来说
明。从天然C3蛋白水解产生C3b对于替代途径发挥功能是必需的。因为替代途径C3转化酶
(C3bBb)包含C3b作为基本亚基,关于经过替代途径的第一C3b的来源的疑问提出了令人困
扰的问题和引起了大量的研究。
酯键。该键是不稳定的和亲电子谷氨酰基-硫酯可与亲核部分例如羟基或氨基反应,因此与其它分子形成共价键。当隔离在完整C3的疏水袋内时,硫酯键是相当稳定的。然而,C3蛋白水解裂解成C3a和C3b导致高反应性硫酯键暴露在C3b上,并且在包括羟基或氨基的邻近部
分亲核攻击后,C3b变成与靶标共价地连接。除了其在C3b与补体靶标共价连接中的充分证
明的作用之外,还认为C3硫酯在触发替代途径中具有关键的作用。根据广泛公认的"tick-
over理论",替代途径通过产生液相转化酶iC3Bb而开始,其自具有水解的硫酯的C3(iC3;C3(H2O))和因子B形成(Lachmann,P.J.等,Springer Semin.Immunopathol.7:143-162,
(1984))。C3b-样C3(H2O)通过蛋白的内部硫酯的缓慢自发水解,自天然C3产生(Pangburn,
M.K.等,J.Exp.Med.154:856-867,1981)。通过C3(H2O)Bb转化酶的活性,C3b分子沉积在靶
标表面上,从而引发替代途径。
以建立共有的被识别的分子决定簇。广泛公认的是,替代途径活化通过在该途径的抑制性
调节组分(例如因子H、因子I、DAF和CR1以及作为替代途径的唯一正调节剂的备解素)之间
的精细平衡得到控制(参见Schwaeble W.J.和Reid K.B.,Immunol Today 20(1):17-21
(1999))。
径C3转化酶(C3bBb)。替代途径C3转化酶通过结合备解素而稳定。备解素延长替代途径C3转化酶的半寿期6-10倍。将C3b添加至替代途径C3转化酶导致形成替代途径C5转化酶。
外,亚溶解的(sublytic)MAC沉积还可在炎症中起重要作用。
题的范围的辅助。
活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物。在一些实施方案中,所述受试者患有或有风险发
生选自溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和非典型溶血性尿毒综合
征(aHUS)的TMA。在一些实施方案中,在给予组合物之前,所述受试者被确定显示选自以下的一个或多个症状:(i)贫血、(ii)血小板减少、(iii)肾机能不全和(iv)肌酸酐升高,和所述组合物以改进所述一个或多个症状的有效量和足够时间给予。在一些实施方案中,MASP-
2抑制剂是抗-MASP-2抗体或其片段。在一些实施方案中,MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ
ID NO:6的一部分的抗-MASP-2单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中,MASP-2抑制剂抑
制微血管内皮细胞损伤。
依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物。在一个实施方案中,在给予组合物之前,所述受试者被确定显示选自以下的一个或多个症状:(i)贫血、(ii)血小板减少、(iii)肾机能不全和(iv)肌酸酐升高,和所述组合物以改进所述一个或多个症状的有效量和足够时间给
予。在一个实施方案中,所述受试者患有或有风险发生非-因子H依赖性aHUS。在一个实施方案中,所述受试者患有与因子I、因子B或膜辅因子CD46相关的aHUS。在一个实施方案中,
MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的抗-MASP-2抗体或其片段,例如抗-
MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制微血管内皮细胞损伤。
在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制血栓形成。
血、血小板减少、肾机能不全和肌酸酐升高的至少一种症状的存在与否;和(c)在确定贫血、血小板减少、肾机能不全或肌酸酐升高的至少之一存在时,给予所述受试者包含有效抑制
MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物,其中所述组合物以改进所述一个
或多个症状的有效量和足够时间给予。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的抗-MASP-2抗体或其片段,例如抗-MASP-2单克隆抗体或其片段。在所述方法的一个实施方案中,步骤(a)包括对获自所述受试者的样品进行遗传筛选试验和鉴定
在选自补体因子H(CFH)、因子I(CFI)、因子B(CFB)、膜辅因子CD46、C3、补体因子H-相关蛋白(CFHR1)、抗凝血蛋白凝血调节蛋白(THBD)、补体因子H-相关蛋白3(CFHR3)和补体因子H-相关蛋白4(CFHR4)的基因中与aHUS有关的至少一种遗传标记的存在。在一个实施方案中,所
述方法进一步包括监测所述受试者已知与触发aHUS临床症状有关的事件的发生,和在触发
事件发生之前、期间或之后,给予所述受试者包含MASP-2抑制剂的组合物。在一个实施方案中,与触发aHUS临床症状有关的事件选自药物暴露、感染、恶性肿瘤、损伤、器官或组织移植和妊娠。在一个实施方案中,感染是细菌感染。在一个实施方案中,组合物经皮下给予。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制微血管内皮细胞损伤。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制血栓形成。
抑制MASP-2补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物。在一个实施方案中,所述受试者患有
或有风险发生与肺炎链球菌(S.pneumonia)感染有关的非肠道aHUS。在一个实施方案中,
MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的抗-MASP-2抗体或其片段,例如抗-
MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制微血管内皮细胞损伤。
在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制血栓形成。
物,其中MASP-2抑制剂通过静脉内导管或其它导管递送方法给予。在一个实施方案中,所述方法进一步包括用血浆去除术治疗患者。在一个实施方案中,在不存在血浆去除术时给予
包含MASP-2抑制剂的组合物。在一个实施方案中,包含MASP-2抑制剂的组合物通过导管给
予第一段时间,进一步包括给予包含MASP-2抑制剂的组合物第二段时间,其中组合物在第
二段时间期间经皮下给予。在一个实施方案中,所述方法进一步包括定期测定至少一种补
体因子的水平,其中与标准值或健康受试者相比,测定至少一种补体因子的水平降低指示
需要继续用组合物治疗。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的抗-MASP-2抗体或其片段,例如抗-MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制微血管内皮细胞损伤。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制血栓形成。
活化的量的MASP-2抑制剂的组合物,其中MASP-2抑制剂通过静脉内导管或其它导管递送方
法给予所述受试者。在一个实施方案中,所述受试者显示选自中枢神经系统受累、血小板减少、严重的心脏受累、严重的肺受累、胃肠梗塞和坏疽的至少一个或多个症状。在一个实施方案中,所述受试者对ADAMTS13的抑制剂的存在测试阳性,和所述方法进一步包括给予受
试者免疫抑制剂。在一个实施方案中,在不存在血浆去除术时给予包含MASP-2抑制剂的组
合物第一段时间。在一个实施方案中,所述受试者对ADAMTS-13的抑制剂的存在测试阳性,和所述方法进一步包括给予ADAMTS-13。在一个实施方案中,所述方法进一步包括用血浆去除术治疗患者。在一个实施方案中,包含MASP-2抑制剂的组合物在存在血浆去除术时给予。
在一个实施方案中,包含MASP-2抑制剂的组合物通过导管给予第一段时间,进一步包括给
予包含MASP-2抑制剂的组合物第二段时间,其中在第二段时间期间组合物经皮下给予。在
一个实施方案中,所述方法进一步包括定期测定至少一种补体因子的水平,其中与标准值
或健康受试者相比,测定至少一种补体因子的水平降低指示需要继续用组合物治疗。在一
个实施方案中,MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的抗-MASP-2抗体或其片
段,例如抗-MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制微血管内皮细胞损伤。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制血栓形成。
的组合物。在一个实施方案中,组合物经皮下给予。在一个实施方案中,所述方法进一步包括定期测定至少一种补体因子的水平,其中与标准值或健康受试者相比,测定至少一种补
体因子的水平降低指示需要继续用组合物治疗。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂是特异
性结合SEQ ID NO:6的一部分的抗-MASP-2抗体或其片段,例如抗-MASP-2单克隆抗体或其
片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂抑制微血管内皮细胞损伤。在一个实施方案中,
MASP-2抑制剂抑制血栓形成。
(ii)化学疗法继发性TMA;或(iii)移植继发性TMA,包括给予受试者包含有效抑制MASP-2-
依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物。在一些实施方案中,所述受试者患有或有
风险发生癌症继发性TMA,和MASP-2抑制剂以有效降低发生TMA的风险或减少TMA的严重性
的量系统性给予所述受试者。在一些实施方案中,所述受试者患有或有风险发生化学疗法
继发性TMA,和MASP-2抑制剂在化学疗法之前、期间或之后以有效降低发生TMA的风险或减
少TMA的严重性的量系统性给予所述受试者。在一些实施方案中,所述受试者患有或有风险发生移植继发性TMA,和MASP-2抑制剂在移植程序之前、期间或之后以有效降低发生TMA的
风险或减少TMA的严重性的量系统性给予所述受试者。在一些实施方案中移植程序是同种
异体造血干细胞移植物。在一些实施方案中,所述受试者先前已经经历或目前正在经历用
抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂的治疗。在一些实施方案中,所述方法还包括给
予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂,例如人源化的抗-C5抗体或其抗原结
合片段,例如艾库组单抗。
补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物。在一些实施方案中,所述方法包括治疗有风险发
生USS的受试者,其中所述方法包括给予一定量的MASP-2抑制剂一段时间,其有效改善或预防与TTP有关的一个或多个临床症状。在一些实施方案中,所述方法还包括周期性地监测所述受试者和在存在已知与触发TTP临床症状有关的事件时给予MASP-2抑制剂。在一些实施
方案中,所述方法还包括周期性地监测所述受试者和在确定存在贫血、血小板减少症或肌
酸上升时给予MASP-2抑制剂。在一些实施方案中,所述受试者先前已经经历或目前正在经
历用抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂治疗。在一些实施方案中,所述方法还包括
给予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂,例如人源化的抗-C5抗体或其抗原
结合片段,例如艾库组单抗。
抑制剂的组合物。在一些实施方案中,所述受试者先前已经经历或目前正在经历用抑制补
体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂的治疗。在一些实施方案中,所述方法还包括给予受试
者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂,例如人源化的抗-C5抗体或其抗原结合片段,例如艾库组单抗。
量的MASP-2抑制剂的组合物。在一些实施方案中,所述受试者先前已经经历或目前正在经
历用抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂的治疗。在一些实施方案中,所述方法还包
括给予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂,例如人源化的抗-C5抗体或其抗
原结合片段,例如艾库组单抗。
MASP-2单克隆抗体或其片段,其特异性结合SEQ ID NO:6的一部分。在一些实施方案中,抗-MASP-2抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化的抗体和人抗体。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是单链分子。在一些实施方案中,MASP-
2抑制性抗体选自IgG1分子、IgG2和IgG4分子。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是包括S228P突变的IgG4分子。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体结合人MASP-2的KD为10nM或更小。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体结合MASP-2的CCP1结构域中的表位。在一些实施方案中,在体外测定法中在1%人血清中MASP-2抑制性抗体以10nM或更小的IC50抑制
C3b沉积。在一些实施方案中,在90%人血清中MASP-2抑制性抗体以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。
70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的
轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3。在一些实施方案中,MASP-2抑制性单克隆抗体包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示
的轻链可变区。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段特异性地识别由
参考抗体所识别的表位的至少一部分,所述参考抗体包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区
和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,与未处理的血清相比,MASP-2抑制性抗体抑制在来自患有aHUS的受试者的血清中的血栓形成达至少40%。在一些实施方案中,MASP-2
抑制性抗体以比其对来自同一受试者的血清中的C5b-9沉积的抑制作用高至少20%(例如,
高至少30%,高至少40%或高至少50%)的水平抑制在来自患有aHUS的受试者的血清中的
血栓形成。在一些实施方案中,所述受试者处于aHUS的急性期。在一些实施方案中,所述受试者处于aHUS的缓解期。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是单克隆抗体或其片段,其特异性结合SEQ ID NO:6的一部分。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化的抗体和人抗体。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是单链分子。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体选自IgG1分
子、IgG2和IgG4分子。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体是包括S228P突变的IgG4分子。
在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体结合人MASP-2的KD是10nM或更小。在一些实施方案
中,MASP-2抑制性抗体结合MASP-2的CCP1结构域中的表位。在一些实施方案中,在体外测定法中在1%人血清中MASP-2抑制性抗体以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积。在一些实施方案
中,在90%人血清中MASP-2抑制性抗体以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。在一些实施方案中MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段包括:(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸
序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和(b)轻链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨
基酸序列的轻链CDR-L3。在一些实施方案中,MASP-2抑制性单克隆抗体包含SEQ ID NO:67
所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。在一些实施方案中,MASP-2抑制性
抗体或其抗原结合片段特异性地识别由参考抗体所识别的表位的至少一部分,所述参考抗
体包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的抗-MASP-2单克隆抗体或
其片段。在一个实施方案中,抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,所述受试者之前已经历,或目前正经历用抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂治疗,例如其中末端补体抑制剂是人源化
抗-C5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中,所述方法进一步包括用血浆去除术治疗患者。在一个实施方案中,包含MASP-2抑制性抗体的组合物在不存在血浆去除术时给予。
合物。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的抗-MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中,抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,所述受试者之前已经历,或当前正经历用抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体抑制剂治疗。在一个实施方案中,所述受试者正
患有与造血干细胞移植有关的TMA,其对用血小板输注的治疗有抵抗,和/或对用血浆去除
术的治疗有抵抗。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体以有效改进与造血干细胞移植有
关的TMA相关的至少一个或多个临床参数的量给予,例如血小板计数增加(例如,治疗之前
的血小板计数的至少2倍、至少3倍、至少4倍)、结合珠蛋白增加和/或乳酸脱氢酶减少。
的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中,所述方法进一步包
括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其
抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定具有与造血干细胞移植有关的持续性TMA的人受
试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片
段。在一个实施方案中,抗体或其抗原结合片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一个实施方案中,在不存在血浆去除术时MASP-2抑制性抗体给予患者。在一个实施方案中,所述受试者之前已经历,或当前正经历用人源化抗-C5抗体或其抗原结合片段治疗,例如其中末端补体抑制剂是人源化抗-
C5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试
者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以有效改进与造血干细胞移
植有关的持续性TMA相关的至少一个或多个以下临床参数的量给予:(i)血小板计数增加
(例如,治疗之前的血小板计数的至少2倍、至少3倍、至少4倍);(ii)结合珠蛋白增加;(iii)乳酸脱氢酶(LDH)减少;和/或(iv)肌酸酐减少。
性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中,所述受试者之前已经历,或当前正经历,或将经历造血干细胞移植。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组
合物的步骤之前,鉴定患有或有风险发生移植物抗宿主病的人受试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中,
MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。在一个实施方案中,所述受试者患有急性GVHD。在一个实施方案中,所述受试者患有类固醇抵抗性GVHD。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸
序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中,与移植物抗宿
主病或TMA有关的一个或多个神经学症状选自虚弱、感觉异常、四肢麻痹、感觉运动缺乏、植物神经功能不全性多神经病和/或神经源性膀胱。在一个实施方案中,所述受试者已接受造血干细胞移植和所述受试者正患有选自感觉异常、四肢麻痹和神经源性膀胱的一个或多个
神经学症状。在一个实施方案中,所述受试者已接受造血干细胞移植和正患有移植物抗宿
主病。在一个实施方案中,所述受试者已接受造血干细胞移植和正患有HSCT-TMA。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施
方案中,抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其
抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有与造血干细胞移植有关的一个或多个神经学
症状的人受试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变
区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中,所述受试
者之前已经历,或当前正经历,或将经历造血干细胞移植。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗
体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有或有风险发生弥漫性肺泡出血(DAH)
的人受试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体
或其片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更
小的IC50抑制C3b沉积。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID
NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在另一方面,本发明提供用于抑制MASP-2-依赖性补体活化的不良作用的组合物,包括治疗有效量的MASP-2抑制剂,例如MASP-2抑制
性抗体和药学上可接受的载体。还提供了制备用于在有需要的活受试者中抑制MASP-2-依
赖性补体活化的不良作用的药物的方法,其包括在药用载体中的治疗有效量的MASP-2抑制
剂。还提供了制备用于抑制MASP-2-依赖性补体活化的药物的方法,所述药物用于治疗下文描述的病况、疾病和病症的每一种。
化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中,所述受试者
之前已经历,或当前正经历,或将经历造血干细胞移植。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体
或其抗原结合片段的组合物的步骤之前,鉴定患有或有风险发生静脉闭塞性病(VOD)的人
受试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其
片段。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其片段选自重组抗体、具有降低的效应器功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体在90%人血清中以30nM或更小的
IC50抑制C3b沉积。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体经全身递送至所述受试者。在一个实施方案中,MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67
所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在另一方面,本发明提供用于抑制MASP-2-依赖性补体活化的不良作用的组合物,其包含治疗有效量的MASP-2抑制剂,例如MASP-2抑制性抗
体和药学上可接受的载体。还提供了制备用于在有需要的活受试者中抑制MASP-2-依赖性
补体活化的不良作用的药物的方法,其包含在药用载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂。
还提供了制备用于抑制MASP-2-依赖性补体活化的药物的方法,所述药物用于治疗下文描
述的病况、疾病和病症的每一种。
发生干细胞移植后弥漫性肺泡出血的受试者,和/或患有或有风险发生静脉闭塞性病(VOD)
的受试者中体内抑制MASP-2-依赖性补体活化的不良作用,如本文进一步描述的。
测量的;
抗剂)抑制的野生型小鼠中(图16A)的血小板聚集相比,在MASP-2(-/-)小鼠中(FIG.16B)测
量的血小板聚集(表示为聚集面积),如实施例15中所述的;
述的;
实施例20中所述的;
的;
处于风险的面积(AAR)和梗塞面积(INF),如实施例22中所述的;
实施例22中所述的;
存活率,如实施例29中所述的;
存活率,如实施例29中所述的;
护免于脑膜炎奈瑟菌诱导的死亡,如实施例30中所述的;
保护免于脑膜炎奈瑟菌血清型B品系MC58诱导的死亡,如实施例30中所述的;
MC58的log cfu/ml(对于两组小鼠在不同的时间点n=3,结果表示为平均值±SEM),证明尽
管MASP-2 KO小鼠用与WT小鼠相同剂量的脑膜炎奈瑟菌血清型B品系MC58感染,但MASP-2
KO小鼠与WT相比具有对菌血症提高的清除率,如实施例30中所述的;
或对照同种型抗体后,小鼠的百分比存活率,证明抗-MASP-2抗体有效治疗和改善用脑膜炎奈瑟菌感染的受试者的存活率,如实施例31中所述的;
同的时间点回收的脑膜炎奈瑟菌血清型B-MC58的活计数的log cfu/ml:(A)正常人血清
(NHS)加人抗-MASP-2抗体;(B)正常人血清(NHS)加同种型对照抗体;(C)MBL-/-人血清;(D)正常人血清(NHS)和(E)热灭活的正常人血清(NHS),显示在人血清中脑膜炎奈瑟菌的补体
依赖性杀伤通过加入人抗-MASP-2抗体而显著提高,如实施例32中所述的;
菌较高水平的杀菌活性,如实施例32中所述的;
光度法测量)。测试的血清包括热灭活的(HI)NHS、MBL-/-、NHS+抗-MASP-2抗体和NHS对照,如实施例33中所述的;
的血清包括热灭活的(HI)NHS、MBL-/-、NHS+抗-MASP-2抗体和NHS对照,证明抑制MASP-2抑制非致敏的WT小鼠红细胞的补体-介导的溶解,如实施例33中所述的;
测量)。测试的血清包括热灭活的(HI)NHS、MBL-/-、NHS+抗-MASP-2抗体和NHS对照,如实施例33中所述的;
成,多达80%的WT小鼠证实了在60分钟时血栓形成;相比之下,在60分钟期间没有MASP-
2-/-小鼠显示任何血栓形成(log秩:p=0.0005),如实施例35中所述的;
鼠死亡,而相比之下,在实验的整个时间过程中100%的抗-MASP-2抗体-处理的小鼠存活,如实施例36中所述的;
型中具有微血管阻塞的小鼠的百分比,如实施例37中所述的;
时间(分钟),如实施例37中所述的;
具有血栓的小鼠的百分比,如实施例39中所述的;
具有微血管阻塞的小鼠的百分比,如实施例39中所述的;
施例40中所述的;
施例40中所述的;
平均变化,如实施例46所述的;
和神经学症状的改善,如实施例47所述的;
的用途。
于术语的清楚性,提供以下定义。
MASP-2抑制剂可减少MASP-2-依赖性补体活化超过20%,例如超过50%,例如超过90%。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂减少MASP-2-依赖性补体活化超过90%(即,导致仅10%或
更小的MASP-2补体活化)。
它修饰构型。
(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原-结合部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合的单克隆抗体和包括具有所需特异性和结合表位的能力的抗原-结合片段(表位识别
位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。不意欲限制抗体的来源或其制备方式(例
如,通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上述在"抗体"的定义下的片段等。
Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。
键以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸的那些寡核苷碱基。
50个)保守氨基酸置换的变体。保守置换通常包括在以下组内的置换:甘氨酸和丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸;赖氨酸、组氨酸和精氨酸;和苯丙氨酸和酪氨酸。
77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)%同一性。
40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、
140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500或600个或更多个)氨基酸残基长度(例如,SEQ ID NO:5的至少6个连续的氨基酸残基)。在一些实施方案中,人MASP-2蛋白的抗原肽片段少于500个(例如,少于450、400、350、325、300、275、250、225、200、190、180、
170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、
44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、
19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个)氨基酸残基长度(例如,SEQ ID NOS:5的任一个中少于500个连续的氨基酸残基)。
比。为确定百分比序列同一性的目的,比对可以本领域技术内的各种方法实现,例如使用公众可得的计算机软件,例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。用于测量比对的合适参数,包括在待比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法,可通
过已知的方法确定。
分子,和该系统包括经典起始途径和放大C1q-引发的末端补体效应分子活化的相关末端途
径放大环。我们分别称这两种主要补体活化系统为凝集素-依赖性补体系统和C1q-依赖性
补体系统。
起特定病理学的补体活化系统而不完全关闭补体的免疫防御能力是特别需要的。例如,在
其中补体活化主要由凝集素-依赖性补体系统介导的疾病状态中,特异性地仅抑制该系统
将是有利的。这将保持C1q-依赖性补体活化系统完整,以处理免疫复合物加工和有助于宿
主防御感染。
所有5种凝集素以保证凝集素-依赖性补体活化系统的抑制将是必要的。此外,因为还已知
MBL和纤维胶凝蛋白具有不依赖于补体的调理素活性,所以凝集素功能的抑制将导致损失
该有利的宿主防御感染机制。相比之下,如果MASP-2是抑制性靶标的话,该补体-非依赖性凝集素调理素活性将保持完整。MASP-2作为抑制凝集素-依赖性补体活化系统的治疗靶标
的额外益处是MASP-2的血浆浓度是任何补体蛋白中最低的(大约500ng/ml);因此,相对低
浓度的MASP-2高-亲和力抑制剂可足以获得完全抑制(Moller-Kristensen,M.等,
J.Immunol Methods 282:159-167,2003)。
或损伤是主要的驱动因素。TMA的临床和实验室发现包括血小板减少症、贫血、紫癜和肾衰竭。经典的TMA是溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。TMA的特征性
基础病理特征是血小板活化和在小动脉和小静脉中小血栓的形成。至少部分地通过对微血
管内皮的损伤或应激引发的补体活化还牵涉到其它TMA,包括灾难性抗磷脂综合征(CAPS)、系统性德戈斯病以及癌症、癌症化学疗法和移植继发的TMA。
Nephrol.14:1045-1053,2000;Levy,M.等,Kidney Int.30:949-56,1986;Pickering,M.C.
等,Nat.Genet.31:424-8,2002)。因子H缺陷导致因子B和C3的低的血浆水平,这是由于这些组分的活化-相关的消耗导致。C5b-9的循环水平也在这些患者的血清中提高,意味着补体
活化。膜增生性肾小球肾炎(MPGN)和特发性溶血性尿毒综合征(HUS)与因子H缺陷或因子H
突变有关。因子H-缺陷的猪(Jansen,J.H.等,Kidney Int.53:331-49,1998)和因子-H敲除
小鼠(Pickering,M.C.,2002)显示MPGN-样症状,证实因子H在补体调节中的重要性。其它补体组分的缺陷与系统性红斑狼疮(SLE)的发生而继发的肾疾病有关(Walport,M.J.,Davies
等,Ann.N.Y.Acad.Sci.815:267-81,1997)。C1q、C4和C2的缺陷通过涉及免疫复合物和细胞凋亡物质的不完全清除的机制强烈引起SLE的发生。在许多这些SLE患者中发生狼疮肾炎,
其特征是在整个肾小球中免疫复合物的沉积。
的。aHUS的家族性病例与编码补体活化或补体调节蛋白的基因突变有关,所述蛋白包括补
体因子H、因子I、因子B、膜辅因子CD46以及补体因子H-相关蛋白1(CFHR1)和补体因子H-相关蛋白3(CFHR3)。(Zipfel,P.F.等,PloS Genetics 3(3):e41(2007))。与aHUS有关的该多
种多样的基因突变的统一特征是在细胞或组织表面上提高的补体活化的倾向。因此,本发
明的一个方面包括通过给予有效量的MASP-2抑制剂,治疗患有与因子H缺陷有关的aHUS的
患者。本发明的另一方面包括通过给予有效量的MASP-2抑制剂,治疗患有与因子I、因子B、膜辅因子CD46、CFHR1或CFHR3缺陷有关的HUS的患者。
血清蛋白,包括20个短的共有重复序列(SCR)结构域,其用作在溶液中以及在宿主细胞表面上补体活化的负调节剂。它靶向激活形式的C3,并且与因子I和其它辅因子一起,促进其失活,阻止进一步的补体活化。为有效控制在宿主细胞表面上的补体活化,因子H需要与宿主细胞相互作用,这被SCR结构域16-20介导。迄今描述的与aHUS有关的所有因子H突变聚集在包括(SCR)结构域16-20的C-末端区。这些突变的因子H蛋白在控制在溶液中的C3活化中具
有完全的功能,但不能与宿主细胞表面相互作用,因此不能在细胞表面上控制C3活化(Exp Med 204(6):1249-56(2007))。因此,因子H的某些突变与aHUS有关,这是因为突变的因子H蛋白不能与宿主细胞表面相互作用,因此不能有效下调在宿主细胞表面(包括微血管内皮)
上的补体活化。结果,一旦出现初始C3活化,在微血管内皮表面上的随后补体活化继续进
行,在具有因子H突变的患者中不减弱。该不受控制的补体活化最终导致对血管内皮的进行性损伤、随后的血小板聚集和微血管凝血,和由RBC通过局部闭塞的微血管的完全应激引起的溶血。因此,aHUS疾病表现以及临床和实验室发现直接与在微血管内皮表面上的补体负
调节的缺陷有关。
多汇聚的数据牵涉到补体活化。该观念通过在治疗aHUS中艾库组单抗(阻断末端补体蛋白
C5的单克隆抗体)的治疗功效得到最有说服力的支持。
感染试剂是众所周知的。在缺少预存在的适应性免疫的情况下,通过感染试剂的补体活化
可主要通过凝集素途径开始。因此,感染触发的凝集素途径活化可代表用于在aHUS-易感个体中补体活化的后续病理性放大的起始触发剂,这最终可导致疾病进展。因此,本发明的另一方面包括通过给予有效量的MASP-2抑制剂,治疗患有感染继发的aHUS的患者。
表面部分而应答(Am J.Pathol 156(6):1549-56(2000))。缺血/再灌注后的血管损伤也通
过体内凝集素途径激活补体(Scand J Immunol 61(5):426-34(2005))。在该背景中凝集素
途径活化对宿主具有病理结果,和通过阻断MASP-2抑制凝集素途径防止进一步的宿主组织
损伤和不良结果(Schwaeble PNAS 2011)。
剂,包括抗-MASP-2抗体,预期可在aHUS易感个体中预防疾病进展或减少加重。
Infect Dis J.30(9):736-9(2011))。该特定的病因学显示具有不利的预后,具有显著的死亡率和长期发病率。特别是,这些病例涉及非肠道感染,导致表现微血管病、尿毒症和溶血,没有证据表明同时存在的已知是aHUS病因的补体基因突变。重要的是应注意,肺炎链球菌
在活化补体中特别有效,和其主要是通过凝集素途径进行。因此,在与肺炎球菌感染有关的非肠道HUS的情况下,微血管病、尿毒症和溶血的表现预期主要通过凝集素途径的活化来驱动,并且阻断凝集素途径的试剂,包括抗-MASP-2抗体,预期预防aHUS的进展或减少在这些患者中的疾病严重性。因此,本发明的另一方面包括通过给予有效量的MASP-2抑制剂,治疗患有与肺炎链球菌感染有关的非肠道aHUS的患者。
一定量的MASP-2抑制剂一段时间,其有效改善或预防所述受试者的肾衰竭。在一些实施方
案中,方法还包括在发生与aHUS有关的任何症状之前确定受试者是否有发生aHUS的风险的
步骤。在其它实施方案中,方法包括在发生指示aHUS的至少一个或多个症状(例如,存在贫血、血小板减少症和/或肾功能不全)和/或在获自所述受试者的活组织检查中存在血栓性
微血管病时,确定受试者是否有发生aHUS的风险。确定受试者是否有发生aHUS的风险包括
确定所述受试者是否具有发生aHUS的遗传素因,其可通过基因组测序或基因-特异性分析
(例如,PCR分析),评价遗传信息(例如自包含所述受试者的基因型的数据库)或对所述受试者进行至少一种遗传筛查检验以确定存在或不存在与aHUS有关的遗传标记(即,确定在编
码补体因子H(CFH)、因子I(CFI)、因子B(CFB)、膜辅因子CD46、C3、补体因子H-相关蛋白1(CFHR1)或THBD(编码抗凝血蛋白凝血调节蛋白)或补体因子H-相关蛋白3(CFHR3)或补体因
子H-相关蛋白4(CFHR4)的基因中存在或不存在与aHUS有关的遗传突变)来进行;和/或确定
所述受试者是否具有aHUS家族史。对存在或不存在与aHUS有关的基因突变进行遗传筛查的
方法已经充分建立,例如参见Noris M等“Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome,”2007 Nov 16[2011Mar 10更新],在:Pagon RA,Bird TD,Dolan CR等编辑,GeneReviewsTM,
Seattle(WA):University ofWashington,Seattle。
Soc Nephrol 5:1844-59(2010))。如Caprioli等,(2006),同上,所述,大量具有补体因子H(CFH)突变的个体从未发生aHUS,并且假定在这些个体中在生理学条件下亚最佳CFH活性足
以保护宿主免于补体活化的影响,然而,当对激活补体的试剂的暴露产生高于正常量的C3b时,亚最佳CFH活性不足以阻止C3b沉积在血管内皮细胞上。
有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物。在另一实施方案中,提供用于在有风险发生因子H-依赖性非典型溶血性尿毒综合征的受试者中抑制MASP-2-依赖性
补体活化的方法,包括周期性地监测所述受试者,以确定存在或不存在贫血、血小板减少症或肌酐上升,和在确定存在贫血、血小板减少症或肌酐上升时用MASP-2抑制剂进行治疗。在另一实施方案中,提供用于减少有风险发生因子H-依赖性aHUS的受试者将遭受与aHUS有关
的临床症状的可能性的方法,包括在已知与触发aHUS临床症状有关的事件(例如,药物暴露(例如,化学疗法)、感染(例如,细菌感染)、恶性肿瘤、损伤、器官或组织移植或妊娠)之前或期间或之后给予MASP-2抑制剂。
行治疗。
(例如,化学疗法)、感染(例如,细菌感染)、恶性肿瘤、损伤、器官或组织移植或妊娠)之前或期间或之后给予MASP-2抑制剂。
性,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予。
与血浆去除术组合进行治疗。作为第一线疗法,MASP-2抑制剂可经系统地给予至所述受试
者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予。在一些实施方案中,在不存在血浆去除术以避免潜在的血浆去除术并发症包括出血、感染和暴露于血浆供
体固有的病症和/或过敏反应时,或在另外不愿意接受血浆去除术的受试者中,或在其中无法利用血浆去除术的背景中,将MASP-2抑制剂作为第一线疗法给予至受试者。
MASP-2抑制剂治疗。
予,但优选每两周给予。抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组合给予。
与某些肠道病原体的感染紧密有关。患者通常呈现为急性肾衰竭、血红蛋白尿和血小板减
少症,通常接着发生血性腹泻。该病况通过肠道感染痢疾志贺氏菌(Shigella
dissenteria)、沙门氏菌或产生志贺菌毒素-样的肠道出血大肠杆菌菌株例如大肠杆菌
O157:H7而引起。所述病原体从污染的食物或供水获得。HUS是医学急症,具有5-10%死亡
率。相当一部分的存活者发生慢性肾病(Corrigan和Boineau,PediatrRev 22(11):365–9
(2011))并可能需要肾移植。
207(1989)),所述受体优选在肾小球内皮上表达和介导STX的毒性作用。一旦与内皮结合,STX诱导破坏血管内皮的一系列事件,激活白细胞和引起vWF-依赖性血栓形成(Forsyth等,
Lancet 2:411–414(1989);Zoja等,KidneyInt.62:846–856(2002);Zanchi等,
J.Immunol.181:1460–1469(2008);Morigi等,Blood 98:1828–1835(2001);Guessou等,
Infect.Immun.,73:8306–8316(2005))。这些小血栓阻塞或闭塞肾和其它器官的小动脉和
毛细血管。小动脉和毛细血管中通过小血栓的血流阻塞增加施用至RBC的剪切力,因为它们挤压通过狭窄的血管。这可导致通过剪切力造成的RBC的破坏和形成称为裂红细胞的RBC碎
片。裂红细胞的存在是HUS的特征性发现。这一机制已知为微血管病性溶血。另外,血流的阻塞导致缺血,引发补体-介导的炎性反应,这引起对受累的器官的另外损伤。
缺血由微血管血流的初始阻塞引起。
过表达结合凝集素和激活补体的凝集素途径的表面部分而应答(Collard等,Am J
Pathol.156(5):1549-56(2000))。缺血再灌注后的血管损伤还通过体内凝集素途径激活补
体(Scand J Immunol 61(5):426-34(2005))。在该背景中凝集素途径活化具有对宿主的病
理后果,和通过阻断MASP-2抑制凝集素途径防止进一步的宿主组织损伤和不良结果
(Schwaeble等,PNAS(2011))。除了补体活化之外,MASP-2的凝集素-依赖性活化已经表明导致凝血酶原裂解形成凝血酶和促进凝血。因此,通过损伤的内皮细胞活化补体的凝集素途
径可直接激活凝血系统。因此根据MASP-2-介导的凝血酶原活化,补体的凝集素途径可能是连接STX导致的初始内皮损伤与在HUS中发生的凝血和微血管血栓形成的主要分子途径。因
此预期,凝集素途径抑制剂,包括但不限于阻断MASP-2功能的抗体,将防止或减轻在患有
HUS的患者中微血管凝血、血栓形成和溶血。事实上,给予抗-MASP-2抗体显著保护在典型
HUS的模型中的小鼠。如实施例36所述和图45所示的,暴露于STX和LPS的所有对照小鼠发生严重HUS和在48小时内变得濒死或死亡。另一方面,如图45中进一步显示的,用抗-MASP-2抗体治疗和然后暴露于STX和LPS的所有小鼠存活(Fisher准确检验p<0.01;N=5)。因此,抗-MASP-2疗法显著保护在该HUS模型中的小鼠。预期给予MASP-2抑制剂例如MASP-2抗体将有
效治疗HUS患者和提供对由肠病性大肠杆菌或其它产生STX的病原体感染引起的微血管凝
血、血栓形成和溶血的保护。
cycplatin、奎宁、环孢霉素、博来霉素以及其它化学疗法药物和免疫抑制药物。因此,预期抗-MASP-2抗体疗法或抑制MASP-2活性的其它药征将在HUS和其它TMA相关的疾病(即,aHUS
和TTP)中有效预防或限制凝血、血栓形成和RBC破坏,和预防肾衰竭。
通常显示除了严重腹泻之外的1个或多个以下症状:血细胞比容水平低于30%(涂片表明血
管内红细胞破坏)、血小板减少症(血小板计数<150x 103/mm3)和/或存在肾功能受损(血清
肌酐浓度大于年龄参比范围的上限)。存在少无尿(尿排出≤0.5mL/kg/h,达>1天)可用作向发生HUS进展的度量(参见C.Hickey等,Arch Pediatr Adolesc Med 165(10):884-889
(2011))。通常对于存在大肠杆菌细菌(大肠杆菌O157:H7)或志贺氏菌或沙门氏菌物种感染
进行测试。在对肠原性大肠杆菌(例如,大肠杆菌0157:H7)感染测试阳性的受试者中,禁忌使用抗生素,因为使用抗生素可通过STX产生增加而增加发生HUS的风险(参见Wong C.等,N Engl J.Med 342:1930-1936(2000)。对于志贺氏菌或沙门氏菌测试阳性的受试者,通常给
予抗生素以清除感染。对HUS的其它充分建立的第一线疗法包括容积扩张、透析和血浆去除术。
3 3
于30%(涂片显示血管内红细胞破坏)、血小板减少症(血小板计数小于150 x 10 /mm)和/
或存在肾功能受损(血清肌酐浓度大于年龄参比范围的上限))的背景中,提供用于在所述
受试者中降低发生HUS的风险或降低肾衰竭的可能性的方法,包括给予一定量的MASP-2抑
制剂一段时间,其有效改善或预防肾功能受损。在一些实施方案中,给予MASP-2抑制剂至少
1天、2天、3天、4天或更多天的一段时间,和可按医生确定重复进行直到病况已经解决或被控制。在前-HUS背景中,MASP-2抑制剂可经系统地给予至所述受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、口服、皮下或其它胃肠外给予。
原性大肠杆菌感染(例如,大肠杆菌0157:H7),提供用于在所述受试者中降低发生HUS的风
险或降低肾衰竭的可能性的方法,包括给予一定量的MASP-2抑制剂持续第一时间段,其有
效抑制或预防在所述受试者中存在少无尿(例如,至少1、2、3或4天),其中在第一时间段期间给予MASP-2抑制剂在不存在抗生素的情况下发生。在一些实施方案中,方法还包括与抗
生素组合给予MASP-2抑制剂至所述受试者第二时间段(例如至少1-2个周)。
或降低肾衰竭的可能性的方法,包括给予一定量的MASP-2抑制剂一段时间,其有效抑制或
预防在所述受试者中存在少无尿,其中给予MASP-2抑制剂在存在或不存在合适的抗生素的
情况下进行。
一线疗法在不存在血浆去除术时或与血浆去除术组合进行治疗。作为第一线疗法,MASP-2
抑制剂可经系统地给予所述受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予。在一些实施方案中,在不存在血浆去除术以避免血浆去除术的并发症例如
出血、感染和暴露于血浆供体中固有的病症和/或过敏反应时,或在另外不愿意接受血浆去除术的受试者中,或在其中不可利用血浆去除术的背景中,将MASP-2抑制剂作为第一线疗
法给予受试者。
抑制剂至所述受试者第二时间段(例如,至少2周或更长的慢性期)。在一些实施方案中,在第一和/或第二时间段期间的给药在不存在血浆去除术时发生。在一些实施方案中,方法还包括在治疗之前和任选在治疗期间确定在所述受试者中至少一种补体因子(例如,C3、C5)
的水平,其中确定与标准值或健康对照受试者相比至少一种补体因子的水平降低表明需要
治疗,和其中正常水平的确定表明改善。
治疗将持续至少1周和多至3个月。抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组
合给予。
354:1927-35(2006))。这导致在全身的小血管中许多微观血块或血栓。红细胞经受剪应力,其破坏它们的膜,导致血管内溶血。由此产生的血流减少和内皮损伤导致器官受损,包括
脑、心脏和肾。TTP的临床特征为血小板减少症、微血管病性溶血性贫血、神经改变、肾衰竭和发烧。在血浆交换前的时期,在急性发作期间死亡率为90%。甚至经过血浆交换,6个月时的存活率为大约80%。
加(Tsai,H.J Am Soc Nephrol 14:1072–1081,(2003))。ADAMTS-13调节vWF的活性;在其缺乏时,vWF形成大的多聚体,其更可能结合血小板并使患者易于在微血管中造成血小板聚集和血栓形成。
Engl.J.Med,298(24):1350-2,1978)。在具有先天性TTP的个体中已经鉴定ADAMTS13的许多
突变(Kinoshita等,International Journal of Hematology,74:101-108(2001);Levy等,
Nature,413(6855):488-494(2001);Kokame等,PNAS 99(18):11902-11907(2002);Savasan等,Blood,101:4449-4451(2003);Matsumoto等,Blood,103:1305-1310(2004)和Fujimura
等,Brit.J.Haemat 144:742-754(2008))。具有USS的受试者通常具有5-10%的正常
ADAMTS13活性(Kokame等,PNAS 99(18):11902-11907,2002)。尽管获得性TTP和USS具有某
些类似性,但USS在临床特征上具有一些重要的不同。USS通常出现在婴儿或儿童中,特征为严重的血胆红素过多,在出生后不久具有阴性Coombs试验,对新鲜血浆输注有反应,和频繁复发(Savasan等,Blood,101:4449-4451,2003)。在一些病例中,具有该遗传性ADAMTS13缺
陷的患者在出生时具有轻度的表型,并在具有增加的血管假性血友病因子水平的临床条件
(例如感染或妊娠)下仅发生与TTP有关的症状。例如,Fujimura等报告来自具有遗传上确认的USS的6个家庭的9名日本女性,在她们首次妊娠期间经诊断患有该病症。血小板减少症发生在她们15次妊娠的每次的第二至第三个三个月期间,之后经常有TTP。发现所有这些女性严重缺乏ADAMTS13活性(Fujimura等,Brit.J.Haemat 144:742-754,2008)。
ADAMTS13基因突变),提供用于降低发生与先天性TTP有关的临床症状(例如,血小板减少
症、贫血、发烧和/或肾衰竭)的可能性的方法,包括给予一定量的MASP-2抑制剂(例如,
MASP-2抗体)一段时间,其有效改善或预防与TTP有关的一个或多个临床症状。在一些实施
方案中,方法还包括在出现与TTP有关的任何症状之前或在出现至少1个或多个指示TTP的
症状(例如,存在贫血、血小板减少症和/或肾功能不全)时测定受试者是否有风险发生与先天性TTP有关的症状的步骤。确定受试者是否有风险发生与先天性TTP有关的症状(即,所述受试者具有USS),包括确定所述受试者是否具有在编码ADAMTS13的基因中的突变和/或确
定所述受试者是否缺乏ADAMTS13活性和/或确定所述受试者是否具有USS家族史。遗传筛查
存在或不存在与USS有关的基因突变的方法已充分建立,例如参见Kinoshita等,
International Journal of Hematology,74:101-108(2001);Levy等,Nature,413(6855):
488-494(2001);Kokame等,PNAS 99(18):11902-11907(2002);Savasan等,Blood,101:
4449-4451(2003);Matsumoto等,Blood,103:1305-1310(2004)和Fujimura等,
Brit.J.Haemat 144:742-754(2008)。
少症或肌酐升高,和在确定存在贫血、血小板减少症或肌酐升高时或在存在已知与触发TTP临床症状有关的事件(例如,药物暴露(例如,化学疗法)、感染(例如细菌感染)、恶性肿瘤、损伤、移植或妊娠)时用MASP-2抑制剂(例如,MASP-2抗体)进行治疗。
如HIV或自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮有关(Hamasaki K,等,Clin Rheumatol.22:
355-8(2003))。TTP也可由某些药物疗法引起,包括肝素、奎宁、免疫介导的成分、癌症化学治疗剂(博来霉素、顺铂、阿糖胞苷、柔红霉素、吉西他滨、丝裂霉素C和他莫西芬)、环孢霉素A、口服避孕药、盘尼西林、利福平和抗-血小板药物,包括噻氯匹定和氯吡格雷(Azarm,T.等,J Res MedSci.,16:353–357(2011))。与TTP有关的其它因素或条件是毒素例如蜂毒、脓毒症、脾隔离症、移植、血管炎、血管手术和感染例如肺炎链球菌和细胞巨化病毒(Moake JL.,N Engl J Med.,347:589–600(2002))。由于瞬时功能性ADAMTS-13缺乏导致的TTP可因为与肺炎链球菌感染有关的内皮细胞损伤而发生(Pediatr Nephrol.,26:631-5(2011))。
些患者中的ADAMTS-13自身抗体(Tsai,H-M,Hematol Oncol Clin North Am.,21(4):609–v
(2007))。其它试剂例如免疫抑制药物常规添加到疗法中(George,JN,N Engl J Med,354:
1927-35(2006))。然而,血浆交换对于大约20%的患者并不成功,在超过三分之一的患者中出现复发,并且血浆去除术具有成本和技术上的要求。此外,许多患者不能耐受血浆交换。
因此,对另外的和更好的TTP治疗仍有紧迫的需要。
(Galbusera,M.等,Haematologica,94:166–170(2009))。具体而言,补体活化已经显示起关键作用;来自与ADAMTS-13缺乏有关的血栓性微血管病的血清已经显示引起C3和MAC沉积,
和随后的中性粒细胞活化,其可被补体失活废除(Ruiz-Torres MP,等,Thromb Haemost,
93:443-52(2005))。另外,最近显示在TTP急性发作期间存在增加水平的C4d、C3bBbP和C3a(M.Réti等,J Thromb Haemost.Feb 28.(2012)doi:10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x.
[Epub ahead of print]),与经典/凝集素和替代途径的活化一致。在急性发作中该增加量的补体活化可引起末端途径活化和导致进一步的TTP加重。
发它们。血小板介导的补体活化增加炎性介质C3a和C5a(Peerschke E等,Mol Immunol,47:
2170-5(2010))。因此,血小板可在遗传性或自身免疫TTP中用作经典补体活化的靶标。
始内皮损伤而启动。因此预期凝集素途径抑制剂,包括但不限于阻断MASP-2功能的抗体,将减轻在患有TTP的患者中与微血管凝血、血栓形成和溶血有关的微血管病。
除术可与免疫抑制疗法(例如,皮质类固醇、rituxan或环孢霉素)组合进行。具有难治性TTP的受试者(大约20%的TTP患者)对至少2周的血浆去除术疗法没有响应。
如,抗-MASP-2抗体)作为第一线疗法在不存在血浆去除术时或与血浆去除术组合治疗所述
受试者的方法。作为第一线疗法,MASP-2抑制剂可经系统地给予所述受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予。在一些实施方案中,在不存在血浆去除术以避免血浆去除术的潜在并发症例如出血、感染和暴露于血浆供体中固有的病症和/
或过敏反应时,或在另外不愿意接受血浆去除术的受试者中,或在其中不可利用血浆去除
术的背景中,将MASP-2抑制剂作为第一线疗法给予受试者。在一些实施方案中,MASP-2抑制剂与免疫抑制剂(例如,皮质类固醇、rituxan或环孢霉素)组合(包括共-给予)和/或与浓
ADAMTS-13组合给予患有TTP的受试者。
法。在一个实施方案中,长期(经过至少2周或更长的一段时间)通过皮下或其它胃肠外给
药,将MASP-2抑制剂(例如,抗-MASP-2抗体)给予具有难治性TTP的受试者。给药可按医生确定重复进行,直到病况已被解决或得到控制。
抑制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分
子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中所述抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不
抑制替代途径。在一个实施方案中,抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不
抑制经典途径或替代途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典和替代补体途径完整)。
(例如至少30%、至少40%、至少50%)的水平抑制在来自患有TTP的受试者的血清中血栓形成。
70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至99%。
原结合片段包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ
ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:
70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的
轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;或(II)其变
体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少
92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
的重链可变区。在一些实施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体
或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70所示氨基
酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,所述参考抗体包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:
70所示的轻链可变区。
599-610,2011)。用艾库组单抗的实验性治疗初始在治疗皮肤和肠损伤中有效,但不预防系统性疾病的进展(参见Garrett-Bakelman F.等“, 在德戈斯病的病理生理学中C5b-9是潜在的效应器;用艾库组单抗治疗的病例报告”(摘要),Jerusalem:International Society
ofHematology;2010,Poster#156;和Polito J.等,“系统性德戈斯病(DD)或恶性萎缩性丘疹病(MAP)的早期检测可增加存活率”(摘要),San Antonio,TX:American College
ofGastroenterology;2010,Poster#1205)。
的病况的所述受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、皮下或其它胃肠外给予,或可能通过口服给予非-肽能药。抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组合给
予。
清中C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分
子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中所述抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本
上不抑制替代途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和
基本上不抑制经典途径或替代途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典和替代补体途径完整)。
60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至
99%。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体以比对血清中C5b-9沉积的抑制作用高至少
20%或更高(例如至少30%、至少40%、至少50%)的水平抑制在来自患有德戈斯病的受试
者的血清中血栓形成。
体或其抗原结合片段包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)
包含SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包含
SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨
基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少
91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
列的重链可变区。在一些实施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗
体或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70所示的
氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,所述参考抗体包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:
70所示的轻链可变区。
衰竭的TMA。像其它TMA一样,在各种器官中小血管的阻塞是特征性的。在CAPS中存在大约
50%的高死亡率,其往往与感染或创伤有关。患者具有抗磷脂抗体,通常为IgG。
Hematol 18(5):361-5,2011)。因此,如本文对其它TMA所述的,预期凝集素途径抑制剂,包括但不限于阻断MASP-2功能的抗体,将有益于治疗患有CAPS的患者。
的方法。MASP-2抑制剂经系统性给予患有CAPS或由CAPS导致的病况的所述受试者,例如通
过动脉内、静脉内、肌内、吸入、皮下或其它胃肠外给予,或可能通过口服给予非-肽能药。
抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组合给予。
制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中所述抗体基本上不抑
制经典途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上
不抑制替代途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基
本上不抑制经典途径或替代途径(即,抑制凝集素途径同时保留经典和替代补体途径完
整)。
大(例如至少30%、至少40%、至少50%)的水平在来自患有CAPS的受试者的血清中抑制血
栓形成。
70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至99%。
抗原结合片段包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:
70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的
轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;或(II)其变
体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少
92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
列的重链可变区。在一些实施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗
体或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70所示的
氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链
可变区。
发现,和显示与肿瘤栓子有关(Francis KK等,Commun Oncol 2:339-43,2005)。肿瘤栓子可减少血流和因此导致受累小动脉和小静脉的低灌注状态。由此产生的组织应激和损伤预期
以局部的方式激活补体的凝集素途径。激活的凝集素途径进而可通过MASP-2依赖性裂解凝
血酶原为凝血酶而激活凝固级联,导致TMA特有的前-血栓性状态。预期在该背景中MASP-2
抑制减少凝血酶的局部活化和因此减轻前-血栓性状态。
预防癌症继发性TMA的方法。MASP-2抑制剂经系统性给予患有或有风险发生癌症继发性TMA
的所述受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、皮下或其它胃肠外给予,或可能通过口服给予非-肽能药。抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组合给予。
制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中所述抗体基本上不抑
制经典途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上
不抑制替代途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基
本上不抑制经典途径或替代途径(即,抑制凝集素途径同时保留经典和替代补体途径完
整)。
99%。
99%。
述抗体或其抗原结合片段包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和
iii)包含SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的
氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;
或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少
91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
列的重链可变区。在一些实施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗
体或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70所示的
氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链
可变区。
Apher Dial 8:102–11,2004)。已经显示通过各种机制的内皮细胞损伤激活补体的凝集素
途径。例如,Stahl等已经表明,暴露于氧化应激的内皮细胞在体内和体外激活补体的凝集素途径(Collard等,Am J Pathol.156(5):1549-56,2000;La Bonte等,J Immunol.15;188
(2):885-91,2012)。在体内,该过程导致血栓形成,和已经表明凝集素途径的抑制预防血栓形成(La Bonte等J Immunol.15;188(2):885-91,2012)。此外,如本文实施例37-39所证实的,在其中FITC-Dex的局部光致激发用于诱导对微血管的局部损伤,随后发生TMA应答的
TMA的小鼠模型中,本发明人已证明MASP-2的抑制可预防TMA。因此,通过化学治疗剂的微血管内皮损伤可激活补体的凝集素途径,其然后产生局部的前-血栓性状态和促进TMA应答。
因为凝集素途径的活化和前-血栓性状态的产生是MASP-2-依赖性的,所以预期MASP-2抑制
剂,包括但不限于阻断MASP-2功能的抗体,将减轻TMA应答和降低癌症化学疗法-相关的TMA的风险。
治疗或预防化学疗法继发性TMA的方法。MASP-2抑制剂经系统性给予已经经历、正在经历或将经历化学疗法的受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、皮下或其它胃肠外给予,或可能通过口服给予非-肽能药。抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组合
给予。
制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中所述抗体基本上不抑
制经典途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上
不抑制替代途径。在一个实施方案中,所述抗体结MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本
上不抑制经典途径或替代途径(即,抑制凝集素途径同时保留经典和替代补体途径完整)。
50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至99%。
50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至99%。
合物,所述抗体或其抗原结合片段包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:67的
31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链
CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70
的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻
链CDR-L3;或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:
67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少
98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少
91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
列的重链可变区。在一些实施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗
体或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70所示的
氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链
可变区。
Transplantation 40:709-719,2007)。该病况的发病机理知之甚少,但可能涉及最终导致
内皮细胞损伤的反应汇合(Laskin B.L.等,Blood 118(6):1452-62,2011)。如上文所述,内皮细胞损伤是对于凝集素途径活化和前-血栓性环境的产生的一种原型刺激。
更加常见(75%)(Laskin B.L.等,Transplanatation,27;96(2):217-23,2013)。因此,C4d可能是TA-TMA的病理标志物,其牵涉到通过凝集素或经典途径的局部补体固定。
TMA(TA-TMA)的风险。
预防移植继发性TMA的方法。MASP-2抑制剂经系统性给予已经经历、正在经历或将经历移植程序的受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、皮下或其它胃肠外给予,或可能通过口服给予非-肽能药。抗-MASP-2抗体可单独或与C5抑制剂例如艾库组单抗组合给予。在一
些实施方案中,本发明提供治疗或预防同种异体干细胞移植继发性TMA的方法,包括在经历同种异体干细胞移植之前、期间或之后给予受试者包含一定量的MASP-2抑制剂例如MASP-2
抑制性抗体的组合物。
制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中所述抗体基本上不抑
制经典途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上
不抑制替代途径。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基
本上不抑制经典途径或替代途径(即,抑制凝集素途径同时保留经典和替代补体途径完
整)。
99%。
99%。
述抗体或其抗原结合片段包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和
iii)包含SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的
氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;
或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少
91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
列的重链可变区。在一些实施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗
体或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:70所示的
氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链
可变区。
41:933-7,1992;Salant,D.J.等,Kidney Int.35:976-84,1989)、膜增生性肾小球肾炎(系
膜毛细管肾小球肾炎)(Bartlow,B.G.等,Kidney Int.15:294-300,1979;Meri,S.等,
J.Exp.Med.175:939-50,1992)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌后肾小球肾炎)、冷球蛋白
血症性肾小球肾炎(Ohsawa,I.等,Clin Immunol.101:59-66,2001)、狼疮肾炎(Gatenby,
P.A.,Autoimmunity 11:61-6,1991)和Henoch-Schonlein紫癜肾炎(Endo,M.等,
Am.J.Kidney Dis.35:401-407,2000)。已经意识到补体参与肾疾病数十年,但对其在肾疾
病的发作、发展和消退期中的准确作用仍存在较多讨论。在正常条件下,补体的贡献有益于宿主,但补体的不适当活化和沉积可促进组织损伤。
Nephrol.Dial.Transplant10:1166-1172,1995),C5b-9在管上皮/基底膜结构中的沉积与
血浆肌酐水平相关。另一膜肾病的研究证实临床结果和尿sC5b-9水平之间的关系(Kon,
S.P.等,KidneyInt.48:1953-58,1995)。sC5b-9水平升高与预后差正相关。Lehto等测量了
CD59(抑制质膜中的膜攻击复合物的补体调节因子)以及在来自具有膜肾小球肾炎的患者
的尿中的C5b-9的升高水平(Lehto,T.等,Kidney Int.47:1403-11,1995)。取自这些相同的
患者的活检样品的组织病理学分析证实在肾小球中C3和C9蛋白的沉积,而与正常的肾组织
相比,CD59在这些组织中的表达减少。这些各种研究表明,进行性的补体-介导的肾小球肾炎导致补体蛋白的尿排泄,其与组织损伤的程度和疾病预后相关。
胞侵润减少80%、胶原IV型(肾小球系膜基质扩张的标志物)合成减少、和蛋白尿减少50%
(Brandt,J.等,KidneyInt.49:335-343,1996)。这些结果暗示在该大鼠抗-胸腺细胞血清模
型中C5b-9作为补体导致的组织损伤的主要介质。在另一肾小球肾炎模型中,输注分级剂量的兔抗-大鼠肾小球基底膜产生多形核白细胞(PMN)的剂量-依赖性流入,其被先前用眼镜
蛇毒因子的治疗(以消耗补体)减弱(Scandrett,A.L.等,Am.J.Physiol.268:F256-F265,
1995)。眼镜蛇毒因子-治疗的大鼠还显示相比对照大鼠,组织病理减少,长期蛋白尿降低,和更低的肌酐水平。使用三个大鼠GN模型(抗-胸腺细胞血清、Con A抗-Con A和被动
Heymann肾炎),Couser等证实通过使用重组sCR1蛋白抑制补体的方法的潜在治疗功效
(Couser,W.G.等,J.Am.Soc.Nephrol.5:1888-94,1995)。用sCR1治疗的大鼠显示相比对照
大鼠,PMN、血小板和巨噬细胞流入显著减少,系膜溶解和蛋白质尿减少。对补体活化在肾小球肾炎中的重要性的进一步证据通过在NZB/W F1小鼠模型中使用抗-C5 MoAb提供。抗-C5
MoAb抑制C5的裂解,因此阻断C5a和C5b-9的产生。用抗-C5 MoAb继续治疗6个月导致肾小球肾炎的病程显著改善。人源化的抗-C5 MoAb单克隆抗体(5G1.1),其防止人补体组分C5裂解成其促-炎性组分,作为肾小球肾炎的潜在治疗,正处于Alexion Pharmaceuticals,Inc.,
New Haven,Connecticut的开发中。
Nephrol.14:1045-1053,2000;Levy,M.,等,KidneyInt.30:949-56,1986;Pickering,M.C.,等,Nat.Genet.31:424-8,2002)。因子H缺陷导致因子B和C3的低的血浆水平和C5b-9的消
耗。非典型膜增生性肾小球肾炎(MPGN)和特发性溶血性尿毒综合征(HUS)两者均与因子H缺
陷有关。因子H缺陷型猪(Jansen,J.H.,等,KidneyInt.53:331-49,1998)和因子H敲除小鼠
(Pickering,M.C.,2002)显示MPGN-样症状,证实因子H在补体调节中的重要性。其它补体组分的缺乏与系统性红斑狼疮(SLE)的发生继发的肾疾病有关(Walport,M.J.,Davies,等,
Ann.N.Y.Acad.Sci.815:267-81,1997)。通过涉及免疫复合物和细胞凋亡物质的不完全清
除的机制,C1q、C4和C2的缺乏强烈易于发生SLE。在许多这些SLE患者中发生狼疮肾炎,其特征为免疫复合物的沉积在整个肾小球上。
199-206,2001)。许多这些自身抗体显示与肾疾病的高度相关性,以致术语肾炎因子(NeF)
被引入以表示该活性。在临床研究中大约50%的肾炎因子阳性的患者发生MPGN(Spitzer,
R.E.,等,Clin.Immunol.Immunopathol.64:177-83,1992)。C3NeF是针对替代途径C3转化酶
(C3bBb)的自身抗体并且它稳定该转化酶,从而促进替代途径活化(Daha,M.R.,等,
J.Immunol.116:1-7,1976)。同样,对经典途径C3转化酶(C4b2a)具有特异性的自身抗体,称为C4NeF,稳定该转化酶,从而促进经典途径活化(Daha,M.R.等,J.Immunol.125:2051-
2054,1980;Halbwachs,L.,等,J.Clin.Invest.65:1249-56,1980)。已经描述抗-C1q自身抗体与SLE患者的肾炎相关(Hovath,L.,等,Clin.Exp.Rheumatol.19:667-72,2001;Siegert,
C.,等,J.Rheumatol.18:230-34,1991;Siegert,C.,等,Clin.Exp.Rheumatol.10:19-23,
1992),并且这些抗-C1q自身抗体的滴度升高据报道预测肾炎发生(Coremans,I.E.等,
Am.J.KidneyDis.26:595-601,1995)。自SLE患者的尸检肾洗脱的免疫沉积物揭示,这些抗-C1q自身抗体的积聚(Mannick,M.,等,Arthritis Rheumatol.40:1504-11,1997)。所有这些
事实指向这些自身抗体的病理学作用。然而,并非所有具有抗-C1q自身抗体的患者发生肾
疾病,而且,一些健康个体具有低滴度的抗-C1q自身抗体(Siegert,C.E.,等,
Clin.Immunol.Immunopathol.67:204-9,1993)。
Am.J.Kidney Dis.35:401-407,2000)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎(Ohsawa,I.,等,
Clin.Immunol.101:59-66,2001)和IgA肾病(Endo,M.,等,Clin.Nephrology 55:185-191,
2001)的患者的肾活检材料进行检测。因此,尽管补体和肾疾病之间的相关性已经知道几十年的事实,但关于补体如何准确影响这些肾疾病的数据远不完善。
化在脓毒症的发病机理中具有重要作用(Bone,R.C.,Annals.Internal.Med.115:457-469,
1991)。脓毒症的临床表现的定义在不断地发展。脓毒症通常定义为对感染的系统性宿主反应。然而,在许多场合,在具有脓毒性症状的患者中没有发现感染的临床证据(例如,阳性细菌血液培养物)。这种偏差首次在1992年的Consensus Conference中当术语"系统性炎性反
应综合征"(SIRS)建立时提出,并且对于该综合征无需确定存在细菌感染(Bone,R.C.,等,
Crit.Care Med.20:724-726,1992)。现在广泛认同脓毒症和SIRS伴随不能调节炎性反应。
为了简单论述的目的,我们考虑脓毒症的临床定义还包括严重脓毒症、感染性休克和SIRS。
Chemotherapy 41(增刊A):41-6,1998)。引人关注的是,致病的微生物谱似乎从20世纪70年代后期和80年代主要的革兰氏阴性细菌变化至目前主要的革兰氏阳性细菌,原因目前尚不
清楚(Martin,G.S.等,N.Eng.J.Med.348:1546-54,2003)。
N.Engl.J.Med.292:937-400,1975)。革兰氏阳性细胞壁的主要组分是肽聚糖和脂磷壁酸,
这两种组分是有效的替代补体途径活化剂,尽管在存在特异性抗体时它们也可激活经典补
体途径(Joiner,K.A.等,Ann.Rev.Immunol.2:461-2,1984)。
透性增加,这些事件在感染性休克中起重要作用(Schumacher,W.A.等,Agents Actions
34:345-349,1991)。另外,过敏毒素诱导支气管痉挛、组胺自肥大细胞释放和血小板聚集。
此外,它们对粒细胞产生许多作用,例如溶酶体酶的趋化性、聚集、粘连、释放,毒性超氧化物阴离子的产生和白三烯的形成(Shin,H.S.等,Science 162:361-363,1968;Vogt,W.,
complement3:177-86,1986)。这些生物学作用被认为在脓毒症的并发症例如休克或急性呼
吸窘迫综合征(ARDS)的发生中起作用(Hammerschmidt,D.E.等,Lancet 1:947-949,1980;
Slotman,G.T.等,Surgery 99:744-50,1986)。此外,过敏毒素C3a的水平升高与脓毒症的致命结果有关(Hack,C.E.等,Am.J.Med.86:20-26,1989)。在一些休克动物模型中,某些补体-缺陷品系(例如,C5-缺陷品系)更耐受LPS输注的影响(Hseuh,W.等,Immunol.70:309-14,
1990)。
断时,得到类似的发现(Huber-Lang,M.S.等,FASEBJ.16:1567-74,2002;Riedemann,N.C.,
等,J.Clin.Invest.110:101-8,2002)。早期在猴中的实验研究表明,C5a的抗体阻断减弱大肠杆菌诱导的感染性休克和成人呼吸窘迫综合征(Hangen,D.H.,等,J.Surg.Res.46:195-
9,1989;Stevens,J.H.,等,J.Clin.Invest.77:1812-16,1986)。当与较不严重脓毒性患者
和存活者相比,在具有脓毒症的人中,C5a提高并与显著降低的存活率以及多器官衰竭有关(Nakae,H.,等,Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.84:189-95,1994;Nakae,等,
Surg.Today 26:225-29,1996;Bengtson,A.,等,Arch.Surg.123:645-649,1988)。在脓毒症期间C5a产生其有害作用的机制已被较详细地研究,但最近的数据表明在脓毒症期间C5a的
产生显著损害血液中性粒细胞的先天性免疫功能(Huber-Lang,M.S.,等,J.Immunol.169:
3223-31,2002)、其表现呼吸爆发的能力和其产生细胞因子的能力(Riedemann,N.C.,等,
Immunity 19:193-202,2003)。另外,在脓毒症期间C5a产生似乎具有促凝血作用(Laudes,
I.J.,等,Am.J.Pathol.160:1867-75,2002)。补体-调节蛋白CI INH也已表明在脓毒症和
ARDS动物模型中的功效(Dickneite,G.,Behring Ins.Mitt.93:299-305,1993)。
Infect.Immun.68:688,2000)。脂磷壁酸(LTA)越来越被认为是LPS的革兰氏阳性对应物。它是有效的免疫促进剂,其诱导细胞因子从单核吞噬细胞和全血释放(Morath,S.,等,
J.Exp.Med.195:1635,2002;Morath,S.,等,Infect.Immun.70:938,2002)。最近证实,L-纤维胶凝蛋白特异性结合自许多革兰氏阳性细菌物种(包括金黄色葡萄球菌)分离的LTA,和
激活凝集素途径(Lynch,N.J.,等,J.Immunol.172:1198-02,2004)。MBL还显示结合来自肠
球菌的LTA(其中多甘油磷酸链被糖基取代),但不结合来自9个其它物种包括金黄色葡萄球
菌的LTA(Polotsky,V.Y.,等,Infect.Immun.64:380,1996)。
病况的方法,所述病况包括而不限于由脓毒症造成的严重脓毒症、感染性休克、急性呼吸窘迫综合征,和系统性炎性反应综合征。提供治疗其它血液病症的相关方法,所述病症包括出血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒综合征
(HUS)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)或其它骨髓/血液破坏性病况,即通过给予患有这
样的病况的受试者在药用载体中包含治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物。将MASP-2抑制
剂经系统性给予所述受试者,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入(特别是在ARDS的情况下)、皮下或其它胃肠外给予,或可能通过口服给予非-肽能药。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种其它治疗剂组合,以抵抗脓毒症和/或休克的后遗症。对于晚期脓毒症或休克或从其中产生的窘迫病况,MASP-2抑制性组合物可合适地以速效剂型给予,例如通过静脉内或
动脉内递送包含MASP-2抑制剂组合物的推注溶液。可按医生确定进行重复给予,直至病况
得到解决。
reperfusion injury),"J Clin Invest 105:1363-1371(2000))。为了研究C4-/-小鼠是否
仍可能通过经典或凝集素途径激活补体,在对经典或凝集素途径活化路线特异性的测定法
中测量了在C4-/-血浆中的C3更新。尽管当通过经典途径触发活化时未能观察到C3裂解,但观察到在C4缺陷血清中C3的高度有效的凝集素途径-依赖性活化(图30)。可见在甘露聚糖
和酵母聚糖上的C3b沉积在MASP-2-/-小鼠中严重受损,甚至在实验条件下,根据许多先前
公开的关于替代途径活化的论文,所述条件应对所有三种途径都是允许的。当在用免疫球
蛋白复合物代替甘露聚糖或酵母聚糖包被的孔中使用相同的血清时,在MASP-2+/+小鼠血
清和MASP-2-/-血清中但不在C1q耗尽血清中见到C3b沉积和因子B裂解。这指示当初始C3b
通过经典活性提供时,在MASP-2-/-血清中促进替代途径活化。图30C描述令人惊讶的发现,即C3可在C4缺陷血浆中以凝集素途径-依赖性方式有效地被激活。
大于30%的直接C3途径活化通常产生血管舒张和对组织的流体损失的明显的临床证据。高
于30%的C3转变,起始机制主要是非-免疫的,由此产生的临床表现有害于患者。补体C5水平在健康和受控制的疾病中显示比C3稳定得多。C5水平显著降低和/或转变与患者对异常
多发性损伤(例如,道路交通事故)和可能发生休克性肺综合征的反应有关。因此,补体C3活化超过血管库的30%或任何C5参与,或两者的任何证据可被认为可能是患者中有害病理学
变化的预兆。
种有益的反应),但此处它们不同,因为C5a对这些吞噬细胞具有特异性凝聚(聚集)作用,防止它们随机移动远离反应位点。在感染的正常控制中,C3激活C5。然而,在多发性损伤中,C5似乎被广泛激活,系统性产生C5a过敏毒素。这种不受控制的活性在血管系统内引起多形体凝聚,然后这些凝块被带到肺的毛细血管中,在其中它们阻塞和因为超氧化物释放而产生
局部损伤作用。尽管不希望受理论限制,但在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发病机理中该
机制可能是重要的,虽然该观点最近已受到挑战。C3a过敏毒素体外可证明是有效的血小板聚集剂,但它们的体内参与不太确定,并且在伤口修复中血小板物质和纤溶酶的释放可仅
次要涉及补体C3。有可能的是,C3活化的延长升高是产生DIC所需要的。
获自在C3缺陷小鼠中的研究。因为C3是各补体途径的共有组分,预测C3缺陷小鼠缺少所有
的补体功能。然而,令人惊讶的是,C3缺陷小鼠完全能够活化末端补体组分。(Huber-Lang,M.,等,"Generation ofC5a in the absence of C3:a new complement activation
pathway,"Nat.Med 12:682-687(2006))。深度研究揭示了末端补体组分的C3-非依赖性活
化由凝血酶(凝固级联的限速酶)介导。(Huber等,2006)。在初始补体活化后介导凝血酶活
化的分子组分仍然难以理解。
众所周知的C2和C4补体蛋白之外,凝血酶原为可能的底物。MASP-2在功能相关位点上特异
性裂解凝血酶原,产生凝血酶,其为凝固级联限速酶。(Krarup,A.,等,"Simultaneous
Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease
2,"PLoS.ONE.2:e623(2007))。MASP-2-产生的凝血酶能够在确定重建的体外系统中促进纤
维蛋白沉积,证明MASP-2裂解的功能相关性。(Krarup等,2007)。如下文实施例中所述的,本发明人进一步通过记录在凝集素途径活化后在正常啮齿动物血清中凝血酶活化,确证了该
发现的生理学意义,并证实了该过程通过中和MASP-2单克隆抗体而阻断。
系统性炎症(通过补体组分介导)和弥散性凝血(通过凝血途径介导)可通过MASP-2激活这
两个途径的能力来解释。这些发现清楚地表明MASP-2在DIC产生中的作用和MASP-2抑制在
治疗或预防DIC中的治疗益处。MASP-2可提供补体和凝血系统之间的分子关联,和凝集素途径的活化,在其在创伤的背景中发生时,可通过MASP-2-凝血酶轴心直接引发凝血系统的活化,提供创伤和DIC之间的机制关联。根据本发明的一个方面,MASP-2的抑制将抑制凝集素途径活化和减少过敏毒素C3a和C5a二者的产生。认为C3活化的延长升高是产生DIC所需要
的。
脓毒症小鼠模型的受保护表型所证明的。此外,如实施例15和图16A和16B中所证实的,
MASP-2(-/-)小鼠在弥散性血管内凝血(DIC)的局部Schwartzman反应模型(一种微血管的
局部凝血模型)中得到保护。
补体活化的量给予。在本发明的该方面的实践中,代表性的MASP-2抑制剂包括:抑制MASP-2的生物学活性的分子(例如小分子抑制剂、抗-MASP-2抗体或与MASP-2相互作用或干扰蛋
白-蛋白质相互作用的阻断肽),和降低MASP-2表达的分子(例如MASP-2反义核酸分子、
MASP-2特异性RNAi分子和MASP-2核酶),从而防止MASP-2激活凝集素补体途径。MASP-2抑制剂可单独用作主要疗法,或作为辅助疗法与其它治疗剂组合使用以增强其它医学治疗的治
疗益处。
物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9(MAC)的形成或产生的抑制(例如按实施例2中所述测量);在溶血测定法中使用未致敏的兔或豚鼠红细胞评价的补体活化减少(例如按实施例33中所述测
量);C4裂解和C4b沉积的减少(例如按实施例2中所述测量);或C3裂解和C3b沉积的减少(例如按实施例2中所述测量)。
肽、小分子、MASP-2可溶性受体和表达抑制剂。MASP-2抑制剂可通过阻断MASP-2的生物功能抑制MASP-2-依赖性补体活化系统。例如,抑制剂可有效阻断MASP-2的蛋白质与蛋白质相互作用,干扰MASP-2二聚化或装配,阻断Ca2+结合,干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点或可减少MASP-2蛋白表达。
氨基酸序列组成)和提供具有前导序列(aa 1-15)的人MASP-2多肽,其在分泌后裂解,产生
成熟形式的人MASP-2(SEQ ID NO:6)。如图2中所示,人MASP2基因包括12个外显子。人MASP-
2 cDNA由外显子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L编码。可变剪接产生20kDa蛋白,称为MBL-相关蛋白
19("MAp19",亦称为"sMAP")(SEQ ID NO:2),其由自外显子B、C、D和E产生的(SEQ ID NO:1)编码,如图2中所示。SEQ ID NO:50所示的cDNA分子编码鼠MASP-2(由SEQ ID NO:51所示的
氨基酸序列组成)和提供具有前导序列的鼠MASP-2多肽,其在分泌后裂解,产生成熟形式的鼠MASP-2(SEQ ID NO:52)。SEQ ID NO:53所示的cDNA分子编码大鼠MASP-2(由SEQ ID NO:
54所示的氨基酸序列组成)和提供具有前导序列的大鼠MASP-2多肽,其在分泌后裂解,产生成熟形式的大鼠MASP-2(SEQ ID NO:55)。
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列的等位基因变体,包括包含沉默突变的那些和其中突变导致氨基酸序列改变的那些,在本发明的范围内。MASP-2序列
的等位基因变体可根据标准程序通过探查来自不同个体的cDNA或基因组文库进行克隆。
域(aa 122-166)、第二CUBI结构域(aa 167-293)以及串联的补体控制蛋白结构域和丝氨酸
蛋白酶结构域。MASP2基因的可变剪接产生图1中所示的MAp19。MAp19是一种非酶蛋白,包含MASP-2的N-末端CUB1-EGF区以及源自外显子E的四个另外的残基(EQSL),如图1中所示。
赖性复合物。各MASP-2/凝集素复合物已经显示通过蛋白C4和C2的MASP-2-依赖性裂解激活
补体(Ikeda,K.等,J.Biol.Chem.262:7451-7454,1987;Matsushita,M.,等,
J.Exp.Med.176:1497-2284,2000;Matsushita,M.,等,J.Immunol.168:3502-3506,2002)。
研究表明,MASP-2的CUB1-EGF结构域是MASP-2与MBL缔合所必需的(Thielens,N.M.等,
J.Immunol.166:5068,2001)。还表明,CUB1EGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化,其是形成活性MBL复合物所需要的(Wallis,R.等,J.Biol.Chem.275:30962-30969,2000)。因此,可鉴定结合或干扰已知对MASP-2-依赖性补体活化是重要的MASP-2靶标区的MASP-2抑制剂。
体的哺乳动物的多克隆、单克隆或重组抗体,和可以是多特异性、嵌合的、人源化的、抗-个体型,和抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体,如本文进一步描述的。
抗体。例如,已经鉴定了阻断MASP-2依赖性补体活化的抗大鼠MASP-2 Fab2抗体,如本文实施例10和11中更详细描述的。一旦鉴定起MASP-2抑制剂作用的抗-MASP-2抗体,它可用于产生抗-个体型抗体和用于鉴定其它MASP-2结合分子,如下文进一步描述的。
于该分子的Fc部分内(Duncan,A.R.等,Nature332:738-7401988)。其中分子的Fc部分已通
过酶裂解被除去的IgG分子没有该效应器功能(参见Harlow,Antibodies:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988)。因此,具有降低的效应器功能的抗体可因为通过具有使效应器功能最小化的基因工程改造的Fc序列而缺少分子的Fc部
分,或属于人IgG2或IgG4同种型而产生。
Rodrigues等,J.Immunol.151:6954-6961,1998。具有降低的效应器功能的抗体还包括人
IgG2和IgG4同种型,其激活补体和/或与Fc受体相互作用的能力降低(Ravetch,J.V.等,
Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991;Isaacs,J.D.等,J.Immunol.148:3062-3071,1992;
van de Winkel,J.G.等,Immunol.Today 14:215-221,1993)。对人MASP-2具有特异性的人
源化的或全人抗体,包括IgG2或IgG4同种型,可通过本领域普通技术人员已知的数种方法
之一产生,如描述于Vaughan,T.J.等,Nature Biotechnical 16:535-539,1998。
抗体。已知参与蛋白-蛋白相互作用的特定MASP-2结构域,例如CUBI和CUBIEGF结构域,以及包括丝氨酸-蛋白酶活性位点的区域,可如实施例3中所述作为重组多肽表达并用作抗原。
另外,包括MASP-2多肽(SEQ ID NO:6)的至少6个氨基酸的部分的肽亦可用于诱导MASP-2抗
体。用于诱导MASP-2抗体的MASP-2来源的抗原的其它实例提供在下表2中。用于产生抗体的MASP-2肽和多肽可作为天然多肽、或重组或合成肽和催化失活的重组多肽分离,例如MASP-
2A,如实施例5-7进一步描述的。在本发明该方面的一些实施方案中,抗-MASP-2抗体使用转基因小鼠品系获得,如实施例8和9中所述和下文进一步描述的。
血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
Polyclonal Antisera,"in Immunochemical Protocols(Manson编辑),第105页,和如实施
例6中进一步描述的。MASP-2多肽的免疫原性可通过使用佐剂,包括无机凝胶例如氢氧化铝或弗氏佐剂(完全或不完全)、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、多聚阴离子、油乳剂、匙孔 血蓝蛋白和二硝基苯酚而增加。多克隆抗体通常在动物例如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中产生。或者,用于本发明的抗-MASP-2抗体也可源自低于人类的灵长类动物。用于在狒狒中产生诊断和治疗上有用的抗体的一般性技术可见于
例如,Goldenberg等,International Patent PublicationNo.WO 91/11465和Losman,M.J.
等,Int.J.Cancer 46:310,1990。然后使用本领域众所周知的标准程序自这样免疫的动物
的血液中产生包含免疫活性抗体的血清。
体可使用提供通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术获得,例如描述于Kohler,G.
等,Nature 256:495,1975中的杂交瘤方法,或它们可通过重组DNA方法制备(参见例如,
Cabilly的美国专利号4,816,567)。单克隆抗体也可使用描述于Clackson,T.等,Nature
352:624-628,1991和Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222:581-597,1991中的技术自噬菌体抗
体库分离。这样的抗体可属于任何免疫球蛋白类型,包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚型。
中。然后将脾细胞与永生细胞系融合,形成杂交瘤。将形成的杂交瘤在细胞培养中生长,并筛选它们产生针对MASP-2的单克隆抗体的能力。进一步描述生产抗-MASP-2单克隆抗体的
实例提供在实施例7中。(亦参见Current Protocols in Immunology,Vol.1.,John Wiley&
Sons,第2.5.1-2.6.7页,1991)。
自胚胎干细胞系的小鼠品系中,所述干细胞系包含内源免疫球蛋白重链和轻链基因座的靶
向破坏。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体,所述抗原例如本文描述的MASP-
2抗原,和所述小鼠可用于使用常规的Kohler-Milstein技术,通过融合来自所述动物的B-
细胞与合适的骨髓瘤细胞系,产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤,如实施例7中进一步描述
的。具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠是市售可得的(例如,来自Abgenix,Inc.,
Fremont,CA和Medarex,Inc.,Annandale,N.J.)。用于自转基因小鼠获得人抗体的方法描述
于例如,Green,L.L.等,Nature Genet.7:13,1994;Lonberg,N.等,Nature 368:856,1994;
和Taylor,L.D.等,Int.Immun.6:579,1994。
Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页;Baines等,"Purification of
Immunoglobulin G(IgG)",于Methods in Molecular Biology,The Humana Press,Inc.,
Vol.10,第79-104页,1992)。
Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)。一旦
鉴定特异性结合MASP-2的抗体,用数种测定法例如,凝集素-特异性C4裂解测定法(描述于
实施例2)、C3b沉积测定法(描述于实施例2)或C4b沉积测定法(描述于实施例2)中的一种测
试抗-MASP-2抗体作为MASP-2抑制剂的能力。
2nM。在一些实施方案中,用于本发明方法的MASP-2抑制性单克隆抗体是MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段,包括(I)(a)重链可变区,包含:i)包括SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包括SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;
和iii)包括SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包括SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包括SEQ ID NO:70的50-56
的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包括SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-
L3;或(II)其变体,包括与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少
99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少
92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源;以及这样的
抗体的片段(Cabilly的美国专利号4,816,567;和Morrison,S.L.等,Proc.Nat'l
Acad.Sci.USA 81:6851-6855,1984)。
区(CDR)至人可变结构域产生。通常,然后将人抗体的残基置换到非-人对应物的框架区。此外,人源化的抗体可包括在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可进行这些修饰以进一
步精修抗体性能。通常,人源化的抗体将包括基本上所有的至少一个和通常两个可变结构
域,其中所有或基本上所有的高变环对应于非-人免疫球蛋白的那些,并且所有或基本上所有的Fv框架区为人免疫球蛋白序列的那些。人源化的抗体任选还将包括免疫球蛋白恒定区
(Fc)的至少一部分,通常为人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的细节,参见Jones,P.T.
等,Nature 321:522-525,1986;Reichmann,L.,等,Nature 332:323-329,1988;和Presta,
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992。
522,1986;Carter,P.,等,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:4285,1992;Sandhu,J.S.,
Crit.Rev.Biotech.12:437,1992;Singer,I.I.等,J.Immun.150:2844,1993;Sudhir(编
辑),AntibodyEngineeringProtocols,Humana Press,Inc.,1995;Kelley,"Engineering
Therapeutic Antibodies",于Protein Engineering:Principles and Practice,Cleland
等(编辑),John Wiley&Sons,Inc.,第399-434页,1996;和Queen的美国专利号5,693,762,
1997。另外,存在从特异性鼠抗体区合成人源化抗体的商业机构,例如Protein Design
Labs(Mountain View,CA)。
的抗体可用于产生抗-个体型,其模拟在MASP-2蛋白上的MBL结合位点,因此结合并中和
MASP-2的结合配体,例如MBL。
Sons,Inc.,NY,1986)。抗体的pFc'和Fc区是经典补体途径的效应器,但不参与抗原结合。
pFc'区从其经过酶裂解的抗体或没有pFc'区而产生的抗体,被称为F(ab')2片段和保留完
整抗体的两个抗原结合位点。分离的F(ab')2片段因为其两个抗原结合位点而被称为二价
单克隆片段。类似地,Fc区从其经过酶裂解的抗体或没有Fc区而产生的抗体,被称为Fab片段和保留完整抗体分子的一个抗原结合位点。
生。该片段可使用巯基还原剂进一步裂解以产生3.5S Fab'单价片段。任选地,裂解反应可使用二硫键裂解产生的巯基的封闭基团进行。或者,使用胃蛋白酶经酶裂解直接产生两个
单价Fab片段和Fc片段。这些方法描述于例如,Goldenberg的美国专利号4,331,647;
Nisonoff,A.等,Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960;Porter,R.R.,Biochem.J.73:119,
1959;Edelman等,于Methods in Enzymology 1:422,Academic Press,1967;和Coligan第
2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。
化学除去,从而产生例如,抗原-结合抗体片段例如Fab或F(ab)2片段(Mariani,M.等,
Mol.Immunol.28:69-71,1991)。或者,人γ4IgG同种型,其不结合Fcγ受体,可在构建人源化抗体期间使用,如本文所述。缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和抗原-结合结构域也可使用本文描述的重组技术经工程改造。
过构建包括通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因制备。结构基因
插入到表达载体,其随后引入至宿主细胞,例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单一多肽链。用于产生scFvs的方法描述于例如,Whitlow等,"Methods:
A Companion to Methods in Enzymology"2:97,1991;Bird等,Science 242:423,1988;
Ladner的美国专利号4,946,778;Pack,P.,等,Bio/Technology 11:1271,1993。
MASP-2蛋白或肽)。编码具有潜在的MASP-2多肽结合结构域的多肽的基因可通过筛选展示
在噬菌体或细菌例如大肠杆菌上的随机肽文库获得。这些随机肽展示文库可用于筛选与
MASP-2相互作用的肽。用于产生和筛选这样的随机肽展示文库的技术是本领域众所周知的
(Lardner的美国专利号5,223,409;Ladner的美国专利号4,946,778;Lardner的美国专利号
5,403,484;Lardner的美国专利号5,571,698;和Kay等,Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press,Inc.,1996),随机肽展示文库和用于筛选这样的文库的试剂盒
可市售获得,例如得自CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,Calif.)、Invitrogen
Inc.(San Diego,Calif.)、New England Biolabs,Inc.(Beverly,Mass.)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway,N.J.)。
单位")可通过构建编码目的抗体的CDR的基因获得。这样的基因,例如,通过使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区制备(参见例如,Larrick等,Methods:A
Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991;Courtenay-Luck,"Genetic
Manipulation of Monoclonal Antibodies",于Monoclonal Antibodies:Production,
Engineering and Clinical Application,Ritter等(编辑),第166页,Cambridge
University Press,1995;和Ward等"Genetic Manipulation and Expression of
Antibodies",于Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Birch等(编
辑),第137页,Wiley-Liss,Inc.,1995)。
降低的效应器功能。
与凝集素途径的另一识别分子结合、与MASP-2竞争结合凝集素途径的另一识别分子(例如,MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)和/或直接与MASP-2相互作用以抑制MASP-2-依赖性补体活化,其是基本上纯的,并且基本上不含它们在自然界中可能一起存在的其它物质至对其预期应用实际和合适的程度。
European Heart J.16:50-55,1995)。已经描述了防止或干扰整联蛋白-依赖性粘连的短的
线性肽(<30个氨基酸)(Murayama,O.等,J.Biochem.120:445-51,1996)。较长的肽,长度范
围为25-200个氨基酸残基,已经成功用于阻断整联蛋白-依赖性粘连(Zhang,L.等,
J.Biol.Chem.271(47):29953-57,1996)。通常,较长的肽抑制剂具有比短肽更高的亲和力
和/或更慢的解离速率,因此可能是更有效的抑制剂。已经显示环状肽抑制剂是用于治疗人炎性疾病的整联蛋白的体内有效抑制剂(Jackson,D.Y.等,J.Med.Chem.40:3359-68,
1997)。产生环状肽的一种方法包括合成其中肽的末端氨基酸是半胱氨酸的肽,从而允许肽通过在末端氨基酸之间的二硫键以环状形式存在,这已经表明改进亲和力和体内半寿期用
于治疗生血肿瘤(例如,Larson的美国专利号6,649,592)。
基酸至约300个氨基酸。表3提供示例性的抑制性肽的列表,其可用于实践本发明的该方面。
可在数种测定法之一中,包括例如,凝集素特异性C4裂解测定法(描述于实施例2)和C3b沉
积测定法(描述于实施例2),测试候选的MASP-2抑制性肽起MASP-2抑制剂作用的能力。
CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)、EGF结构域(SEQ ID NO:11)和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:12)。如之前描述的,CUBEGFCUBII区已经表明对于二聚化和与MBL结合是必需的
(Thielens等,同上)。具体而言,在鉴定带有在Asp105处纯合突变为Gly105的人的研究中,MASP-2的CUBI结构域中的肽序列TFRSDYN(SEQ ID NO:16)已经表明参与结合MBL,导致
MASP-2从MBL复合物丢失(Stengaard-Pedersen,K.等,New England J.Med.349:554-560,
2003)。
7451-7454,1987;Matsushita,M.,等,J.Exp.Med.176:1497-2284,2000;Matsushita,M.,
等,J.Immunol.168:3502-3506,2002)。这些凝集素作为同型三聚亚基的寡聚体存在于血清
中,各自具有N-末端胶原-样纤维,其具有碳水化合物识别结构域。这些不同的凝集素已经显示结合MASP-2,和凝集素/MASP-2复合物通过蛋白C4和C2的裂解激活补体。H-纤维胶凝蛋白具有24个氨基酸的氨基-末端区、具有11个Gly-Xaa-Yaa重复的胶原-样结构域、12个氨基酸的颈结构域和207个氨基酸的纤维蛋白原-样结构域(Matsushita,M.等,J.Immunol.168:
3502-3506,2002)。H-纤维胶凝蛋白结合GlcNAc和凝集用源自鼠伤寒沙门氏菌
(S.Typhimurium)、明尼苏达沙门氏菌(S.Minnesota)和大肠杆菌的LPS包被的人红细胞。H-纤维胶凝蛋白已经显示与MASP-2和MAp19缔合,激活凝集素途径(同前)。L-纤维胶凝蛋白/
P35还结合GlcNAc和已经显示与人血清中的MASP-2和MAp19缔合,和该复合物已经显示激活
凝集素途径(Matsushita,M.等,J.Immunol.164:2281,2000)。因此,用于本发明的MASP-2抑制性肽可包括选自MBL蛋白(SEQ ID NO:21)、H-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号NM_173452)、M-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号O00602)和L-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号NM_015838)的
至少5个氨基酸的区。
NO:26)内,位于MBP的胶原-样结构域的C-末端部分的铰链和颈区之间(Wallis,R.等,
J.Biol.Chem.279:14065,2004)。该MASP-2结合位点区在人H-纤维胶凝蛋白和人L-纤维胶
凝蛋白中亦是高度保守的。已经描述了存在于所有三种凝集素蛋白中的共有结合位点,包
括氨基酸序列"OGK-X-GP"(SEQ ID NO:22),其中字母"O"表示羟基脯氨酸和字母"X"是疏水
残基(Wallis等,2004,同上)。因此,在一些实施方案中,用于本发明的该方面的MASP-2抑制性肽为至少6个氨基酸长,并包括SEQ ID NO:22。源自MBL的肽,其包括氨基酸序列"GLR GLQ GPO GKL GPO G"(SEQ ID NO:24),已经显示体外结合MASP-2(Wallis等,2004,同上)。为增强与MASP-2的结合,可合成在各末端上侧连两个GPO三联体的肽("GPO GPO GLR GLQ GPO
GKL GPO GGP OGP O"SEQ ID NO:25),以提高三重螺旋的形成,如天然MBL蛋白中发现的那
样(进一步描述于Wallis,R.等,J.Biol.Chem.279:14065,2004)。
27)。还包括源自人L-纤维胶凝蛋白的肽,其包括来自在L-纤维胶凝蛋白中的共有MASP-2结合区的序列"GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO"(SEQ
ID NO:28)。
Mol.Immunol.25:1261(1988))。
价连接而永久抑制酶的益处。这可导致较低的有效剂量和/或需要较低频率给予肽抑制剂。
过本领域已知的方法确定。重链可变区是通常范围为100-150个氨基酸长的肽。轻链可变区是通常范围为80-130个氨基酸长的肽。在重链和轻链可变区内的CDR序列仅包括大约3-25
个氨基酸的序列,其可容易地由本领域普通技术人员测序。
分上具有插入、缺失、置换和/或另外的氨基酸的肽和其混合物。因此,具有MASP-2抑制活性的那些同源肽被认为可用于本发明的方法。所述的肽还可包括重复基序和具有保守置换的
其它修饰。保守变体在本文他处有所描述,包括氨基酸交换为具有类似电荷、大小或疏水性等的另一氨基酸。
基酸结构,只要衍生物在功能上保留所需的MASP-2抑制性质。修饰可包括用通常已知的20
种氨基酸之一或用另一种氨基酸、用具有辅助需要特性(例如抵抗酶降解)的衍生的或取代
的氨基酸或用D-氨基酸的氨基酸置换,或用另一种模拟一个氨基酸、多个氨基酸或肽的天
然构象和功能的分子或化合物例如碳水化合物置换;氨基酸缺失;用通常已知的20种氨基
酸之一或用另一种氨基酸、用具有辅助需要特性(例如抵抗酶降解)的衍生的或取代的氨基
酸或用D-氨基酸的氨基酸插入,或用另一种模拟一个氨基酸、多个氨基酸或肽的天然构象
和功能的分子或化合物例如碳水化合物置换;或用另一种模拟母体肽的天然构象、电荷分
布和功能的分子或化合物例如碳水化合物或核酸单体置换。肽还可通过乙酰化或酰胺化修
饰。
的置换,以形成保留母体肽的基本构象和荷电分布但可具有母体肽中不存在或比母体肽中
存在的那些提高的特性的衍生物。一旦候选衍生分子被鉴定,所述衍生物可使用本文描述
的测定法经测试以确定它们是否作为MASP-2抑制剂起作用。
CDR区,以及已知对MASP-2功能是重要的靶标区,包括二聚化所需要的区、参与结合MBL的区和丝氨酸蛋白酶活性位点,如先前所述。用于鉴定结合特定靶标的肽的方法是本领域众所
周知的。例如,分子印迹可用于从头构建大分子结构,例如结合特定分子的肽。参见例如,Shea,K.J.,"Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo
synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties,"TRIP 2(5)1994。
模板,接着在模板留下的空隙中聚合第二类单体,以提供显示类似于模板的一个或多个所
需性质的新分子。除了以这种方式制备肽之外,也可制备作为MASP-2抑制剂的其它MASP-2
结合分子例如多糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、碳水化合物、糖蛋白、类固醇、脂质和其它生物活性物质。该方法可用于设计比它们的天然对应物更稳定的各种生物模拟物,因为它
们通常通过功能单体的自由基聚合制备,产生具有不可生物降解的主链的化合物。
它技术可见于例如,Bodanszky,M.等,Peptide Synthesis,第二版,John Wiley&Sons,1976
以及本领域技术人员已知的其它参考文献。
成肽。然后使用色谱或电泳技术,或借助可通过将编码载体蛋白的核酸序列与肽编码序列
同相插入表达载体与肽融合和随后从肽裂解的载体蛋白将肽纯化。融合蛋白-肽可使用色
谱、电泳或免疫学技术(例如通过载体蛋白的抗体与树脂结合)分离。肽可使用化学方法或
经酶,例如水解酶裂解。
达的调节序列可操作连接,然后引入至宿主细胞。除了转录调节序列例如启动子和增强子
之外,表达载体可包括翻译调节序列和标记物基因,其适合于选择带有表达载体的细胞。
备。短基因(60-80个碱基对)的产生在技术上是简单的,可通过合成互补的链然后将它们退火实现。对于产生较长的基因,将合成的基因(双链)以模块形式从20-100个核苷酸长的单
链片段装配。对于有关多核苷酸合成的综述,参见例如,Glick和Pasternak,"Molecular
Biotechnology,Principles and Applications of Recombinant DNA",ASM Press,1994;
Itakura,K.等,Annu.Rev.Biochem.53:323,1984;和Climie,S.等,Proc.Nat'l
Acad.Sci.USA 87:633,1990。
H.,等,EMBO J.22:2348-2359,2003)。使用Kuntz等描述的方法,MASP-2晶体结构坐标用作
计算机程序例如DOCK的输入,其输出预期结合MASP-2的小分子结构的列表。这样的计算机
程序的使用是本领域技术人员众所周知的。例如,通过使用程序DOCK评价在Cambridge
Crystallographic数据库中存在的化合物与酶的结合位点的配合度,HIV-1蛋白酶抑制剂
的晶体结构用于鉴定作为HIV-1蛋白酶抑制剂的独特的非肽配体(Kuntz,I.D.等,
J.Mol.Biol.161:269-288,1982;DesJarlais,R.L.,等,PNAS 87:6644-6648,1990)。
2RNAi分子。
的表达。例如,反义核酸分子可通过相对于其正常转录取向,使MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)的编码区(或其一部分)反转来构建,以允许转录其互补物。
效阻遏。超过约80%的显著较大的百分比同一性通常是优选的,尽管约95%的绝对同一性
通常是最优选的。
的DNA序列可用作反义核酸分子,尽管更长的序列是优选的。在本发明中,有用的MASP-2抑制剂的代表性实例是与由SEQ ID NO:4所示的核酸序列组成的MASP-2cDNA的互补序列具有
至少90%同一性的反义MASP-2核酸分子。SEQ ID NO:4所示的核酸序列编码由SEQ ID NO:5
所示的氨基酸序列组成的MASP-2蛋白。
829)。此外,反义抑制的实例用核蛋白细胞周期蛋白、多药抗性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABAA受体和人EGF得到证实(参见例如,Baracchini的美国专利号5,
801,154;Baker的美国专利号5,789,573;Considine的美国专利号5,718,709;和
Reubenstein的美国专利号5,610,288)。
Scherr,M.等,Nucleic Acids Res.26:5079-5085,1998;Lloyd,等,Nucleic Acids
Res.29:3665-3673,2001。将与MASP-2转录物的某些区互补的反义寡核苷酸的混合物加入
至表达MASP-2的细胞提取物中,例如肝细胞,和杂交以产生RNAseH易感位点。该方法可与计算机辅助的序列选择组合,所述计算机辅助的序列选择可根据它们形成二聚体、发夹结构
或其它二级结构的相对能力预测反义组合物的最佳序列选择,所述二级结构将降低或抑制
与在宿主细胞中的靶标mRNA特异性结合。这些二级结构分析和靶标位点选择考虑可使用
OLIGO引物分析软件(Rychlik,I.,1997)和BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul,S.F.,等,
Nucl.Acids Res.25:3389-3402,1997)进行。针对靶标序列的反义化合物优选地包括约8-
约50个核苷酸长度。包括约9-约35个左右核苷酸的反义寡核苷酸是特别优选的。本发明人
考虑了对于实施本发明的基于反义寡核苷酸的方法,范围为9-35个核苷酸(即,9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个左右碱基长的那些)的所有寡核苷酸组合物是高度优选的。MASP-2mRNA的高度优选的靶标区
是在AUG翻译起始密码子处或其附近的那些,和与mRNA的5'区基本上互补的那些序列,例
如,在MASP-2基因核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的–10和+10区之间。示例性的MASP-2表达抑制剂提供在表4中。
稳定性增加和细胞摄取增加。在说明性的实施方案中,本发明的反义化合物不同于天然DNA之处在于修饰磷酸二酯主链以延长反义寡核苷酸的寿命,所述反义寡核苷酸中的磷酸酯取
代基被置换为硫代磷酸酯。同样,寡核苷酸的一个或两个末端可被一个或多个吖啶衍生物
取代,其嵌入在核酸链内的邻近的碱基对之间。
子和病毒入侵的保护,所述遗传元件当变得具有活性时在宿主细胞中产生异常RNA或dsRNA
(参见例如,Jensen,J.,等,Nat.Genet.21:209-12,1999)。双链RNA分子可通过合成能够形
成双链RNA分子的两条RNA链制备,每条链具有约19至25(例如,19-23个核苷酸)的长度。例如,用于本发明方法的dsRNA分子可包括对应于表4中所列的序列和其互补序列的RNA。优选地,RNA的至少一条链具有1-5个核苷酸的3'突出。合成的RNA链在形成双链分子的条件下合并。RNA序列可包括SEQ ID NO:4的至少8个核苷酸的部分,其总长度为25个核苷酸或更小。
设计给定靶标的siRNA序列在本领域普通技术的范围内。可使用设计siRNA序列和保证表达
至少70%敲减的商业化服务(Qiagen,Valencia,Calif)。
Sons,Inc.,1993中教导。
链,从而在功能上灭活靶标RNA。在进行这种裂解时,核酶本身不改变,因此能够循环和裂解其它分子。在反义RNA内包含核酶序列,赋予它们RNA-裂解活性,从而增加反义构建体的活性。
EPA No.0 321 201;WO88/04300;Haseloff,J.等,Nature 334:585-591,1988;Fedor,M.J.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1668-1672,1990;Cech,T.R.,等,Ann.Rev.Biochem.55:
599-629,1986)。
和应用。
糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸的技术,例如固相磷酸亚胺酸酯化学合成。或者,RNA分子可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录产生。这样的DNA序列可掺入至包含合适
RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子的各种载体中。或者,组成地或诱导地(取决于使用的启动子)合成反义RNA的反义cDNA构建体可稳定地引入至细胞系。
在寡聚脱氧核糖核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2'O-甲基而非磷酸二酯酶键。
抑制剂和药学上可接受的载体的组合物。MASP-2抑制剂可以治疗有效剂量给予有需要的受
试者以治疗或改善与MASP-2-依赖性补体活化有关的病况。治疗有效剂量是指足以导致与
所述疾病或病况有关的症状改善的MASP-2抑制剂的量。
型,NOAEL(未观察到不良作用水平)和MED(最小有效剂量)可使用标准方法测定。NOAEL和
MED效果之间的剂量比率是治疗比,其表示为比率NOAEL/MED。显示大的治疗比或指数的
MASP-2抑制剂是最优选的。获自细胞培养测定法和动物研究的数据可用于配制人用剂量范
围。MASP-2抑制剂的剂量优选地在循环浓度的范围内,其包括几乎没有或没有毒性的MED。
剂量可在该范围内改变,取决于使用的剂型和使用的给药途径。
500ng/ml的低水平存在于血清中,和在具体的受试者中的MASP-2水平可使用用于MASP-2的
定量测定法测定,其描述于Moller-Kristensen M.等,J.Immunol.Methods 282:159-167,
2003。
0.1mg/kg的受试者体重的剂量范围给予。在一些实施方案中,组合物包括抗-MASP-2抗体和MASP-2抑制性肽的组合。
来,已经开发了灵敏和特异的测定法,并且对于大多数这些活化产物,包括小活化片段C3a、C4a和C5a和大活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9,这些测定法为市售可得的。大多数这些测定法利用与在所述片段上,而不是在它们从其中形成的天然蛋白上暴露的新抗原
(neoantigen)反应的单克隆抗体,这使得这些测定法非常简单和特异。大多数依赖于ELISA技术,尽管放射免疫测定法有时仍用于C3a和C5a。这些后来的测定法测量未处理的片段和
它们的“脱Arg”片段,其是循环中存在的主要形式。未处理的片段和C5a脱Arg通过结合细胞表面受体被快速清除,因此以非常低的浓度存在,而C3a脱Arg不结合细胞和在血浆中积聚。C3a的测量提供补体活化的灵敏的、途径-非依赖性的指示剂。替代途径活化可通过测量Bb片段进行评价。膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9的检测,提供补体被激活至完成的证据。因为凝集素和经典途径两者均产生相同的活化产物C4a和C4d,因此这两个片段的测量不提供关
于这两个途径中哪一个产生所述活化产物的任何信息。
物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9(MAC)的形成或产生的抑制(例如按实施例2中所述测量)、C4裂解和C4b沉积减少(例如按实施例10中所述测量)或C3裂解和C3b沉积减少(例如按实施例10
中所述测量)。
aHUS的受试者的情况下,一种或多种MASP-2抑制剂可与其它补体抑制剂例如艾库组单抗
(Soliris)、TT-30、因子B的抗体或抑制末端补体组分或替代途径放大的其它试剂组合给予(包括共-给予)。
血清素受体拮抗剂;血清素受体激动剂;组胺受体拮抗剂;缓激肽受体拮抗剂;血管舒缓素抑制剂;速激肽受体拮抗剂,包括神经激肽1和神经激肽2受体亚型拮抗剂;降钙素基因-相关肽(CGRP)受体拮抗剂;白介素受体拮抗剂;花生四烯酸代谢物合成途径中有活性的酶的抑
制剂,包括磷脂酶抑制剂,包括PLA2同种型抑制剂和PLCγ同种型抑制剂、环氧合酶(COX)抑制剂(其可以是COX-1、COX-2或非选择性COX-1和-2抑制剂)、脂加氧酶抑制剂;类前列腺素受体拮抗剂,包括类花生酸EP-1和EP-4受体亚型拮抗剂和血栓素受体亚型拮抗剂;白三烯
受体拮抗剂,包括白三烯B4受体亚型拮抗剂和白三烯D4受体亚型拮抗剂;阿片样物质受体
激动剂,包括μ-阿片样物质、δ-阿片样物质和κ-阿片样物质受体亚型激动剂;嘌呤受体激动剂和拮抗剂,包括P2X受体拮抗剂和P2Y受体激动剂;腺苷三磷酸(ATP)-敏感性钾通道开放
剂;MAP激酶抑制剂;烟碱乙酰胆碱抑制剂;和α肾上腺素能受体激动剂(包括α-1、α-2和非选择性α-1和2激动剂)。
已被批准人用。然而,一些药剂已经显示在体内阻断补体。K76COOH和甲磺酸萘莫司他
(nafamstat mesilate)是已经在移植的动物模型中显示一些有效性的两种试剂
(Miyagawa,S.等,Transplant Proc.24:483-484,1992)。低分子量肝素也已经显示在调节
补体活性中有效(Edens,R.E.等,Complement Today,pp.96-120,Basel:Karger,1993)。认
为这些小分子抑制剂可用作与本发明的MASP-2抑制剂组合使用的试剂。
钟内,补体系统(替代和经典两者)提供活动过度排斥综合征的触发剂(Platt,J.L.等,
Immunol.Today 11:450-6,1990;Marino,I.R.等,Transplant Proc.1071:6,1990;
Johnstone,P.S.等,Transplantation 54:573-6,1992)。sCR1的使用保护和延长移植的器
官的存活时间,在器官存活的发病机理中牵涉到补体途径(Leventhal,J.R.等,
Transplantation 55:857-66,1993;Pruitt,S.K.等,Transplantation 57:363-70,1994)。
(例如,艾库组单抗)和抗-备解素MoAbs。
受的载体描述于Yamada的美国专利号5,211,657。用于本发明的抗-MASP-2抗体和抑制性肽
可配制成呈固体、半固体、凝胶、液体或气体形式的制剂,例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、贮库制剂、吸入剂和注射剂,其允许口服、胃肠外或手术给予。本发明还考虑了通过包覆医学装置等局部给予组合物。
中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物,和美国专利申请号2002/0019369
A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。这样的水凝胶可局部注射在预期作用的部位处,或经皮下或肌内注射形成延迟释放贮库。
以是无菌液体,例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外,辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于包括抗-MASP-2抗体和抑制性肽的组合物中。药物组合物的其它组分包括油(例如动物、植物或合成来源),例如,大豆油和矿物油。通常,二醇例如丙二醇或聚乙二醇是用于注射溶液的优选的液体载体。
剂、低分子量多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精;螯合剂例如EDTA、谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非-特异性血清白蛋白混合的盐水是合
适的稀释剂的实例。
Rieger和Banker(编辑),Marcek Dekker,Inc.,N.Y.,1988)。用于乳剂配制的天然存在的乳
化剂的实例包括阿拉伯胶、蜂蜡、羊毛脂、卵磷脂和磷脂。
和递送反义寡核苷酸至所需部位。
物涂布或掺入可植入的医疗装置上面或里面而递送。
药途径相关的代谢转化途径的敏感性加以确定。例如,肽能药物可能最适于通过口服以外
的途径给药。
(1988);Lee,V.H.L.,J.Controlled Release13:213,(1990);Lee,V.H.L.主编,Peptide
andProtein Drug Delivery,Marcel Dekker,New York(1991);DeBoer,A.G.,等人,
J.Controlled Release13:241,(1990)。例如,STDHF是梭链孢酸的合成衍生物,是结构上类似于胆盐的甾类表面活性剂,已被用作经鼻递送的渗透促进剂(Lee,W.A.,Biopharm.22,
1990年11/12月)。
(1990))。已经报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae,Y.H.,等人,J.Controlled
Release9:271,(1989);Hori,R.,等人,Pharm.Res.6:813,(1989);Yamakawa,I.,等人,
J.Pharm.Sci.79:505,(1990);Yoshihiro,I.,等人,J.Controlled Release10:195,
(1989);Asano,M.,等人,J.Controlled Release9:111,(1989);Rosenblatt,J.,等人,
J.Controlled Release9:195,(1989);Makino,K.,J.Controlled Release12:235,(1990);
Takakura,Y.,等人,J.Pharm.Sci.78:117,(1989);Takakura,Y.,等人,J.Pharm.Sci.78:
219,(1989))。
行了综述(参见例如Szoka的美国专利号5,567,434;Yagi的美国专利号5,552,157;
Nakamori的美国专利号5,565,213;Shinkarenko的美国专利号5,738,868以及Gao的美国专
利号5,795,587)。
软膏、乳膏、凝胶或混悬液。MASP-2抑制性抗体和多肽还可被浸渍到经皮贴剂、膏药和绷带中,优选以液体或半液体形式。
的进展程度、患者的年龄、性别和体重和其它临床因素。各独立药物的剂量将随组合物中所包含的MASP-2抑制剂以及任何递送媒介(例如缓释递送媒介)的存在和性质而变化。此外,
可在考虑给药频率和所递送药物的药代动力学行为的变化后对剂量进行调整。
进的剂量控制。
斑块附近,给气囊充气使得斑块向血管壁挤压。结果,气囊表面与血管表面的血管内皮细胞层接触。可以按允许药物在动脉粥样硬化斑块部位释放的方式,将MASP-2抑制剂附着到气
囊血管成形术导管上。可按照本领域已知标准程序将药物附着在气囊导管上。例如,可将药物保存在气囊导管的隔室中直到气囊充气,此时药物被释放到局部环境中。或者,可将药物浸渍在气囊表面,使得当气囊充气时,药物就接触到动脉壁的细胞。还可在多孔气囊导管中递送药物,例如Flugelman,M.Y.,等人,Circulation85:1110-1117,(1992)中公开的那些。
另见已公开的PCT申请WO 95/23161中对于将治疗性蛋白附着到气囊血管成形术导管上的
示例性程序。同样地,可将MASP-2抑制剂包括在应用于支架上的凝胶或聚合涂层中,或者可将其掺入支架材料中,使得支架在血管安置之后将MASP-2抑制剂洗脱出来。
一个实例,用于治疗泌尿生殖病况的MASP-2抑制性组合物可适当地滴入膀胱内或者其它泌
尿生殖结构中。
活性的任何技术,例如通过连接蛋白的一个或两个N-C-末端残基至装置进行。连接还可在
蛋白的一个或多个内部位点上进行。可使用多个连接(蛋白的内部和末端)。对于其上的蛋
白固定,可植入或可连接医学装置的表面可经改性以包括官能团(例如,羧基、酰胺、氨基、醚、羟基、氰基、次氮基、磺酰胺基、炔基(acetylinic)、环氧化物、硅烷基(silanic)、酸酐、琥珀酰亚胺基(succinimic)、叠氮基)。偶联化学包括但不限于与MASP-2抗体或抑制性肽上可用的官能团形成酯、醚、酰胺、叠氮基和磺酰胺基衍生物、氰酸酯和其它键。MASP-2抗体或抑制性片段还可通过添加亲和标签序列至蛋白非-共价地连接,例如GST(D.B.Smith和
K.S.Johnson,Gene 67:31,1988)、多组氨酸(E.Hochuli等,J.Chromatog.411:77,1987)或
生物素。这样的亲和标签可用于将蛋白可逆连接至装置。
一个成员存在于装置体的表面上,而配对的另一个成员位于基质细胞蛋白上):羟基/羧酸
以得到酯键;羟基/酸酐以得到酯键;羟基/异氰酸酯以得到氨基甲酸乙酯键。没有可用的活性基团的装置体的表面可用射频放电等离子体(RFGD)蚀刻处理,以产生活性基团,以允许
基质细胞蛋白的沉积(例如,用氧等离子体处理以引入含氧基团;用丙基氨基等离子体处理以引入胺基团)。
那些,例如可获自各种市售来源(例如,Sigma和Collagen Corporation),或按Jefferies的美国专利号4,394,370和Koezuka的4,975,527所述制备的胶原基质。一种胶原材料称为
TM
UltraFiber 和可获自Norian Corp.(MountainView,California)。
降低发生所述病况的症状的风险。在治疗性应用中,将药物组合物给予疑似或已经患有与
MASP-2-依赖性补体活化有关的病况的受试者,其治疗有效量足以缓解或至少部分地减轻
所述病况的症状。在预防性和治疗性方案两者中,包含MASP-2抑制剂的组合物可以数个剂
量给予,直到在所述受试者中实现足够的治疗结果。本发明的MASP-2抑制性组合物的施用
可通过单次给予所述组合物或有限的给予顺序进行,用于治疗急性病况,例如,再灌注损伤或其它创伤性损伤。或者,可在长期的一段时间内以定期间隔给予组合物用于治疗慢性病
况,例如,关节炎或银屑病。
(periprocedurally)施用。如本文所用的,"围绕程序"是指在程序前和/或程序中和/或程
序后给予抑制性组合物,即,在程序之前;在程序之前和其中;在程序之前和之后;在程序之前、期间和之后;在程序期间;在程序期间和之后;或在程序之后。围绕程序施用可通过局部给予组合物至手术或程序部位进行,例如通过注射或连续或间断冲洗部位或通过系统性给
予。局部的手术期间递送MASP-2抑制剂溶液的合适方法公开于Demopulos的美国专利号6,
420,432和Demopulos的6,645,168。局部递送包括MASP-2抑制剂的软骨保护性组合物的合
适方法公开于国际PCT专利申请WO 01/07067 A2。用于靶向系统递送包括MASP-2抑制剂的
软骨保护性组合物的合适方法和组合物公开于国际PCT专利申请WO 03/063799 A2。
Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60,2011,其通过引用结合到本文中)。在一个实
施方案中,所述受试者患有或有风险发生TMA,其是(i)癌症继发性TMA;(ii)化学疗法继发性TMA;或(iii)移植继发性TMA(例如,器官移植,例如肾移植或同种异体造血干细胞移植)。
在一个实施方案中,所述受试者患有或有风险发生Upshaw-Schulman综合征(USS)。在一个
实施方案中,所述受试者患有或有风险发生德戈斯病。在一个实施方案中,所述受试者患有或有风险发生灾难性抗磷脂综合征(CAPS)。在治疗性应用中,将药物组合物给予患有或有
风险发生TMA的受试者,其治疗有效量足以抑制血栓形成,减轻或至少部分地减轻所述病况的症状。
剂包括抗-MASP-2抗体,其可以0.1mg至10,000mg、更合适1.0mg至5,000mg、更合适10.0mg至
2,000mg、更合适10.0mg至1,000mg和还更合适50.0mg至500mg的剂量合适地给予成年患者
(例如,平均成人体重70kg)。对于儿科患者,可按患者体重的比例调整剂量。本发明的MASP-
2抑制性组合物的施用可进行通过单次给予组合物,或有限顺序给予,以治疗TMA。或者,组合物可在长期的一段时间内以定期间隔例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每月两次给予,用于治疗TMA。
试者包括MASP-2抑制剂的本发明的组合物和进一步给予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的
末端补体抑制剂。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是人源化的抗-C5抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是艾库组单抗。
症状。在本发明的一个方面,在给药之前,可检查所述受试者以确定所述受试者是否显示
aHUS的一个或多个症状,包括(i)贫血;(ii)血小板减少症;(iii)肾功能不全;和(iv)肌酐升高,然后以有效量给予本发明的组合物持续一段足够的时间,以改善这些症状。
受试者的样品进行遗传筛选测试和鉴定与aHUS有关的至少一种遗传标记(补体因子H
(CFH)、因子I(CFI)、因子B(CFB)、膜辅因子CD46、C3、补体因子H-相关蛋白(CFHR1)、抗凝血蛋白凝血调节蛋白(THBD)、补体因子H-相关蛋白3(CFHR3)或补体因子H-相关蛋白4
(CFHR4))的存在来测定受试者中已知与aHUS有关的遗传标记的存在。然后所述受试者周期
性地监测(例如,每月一次、每季度一次、每年两次或每年一次)以测定aHUS的至少一个症状的存在或不存在,例如贫血、血小板减少症、肾功能不全和肌酐升高。在测定这些症状的至少一种存在后,可将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂给予所述受试
者,以有效量并给予足够的一段时间,以改进所述一个或多个症状。在本发明的又一方面,由于已经筛选和测定具有一种与aHUS有关的遗传标记而有增加的发生aHUS的风险的受试
者,可监测其触发aHUS临床症状有关的事件的发生,包括药物暴露、感染(例如,细菌感染)、恶性肿瘤、损伤、器官或组织移植和妊娠。
例如,患有或有风险发生与肺炎链球菌感染有关的非肠道aHUS的患者可用本发明的组合物
治疗。
血浆去除术治疗的受试者),或在另外不愿意血浆去除术的受试者中,或在其中不可利用血浆去除术的背景中,给予患有aHUS的受试者。
水平而监测,其中确定与标准值或健康受试者相比至少一种补体因子的水平降低表示需要
继续用组合物治疗。
括抗-MASP-2抗体,其可适合以0.1mg至10,000mg、更合适1.0mg至5,000mg、更合适10.0mg至
2,000mg、更合适10.0mg至1,000mg和还更合适50.0mg至500mg的剂量给予成年患者(例如,
平均成人体重70kg)。对于儿科患者,可按患者体重比例调整剂量。本发明的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物,或有限顺序给予进行,用于治疗aHUS。或者,组合物可在长期的一段时间内以定期间隔给予,例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次,用于治疗aHUS。
MASP-2抑制剂的本发明的组合物和进一步给予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体
抑制剂。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是人源化的抗-C5抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是艾库组单抗。
似或已经患有HUS的受试者,其治疗有效量足以减轻或至少部分地减轻所述病况的症状。
降低。例如,有风险发生HUS和待用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗的受试者可显示与
HUS有关的一个或多个症状,包括腹泻;血细胞比容水平低于30%,涂片证明血管内红细胞破坏;血小板减少症和肌酐升高水平。作为进一步的实例,有风险发生HUS和待用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗的受试者可感染有大肠杆菌、志贺氏菌或沙门氏菌。感染有大肠
杆菌、志贺氏菌或沙门氏菌的这样的受试者可用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗,同时
用抗生素治疗;或者可用MASP-2抑制性组合物治疗,未同时用抗生素治疗,特别是对于肠原性大肠杆菌,对其禁忌用抗生素治疗。感染有肠原性大肠杆菌的已经用抗生素治疗的受试
者可具有升高的发生HUS的风险,和可合适地用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗以降低
风险。感染有肠原性大肠杆菌的受试者可在缺少抗生素的情况下用本发明的MASP-2抑制性
组合物治疗第一时间段,然后用本发明的MASP-2抑制性组合物和抗生素治疗第二时间段。
1天、2天或3天。所述受试者然后可用MASP-2抑制性组合物治疗第二时间段,其通过常规皮下注射给予,例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次注射。
浆去除术治疗的受试者),或在另外不愿意血浆去除术的受试者中,或在其中不可利用血浆去除术的背景中,给予患有HUS的受试者。
MASP-2抑制性组合物或与血浆交换交替进行。
水平而监测,其中测定与标准值或健康受试者相比至少一种补体因子的水平降低表示需要
继续用组合物治疗。
000mg、更合适10.0mg至1,000mg和更合适50.0mg至500mg的剂量给予成年患者(例如,平均
成人体重70kg)。对于儿科患者,可按患者体重比例调整剂量。本发明的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物,或有限顺序给予进行,用于治疗HUS。或者,组合物可在长期的一段时间内以定期间隔给予,例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次,用于治疗HUS。
MASP-2抑制剂的本发明的组合物和进一步给予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体
抑制剂。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是人源化的抗-C5抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是艾库组单抗。
似或已经患有TTP的受试者,其治疗有效量足以减轻或至少部分地减轻所述病况的症状。
ADAMTS13的抑制剂(即,抗体)测试阳性的受试者可用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗。
在本发明的又一方面,对ADAMTS13的抑制剂的存在测试阳性的受试者可用免疫抑制剂(例
如,皮质类固醇、rituxan或环孢霉素)治疗,同时用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗。在本发明的又一方面,确定具有降低水平的ADAMTS13和对存在ADAMTS13的抑制剂测试阳性的
受试者可用ADAMTS13治疗,同时用本发明的MASP-2抑制性组合物治疗。
1天、2天或3天。所述受试者然后可用MASP-2抑制性组合物治疗第二时间段,其通过常规皮下注射给予,例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次注射。
浆去除术治疗的受试者),或在另外不愿意血浆去除术的受试者中,或在其中不可利用血浆去除术的背景中,给予患有HUS的受试者。
MASP-2抑制性组合物或与血浆交换交替进行。
水平而监测,其中确定与标准值或健康受试者相比至少一种补体因子的水平降低表示需要
继续用组合物治疗。
括抗-MASP-2抗体,其可合适以0.1mg至10,000mg、更合适1.0mg至5,000mg、更合适10.0mg至
2,000mg、更合适10.0mg至1,000mg和还更合适50.0mg至500mg的剂量给予成年患者(例如,
平均成人体重70kg)。对于儿科患者,可按患者体重比例调整剂量。本发明的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物,或有限顺序给予进行,用于治疗TTP。或者,组合物可在长期的一段时间内以定期间隔给予,例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次,用于治疗TTP。
MASP-2抑制剂的本发明的组合物和进一步给予受试者抑制补体蛋白C5的裂解的末端补体
抑制剂。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是人源化的抗-C5抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,末端补体抑制剂是艾库组单抗。
VI.实施例
隆,和在这些克隆中,通过DNA印迹鉴定和验证4个不同的克隆,以包含预期的选择性靶向和重组事件,如图3中所示。从这4个阳性克隆中通过胚胎转移产生嵌合体。然后将嵌合体在遗传背景C57/BL6中回交,以产生转基因雄性。转基因雄性与雌性杂交,产生F1,其中50%的后代对于破坏的MASP-2基因显示杂合性。杂合小鼠互交,产生纯合MASP-2缺陷后代,以1:2:1的比率分别得到杂合和野生型小鼠。
缺少MASP-2蛋白(数据未显示),验证是MASP-2缺陷的。使用时间解析RT-PCR在LightCycler仪器上进一步证实存在MAp19 mRNA和缺少MASP-2mRNA。MASP-2-/-小鼠的确按期望地继续
表达MAp19、MASP-1和MASP-3mRNA和蛋白质(数据未显示)。在MASP-2-/-小鼠中备解素、因子B、因子D、C4、C2和C3的mRNA的存在和丰度通过LightCycler分析评价,和发现与野生型同窝对照相同(数据未显示)。来自纯合MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素-途径-介导的补
体活化,如实施例2中进一步描述的。
MASP-2,替换缺陷的鼠MASP2基因。
脂磷壁酸(LTA)导致的凝集素途径活化。Petersen等(2001)描述的该测定法通过用LPS和甘
露聚糖或酵母聚糖包被板,然后加入来自MASP-2-/-小鼠的血清,经改良以测量经过MBL的
凝集素途径活化,如下文所述。该测定法还经改良,以除去由于经典途径导致的C4裂解的可能性。这通过使用包含1M NaCl的样品稀释缓冲液实现,其允许凝集素途径识别组分与它们的配体高亲和力结合,但阻止内源C4的活化,从而通过解离C1复合物排除经典途径的参与。
简言之,在改良的测定法中,将血清样品(在高盐(1M NaCl)缓冲液中稀释)加入配体包被的板,接着加入在具有生理学浓度的盐的缓冲液中的恒定量的纯化的C4。包含MASP-2的结合
的识别复合物裂解C4,导致C4b沉积。
糖(M7504 Sigma)或任何其它配体(例如,下文列举的那些)包被。
根据测量标准化至野生型血清的C4b沉积的量,在用来自MASP-2-/+小鼠(n=5)和MASP-
2-/-小鼠(n=4)的酵母聚糖(白色条)或甘露聚糖(阴影条)包被的板上,相对于野生型小鼠
(n=5)的相对C4转化酶活性。误差棒表示标准偏差。如图5A-C中所示,在甘露聚糖和酵母聚糖包被的板上,来自MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素-途径-介导的补体活化。这些结果清楚证实,MASP-2是凝集素途径的效应器组分。
施例3所述,产生和纯化在功能上有活性的鼠MASP-2和催化失活的鼠MASP-2A(其中丝氨酸
蛋白酶结构域中的活性位点丝氨酸残基被置换为丙氨酸残基)重组蛋白。用递增蛋白浓度
的重组鼠MASP-2或失活的重组鼠MASP-2A预孵育来自4MASP-2-/-小鼠的合并的血清,按上
文所述测定C4转化酶活性。
化失活的鼠MASP-2A蛋白(以星号表示)未恢复C4活化。图6中显示的结果标准化至用合并的
野生型小鼠血清观察到的C4活化(以虚线表示)。
Nucleic Acids Research19:4485-90,1991;Kaufman,Methods in Enzymology,185:537-
66(1991))。将全长小鼠cDNA(SEQ ID NO:50)和大鼠MASP-2cDNA(SEQ ID NO:53)各自亚克
隆至pED表达载体。然后使用Maniatis等,1989中描述的标准磷酸钙转染程序,将MASP-2表
达载体转染至粘附的中国仓鼠卵巢细胞系DXB1。用这些构建体转染的细胞生长极慢,意味
着编码的蛋白酶是细胞毒性的。
文所述分离。
纯化期间。为了获得较稳定的蛋白制备物用作抗原,催化失活形式的MASP-2,被称为MASP-
2A,通过替代存在于蛋白酶结构域的催化三联体中的丝氨酸残基为大鼠(SEQ ID NO:
55Ser617至Ala617)、小鼠(SEQ ID NO:52 Ser617至Ala617)或人(SEQ ID NO:3 Ser618至
Ala618)中的丙氨酸残基产生。
丝氨酸至终止密码子的区域,以产生包含Ser618至Ala618突变的突变MASP-2A的完整开放
阅读形式。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后纯化,和单一腺苷重叠使用标准加尾程序产生。然后将腺苷加尾的MASP-2A克隆至pGEM-T easy载体,转化至大肠杆菌。
cDNA(SEQ ID NO:53)的Pst1-Xba1片段,以产生大鼠MASP-2A。
Thiel等,Nature 386:506,1997)用Xho1和EcoR1消化,将MASP-2 cDNA(本文称为SEQ ID
NO:4)克隆至pFastBac1杆状病毒转移载体(Life Technologies,NY)的相应的限制位点。然
后通过用编码肽区域氨基酸610-625(SEQ ID NO:13)的双链寡核苷酸置换天然区域氨基酸
610-625,将在Ser618处的MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点改变为Ala618,以产生具有失活的蛋白酶结构域的MASP-2全长多肽。
残基1–121(SEQ ID NO:6)的区域(对应于N-末端CUB1结构域)制备。表达人MASP-2CUBIEGF
结构域(SEQ ID NO:9)的构建体通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)的残基1–166的区
域(对应于N-末端CUB1EGF结构域)制备。表达人MASP-2 CUBIEGFCUBII结构域(SEQ ID NO:
10)的构建体通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)的残基1-293的区域(对应于N-末端
CUBIEGFCUBII结构域)扩增。上述的结构域使用VentR聚合酶和pBS-MASP-2作为模板,按照
已建立的PCR方法,通过PCR进行扩增。有义引物的5'引物序列
PCR产物末端在EcoRI位点(下划线)之前引入终止密码子(粗体)。一旦扩增,DNA片段用
BamHI和EcoRI消化,和克隆至pFastBac1载体的相应位点。得到的构建体通过限制性作图表征和通过dsDNA测序证实。
染。每2天自汇合的细胞收获培养基(总共四次)。对于三个物种的每一个,重组MASP-2A的水平平均为大约1.5mg/升培养基。
用10ml的上样缓冲液预平衡的MBP-琼脂糖亲和柱(4ml)上。在用另外10ml的上样缓冲液洗
涤后,蛋白用包含1.25M NaCl和10mM EDTA的50mM Tris-Cl,pH 7.5以1ml流分洗脱。包含
MASP-2A的流分通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。在必要时,MASP-2A通过在MonoQ柱(HR
5/5)上离子交换色谱进一步纯化。蛋白质用包含50mM NaCl的50mM Tris-Cl pH 7.5透析,
和上样到用相同缓冲液平衡的柱上。在洗涤后,结合的MASP-2A用经10ml的0.05–1M NaCl梯度洗脱。
处聚糖的连接是观测的质量的原因。MASP-2A在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上作为单一条带迁移,证明在生物合成期间其未被蛋白水解加工。对于糖基化多肽的同二聚体,通过平衡超速离
心测定的重均分子量与计算值一致。
Novagen,Madison,WI的Ready-Plaque Sf9细胞)在添加有50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素
(Life Technologies)的Sf900II无血清培养基(Life Technologies)中生长和维持。
Trichoplusia ni(High Five)昆虫细胞(由Jadwiga Chroboczek,Institut de Biologie
Structurale,Grenoble,France提供)在添加有50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素的包含
10%FCS(Dominique Dutscher,Brumath,France)的TC100培养基(Life Technologies)中
维持。重组杆状病毒使用Bac-to-Bac系统(Life Technologies)产生。使用Qiagen
midiprep纯化系统(Qiagen)纯化杆粒DNA,并且使用cellfectin/Sf900 II SFM培养基
(Life Technologies)按制造商的方案所述,将杆粒DNA用于转染Sf9昆虫细胞。4天后收集
重组病毒颗粒,通过病毒斑测定法滴定,和按King和Possee在The Baculovirus
Expression System:A Laboratory Guide,Chapman and Hall Ltd.,London,第111-114
页,1992中描述进行扩增。
入二异丙基氟代磷酸酯至终浓度1mM。
柱(Amersham Pharmacia Biotech)(2.8 x 12cm)上。通过应用在相同缓冲液中至350mM
NaCl的1.2升线性梯度进行洗脱。包含重组MASP-2多肽的流分通过蛋白质印迹分析鉴定,通过加入(NH4)2SO4至60%(w/v)进行沉淀,和在4℃放置过夜。将沉淀重悬浮于145mM NaCl,
1mM CaCl2,50mM三乙醇胺盐酸盐,pH 7.4中,并施加到用相同缓冲液平衡的TSK G3000 SWG
柱(7.5 x 600mm)(Tosohaas,Montgomeryville,PA)上。然后通过在Microsep微量浓缩器
(m.w.截止=10,000)(Filtron,Karlstein,Germany)上超滤将纯化的多肽浓缩至0.3mg/
ml。
rMASP-2或rMASP-2A多肽(按实施例3中所述制备)皮下注射。以两周间隔,小鼠用在不完全
弗氏佐剂中的50μg的人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽两次皮下注射。在第四周,小鼠用在PBS中的50μg的人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽注射和4天后融合。
和5%二甲基亚砜(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)的培养基中融合。然后在添加有
10%胎牛血清、100个单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和
16μM胸苷的Iscove培养基(Gibco,Grand Island,N.Y.)中将细胞调整至1.5x105个脾细胞/
200μl悬浮液的浓度。将200微升的细胞悬浮液加入至大约20个96-孔微量培养板的各孔。在大约10天后,吸出培养上清液用于在ELISA测定法中筛选与纯化的因子MASP-2的反应性。
过夜。用于包被的低浓度的MASP-2能够选择高-亲和力抗体。在包被溶液通过轻弹板除去
后,将200μl含BLOTTO(脱脂奶粉)的PBS加入至各孔中1小时,以封闭非-特异性位点。在1小时后,然后用缓冲液PBST(包含0.05%Tween 20的PBS)洗涤各孔。自各融合孔的50微升的培养上清液经收集和与50μl的BLOTTO混合,然后加入至微量测试板的各个孔中。在1小时孵育后,各孔用PBST洗涤。然后,结合的鼠抗体通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合和以1:2,000稀释在BLOTTO中的山羊抗-小鼠IgG(Fc特异性)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,
West Grove,Pa.)反应而检测。将包含0.1%3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma,St.Louis,Mo.)
和0.0003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加入至各孔用于显色30分钟。通过每
孔加入50μl的2M H2SO4终止反应。反应混合物在450nm的光密度用BioTek ELISA Reader
(BioTek Instruments,Winooski,Vt.)读出。
结合在补体系统中的其它抗原。
Technology,San Diego,CA)在4℃包被过夜。在吸出MASP-2溶液后,各孔用包含1%牛血清
白蛋白(BSA;Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭2小时。没有MASP-2包被的各孔用作背景对照。将在封闭溶液中各种浓度的等份的杂交瘤上清液或纯化的抗-MASP-2 MoAb加入至各
孔。在室温孵育2h后,各孔用PBS充分漂洗。MASP-2-结合的抗-MASP-2 MoAb通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG(Sigma Chemical),使其在室温下孵育1h而检
测。再次用PBS充分漂洗板,和加入100μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物
(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)。TMB的反应通过加入100μl的
1M磷酸淬灭,和在微板阅读器(SPECTRA MAX 250,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中在
450nm读出板。
段,降低其免疫原性,其根据本发明可用于抑制在人受试者中MASP-2-依赖性补体活化的不良作用。
获得)分离。第一链cDNA使用寡聚dT作为引物自总RNA合成。使用免疫球蛋白恒定C区衍生的
3'引物和源自前导肽或鼠VH或VK基因的第一框架区的简并引物组作为5'引物进行PCR。锚
定PCR按Chen和Platsucas(Chen,P.F.,Scand.J.Immunol.35:539-549,1992)所述进行。对
于克隆VK基因,双链cDNA使用Notl-MAK1引物(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3'SEQ ID
NO:38)制备。将退火的接头AD1(5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3'SEQ ID NO:39)和AD2
(5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3'SEQ ID NO:40)连接至双链cDNA的5'和3'末端。在3'末端的接
头通过Notl消化除去。然后消化的产物用作PCR模板,用AD1寡核苷酸作为5'引物和MAK2
(5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3'SEQ ID NO:41)作为3'引物。将大约500bp的DNA
片段克隆至pUC19。选择数个克隆用于序列分析以验证克隆的序列包括预期的鼠免疫球蛋
白恒定区。Not1-MAK1和MAK2寡核苷酸源自VK区和分别为在Cκ基因的第一碱基对下游182和
84bp。选择包括完整VK和前导肽的克隆。
CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3'SEQ ID NO:43)作为引物。将500-600bp长度的DNA片段
克隆至pUC19。Notl-MAG1和MAG2寡核苷酸源自鼠Cγ.7.1区,和分别为在鼠Cγ.7.1基因的
第一碱基对的下游180和93bp。选择包含完整VH和前导肽的克隆。
端。在分析序列以证实PCR错误不存在后,将VH和VK基因插入分别包含人C.γ1和C.κ的表达载体盒,得到pSV2neoVH-huCγ1和pSV2neoV-huCγ。CsCl梯度纯化的重链和轻链载体的质
粒DNA用于通过电穿孔转染COS细胞。在48小时后,培养上清液通过ELISA测试以证实存在大约200ng/ml的嵌合IgG。收获细胞和制备总RNA。第一链cDNA自总RNA使用寡聚dT作为引物合成。该cDNA用作PCR模板以产生Fd和κDNA片段。对于Fd基因,使用5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3'(SEQ ID NO:44)作为5'引物和CH1-衍生的3'引物(5'-
CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3'SEQ ID NO:45)进行PCR。DNA序列经证实包含人
IgG1的完整的VH和CH1结构域。在用合适的酶消化后,将Fd DNA片段插入在表达载体盒
pSV2dhfr-TUS的HindIII和BamHI限制位点,得到pSV2dhfrFd。pSV2质粒为市售可得的,并由来自各种来源的DNA区段组成:pBR322 DNA(细线)包含pBR322 DNA复制起点(pBR ori)和内
酰胺酶氨苄青霉素抗性基因(Amp);SV40 DNA,通过通过较宽阴影表示和标注,包含SV40
DNA复制起点(SV40 ori)、早期启动子(5'至dhfr和neo基因)和多腺苷酸化信号(3'至dhfr
和neo基因)。SV40-来源的多腺苷酸化信号(pA)还位于Fd基因的3'末端。
进行PCR。DNA序列证实包含完整的VK和人CK区。在用合适的限制酶消化后,将κDNA片段插入表达载体盒pSV2neo-TUS的HindIII和BamHI限制位点以得到pSV2neoK。Fd和κ基因的表达受HCMV-衍生的增强子和启动子元件驱动。因为Fd基因不包括参与链间二硫键的半胱氨酸氨
基酸残基,该重组嵌合Fab包含非-共价地连接的重链和轻链。该嵌合Fab被称为cFab。
3'末端的30个氨基酸的BstEII-BamHI DNA区段可置换为编码延长的Fd的DNA区段,产生
pSV2dhfrFd/9aa。
3.0洗脱。将等体积的1M Hepes,pH 8.0加入至包含纯化抗体的流分中,以调整pH至7.0。残留的盐通过用PBS通过Millipore膜超滤(M.W.截止:3,000)进行缓冲液交换而除去。纯化的抗体的蛋白浓度通过BCA方法(Pierce)测定。
下选择转染的细胞。选择的细胞系在递增浓度的甲氨蝶呤中扩增。细胞是通过有限稀释亚
克隆的单细胞。高产量的单细胞亚克隆细胞系然后在100ml旋转培养物中使用无血清培养
基进行培养。
小鼠和筛选可与人MASP-2竞争的特异性MoAb结合来制备。对于纯化,将来自产生cFab或
cFab/9aa的CHO细胞的旋转培养物的100ml上清液上样到与抗-个体型MASP-2 MoAb偶联的
亲和柱上。然后用PBS充分洗涤柱,之后用50mM二乙胺pH 11.5洗脱结合的Fab。残留的盐按上述通过缓冲液交换除去。纯化Fab的蛋白浓度通过BCA方法(Pierce)测定。
所致的凝集素途径活化。
在PBS/0.5%福尔马林中固定1小时,再用PBS洗涤3次后,重悬浮于包被缓冲液(15mM
Na2CO3、35mM NaHCO3,pH 9.6)中。
包被缓冲液与1ug L-纤维胶凝蛋白的包被缓冲液。孵育过夜后,各孔用0.1%人血清白蛋白(HSA)的TBS溶液(10mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH 7.4)封闭,然后用含有0.05%Tween 20
和5mM CaCl2的TBS溶液(洗涤缓冲液)洗涤。将人血清样品稀释于20mM Tris-HCl,1M NaCl,
10mM CaCl2,0.05%Triton X-100,0.1%HSA,pH 7.4中,这防止了内源C4的活化,并使Cl复合物(由Clq、Clr和Cls组成)解离。将不同浓度的MASP-2抑制剂(包括抗-MASP-2 MoAb和抑
制性肽)加到血清样品中。将稀释的样品加到板中,在4℃下孵育过夜。24小时后,各板用洗涤缓冲液充分洗涤,然后向各孔中加入0.1μg经纯化的人C4(按照Dodds,A.W.,Methods
Enzymol.223:46,1993所述获得)/100μl 4mM巴比妥、145mM NaCl,2mM CaCl2,1mM MgCl2,
pH 7.4。在37℃1.5小时后,各板再次经洗涤,使用碱性磷酸酶-缀合的鸡抗人C4c(获自
Immunsystem,Uppsala,Sweden),检测C4b沉积,并使用比色底物磷酸对硝基苯酯进行测定。
接着在4℃用以1:1000在TBS/tween/Ca2+中稀释的绵羊抗全血清抗血清(Scottish
Antibody Production Unit,Carluke,Scotland)孵育过夜来原位产生。血清样品获自野生
型和MASP-2-/-小鼠和加入至包被的板中。制备对照样品,其中C1q从野生型和MASP-2-/-血清样品中耗尽。C1q-耗尽的小鼠血清使用包被有兔抗-人C1q IgG(Dako,Glostrup,
Denmark)的蛋白-A-偶联的Dynabeads(Dynal Biotech,Oslo,Norway)根据供应商的说明书
制备。板在37℃孵育90分钟。结合的C3b用在TBS/tw/Ca++中以1:1000稀释的多克隆抗-人-
C3c抗体(Dako A 062)检测。第二抗体是山羊抗-兔IgG。
37℃孵育,并且还包括平行的一式三份的样品(+/-IC),其在37℃孵育期间含有200nM抗备
解素单克隆抗体。在37℃孵育2小时后,将13mM EDTA加到所有样品中以终止进一步的补体
活化,并立即将样品冷却到5℃。再将样品保存于-70℃,然后按照生产商的说明书,使用
ELISA试剂盒(Quidel,目录号A015和A009)进行补体活化产物(C3a和sC5b-9)的测定。
MASP-2高亲和性结合的Fab2抗体片段,并在功能测定法中测定所鉴定的Fab2片段,以确定
它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
能抑制MASP-2功能活性,除非它们结合直接参与MASP-2功能活性的MASP-2上的结构表位。
(SEQ ID NO:55)的高亲和性Fab2。利用已知量的大鼠MASP-2(~1mg,纯度>85%)蛋白进行
抗体筛选。利用三轮扩增以选出具有最高亲和性的抗体。挑选约250个不同的表达抗体片段的目标(hit)用于ELISA筛选。随后对高亲和性目标进行测序以确定不同抗体的独特性。
径中的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分;因此,抗-MASP-2抗体(或Fab2)不会直接抑制之前已存在的C3转化酶的活性。然而,为了产生组成凝集素途
径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a),MASP-2丝氨酸蛋白酶活性是必需的。因此,抑制MASP-2功能活性的抗-MASP-2Fab2(即阻断性抗-MASP-2Fab2)抑制凝集素途径C3转化酶从
头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构的部分。在该测定法中当C3转化酶裂
解C3时,C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或
氨基形成共价键,从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
后洗涤各孔,并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的抗-MASP-2
Fab2抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
PBS洗涤3次。在5℃,将抗-MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0mM巴比
妥,141mM NaCl,1.0mM MgCl2,2.0mM CaCl2,0.1%明胶,pH 7.4)至选定浓度。在5℃,将
0.5%大鼠血清加到上述样品中,将100μl转移到各孔。将板盖上,在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔用200μl PBS-Tween 20(0.05%Tween 20的PBS溶液)洗涤5次,再用200μl PBS洗涤2次。加入100μl/孔的1:10,000稀释的第一抗体(兔抗人C3c,DAKO A0062),该抗体溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中,在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200μl PBS洗涤5次。加入100μl/孔的1:10,000稀释的第二抗体(过氧化物酶-缀合的山羊抗兔IgG,American Qualex
A102PU),该抗体溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中,在室温下在振荡器中轻轻搅动
孵育1小时。各孔用200μl PBS洗涤5次。加入100μl/孔的过氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories),在室温下孵育10分钟。通过加入100μl/孔1.0M H3PO4终止过氧化物酶反应,测定OD450。
MASP-2的结构表位(例如C4的MASP-2结合位点;MASP-2丝氨酸蛋白酶催化位点),从而抑制
MASP-2的C4裂解功能活性。
径。因为用于该ELISA测定法中的第一抗体仅识别人C4,所以稀释的大鼠血清还补充了人C4(1.0μg/mL)。然后洗涤各孔,采用标准ELISA方法测定固定到孔中的人C4b。在该测定法中所产生的C4b的量可衡量MASP-2-依赖性C4裂解活性。在该测定法中,测定选定浓度的抗-
MASP-2 Fab2抑制C4裂解的能力。
(ImmunsystemAB,Uppsala,Sweden),该抗体溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中,在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200μl PBS洗涤5次。加入100μl/孔的0.1μg/mL过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素(Pierce Chemical#21126),其溶于含有2.0mg/ml BSA的PBS中,在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200μl PBS洗涤5次。加入100μl/孔的过氧化物酶底物TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories),在室温下孵育16分钟。通过加入100μl/孔1.0M H3PO4终止过氧化物酶反应,并测定OD450。
“天然”MASP-2之间,而不是与纯化的重组MASP-2之间的相互作用。在该结合测定法中,先将得自10%大鼠血清的“天然”MASP-2-MBL复合物固定在甘露聚糖包被的孔内。然后采用标准ELISA方法,对各种抗-MASP-2 Fab2与固定化“天然”MASP-2的结合亲和性进行了研究。
用200μl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液(Tris-缓冲盐水,0.05%Tween20,含有5.0mM CaCl2,
pH 7.4)洗涤3次。在冰上制备含10%大鼠血清的高盐结合缓冲液(20mM Tris,1.0M NaCl,
10mM CaCl2,0.05%Triton-X100,0.1%(w/v)牛血清白蛋白,pH 7.4)。加入100μl/孔并在5℃孵育过夜。各孔用200μl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液洗涤3次。然后,各孔用200μl PBS洗涤2次。加入100μl/孔的稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0mM巴比妥,141mM NaCl,1.0mM MgCl2,2.0mM CaCl2,0.1%明胶,pH 7.4)的选定浓度的抗-MASP-2 Fab2,并在室温下孵育1
小时并温和搅动。各孔用200μl PBS洗涤5次。加入在2.0mg/mL牛血清白蛋白的PBS中1:5000稀释的100μl/孔的HRP-缀合的山羊抗Fab2(Biogenesis Cat No 0500-0099),并在室温下
孵育1小时并温和搅动。各孔用200μl PBS洗涤5次。加入100μl/孔的过氧化物酶底物TMB
(Kirkegaard&Perry Laboratories)并在室温下孵育70分钟。通过加入100μl/孔1.0M H3PO4终止过氧化物酶反应,并测定OD450。
Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。图8A图示了对于Fab2
抗体#11的C3转化酶形成测定法的结果,其代表了测试的其它Fab2抗体,结果显示在表6。这是重要的考虑因素,因为理论上可能的是,甚至当各MASP-2分子被Fab2结合时,“阻断性”Fab2可能仅微弱地抑制MASP-2功能。
95%),因此证明了该测定法对于凝集素途径C3转化酶的特异性。
用Fab2抗体#11的结合测定法的结果。对于其它Fab2也进行了类似的结合测定,其结果见表
6。一般而言,对于6个Fab2的每一个结合“天然”MASP-2所获得的表观Kd与在C3转化酶功能测定中Fab2的IC50恰好适当对应。有证据表明,在激活其蛋白酶活性时,MASP-2经历了从
“无活性”到“活性”形式的构象变化(Feinberg等人,EMBO J 22:2348-59(2003);Gal等人,J.Biol.Chem.280:33435-44(2005))。在用于C3转化酶形成测定法的正常大鼠血浆中,
MASP-2主要以“无活性”酶原构象存在。相比之下,在结合测定法中,MASP-2作为与MBL(其结合到固定化甘露聚糖)的复合物的部分而存在;因此,MASP-2可能为“活性”构象(Petersen等人,J.Immunol Methods 257:107-16,2001)。因此,对于这两个功能测定法中所测定的17个阻断性Fab2的每一个,不必预期IC50和Kd之间确切的对应性,因为在各个测定法中,Fab2可结合不同构象形式的MASP-2。尽管如此,除了Fab2#88以外,对于两种测定法中所测的其它16个Fab2的每一个,IC50和表观Kd之间显示出相当密切的对应性(参见表6)。
C4裂解的特异性。C4,如同C3一样,含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当通过MASP-2裂解C4时,C4b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底
部的大分子上羟基或氨基形成共价键,因此有利于在ELISA测定法中检测C4b。
蛋白质从细胞裂解物中纯化。硫氧还蛋白融合配偶体由pTrxFus空载体表达作为阴性对照。
中的范围为100ng至6.4pg。在稍后的实验中,蛋白质的点样量再次在5重步骤中的范围由
50ng降至16pg。该膜用含5%脱脂奶粉的TBS溶液(封闭缓冲液)封闭,然后与含1.0μg/mL抗-MASP-2 Fab2的封闭缓冲液(含有5.0mM Ca++)一起温育。用HRP-缀合的抗人Fab(AbD/
Serotec;1/10,000稀释)和ECL检测试剂盒(Amersham)检测结合的Fab2。一块膜与作为阳性对照的多克隆兔抗人MASP-2Ab(参见Stover等人,J Immunol 163:6848-59(1999))一起温
育。在这种情况下,用HRP-缀合的山羊抗兔IgG(Dako;1/2,000稀释),检测结合的Ab。
2+ 2+
TBS溶液(含有5.0mM Ca )。将各板在室温下孵育1小时。用TBS/Tween/Ca 洗涤3次后,加入按1/10,000稀释于TBS/Ca2+的HRP-缀合的抗人Fab(AbD/Serotec),将各板再次在室温下孵
育1小时。用TMB过氧化物酶底物试剂盒(Biorad)检测结合的抗体。
产生)识别。
血清。
段,但不识别CUBI/EGF样多肽或CCPII-SP多肽,提示它结合CUBII的表位,或者跨越CUBII和EGF样结构域。Fab2#57识别MASP-2A但不识别任何所测试的MASP-2片段,表明该Fab2识别
CCP1的表位。Fab2#40和#49仅结合完整的MASP-2A。在图11所示的ELISA结合测定法中,
Fab2#60还结合CUBI-II多肽,虽然只具有略微较低的表观亲和性。
没有肾I/R损伤的有效治疗,和血液透析是唯一的可用治疗。肾I/R损伤的生理病理学是复
杂的。最近研究表明,补体活化的凝集素途径可在肾I/R损伤的发病机理中具有重要作用
(deVries等,Am.J.Path.165:1677-88,2004)。
MASP-2(-/-)和6只野生型(+/+)小鼠,体重为22-25g,和随后通过吸入异氟烷(Abbott
Laboratories Ltd.,Kent,UK)麻醉。选择异氟烷,因为它是温和的吸入麻醉剂,具有最小的肝毒性;准确产生浓度和动物快速恢复,甚至在延长的麻醉后。给予Hypnovel是因为它在动物中产生安定镇痛的条件和意味着需要给予较少的异氟烷。将加温垫置于动物之下以保持
恒定体温。接着,进行腹部中线切开,使用一对牵开器保持体腔打开。在右肾和左肾的肾静脉和动脉之上和之下清除结缔组织,和通过施用小动脉瘤钳,将肾蒂钳住55分钟的时间。该缺血时间最初基于在该实验室进行的之前研究(Zhou等,J.Clin.Invest.105:1363-71
(2000))。另外,在缺血性滴定后选择55分钟的标准缺血时间,发现55分钟产生一致的损伤,其也是可逆的,具有低于5%的低死亡率。在阻塞后,将0.4ml的温热盐水(37℃)置于腹腔
中,然后在缺血期间闭合腹部。在除去小动脉瘤钳后,观察肾,直到颜色改变,即指示血液重新流到肾。将另外的0.4ml温热盐水置于腹腔中,和缝合开口,随之将动物放回它们的笼子。
在除去钳后24小时收集尾血样品,和在48小时将小鼠处死,和收集另外的血样。
素氮清除率。如图12中所示,MASP-2(-/-)小鼠显示与野生型对照小鼠相比,在24和48小时血液尿素的量显著降低,指示在缺血再灌注损伤模型中免于肾损伤的保护功能作用。
5.8mmol/L。除了图12提供的数据之外,一只MASP-2(-/-)动物显示几乎完全保护免于缺血
性损伤,在24和48小时分别具有6.8和9.6mmol/L的值。该动物作为可能的异常值从组分析
中排除,其中可能不存在缺血性损伤。因此,图12所示的最终分析包括5只MASP-2(-/-)小鼠和6只WT(+/+)小鼠,和在24和48小时在MASP-2(-/-)小鼠中见到血液尿素统计显著降低
(Student t-检验p<0.05)。这些发现表明,MASP-2活性的抑制预期对由于缺血性损伤导致
的肾损伤具有保护或治疗作用。
Macugen药物(哌加他尼(pegaptanib)),一类新的特异性靶向并阻断血管内皮生长因子
(VEGF)作用的眼科药物,以治疗湿性(新生血管)形式的AMD(Ng等,NatRev.Drug Discov 5:
123-32(2006))。虽然Macugen药物对于AMD患者亚群代表了有前景的新的治疗选择,但对于这种复杂疾病仍迫切需要开发其他治疗。多个独立系列的调查暗示了补体活化在AMD发病
机制中的中心作用。最严重形式的AMD,脉络膜新生血管形成(CNV)的发病机制可涉及补体
途径激活。
1641-46,1998)。在该模型中,激光光凝用来破坏布鲁赫膜,该行为导致形成CNV样膜。激光诱导的模型包括人类病况的许多重要特征(最近的综述,参见Ambati等,Survey
Ophthalmology 48:257-293,2003)。激光诱导的小鼠模型现已确立,并且在一个大的且数
目不断增加的研究项目中被用作试验基础。普遍认为,激光诱导的模型与人类CNV享有足够的生物相似性,以致使用这种模型进行发病机制和药物抑制的临床前研究与人类CNV相关。
CNV是新生血管性AMD的加速模型,通过扫描激光共聚焦显微术集中于激光诱导的CNV的体
积作为组织损伤的量度,并通过ELISA测定激光损伤后视网膜色素上皮细胞(RPE)/脉络膜
中的VEGF水平,VEGF是CNV中涉及的强效血管生成因子,
具体方法和终点如下。
2.5%荧光素钠后,用与眼底照相机透镜接触的20-D透镜捕获照片。没有参与激光光凝或血管造影的视网膜专家以蒙面方式在单个位置评估了荧光素血管造影。
次达30分钟后,在4℃用含有0.2%BSA和0.1%的Triton X-100的PBS稀释的0.5%的FITC-
异凝集素B4(Vector laboratories,Burlingame,CA)孵育眼杯过夜,其结合内皮细胞表面
上的末端β-D-半乳糖残基并选择性标记鼠血管。经过两次用含有0.1%Triton X-100的PBS洗涤后,感觉神经视网膜被轻轻剥离,从视神经切断。产生四个松弛的放射状切口,其余
RPE-脉络膜巩膜复合物平展安放在防褪色介质中(Immu-Mount Vectashield Mounting
Medium;Vector Laboratories)并用盖玻片盖上。
在激光靶向区域和该基准面表面的任何血管判断为CNV。各切片的图像进行数字存储。CNV
相关荧光面积通过计算机化图像分析与显微镜软件(TCS SP;Leica)进行测量。各水平切片中整个荧光区域的总和被用作CNV体积指数。成像通过对治疗组分配掩盖的操作员执行。
遗传组,而裂区因子是眼睛。统计显著性以0.05的水平来确定。用Bonferroni调整构建Post hoc均值比较,以供多重比较。
(Emax;Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在450至570纳米(R&D Systems,Minneapolis,
MN)测定上清液中的VEGF蛋白水平,并标准化至总蛋白。以蒙面的方式,由不参与光凝、成像或血管造影的操作员执行重复测量。VEGF数字被表示为至少三个独立实验的平均值+/-SEM
并使用Mann Whitney U检验比较。零假设在P<0.05拒绝。
MASP-2(-/-)小鼠中基线水平的VEGF降低。图13B图示了激光诱导损伤后第三天测得的VEGF
蛋白水平。如图13B所示,激光诱导损伤后第三天,在野生型(+/+)小鼠中,VEGF水平显著增加,这与已发表的研究一致(Nozaki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:232833(2006))。然
而,在MASP-2(-/-)小鼠中,观察到VEGF的令人惊讶的非常低的水平。
积。如图14所示,相比于野生型对照小鼠,在激光诱导损伤后第7天MASP-2(-/-)小鼠的CNV区域显示减少约30%。
积)并发的凝血酶活化(评估为凝血酶沉积)。如从图15A和15B可看到,本系统中凝血酶活化由MASP-2阻断抗体(Fab2形式)抑制,表现出抑制浓度-反应曲线(图15B),这与对于补体活
化的抑制类似(图15A)。这些数据表明,凝集素途径的活化,当它发生在创伤中时,将导致在完全依赖于MASP-2的过程中补体和凝血系统两者活化。由此推断,MASP-2阻断抗体可证明
有效减轻过度的全身凝血例如弥散性血管内凝血的情况,弥散性血管内凝血是严重创伤病
例中导致死亡的标志之一。
确,在伤口修复中血小板物质和纤溶酶的释放可能仅次要涉及补体C3。在本实施例中,在
MASP-2(-/-)和WT(+/+)小鼠中分析凝集素途径的作用以解决以下问题:是否需要C3活化的
延长升高而产生弥散性血管内凝血。
对补体的依赖已经充分确立(Polak,L.等,Nature 223:738-739(1969);Fong J.S.等,JExp Med 134:642-655(1971))。在LSR模型中,提供TNFα给小鼠4小时(500ng,阴囊内),然后将小鼠麻醉,并准备用于提睾肌的活体显微术。选定具有良好血流量(1-4mm/s)的毛细血管后静脉(15-60μm直径)网络用于观察。动物用荧光抗体处理以选择性标记中性粒细胞或血小板。
依次扫描血管网络并数字记录所有血管图像供以后分析。记录微循环的基础状态后,小鼠
接受单次静脉内注射LPS(100μg),无论是单独还是与以下列出的药剂一起。然后每10分钟扫描同一血管网络达1小时。通过减去背景荧光而确定荧光团的具体累积,并通过使图像阈值化而增强。反应幅度根据记录的图像进行测定。Schwarztman反应的主要量度是聚集数
据。
天然肾在移植后5天从受体中除去,之后24小时通过测量血尿素氮(BUN)水平评价肾功能。
的正常BUN水平为<5mM),表明肾衰竭。相比之下,MASP-2(-/-)同基因移植受体小鼠显示显著更低的BUN水平,表明肾功能改善。注意,这些结果使用来自WT(+/+)肾供体的移植物获
得,表明在移植受体中仅缺少功能性凝集素途径足以实现治疗益处。
盲肠结扎和穿刺(CLP)模型是其中盲肠被结扎和被针穿刺的模型,导致细菌持续泄露至腹
腔,其通过淋巴引流到达血液,然后分布于所有腹部器官,导致多器官衰竭和感染性休克
(Eskandari等,J Immunol 148(9):2724-2730(1992))。CLP模型模拟患者中观察到的脓毒
症的过程和诱导早期过多炎性反应,之后是显著的低-炎性阶段。在该阶段,动物对细菌攻击高度敏感(Wichterman等,J.Surg.Res.29(2):189-201(1980))。
种到Mueller Hinton板中,之后在37℃在厌氧条件下孵育24小时,之后测量细菌载量。
数大约1000倍增加)。这些结果表明,MASP-2(-/-)缺陷小鼠抵抗感染性休克。在该模型中在MASP-2缺陷小鼠中降低的细菌清除率可能归因于C3b介导的吞噬作用受损,因为已经证实
C3沉积是MASP-2依赖性的。
况下允许这些动物存活。
性免疫反应和降低炎性介质的表达水平。因此,认为通过给予针对MASP-2的抑制性单克隆
抗体的MASP-2(-/-)的抑制将有效降低在患有感染性休克的受试者中的炎性反应。
中性粒细胞募集和显著的肺炎症,导致广泛的组织损伤(Palanki M.S.等,J.Med.Chem 51:
1546-1559(2008))。
然而,在C3(-/-)小鼠中除去经典(C1q)途径导致对细菌感染的严重易感性。这些结果证实,MASP-2抑制不增加对细菌感染的易感性,表明通过抑制MASP-2有可能减少在创伤患者中不
需要的炎性并发症,而不损害患者使用经典补体途径对抗感染的能力。
白基因序列来构建。如实施例10所述,通过ELISA筛选鉴定了大约250个单个噬菌体克隆,其以高亲和性与大鼠MASP-2蛋白结合。对这些克隆测序,鉴定了50个编码独特MASP-2抗体的
噬菌体。从这些克隆中表达Fab2蛋白,纯化并分析MASP-2结合亲和性和凝集素补体途径功
能性抑制。
上是明显的,其是MASP-2对C4裂解的直接度量。重要的是,当评价C3转化酶活性时,抑制同样明显,表明凝集素补体途径的功能性阻断。如实施例10所述鉴定的17个MASP-2封闭性
Fab2有效抑制C3转化酶形成,IC50等于或小于10nM。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50值的范围为纳摩尔以下。此外,如图8A-C所示和实施例10表6所概述,所有17个MASP-2阻断性
Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。此外,表6所示的17个阻断性抗-MASP-2 Fab2的每一个有效抑制C3b产生(>95%),因此证明了该测定法对凝集素
途径C3转化酶的特异性。
大鼠IgG2c和小鼠IgG2a两者全长抗体同种型的药效动力学参数。
0.3mg/kg或1.0mg/kg小鼠抗-MASP-2 MoAb(衍生自Fab2#11的小鼠IgG2a全长抗体同种型)
之后的不同时间点,离体测定C4沉积。
积。在给予抗体前采自小鼠的血清样品作为阴性对照(100%活性),在体外补充100nM所述
阻断性抗-MASP-2抗体的血清用作阳性对照(0%活性)。
C4b沉积的部分抑制。
了小鼠IgG2a同种型的全长抗-MASP-2抗体的药效动力学参数(如实施例19所述)。在该实施
例中,在年龄相关性黄斑变性(AMD)的小鼠模型中,分析源自Fab2#11的小鼠抗-MASP-2全长抗体,如Bora P.S.等,J Immunol 174:491-497(2005)所述。
图23中进一步示出,观察到0.3mg/kg剂量的抗-MASP-2 MoAb不能有效减少CNV。应该注意的是,0.3mg/kg剂量的抗-MASP-2 MoAb显示出部分和瞬时抑制皮下给药后的C4b沉积,如实施例19中描述并在图21示出的。
MASP-2(-/-)小鼠中进行的研究所观察到的结果一致,在实施例13中,相比于野生型对照小鼠,在激光处理后7天观察到MASP-2(-/-)小鼠的CNV减少30%。此外,本实施例结果进一步证明,全身性递送抗-MASP-2抗体提供眼睛的局部治疗益处,从而突出表明全身性给药途径治疗AMD患者的潜力。总之,这些结果提供了证据,支持在AMD的治疗中采用MASP-2 MoAb。
死亡率的主要原因。严重的并发症包括败血病、Waterhouse-Friderichsen综合征、肾上腺功能不全和弥散性血管内凝血(DIC)。参见例如,Rintala E等,Critical Care Medicine28(7):2373-2378(2000)。在本实施例中,在MASP-2(-/-)和WT(+/+)小鼠中分析凝集素途径的作用,以解决MASP-2缺陷小鼠是否对脑膜炎奈瑟菌诱导的死亡率敏感。
中的5x108cfu/100μl、2x108cfu/100μl或3x107cfu/100μl的剂量的脑膜炎奈瑟菌血清型A Z2491。在72小时时间段内监测感染后小鼠的存活。感染后以每小时的间隔自小鼠获取血液样品,分析以确定脑膜炎奈瑟菌的血清水平(log cfu/ml),以证实感染和确定细菌自血清
的清除率。
导的死亡率。
WT小鼠中在感染后24小时在血液中脑膜炎奈瑟菌的水平达到约6.5log cfu/ml的峰值,和
到感染后48小时下降到零。相比之下,在MASP-2 KO小鼠中,在感染后6小时脑膜炎奈瑟菌的水平达到约3.5log cfu/ml的峰值和到感染后36小时下降到零。
小时仍存活。与图24A所示的结果一致,这些结果还证实MASP-2缺陷小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟菌诱导的死亡率。
感染后24小时下降到零。图25C图示说明了在不同的时间点在取自用2x108cfu/100μl脑膜
炎奈瑟菌感染的MASP-2 KO小鼠的血液样品中回收的脑膜炎奈瑟菌的log cfu/ml。如图25C
中所示,在用2x108cfu感染的MASP-2 KO小鼠的血液中脑膜炎奈瑟菌的水平在感染后2小时
达到约3.5log cfu/ml的峰值和在感染后3小时下降到零。与图24B中显示的结果一致,这些结果证实尽管MASP-2 KO小鼠用与WT小鼠相同剂量的脑膜炎奈瑟菌感染,但MASP-2 KO小鼠
具有与WT相比提高的菌血症清除率。
DIC)的影响。此外,这些结果显示MASP-2抑制剂例如MASP-2 MoAb的治疗应用不会使受试者遭受脑膜炎奈瑟菌感染的风险增加。
表面补体受体1型的可溶性截短衍生物(CR1),并在MIRI的大鼠体内模型中评估其效果。用
sCR1治疗减少梗死体积超过40%(Weisman,H.F.等,Science 249:146-151(1990))。该重组
抑制剂的治疗潜力随后在临床试验中证实,显示给予MI患者sCR1在缺血后心脏中防止了收
缩失败(Shandelya,S.等,Circulation 87:536-546(1993))。但是还没有最终确定导致补
体在缺血组织中激活的主要机制,主要是由于缺乏合适的实验模型,对导致氧气剥夺细胞
中补体活化的分子过程了解有限,并且不同补体活化途径之间的交叉对话和协同作用。
经典途径识别亚组分C1q结合到各种靶标-最显著的是免疫复合物-以启动相关丝氨酸蛋白
酶C1r和C1s的逐步激活,为被适应性免疫系统衔接后的病原体和免疫复合物清除提供了主
要机制。C1q结合免疫复合物使C1r酶原二聚体转化成其活性形式以裂解并从而激活C1s。
C1s将Clq结合以两个裂解步骤转化成补体活化:它首先将C4转化成C4a和C4b,然后裂解C4b结合的C2,以形成C3转化酶C4b2a。这种复合物将丰富的血浆组分C3转化成C3a和C3b。与
C4b2a复合物紧邻的C3b积累将对C3的底物特异性转移至C5,以形成C5转化酶C4b2a(C3b)n。
通过经典途径激活产生的C3和C5转化酶复合物与通过凝集素途径激活路线生成的那些是
相同的。在替代途径中,组分C3的自发低水平水解导致蛋白质片段沉积到细胞表面,引发对外源细胞的补体活化,而宿主组织中的细胞相关调节蛋白避免激活,从而防止自破坏。如同替代途径,凝集素途径可能在缺乏免疫复合物时激活。活化通过多分子凝集素途径激活复
合物与病原体相关分子模式(PAMP)结合而启动,PAMP主要是细菌、真菌或病毒性病原体上
存在的碳水化合物结构或细胞凋亡、坏死、恶性或氧气剥夺细胞中的异常糖基化模式
(Collard,C.D.等,Am.J.Pathol.156:1549-1556(2000);Walport,M.J.,
N.Engl.J.Med.344:1058-1066(2001);Schwaeble,W.等,Immunobiology 205:455-466
(2002);和Fujita,T.,Nat.Rev.Immunol.2:346-353(2002))。
现的顺序编号(即,MASP-1、MASP-2和MASP-3)。在人中,凝集素途径激活复合物可与具有不同碳水化合物结合特异性的四个替代碳水化合物识别亚组分形成,即,MBL2和三种不同的
纤维胶凝蛋白家族成员,即L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白和M-纤维胶凝蛋白与MASP。在小鼠和大鼠血浆中,两种形式的MBL,MBL A和MBL C以及纤维胶凝蛋白-A与MASP形成凝集素激活途径复合物。我们先前克隆和表征了MASP-2和19kDa的额外的截短MASP-2基因产物,在人类、小鼠和大鼠中称为MAp19或sMAP(Thiel,S.等,Nature 386:506-510(1997);.Stover,C.M.等,J.Immunol.162:3481-3490(1999);Takahashi,M.等,Int.Immunol.11:859-863
(1999);和Stover,C.M.等,J.Immunol.163:6848-6859(1999))。MAp19/sMAP缺乏蛋白酶活
性,但可通过竞争MASP与碳水化合物识别复合物的结合而调节凝集素途径激活(Iwaki,D.
等,J.Immunol.177:8626-8632(2006))。
Thiel,S.等,J.Immunol.165:878-887(2000);Rossi,V.等,J.Biol.Chem.276:40880-40887
(2001))。最近描述的MASP-1和MASP-3缺陷的小鼠品系的表型突出表明了这个结论。除了在体外凝集素途径介导的补体活化的启动延迟外,MASP-1/3缺陷的小鼠保留凝集素途径的功
能活性。用重组MASP-1重构MASP-1-和MASP-3缺陷型血清克服了凝集素途径激活的这种延
迟,暗示MASP-1可促进MASP-2活化(Takahashi,M.等,J.Immunol.180:6132-6138(2008))。
最近的一项研究表明,需要MASP-1(以及可能还有MASP-3)将替代途径激活酶因子D自其酶
原形式转化成其酶促活性形式(Takahashi,M.等,J.Exp.Med.207:29-37(2010))。在MASP-
1/3缺陷小鼠的血浆中缺乏替代途径的功能活性突出表明了这一过程的生理重要性。
激活(Takahashi,K.等,Microbes Infect.4:773-784(2002))。在MASP-2缺陷型小鼠中没有
任何残余凝集素途径的功能活性,这提供了一个明确的模型以研究先天体液免疫的该效应
器分支在健康和疾病中的作用。
表明了该新的凝集素途径介导的C4旁路激活途径对缺血后组织损失的重要贡献,而在同一
个模型中测试的C4缺陷型小鼠没有显示保护作用。
性是由MASP-2缺乏的保护性表型建立的,在该模型中C4缺陷型动物未受到保护。
剪接产物)大量表达。
300ng/ml(范围260-330ng/ml),对于杂合小鼠为360ng/ml(范围330-395ng/ml),而在MASP-
2-/-小鼠中不可检测。使用qRT-PCR,建立mRNA表达谱,表明MASP-2-/-小鼠表达MBL A、MBL C、纤维胶凝蛋白A、MASP-1、MASP-3、C1q、C1rA、C1sA、因子B、因子D、C4和C3的mRNA,其丰度类似于其MASP-2足够的同窝小鼠(数据未示出)。
0.84mg/ml,+/-0.34)类似于WT对照的水平(平均0.92,+/-0.37)。
有N-乙酰葡糖胺的表面上的MASP-2-/-血浆中,凝集素途径依赖性的C4和C3裂解两者都不可检测,N-乙酰葡糖胺结合并经由MBL A、MBL C和纤维胶凝蛋白A而触发激活(数据未示出)。
2-/-血浆仍可通过经典(图26A)和替代途径(图26B)而激活补体。在图26A和26B中,符号“*”表示来自WT(MASP-2(+/+))的血清;符号“●”表示WT的血清(C1q耗尽);符号“□”表示MASP-
2(-/-)的血清;和符号“Δ”表示MASP-2(-/-)的血清(C1q耗尽)。
MASP-2缺陷型小鼠保留功能性替代途径:在仅允许替代途径激活(含有Mg2+和EGTA的缓冲
液)的条件下在酵母聚糖包被的微量滴定板上测定C3b沉积。图26A和图26B示出的结果是重
复的均值,并且代表三个独立实验。从始至终使用相同的符号表示血浆来源。这些结果表
明,功能性替代途径存在于MASP-2缺陷型小鼠,如在设计成直接触发替代途径的实验条件
下如图26B所示结果证明的,而使经典途径和凝集素途径均失活。
的影响。如图27A和图27B所示,在C4缺陷型小鼠及其WT同窝小鼠两者中观察到几乎相同的
梗塞面积。图27A图示了在C4-/-小鼠(n=6)和匹配的WT同窝对照(n=7)中,在LAD结扎和再灌注后MIRI诱导的组织损失。图27B图示了INF作为AAR的函数,清楚地表明C4-/-小鼠与其
WT对照(虚线)同样易受MIRI。
C3的残留凝集素途径的特异性激活。
具有残余经典或凝集素途径的功能活性,并且在排除替代途径作用的途径特异性测定条件
下监测C3活化。
到C3裂解(数据未示出),但当通过凝集素途径引发补体活化时,在C4缺陷的小鼠血浆中观
察到强烈的残留C3裂解活性。凝集素途径依赖性通过将C4缺陷的血浆稀释液与可溶性甘露
聚糖预孵育后C3裂解的竞争性抑制而证明(参见图28A)。如图28A-D所示,在不存在C4时观
察到C3的MASP-2依赖性激活。图28A图示了通过C4+/+(十字)和C4-/-(空心圆)小鼠血浆的
C3b沉积。在测定前将C4-/-血浆与过量的(1μg/ml)流体相甘露聚糖预孵育,完全抑制了C3沉积(实心圆)。结果代表3个独立实验。图28B图解说明了实验结果,其中野生型、MASP-2缺陷型(空心方块)和C4-/-小鼠血浆(1%)与不同浓度的抗-大鼠MASP-2mAbM11(横坐标)混
合,并在甘露聚糖包被的平板上测定C3b沉积。结果是4个测定(每种类型血浆中的2个的重
复)的均值(±SD)。图28C图示了实验结果,其中人血浆:合并的NHS(十字)、C4-/-血浆(空心圆)和与1μg/ml甘露聚糖预孵育的C4-/-血浆(实心圆)。结果代表三个独立实验。图28D图示了在C4-足够和C4缺陷的人血浆(1%)中通过抗-人MASP-2mAbH3(均值±一式三份的SD)抑
制C3b沉积。如图28B所示,在平行测定的MASP-2-/-血浆中没有检测到凝集素途径依赖性C3激活,暗示C3的该C4-旁路活化途径是MASP-2依赖性的。
酸残基,以防止抗原的自溶降解)的亲和力筛选,分离自噬菌体展示抗体文库。利用重组人和大鼠MASP-2A作为抗原(Chen,C.B.和Wallis,J.Biol.Chem.276:25894-25902(2001)),针
对MASP-2的重组抗体(AbH3和AbM11)从组合抗体文库(Knappik,A.等,J.Mol.Biol.296:57-
86(2000))中分离。在小鼠血浆中有效抑制凝集素途径介导的C4和C3激活的抗大鼠Fab2片
段(IC50~1nM)被转化为全长IgG2a抗体。多克隆抗鼠MASP-2A抗血清在大鼠中产生。这些工具使我们证实C3的这种新的凝集素途径特异性C4-旁路活化途径的MASP-2依赖性,如下面
进一步描述。
小鼠血浆的C3活化。所有测定均在高血浆稀释度下进行,使得替代途径激活路线功能障碍
(最高血浆浓度为1.25%)。
J.Immunol.173:2803-2814(2004))。图28C显示,该患者的血浆在高血浆稀释度下有效激活C3(使得替代激活途径功能障碍)。在甘露聚糖包被的平板中C3激活的凝集素途径特定模式
在鼠C4缺陷血浆(图28A)和人C4缺陷血浆(图28C)中通过加入过量浓度的流体相甘露聚糖
而证明。使用特异性结合人MASP-2和除去MASP-2功能活性的单克隆抗体AbH3,在人C4缺陷
血浆中评估了这种C3激活机制对MASP-2的依赖。如图28D所示,在C4-足够和C4-缺乏的人血浆两者中AbH3以相当效力抑制C3b(和C3dg)沉积。
MASP-2-/-、C4-/-和C1q-/-血浆(作为对照)。C3裂解的相对量针对使用WT血浆时沉积的C3
量作图。
MASP-2-/-小鼠(n=4)、MASP-1/3-/-小鼠(n=2)、C4-/-小鼠(n=8)、C4/MASP-1/3-/-小鼠(n=8)、Bf/C2-/-(n=2)和C1q-/-小鼠(n=2)的稀释血浆样品。用2.5μg/ml重组大鼠C2
(Bf/C2-/-+C2)重构Bf/C2-/-血浆恢复了C3b沉积。结果是均值(±SD)。**P<0.01(与WT血浆
相比)。如图29A所示,在凝集素途径特异性测定条件下而不是在经典途径特异性条件下测
试的C4-/-血浆中观察到显著C3沉积。再次,在MASP-2缺陷的血浆中没有观察到通过凝集素途径激活路线的C3沉积,而同样的血浆经由经典途径使C3沉积。在MASP-1/3-/-血浆中,C3沉积在凝集素和经典途径特异性测定条件下均发生。无论是使用凝集素途径还是经典途径
特异性条件,在C4和MASP-1/3组合缺乏时没有观察到血浆中C3沉积。在C2/Bf-/-血浆中没
有可检测的C3沉积,无论是通过凝集素途径还是通过经典途径。但是,用重组C2重构C2/
Bf-/-小鼠血浆恢复了凝集素途径和经典途径介导的C3裂解。使用C1q-/-血浆验证了测定
条件。
到C3裂解,但fB-/-血浆以与WT血浆相似的动力学裂解C3。在C4-/-以及在MASP-1/3缺乏的
血浆中,观察到C3经凝集素途径依赖性转化为C3b(和C3dg)的显著延迟。C3活化在MASP-1/
3-/-血浆中的这种延迟最近证明是MASP-1依赖性的,而不是MASP-3依赖性的(Takahashi,
M.等,J.Immunol.180:6132-6138(2008))。
体C3的先前未认识的C4-非依赖性的、但MASP-2依赖性的活化途径,并且表明C3可以在完全不存在C4时以凝集素途径依赖性模式被激活。尽管这种新的MASP-2依赖性C3转化酶的详细
分子组成和激活事件的顺序尚待阐明,但我们的结果暗示该C4-旁路激活途径还需要补体
C2以及MASP-1的存在。C4和MASP-1/3合并缺乏的小鼠血浆中凝集素途径介导的C3裂解活性
的损失可通过最近描述的MASP-1作用进行说明,该作用即通过直接裂解和活化MASP-2而提
高MASP-2依赖性补体活化(Takahashi,M.等,J.Immunol.180:6132-6138(2008))。同样地,
MASP-1可以通过其裂解C2的能力而有助于MASP-2功能活性(Moller-Kristensen等,
Int.Immunol.19:141-149(2007))。两种活性可以解释降低的速率,由此MASP-1/3缺陷的血浆经由凝集素激活途径裂解C3,并解释可能需要MASP-1经由C4-旁路激活途径来维持C3转
化的原因。
等,Glia 49:158-160(2005))和C3依赖性鼠肝再生模型(Clark,A.等,Mol.Immunol.45:
3125-3132(2008)))中凝集素途径的作用进行重新评估:C4缺乏特异性破坏经典补体活化
途径而凝集素途径通过MASP-2依赖性C4-旁路激活途径保留生理学临界水平的C3转化酶活
性。后一组证明,C4缺陷小鼠可以替代途径非依赖性的方式激活C3,由于在C4-/-小鼠中通过抗体介导的因子B功能活性耗尽而体内抑制替代途径并没有影响C3裂解依赖性肝再生
(Clark,A.等(2008))。在我们的MIRI模型以及在先前描述的肾同种异体移植物排斥模型中
(Lin,T.等,Am.J.Pathol.168:1241-1248(2006)),C3的这种凝集素途径介导的C4-旁路激
活途径还可以解释C4缺乏的保护性表型的缺乏。相比之下,我们最近的结果已独立地证明
在肾移植模型中MASP-2-/-小鼠的显著保护性表型(Farrar,C.A.等,Mol.Immunol.46:2832
(2009))。
链用箭头示出。如图30所示,C3与活化形式的人凝血因子XI和因子X,以及活化的牛凝血因子X孵育,可以在没有任何补体蛋白酶的情况下在体外裂解C3。
本实施例中描述的数据还表明,在全血清的生理情况下,凝集素途径可以激活凝血级联的
组分。因此证明存在涉及MASP-2的补体和凝血之间的交叉对话。
血管内溶血,其是补体的替代途径的活化不受调节的结果。Lindorfer,M.A.等,Blood 115
(11)(2010)。PNH中的贫血归因于血流中红细胞的破坏。PNH的症状包括红色尿,其归因于在尿液中出现血红蛋白和血栓形成。PNH可自身发生,称为"原发性PNH"或在其它骨髓病症例
如再生障碍性贫血的背景中发生,称为"继发性PNH"。PNH的治疗包括输血(对于贫血)、抗凝血(对于血栓形成)和使用单克隆抗体艾库组单抗(Soliris),其通过抑制补体系统保护血
细胞免于免疫破坏(Hillmen P.等,N.Engl.J.Med.350(6):552-9(2004))。然而,相当大一
部分的用艾库组单抗治疗的PNH患者具有临床上显著的免疫-介导的溶血性贫血,这是因为
所述抗体不阻断补体的替代途径的活化。
的红细胞的溶血的能力上的作用的方法,这两篇文献通过引用结合到本文中。如Lindorfer等所述,将来自PNH患者样品的红细胞离心,吸出血沉棕黄层和细胞用明胶佛罗拿缓冲液
(GVB)洗涤,然后进行各实验。按下测试红细胞对APC-介导的溶解的易感性。ABO-匹配的正常人血清用包含0.15mM CaCl2和0.5mM MgCl2的GVB(GVB+2)稀释和酸化至pH 6.4(酸化
NHS、aNHS)和用于重构红细胞为在50%aNHS中1.6%的血细胞比容。然后在37℃孵育混合
物,和在1小时后,通过离心使红细胞沉淀。等份的回收上清液的光密度在405nM测量和用于计算百分比溶解。在酸化血清-EDTA中重构的样品进行类似地处理和用于定义背景非补体-
介导的溶解(通常少于3%)。在蒸馏水中孵育红细胞后测定完全溶解(100%)。
疗法。
(混合性冷球蛋白血症)包含类风湿因子(RF),其通常为与多克隆IgG的Fc部分复合的IgM。
体的能力。尽管IgG免疫复合物通常激活补体的经典途径,但包含IgM的复合物还可通过凝
集素途径激活补体(Zhang,M.,等,Mol Immunol 44(1-3):103-110(2007)和Zhang.M.,等,
J.Immunol.177(7):4727-34(2006))。
(Ohsawa,I.,等,Clin Immunol101(1):59-66(2001))。这些结果表明凝集素途径可促进炎
症和冷球蛋白疾病中的不利结果。
107(1988)中所述,其通过引用结合到本文中。如Ng等所述,在特发性混合性冷球蛋白血症(EMC)中,单克隆类风湿因子(mRF),通常IgM,与多克隆IgG复合以形成特征性冷沉淀物免疫复合物(IC)(II型冷球蛋白)。免疫球蛋白和C3已经在受累组织例如皮肤、神经和肾的血管
壁中得到证实。如Ng等中所述,将125I-标记的mRF加入至血清(正常人血清和获自患有冷球蛋白血症的患者的血清),在37℃孵育和测量与红细胞的结合。
抗-C4测量。
者的疗法。
这导致红细胞的调理素作用(溶血),其触发它们通过网状细胞内皮系统清除。凝集发生的
温度在患者之间不同。
体)敏化。然后通过测量C3结合,测试红细胞激活凝集素途径的能力。
者的疗法。
散发性或家族性的。aHUS与编码补体活化的基因的突变有关,包括补体因子H、膜辅因子B和因子I,以及补体因子H-相关1(CFHR1)和补体因子H-相关3(CFHR3)。Zipfel,P.F.等,PloS
Genetics 3(3):e41(2007)。本实施例描述评价抗-MASP-2抗体对来自获自aHUS小鼠的血液
样品的红细胞溶解的作用的方法。
M.C.等,J.Exp.Med.204(6):1249-1256(2007),通过引用结合到本文中。如在Pickering等
中所述,这样的小鼠出现aHUS样病理。为了评价抗-MASP-2抗体用于治疗aHUS的作用,将抗-MASP-2抗体给予突变体aHUS小鼠,并比较获自抗-MASP-2ab治疗和未治疗的对照的红细胞
的溶解。考虑抗-MASP-2抗体已显示阻断凝集素途径活化的事实,预期抗-MASP-2抗体将有
效阻断在患有aHUS的哺乳动物受试者中红细胞的溶解。
5082(2010)。例如,人组织的组织病理研究和使用不同动物模型的体内研究已经证实,在青光眼视网膜中合成补体组分包括C1q和C3,并形成末端补体复合物(参见Stasi K.等,
Invest Ophthalmol Vis Sci 47:1024-1029(2006),Kuehn M.H.等,Exp Eye Res 83:620-
628(2006))。如在Kuehn M.H.等,Experimental Eye Research 87:89-95(2008)中进一步
描述的,补体合成和沉积由视网膜I/R诱导,和补体级联的破坏延迟RGC变性。在该研究中,当与正常动物相比,发现带有补体组分C3的靶向破坏的小鼠在暂时视网膜I/R后显示延迟
的RGC变性。
标记进行。
MASP-2敲除小鼠中进行该测定法和当在缺血损伤之前将抗-MASP-2抗体给予正常小鼠时,
将观察到类似结果。
毒症和相关的系统性炎性反应综合征,其可导致死亡。
的结果。假定凝集素途径在响应辐射诱导的组织损伤时可触发过度和有害的炎症。凝集素
途径的阻断因此可减少继发性损伤和增加在急性辐射暴露后的存活率。
MASP-2蛋白组分。剂量浓度为1mg/kg的抗-鼠MASP-2抗体(mAbM11)、5mg/kg的抗-人MASP-2
抗体(mAbH6)或无菌盐水。对于各给药期间,制备适当体积的新鲜给药溶液。
饲料(Animal Specialties,Inc.,Hubbard OR)和水。监测温度,动物饲养室以12小时光照/
12小时黑暗的光周期运行。
7.0Gy辐射小鼠。剂量水平根据用相同的小鼠品系进行的先前研究进行选择,表明LD50/30介于6.5和7.0Gy之间(数据未显示)。
mAbM11、5mg/kg mAbH6或盐水溶媒。
存活的动物以相同的方式处死和收集血液。根据方案,血浆从收集的血液样品制备和返回
到Sponsor用于分析。
均值。使用双尾非配对t-检验在对照辐射动物和各个治疗组之间进行统计学比较。
加)暴露水平上,辐射前用抗-鼠MASP-2ab(mAbM11)治疗增加辐射小鼠的存活率。与溶媒对
照辐射动物比较,在6.5Gy暴露水平,辐射后用抗-鼠MASP-2ab治疗导致存活率适度增加
(15%)。
(p=0.0087)。
变化(数据未显示)。在研究结束时,所有存活的动物显示自起始(第-1天)体重的体重增加。
或延迟死亡。对于在暴露水平之间的该响应差异,可能存在多个原因,尽管任何假设的验证可能需要另外的研究,包括中间样品采集用于微生物培养和血液学参数。一种解释可简单
为分配到各组的动物数可能已经使得不能见到任何细微的治疗-相关的差异。例如,对于n
=20的组大小,在65%(mAbH6,以6.5Gy暴露)和80%(mAbH6,以7.0Gy暴露)之间的存活率差异为3只动物。另一方面,在35%(溶媒对照,以7.0Gy暴露)和80%(mAbH6,以7.0Gy暴露)之间的差异为9只动物,并提供了治疗-相关差异的合理证据。
2.6x 107CFU剂量的脑膜炎奈瑟菌血清型A Z2491。将感染剂量联合终浓度400mg/kg的铁葡
聚糖给予小鼠。在72小时时间内监测感染后的小鼠存活。
量联合最终剂量为400mg/kg的铁葡聚糖给予小鼠。在72小时时间内监测感染后的小鼠存
活。对于WT和MASP-2 KO小鼠,在感染后72小时时间期间还根据下文描述于表10的疾病评分参数(其基于Fransen等(2010)的方案,略微改变),确定疾病评分。
毛略微皱起 1
毛皱起,迟缓和粘滞眼睛 2
毛皱起,昏睡和闭眼 3
重病和在刺激后不移动 4
死亡 5
时期间100%的MASP-2KO小鼠存活。相比之下,仅80%的WT小鼠(p=0.012)在感染后24小时仍存活,和仅50%的WT小鼠在感染后72小时仍存活。这些结果证实,MASP-2-缺陷小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟菌血清型A Z2491-诱导的死亡。
时期间90%的MASP-2 KO小鼠存活。相比之下,仅20%的WT小鼠(p=0.0022)在感染后24小
时仍存活。这些结果证实MASP-2-缺陷小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟菌血清型B品系MC58-
诱导的死亡。
品中回收的脑膜炎奈瑟菌血清型B品系MC58的log cfu/mL。结果表示为平均值±SEM。如图
35中所示,在感染后24小时在WT小鼠中在血液中脑膜炎奈瑟菌的水平达到大约6.0log
cfu/mL的峰值和到感染后36小时下降至大约4.0log cfu/mL。相比之下,在MASP-2 KO小鼠
中,在感染后12小时脑膜炎奈瑟菌的水平达到大约4.0log cfu/mL的峰值和到感染后36小
时下降至大约1.0log cfu/mL(符号"*"表示p<0.05;符号"**"表示p=0.0043)。这些结果证实尽管MASP-2 KO小鼠用与WT小鼠相同剂量的脑膜炎奈瑟菌血清型B品系MC58感染,但与WT
相比MASP-2KO小鼠具有提高的菌血症清除率。
抵抗,与WT小鼠相比低得多的疾病评分在感染后6小时(符号"*"表示p=0.0411)、12小时
(符号"**"表示p=0.0049)和24小时(符号"***"表示p=0.0049)。图36中的结果表示为平
均值±SEM。
IgG2a同种型的全长抗-MASP-2抗体用药效学参数表征(如实施例19中所述)。
种型抗体(n=10)治疗。
体后,小鼠的百分比存活率。如图37中所示,90%的用抗-MASP-2抗体治疗的小鼠在感染后整个72小时期间存活。相比之下,仅50%的用同种型对照抗体治疗的小鼠在感染后整个72
小时期间存活。符号"*"表示p=0.0301,如通过比较两个存活曲线测定的。
立即开始(即,在脑膜炎奈瑟菌作为病原体被鉴定阳性之前)。
MBL识别,已经证实MBL-缺乏的血清不溶解奈瑟菌。
进行实验以保护补体途径。
A 正常人血清(NHS)+人抗-MASP-2Ab
B NHS+同种型对照Ab
C MBL-/-人血清
D NHS
E 热灭活的(HI)NHS
J.Biol.Chem.276:25894-25902(2001))。在人血浆中强力抑制C4和C3的凝集素途径-介导
的活化(IC50~20nM)的抗人scFv片段被鉴定并转化为全长人IgG4抗体。
在以下时间点采集样品:0-、30-、60-和90-分钟间隔,倒平板(plated out),然后测定活菌计数。热灭活的人血清用作阴性对照。
AvsB -0.3678 是 ***(0.0002)
AvsC -1.1053 是 ***(p<0.0001)
AvsD -0.2111 是 **(0.0012)
CvsD 1.9 是 ***(p<0.0001)
A WT
B MASP-2-/-
C MBLA/C-/-
D WT热灭活的(HIS)
比,对脑膜炎奈瑟菌具有更高水平的杀菌活性。符号“**”表示p=0.0058,符号“***”表示p=0.001。表14提供图39的Student's t-检验结果。
径的未经调节的活化的结果,随后是血红蛋白尿和贫血。Lindorfer,M.A.,等人,Blood 115(11)(2010),Risitano,A.M,Mini-Reviews in Medicinal Chemistry,11:528-535(2011)。
PNH中的贫血是因为血流中的红细胞破坏所致。PNH的症状包括血尿(因尿中可见血红蛋
白)、背痛、疲劳、呼吸短促和血栓形成。PNH可以自发产生,称为“原发性PNH”或在其它骨髓病症例如再生障碍性贫血的情况下发生,称为“继发性PNH”。PNH的治疗包括针对贫血的输血,针对血栓形成的抗凝,和使用单克隆抗体艾库组单抗 该抗体保护血细胞免
于因抑制补体系统所致的免疫破坏(Hillmen P.等人,N.Engl.J.Med.350(6):552-9
(2004))。艾库组单抗 是人源化单克隆抗体,其靶向补体成分C5,封闭其被C5转
化酶裂解,从而阻止C5a的产生和MAC的装配。用艾库组单抗治疗PNH患者,在大约半数患者中导致血管内溶血减少(经乳酸脱氢酶(LDH)测定),导致血红蛋白稳定化和输血非依赖性
(Hillmen P,等人,Mini-Reviews in Medicinal Chemistry,vol 11(6)(2011))。尽管经历
艾库组单抗治疗的几乎所有患者都达到正常或几乎正常的LDH水平(因为控制了血管内溶
血),但仅有大约三分之一的患者的血红蛋白值达到高于11gr/dL,接受艾库组单抗的其余
患者以大约相同比例继续表现出中度至严重(即输血-依赖性的)贫血(Risitano A.M.等
人,Blood 113:4094-100(2009))。正如Risitano等人,Mini-Reviews in Medicinal
Chemistry 11:528-535(2011)所述,已经证明接受艾库组单抗的PNH患者含有与他们的大
部分PNH红细胞结合的C3片段(而未经治疗的患者则没有),得到以下结论:膜-结合的C3片
段作为调理素对PNH红细胞起作用,导致它们通过特异性C3受体而被俘获到网状内皮细胞
中并且随后导致血管外溶血。因此,对于发生C3-片段-介导的血管外溶血的那些患者,需要除了使用艾库组单抗之外的治疗策略,因为他们继续需要输入红细胞。
PNH的受试者的功效,并且还支持在经历C5抑制剂例如艾库组单抗治疗的PNH受试者中使用
MASP-2抑制剂以改善C3片段-介导的血管外溶血的作用。
自溶,如同PNH人红细胞那样。
涤3次。第3次洗涤后,将沉淀物重悬于4mL BBS/Mg2+/Ca2+中。将2mL等分试样的RBC留出,作为未包被对照。向剩余的2mL中加入2mL CrCl3和2mL甘露聚糖,并将样品在室温下孵育同时温和搅拌5分钟。通过加入7.5mL BBS/明胶/Mg2+/Ca2+而终止反应。将样品如上所述地离心,重悬于2mL BBS/明胶/Mg2+/Ca2+和如上所述地再洗涤2次,然后贮存于4℃。
冲液稀释至10/mL,然后采用100ul每孔。在410-414nm处(允许比541nm更高的灵敏度)测定
溶血。在冰冷的BBS/明胶/Mg2+/Ca2+中制备测试血清稀释液。将100μl每种血清稀释液移入圆底板中(参见板布置)。加入100μl适当稀释的RBC制备物(即108/mL)(参见板布置),在37℃孵育大约1小时,并观察溶血。(此时可对各板拍照)。然后将板在最大速率离心5分钟。吸出100μl液相,转移至平底板中,并在410-414nm处记录OD。保留RBC沉淀物(这些可以在随后用水溶解,以得到相反结果)。
3小时),但它们在无MBL血清中不溶解(数据未显示)。
解甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞,表明经典途径亦与所观察的溶解无关。因为需要
凝集素途径识别分子(即MBL),所以这种溶解由凝集素途径介导。
释度溶解甘露聚糖-包被的小鼠红细胞,而WT人血清在低至1/32稀释度溶解甘露聚糖-包被
的小鼠红细胞。
的小鼠红细胞(Crry/C3-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量,所述上清液按照光度测定
法测定)。
清;用人抗-MASP-2抗体预处理的NHS和热灭活的NHS作为对照。
41所示的,证明了抑制MASP-2抑制补体-介导的非-敏化的WT小鼠红细胞的溶解。
小鼠红细胞(CD55/59-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量,所述上清液按照光度测定法
测定)。
中改善(即抑制、阻止或降低其严重程度)血管外溶血。
结果。
率的影响。
(III:高)mAbH6(10mg/kg),辐射之前18小时和辐射之后2小时给予;和(IV:后高)mAbH6
(10mg/kg),仅辐射之后2小时给予。
有害作用的哺乳动物受试者。
Fischer’s exact)。如图44所示,在MASP-2-/-和WT小鼠中测定至LPS感染后微血管闭塞发作的时间,显示了经60分钟测定的具有血栓形成的WT小鼠的百分比,其中早在约15分钟时
检测到血栓形成。高达80%的WT小鼠在60分钟时出现血栓形成。相比之下,如图44所示,在
60分钟时,MASP-2-/-无一具有血栓形成(对数秩:P=0.0005)。
血液和血清分析表明,中性粒细胞增多,血小板减少,红细胞溶血,并且血清肌酐和血液尿素氮增加。此外,小鼠肾的组织学分析和电子显微术显示出肾小球纤维蛋白沉积,红细胞充血,微血栓形成,和肾小球超微结构改变。确定该HUS模型在C57BL/6小鼠中诱导人HUS病理学的所有临床症状,包括定义人类疾病的血小板减少,溶血性贫血,和肾衰竭。
(J.Immunol187(1):172-80(2011))。
MASP-2抗体mAbM11(每只小鼠100μg;对应于5mg/kg体重的终浓度)而预处理。对照组接受盐水,没有任何抗体。在i.p.注射抗-MASP-2抗体mAbM11后6小时,所有小鼠接受在150μl总体积中组合的i.p.注射亚致死剂量(3μg/动物;对应于150μg/kg体重)的粘质沙雷氏菌
(Serratia marcescens)LPS(L6136;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和4.5ng/动物剂量(相
当于225ng/kg)STX2(LD50剂量的2倍)。盐水注射被用于对照。
和血清肌酐水平。
42小时为止全部死亡。形成鲜明对比的是,100%的抗-MASP-2抗体治疗的小鼠在整个实验
的时间过程中存活。与图45所示结果一致的是,观察到所有死亡或因严重疾病迹象而必须
处死的未经处理小鼠具有显著肾小球损伤,而所有抗-MASP-2-抗体治疗的小鼠的肾小球看
起来正常(数据未显示)。这些结果表明,MASP-2抑制剂例如抗-MASP-2抗体可用于治疗患有或有风险发展血栓性微血管病(TMA)例如溶血性尿毒综合征(HUS)、非典型HUS(aHUS)或血
栓性血小板减少性紫癜(TTP)的受试者。
现严重的HUS,变得垂死或48小时内死亡。例如,如图54所示,用MASP-2抑制性抗体处理,然后暴露于STX和LPS的所有小鼠均存活(Fisher' exact P<0.01;N=5)。因此,在该HUS模型中,抗MASP-2疗法保护小鼠。
疗HUS、aHUS、TTP和具有其他病因的TMA的益处。
GmbH,Karlsruhe,Germany)和赛拉嗪(12.5mg/kg体重;Rompun,Bayer,Leverkusen,
Germany)而麻醉,并放置在加热垫上以保持体温在37℃。用盐水浸泡目镜(SW 40/0.75数值孔径,Zeiss,Jena,Germany)在直立显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)上进行活体内显微
术。为了缓解呼吸,小鼠采用PE 90管(Becton Dickson和Company,Sparks,MD,USA)插管。左颈动脉用PE10管(Becton Dickson和Company,Sparks,MD,USA)插管进行血液取样和系统性
单克隆抗体(mAb)给药。
Frommhold等,BMC Immunology 12:56-68,20112011所述,用热控制的(35℃碳酸氢盐缓冲
盐水)表面灌流提睾肌。
形成。作为光毒性试剂,将60μL 10%w/v FITC-葡聚糖溶液通过左颈动脉入口注入并使其均匀分布在整个循环血液10分钟。在选定良好灌注的小静脉后,将低到中范围强度(800-
1500)卤素光聚焦于目的血管以对内皮表面诱导FITC-葡聚糖荧光和轻度至中度光毒性,以
便以可再现的受控方式刺激血栓形成。使用卤素灯(12V,100W,Zeiss,Oberkochen,
Germany)产生激发FITC-葡聚糖必需的光毒性光强度。由荧光的光致激发而产生的光毒性
需要光强度阈值和/或照明持续时间,并且通过内皮表面直接加热或通过产生活性氧自由
基引起,如Steinbauer等,Langenbecks Arch Surg 385:290-298,2000所述。
机辅助微循环分析系统(CAMAS,Dr.Zeintl,Heidelberg)进行,并如Zeintl等,Int J
Microcirc Clin Exp,8(3):293-302,2000所述,测定红细胞速度。
的终浓度给予)或等量的同种型对照抗体(无MASP-2抑制活性)i.p.注射给予9周龄雄性
C57BL/6WT同窝小鼠。在诱导血栓形成前1小时,给予第二剂量的mAbH6或对照抗体。也在该模型中评价MASP-2敲除(KO)小鼠。
能活性的有效阻断。
分钟或更短时间内闭塞,而只有19%的经人MASP-2抗体(mAbH6)预处理的野生型小鼠在同
一时间内闭塞,并且在人MASP-2抗体处理组中的确最终闭塞的小鼠中至闭塞的时间延迟。
进一步注意的是,3只经MASP-2mAbH6处理的小鼠在60分钟观察期间内完全没有闭塞(即,被保护免于血栓闭塞)。
配对t检验;其中符号“*”表示p值=0.0129。如示于图47中,在采用低光强度(800-1500)的FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中,在闭塞的4只MASP-2抗体(mAbH6)
处理的小鼠中,与同种型对照抗体处理的小鼠相比,用MASP-2抗体处理显著增加了静脉闭
塞时间。同种型对照的完全闭塞时间平均为19.75分钟,而MASP-2抗体处理组的完全闭塞时间平均为32.5分钟。
的野生型小鼠,以分钟计的闭塞时间。仅闭塞的动物被包括在图48中;对于接受同种型对照抗体的野生型小鼠,n=2;对于MASP-2 KO,n=2;和对于接受人MASP-2抗体(mAbH6)的野生型小鼠,n=4。符号“*”表示P<0.01。如示于图48,在采用低光强度(800-1500)的FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中,MASP-2缺乏和MASP-2抑制(10mg/kg的
mAbH6)增加静脉闭塞时间。
多种微血管病症的标志。因此,预期在患有HUS、aHUS、TTP或其他微血管病症的患者中,给予MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体将是一种有效疗法,并提供保护而免于微血管凝血和
血栓形成。
通道Chrono-log Platelet Aggregometer Model 700 Whole Blood/Optical Lumi-
Aggregometer中测定。
人MASP-2抑制性抗体(mAbH6)抑制MASP-2增加了静脉闭塞时间,该结果并非由于mAbH6对血
小板功能的影响。因此,MASP-2抑制防止血栓形成,而不直接影响血小板功能,揭示出与现有抗血栓形成剂不同的治疗机制。
复合物、血小板活化和白细胞募集。该作用限制组织损伤。
(Thorlacius H等,Eur J Clin.Invest 30(9):804-10,2000;Agero等,Toxicon 50(5):
698-706,2007)。
注射,将mAbH6(2mg/kg、10mg/kg或20mg/kg)或同种型对照抗体(20mg/kg)给予各组小鼠。记录发生血栓形成的时间和完全血管阻塞的时间。在30-60分钟记录的活体显微镜检查图像
的视频再现分析用于评价血管大小、血流速度、光强度、发生血栓形成(相当于血小板粘附)的速度、发生血栓形成的时间、总血管阻塞速度和直到总血管阻塞的时间。使用SigmaPlot v12.0进行统计学分析。
性微血管病中,具有血栓的小鼠的百分比作为时间的函数。如图49中所示,相对于对照治疗的小鼠,在mAbH6-治疗的小鼠中以剂量-依赖性方式,血栓形成的开始被延迟。
学分析提供在表14和15中。
性微血管病中,具有微血管阻塞的小鼠的百分比,其为时间的函数。如图51中所示,与对照小鼠相比,在mAbH6治疗组中完全微血管阻塞被延迟。
2mg/kg mAbH6治疗组的38.6分钟(p<0.05)。10mg/kg或20mg/kg剂量的mAbH6与2mg/kg
mAbH6治疗组表现类似(完全微血管阻塞的中位数时间分别是40.3和38分钟)。基础实验数
据和统计学分析提供在表16和17中。
MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体,将是患有HUS、aHUS、TTP或其它微血管病性病症,例如其它TMA,包括灾难性抗磷脂综合征(CAPS)、系统性德戈斯病;和癌症、癌症化学疗法和移植继发性TMA的患者的有效疗法和提供保护免于微血管凝血和血栓形成。
导的替代补体途径活化有关的细胞损伤,同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分
完整。在一些实施方案中,本发明的MASP-2抑制性抗体具有以下特征:(a)对人MASP-2的高亲和力(例如,KD为10nM或更小);和(b)在90%人血清中抑制MASP-2-依赖性补体活性,其
IC50为30nM或更小。
1991;Kaufman,Methods in Enzymology,185:537-66(1991))。
杆菌。将人MASP-2A进一步亚克隆至哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo。
MASP-2A(上述Ser-Ala突变体)通过亲和色谱在MBP-A-琼脂糖柱上纯化。
HIS-标记的或生物素标记的MASP-2A的scFv噬菌体文库的三轮淘选。第三轮淘选先用MBL洗
脱,再用TEA(碱性)洗脱。为了监测噬菌体展示scFv片段对靶MASP-2A的特异性富集,进行了针对固定化MASP-2A的多克隆噬菌体ELISA。将来自3轮淘选的scFv基因克隆到pHOG表达载
体中并进行小规模过滤筛选,以寻找针对MASP-2A的特定克隆。
个菌落,半数来自竞争性洗脱,半数来自随后的TEA洗脱。淘选针对MASP-2A的scFv噬菌粒文库,接着scFv转化和过滤筛选,得到137个阳性克隆。108/137克隆在ELISA测定法中对MASP-
2结合呈阳性(数据未显示),其中进一步分析了其中的45个克隆在正常人血清中阻断MASP-
2活性的能力。
制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在
该测定法中当C3转化酶裂解C3时,C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔
底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键,从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头
形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的MASP-2scFv克隆抑制C3转化酶
形成和随后C3b产生的能力。
0.1%明胶,pH 7.4)中,以确保所有克隆都具有相同量的缓冲液。以一式三份,测定浓度为2μg/mL的每个scFv克隆。阳性对照是OMS100 Fab2并以0.4μg/mL测定。在有和没有scFv/IgG克隆存在时监测C3c形成。
将各板用200μl PBS洗涤3次,并贮存在冰上在200μl PBS中,直到加入样品。
应,并通过将各板移至冰浴而终止反应。用兔α-小鼠C3c抗体,接着是山羊α-兔HRP来检测C3b沉积。阴性对照是无抗体缓冲液(无抗体=最大C3b沉积),阳性对照是含EDTA的缓冲液
(无C3b沉积)。通过进行同样的测定法来检测背景,除了各孔中无甘露聚糖之外。将无甘露聚糖板的背景信号从含甘露聚糖的孔的信号中减去。截止标准设置为仅无关scFv克隆
(VZV)和缓冲液的活性的一半。
3,但有三个不同的重链亚类VH2、VH3和VH6。在功能测定法中,使用0.5%人血清,10个候选scFv克隆中有5个的IC50 nM值小于25nM目标标准。
性和/或功能性的scFv克隆。
GGIDYWGQGTLVTVSS
PFGVPFDIWGQGTMVTVSS
“OMS646”和“mAbH6”),这两者已证明以高亲和性与人MASP-2结合并具有阻断功能性补体活性的能力。结果表明OMS646和OMS100抗体对MASP-2是高特异性,而不与MASP-1/3结合。抗体既不与MAp19结合,也不与不含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段结合,得到以下结论:结合位点包含CCP1。
MASP-1 >500,000
MASP-2 62±23*
MASP-3 >500,000
纯化的人C1r >500,000
纯化的人C1s ~500,000
Comp300补体筛选试剂盒(Wieslab,Lund,Sweden)。
(OMS646)的情况下在经典途径-特异性测定条件下MAC沉积的水平。图53C图示说明了在存
在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在替代途径-特异性测定条件下MAC沉积的水
平。
5mg/kg OMS646的剂量水平。
天,OMS646达到5-6ug/mL的最大血浆浓度。以5mg/kg SC,OMS646的生物利用度为大约60%。
如图54中进一步显示的,以15mg/kg SC,给药后大约1-2天,OMS646达到10-12ug/mL的最大血浆浓度。对于所有组,OMS646从系统循环中被缓慢清除,具有大约8-10天的终末半寿期。
OMS646的概况对于人抗体在小鼠中是典型的。
(最大抑制;测定之前体外加入过量OMS646的幼稚小鼠血清)。如图55A中所示,在IV给予
5mg/kg的OMS646后,系统性凝集素途径活性立刻下降至接近不可检测的水平,和经过28天
的观察期凝集素途径活性显示仅适度恢复。如图55B中所示,在给予5mg/kg的OMS646 SC的
小鼠中,观察到凝集素途径活性的时间-依赖性抑制。凝集素途径活性在给予药物24小时内下降至接近不可检测的水平和保持在低水平至少7天。凝集素途径活性随时间逐渐增加,但在28天观察期内未恢复至给药前水平。给予15mg/kg SC后观察到的凝集素途径活性vs时间
曲线类似于5mg/kg SC剂量(数据未显示),表明PD终点的饱和。数据还表明,IV或SC给予的每周剂量5mg/kg的OMS646足以在小鼠中实现系统性凝集素途径活性的持续抑制。
胞(HMEC-1)的表面上aHUS血清诱导的补体C5b-9沉积。
(2)缓解期期间获得的血清后,在激活的HMEC-1细胞的表面上aHUS血清诱导的补体C5b-9沉
积。
行基因分型。一名aHUS患者具有杂合性p.R1210C补体因子H(CFH)突变和一名具有抗-CFH自
身抗体,在其它两名aHUS患者中未发现CFH的突变或抗体。
缓解期采集的或来自四名健康对照受试者的血清孵育4小时。在存在或不存在按上文实施
例40中所述产生的MASP-2抑制性抗体OMS646(100μg/mL)的情况下,或在存在可溶性补体受体1(sCR1)(150μg/mL)作为补体抑制的阳性对照的情况下,用测试培养基(含0.5%BSA的
HBSS)将血清按1:2稀释。在孵育步骤结束时,HMEC-1细胞用兔抗–人补体C5b-9处理,接着用FITC-缀合的第二抗体处理。在各实验中,来自一名健康对照的血清与aHUS患者血清(急性
期和缓解期)平行测试。共聚焦倒置激光显微镜用于获得内皮细胞表面上的荧光染色。获得
15个视野/样品,并且荧光染色占据的面积使用软件Image J的内置特定功能通过自动边缘
检测进行评价,表示为像素2/分析的视野。将显示最低和最高值的视野从计算中排除。
0.0001vs未治疗的aHUS急性期;^P<0.0001vs aHUS急性期+sCR1;§P<0.0001vs未治疗的
aHUS缓解期和#P<0.0001vs aHUS缓解期+sCR1。
聚焦显微镜测定的。通过测量C5b-9覆盖的面积,与在暴露于来自健康对照受试者的血清的细胞中相比,在暴露于来自aHUS患者的血清的细胞中观察到显著更高量的C5b-9沉积,不管aHUS血清在急性期还是在缓解期收集。在急性期和缓解期之间未观察到血清诱导的内皮
C5b-9沉积的差异。
比)如下:
示受限于与aHUS有关的任何特定的补体缺陷。如本实施例中进一步证实的,用MASP-2抑制
性抗体例如OMS646选择性抑制凝集素途径减少具有各种病因的aHUS患者中的补体沉积。
清诱导的血小板聚集和血栓形成。
Registry of HUS/TTP中和通过Laboratory of Immunology and Genetics of
Transplantation and Rare Diseases of the Mario Negri Institute进行基因分型。还
选择五名健康受试者作为血液供体用于灌注实验。
的MASP-2抑制性抗体OMS646(100μg/mL)的情况下,血清用试验培养基(含0.5%BSA的HBSS)按1:2稀释;或用sCR1(150μg/mL)作为补体抑制的阳性对照。对于患者#1和#2,另外的孔用包含100μg/mL的无关同种型对照抗体的试验培养基或用20μg/mL的OMS646按1:2稀释的血
清(来自急性期和缓解期)孵育(对于后者,病例#1仅测试缓解期和病例#2测试急性期和缓
解期两者)。
流动室。在三分钟灌注后,将内皮-细胞单层在丙酮中固定。通过共聚焦倒置激光显微镜获得内皮细胞表面上的每个血小板血栓样品15个图像,并且血栓占据的面积使用Image J软
件评价。将显示最低和最高值的视野从计算中排除。
24B和图57)。如图57和表24A中所示,OMS646(100μg/ml和20μg/ml)显示在预先暴露于取自急性期的aHUS血清的细胞中血栓形成的部分抑制。在两个不同剂量的OMS646之间抗-血栓
形成作用是相当的,并且与sCR1的作用没有不同(图57和表24A)。加入无关的同种型对照抗体对aHUS-血清诱导的血栓形成没有抑制作用。
作为100%)如下:
讶的是,将100μg/ml和20μg/ml剂量的OMS646加入取自缓解期的aHUS患者血清导致几乎完全抑制血栓形成。另一令人惊讶的发现是,观察到在急性期和缓解期,OMS646与阳性对照
sCR1一样有效,sCR1是补体系统的广泛和几乎完全抑制剂(Weisman H.等,Science 249:
146-151,1990;Lazar H.等,Circulation 100:1438-1442,1999)。
何特定理论的束缚,但认为对照诱导的血栓不依赖于补体,如通过在用对照血清孵育的
HMEC-1中观察到的极低的C5b-9沉积所支持的(参见实施例41)。
和显示于图56)。例如,如描述于Gastoldi等,Immunobiology 217:1129-1222 Abstract 48(2012),标题为“C5a/C5aR interaction mediates complement activation and
thrombosis on endothelial cells in atypical hemolytic uremic syndrome(aHUS)”,确定加入抑制C5b-9沉积(减少60%)的C5抗体限制在HMEC-1中的血栓形成至相当的程度
(减少60%)。相比之下,MASP-2抑制性抗体(OMS646,100μg/mL)抑制C5b-9沉积(平均值:急性期=减少40%;缓解期=减少54%);和以显著更高的百分比抑制血栓形成(急性期=减
少57%;缓解期=减少79%)。比较而言,OMS646以比阳性对照补体抑制剂(sCR1,150μg/mL,C5b-9沉积的急性期抑制=减少91%;缓解期=减少91%)更低的百分比抑制补体沉积,但
在抑制血栓形成中与sCR1阳性对照同等有效(sCR1,150μg/mL,急性期=减少60%;缓解期=减少85%)。这些结果证实,MASP-2抑制性抗体(例如,OMS646)令人惊讶地在获自急性期和缓解期的aHUS受试者的血清中有效抑制血栓形成。
补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物。在一个实施方案中,TMA选自溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)。在一个实施
方案中,TMA是aHUS。在一个实施方案中,在疾病的急性期将组合物给予aHUS患者。在一个实施方案中,在缓解期将组合物给予aHUS患者(即,在已从急性期aHUS的发作中恢复或部分恢复的受试者中,这样的减轻例如通过血小板计数增加和/或血清LDH浓度降低证明,例如描
述于Loirat C等,Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60,2011中,其通过引用结合到
本文中)。
抑制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中抗体基本上不抑制经典途径。
在一个实施方案中,抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制替代途径。
在一个实施方案中,抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径或
替代途径(即,抑制凝集素途径同时保留经典和替代补体途径完整)。
50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至99%。在一些实施方案中,MASP-2抑制性抗体在来自患有aHUS的受试者的血清
中以超过对血清中C5b-9沉积的抑制作用至少20%或更大(例如至少30%、至少40%、至少
50%)的水平抑制血栓形成。
积的抑制作用至少20%或更大(例如至少30%、至少40%、至少50%)的水平抑制血栓形成。
可变区,包含:i)包括SEQID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包括SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包括SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序
列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包括SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻
链CDR-L1;和ii)包括SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包括SEQ
ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;或(II)其变体,包括与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合
物,包括包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,所述参考抗体包括SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:
70所示的轻链可变区。结合成员之间的竞争可容易地体外测定,例如使用ELISA和/或通过
标记特定的报告分子至一个结合成员,其可在存在其它未标记的结合成员的情况下检出,
以能够鉴定结合相同表位或重叠表位的特定结合成员。因此,本发明提供包含人抗体抗原-结合位点的特异性抗体或其抗原结合片段,其与参考抗体OMS646竞争结合人MASP-2。
Nephron Clin Pract 114:c219-c235,2010;Goldberg R.J.等,Am JKidneyDis 56(6):
1168-1174,2010)。已经显示当体外暴露于来自TMA-相关病症的患者的血浆时,MVEC经过细胞凋亡损伤(参见Stefanescu等,Blood Vol 112(2):340-349,2008;Mitra D.等,Blood
89:1224-1234,1997)。与TMA有关的细胞凋亡损伤在获自这样的患者的组织活检(皮肤、骨、骨髓、脾、肾、回肠)的MVEC中证明。还显示对MVEC的细胞凋亡损伤降低MVEC的膜-结合补体调节蛋白的水平(参见例如,Mold&Morris,Immunology 102:359-364,2001;Christmas等,
Immunology 119:522,2006)。
2013)。
浆-介导的细胞凋亡诱导的能力。
340-349,2008中所述,其通过引用结合到本文中。用于本测定法的血浆样品获自一批健康
对照受试者和获自具有急性期或恢复期血栓性微血管病的个体。在TMA患者中微血管病的
存在通过在外周血涂片上检测裂红细胞来评价。另外,TTP按StefanescuR.等,Blood Vol
112(2):340-349,2008中所述诊断。
明胶的水包被的聚苯乙烯瓶中,将MVEC维持在包含内皮细胞生长添加剂、青霉素、链霉素和
15%胎牛血清的ECM1001培养基(ScienCell Research Labs)中。所有MVEC在第2-6代使用。
次代培养包括5-10分钟暴露于0.25%胰蛋白酶-EDTA。
板的各室中。将铺板的MVEC细胞在完全培养基中饥饿24小时,然后在存在或不存在MASP-
2mAb OMS646(150μg/mL)的情况下暴露于各种浓度(2%-20%v/v)的TMA患者血浆样品或健
康供体血浆18小时,然后通过胰蛋白酶消化收获细胞。各TMA患者样品一式两份分析。血浆-介导的细胞凋亡程度使用碘化丙啶(PI)染色评价,在细胞荧光图中分析>5x103个细胞和A0
峰通过计算机软件确定(MCycle Av,Phoenix Flow Systems,SanDiego,CA)。还根据制造商
的说明书(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany),进行基于酶联免疫吸附测定法
(ELISA)的来自细胞裂解物的胞质组蛋白相关DNA片段的定量测定。
显著的细胞凋亡。将来自健康人受试者的对照血浆样品平行运行,在MVEC中未诱导细胞凋
亡(数据未显示)。如表25中所示,在13份测试的患者血浆样品的6份中(46%),MASP-2抑制性mAb(OMS646)在原代MVEC中抑制TMA患者血浆-介导的细胞凋亡诱导(表25中的“应答
者”)。具体而言,应注意MASP-2抑制性mAb(OMS646)在获自患有aHUS、TTP、德戈斯病、SLE、移植和APLA(CAPS)的患者的血浆中抑制细胞凋亡。关于在该测定法中测试的其中MASP-2mAb
未阻断细胞凋亡的7份患者样品(表25中的“非应答者”),应注意细胞凋亡可通过数个途径诱导,并非所有的途径是补体依赖性的。例如,如在Stefanescu R.等,Blood Vol 112(2):
340-349,2008中所述的,在EC测定法中细胞凋亡依赖于基础EC活化状态,其受血浆因子的
影响,所述因子可在测定诱导细胞凋亡所需的损伤的水平中起作用。如在Stefanescu R.等中进一步描述的,能够调节细胞凋亡的其它因子可能存在于TMA患者血浆中,例如细胞因子和补体系统的各种组分。因此,因为这些复杂的因素,并非出人意料的是,MASP-2抗体未在显示TMA-血浆诱导的细胞凋亡的所有血浆样品中都显示阻断作用。
Meeting Abstracts):Abstract#3342,120:2012)。艾库组单抗(一种高度成功的市售产品)
的临床功效显示大于在该模型中证实的功效,表明该体外模型可能低估了补体抑制性药物
的临床潜力。
者的MVEC来源的肾肾小球细胞中观察到细胞凋亡的证据(Arends M.J.等,Hum Pathol20:
89,1989)。因此,预期给予MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体(例如,OMS646)将是患有
TMA例如aHUS、TTP或其它微血管病性病症(例如其它TMA,包括CAPS、系统性德戈斯病和癌症继发性TMA、化学疗法继发性TMA或移植继发性TMA)的患者的有效疗法。
给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物。在
一个实施方案中,TMA选自非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、血栓性血小板减少性紫癜
(TTP)和溶血性尿毒综合征(HUS)。在一个实施方案中,TMA是aHUS。在一个实施方案中,在疾病的急性期将组合物给予aHUS患者。在一个实施方案中,在缓解期将组合物给予aHUS患者
(即,在已从急性期aHUS发作中恢复或部分恢复的受试者中,这样的缓解通过例如,血小板计数增加和/或血清LDH浓度降低来证明,例如描述于Loirat C等,Orphanet Journal of
Rare Diseases 6:60,2011,其通过引用结合到本文中)。
合征(USS)。在一个实施方案中,所述受试者患有或有风险发生德戈斯病。在一个实施方案中,所述受试者患有或有风险发生灾难性抗磷脂综合征(CAPS)。
位;在体外测定法中在1%人血清中所述抗体抑制C3b沉积,IC50为10nM或更小;在90%人血清中所述抗体抑制C3b沉积,IC50为30nM或更小,其中抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段,其中抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包括S228P突变,和/或其中抗体基本上不抑制经典途径。在一个实施方案中,抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑
制替代途径。在一个实施方案中,抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑
制经典途径(即,抑制凝集素途径同时保留经典补体途径完整)。
自患有Upshaw-Schulman综合征(USS)的受试者的血清中,或在来自患有德戈斯病的受试者
的血清中,或在患有灾难性抗磷脂综合征(CAPS)的受试者中,MASP-2抑制性抗体抑制血浆
诱导的MVEC细胞凋亡,其中与未处理的血清相比,血浆诱导的MVEC细胞凋亡被抑制至少
5%、例如至少10%、例如至少20%、例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少
60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%直至
99%。在一些实施方案中,在来自患有TMA(例如aHUS(急性或缓解期)、溶血性尿毒综合征
(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、癌症继发性TMA、化学疗法继发性TMA、移植(例如,器官移植,例如肾移植或同种异体造血干细胞移植)继发性TMA的受试者的血清中,或在来
自患有Upshaw-Schulman综合征(USS)的受试者的血清中,或在来自患有德戈斯病的受试者
的血清中,或在患有灾难性抗磷脂综合征(CAPS)的受试者中,MASP-2抑制性抗体以超过对
血清中C5b-9沉积的抑制作用至少20%或更大(例如至少30%、至少40%、至少50%)的水平抑制血栓形成。
者的血清中,或在患有灾难性抗磷脂综合征(CAPS)的受试者中抑制血栓形成的方法,包括
给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物,包括(I)(a)重链
可变区,包含:i)包括SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包括SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包括SEQ ID NO:67的95-102的氨基酸序
列的重链CDR-H3;和b)轻链可变区,包含:i)包括SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻
链CDR-L1;和ii)包括SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包括SEQ
ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3;或(II)其变体,包括与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性(例如,至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
施方案中,方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合
物,包括包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
上的表位的至少一部分,所述参考抗体包括SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:
70所示的轻链可变区。
输注)的反应分类:
用MASP-2抑制剂治疗的血浆疗法抵抗性患者之前用血浆疗法治疗至少一次,和在这样的血
浆疗法治疗后仍具有通过这样的血浆疗法治疗未充分减少或消除的一种或多种aHUS临床
标记。
C1s、C1r和MASP-1的大于5,000倍选择性。在功能测定中,OMS646以纳摩尔效力(大约3nM的浓度,导致50%抑制[IC50])抑制人凝集素途径,但对经典途径没有显著影响。通过静脉内(IV)或皮下(SC)注射给予小鼠、非人灵长类和人的OMS646导致高的血浆浓度,其在离体试
验中与凝集素途径活化的抑制有关。如实施例42进一步描述的,OMS646治疗在TMA的体外模型中减少C5b-9沉积和血栓形成,和在TMA的小鼠模型中减少血栓形成,因此证实了OMS646
具有治疗功用。
白作为疾病活动的标记进行测量。当与基线水平比较时,血小板计数在所有患者中改进。血清LDH水平在一个患者中保持正常,在另一个中显著降低至接近正常范围和在第三个中保
持升高。结合珠蛋白在两个患者中改进,在一个中正常化。在一个具有独立肾功能的患者中肌酸酐水平也得到改进。
在研究招募之前和之时进行肾透析。在第二个或中等剂量组中,具有血浆疗法抵抗性aHUS
的两个患者证实:
要血浆疗法。
正常值,具有从基线大约68,000个血小板/mL的统计学显著的平均增加(p=0.0055)。
抑制性抗体的组合物。在一些实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含
MASP-2抑制性抗体的组合物之前,鉴定患有血浆疗法抵抗性aHUS的受试者的步骤。
位,所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积,所述抗体在
90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)
2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典补体途径完整)。
时发生。在一些实施方案中,在第一段时间和/或第二段时间的给予在存在血浆疗法时发
生。
其抗原结合片段包含(I)(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包
含SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序列的重链CDR-H3,和b)轻链可变区,其包含:i)包含
SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨
基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3,或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少
91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的轻链可变区。
氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
OMS646识别的表位的至少一部分,参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和
SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
的结果。
(HSCT)受体中发生。本实施例描述了在患有造血干细胞移植相关的TMA的患者中评价全人
单克隆MASP-2抑制性抗体的安全性和临床功效的2期临床试验的初始结果。
全性顾虑,允许在临床试验中慢性给药。
的MASP-2抑制性抗体的组合物。在一个实施方案中,所述受试者正患有与造血干细胞移植
相关的TMA,其抵抗用血小板输注和/或血浆去除术治疗。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体
的组合物的步骤之前,鉴定患有与造血干细胞移植相关的TMA的人受试者,其抵抗用血小板输注和/或血浆去除术治疗。
位,所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积,所述抗体在
90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)
2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中所述IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典补体途径完整)。
数的至少2倍、至少3倍、至少4倍)、结合珠蛋白增加和/或乳酸脱氢酶降低。
或两周),接着皮下给予MASP-2抑制性抗体至所述受试者,持续第二段时间(例如,至少两周或更长的慢性阶段)。在一些实施方案中,在第一段时间和/或第二段时间的给予在不存在
血浆疗法时发生。在一些实施方案中,在第一段时间和/或第二段时间的给予在存在血浆疗法时发生。
述抗体或其抗原结合片段包含(I)(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;
和iii)包含SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序列的重链CDR-H3,和b)轻链可变区,其包含:
i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-
56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链
CDR-L3,或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的轻链可变区。
氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
OMS646识别的表位的至少一部分,参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和
SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
外的结果。
关。根据各种诊断标准和调节以及移植物抗宿主病预防方案,同种异体HSCT后相关的TMA的发生在频率方面不同,其中钙依赖磷酸酶抑制剂是涉及的最常用的药物(Ho VT等,Biol
Blood Marrow Transplant,11(8):571-5,2005)。免疫抑制性钙依赖磷酸酶抑制剂方案的
更改可导致在减少或停止钙依赖磷酸酶抑制剂给予的几周内,在一些患者中TMA改善。
来控制。尽管许多HSCT-TMA患者对减少或停止免疫抑制剂的反应良好,但一部分患者具有
持续性HSCT-TMA,尽管保守治疗措施(即,TMA对减少或停止免疫抑制剂无反应)。对这些保守治疗措施无反应的患者具有差的预后。血浆交换未显示功效,和没有其它疗法被批准。
结果。本实施例描述了在患有抵抗保守治疗措施的持续性HSCT-TMA的三个另外的受试者中
评价OMS646的安全性和临床功效的正进行的2期临床试验的另外的结果。
两周或移植后至少30天,具有以下所有条件:
研究允许进入时具有显著升高的肌酸酐。
均变化。
效果,并在下文进一步描述。特别地,在三个响应者的每个中的治疗效果在用OMS646治疗大约三周后开始见到。
结合珠蛋白水平从不可检测的水平增加至高达250mg/dL。
进,但在该小数量的患者中未达到统计学显著性。在完成治疗的三个患者中,一个患者未显示肌酸酐改进,但正接受共存的肾毒性剂。在其他两个患者中肌酸酐改进或保持正常。
HSCT-TMA的患者中(尽管保守治疗措施)OMS646的治疗效果的临床证据。
的MASP-2抑制性抗体的组合物。在一个实施方案中,所述受试者正患有与造血干细胞移植
有关的持续性TMA,其抵抗保守治疗措施。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物的步
骤之前,鉴定患有抵抗保守治疗措施的与造血干细胞移植有关的持续性TMA的人受试者。
位,所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积,所述抗体在
90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)
2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中所述IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典补体途径完整)。
数的至少2倍、至少3倍、至少4倍)、结合珠蛋白增加和/或乳酸脱氢酶降低。
或两周或三周或四周或更长),接着皮下给予MASP-2抑制性抗体至所述受试者,持续第二段时间(例如,至少两周或更长的慢性阶段)。在一些实施方案中,在第一段时间和/或第二段时间的给予在不存在血浆疗法时发生。在一些实施方案中,在第一段时间和/或第二段时间的给予在存在血浆疗法时发生。
物,所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列
的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-
L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中,组合物包含MASP-2抑制性抗体,其包含(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序
列的重链CDR-H3,和b)轻链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3,或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的轻链可变区。
氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
OMS646识别的表位的至少一部分,参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和
SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物,所述抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ
ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链
可变区,剂量为1mg/kg-10mg/kg(即,1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg),至少每周一次(例如至少每周两次或至少每周三次),持续至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周的时间。
患者的免疫反应。急性GvHD在多达50%或更多的接受同种异体移植的患者中发生。急性
GvHD最常见靶向皮肤、胃肠道和肝脏,但也可影响肾、眼、肺和血细胞。慢性GvHD在大约40%的接受同种异体移植的患者中发生,和最常见影响皮肤、肝脏、眼、胃肠道和肺。急性和慢性GvHD二者均涉及明显的发病率和死亡率。
岁9/10HLA相容性(在基因座A的抗原错配)女性供体的外周血干细胞(PBSC)同种异体HSCT
移植。移植物抗宿主病(GVHD)的预防基于抗胸腺细胞球蛋白(ATG,5mg/kg)(在调节期间)、
环孢菌素A(CSA)和甲氨蝶呤的短期疗程(即,在第+1、+3、+6天的甲氨蝶呤(由于低CD34+而降低剂量))。他实现稳健的血液学重建(移植物移入:在第+15天WBC>1000/mmc,嗜中性粒细胞>500/mmc;在第+18天血小板>20000/mmc,在第+21天50000/mmc)。在第+30、+60、+90、+
180、+354天以完全供体(骨髓和外周血,CD3+和CD3-部分)观察到嵌合现象。在第+30、+60、+
90、+180天,完全缓解得到证实(免疫表型,分子MRD)。
变性溶血性贫血(6.7g/dL)、网状细胞增多(335 x 109/L)、LDH增加(1635U/L)和不可检测
的结合珠蛋白的特征。直接抗球蛋白检测是阴性的。在外周血涂片中(2-3/视野50x)观察到裂红细胞,以及不存在抗-B ab(主要不相容性患者/供体)、正常ADAMTS13活性、不存在抗-ADAMTS13 Ab、正常凝固测试和具有正常肌酸酐值的蛋白尿。他还在内窥镜检查中表现黑粪为证明的结肠性溃疡;组织病理学研究显示粘膜水肿、纤维化、扩张的小血管以及管腔内纤维蛋白沉积、腺萎缩和凋亡小体,没有微生物学发现。因此,尽管有证据表明持续性GI
GVHD,但临床和组织病理学图片也与结肠的移植相关的血栓性微血管病的诊断一致。因为
复发的GI GVHD,CSA逐渐减少,但不停止(谷水平100-150ng/mL),没有获得临床或血液学变化。
示,在前两次每周剂量的药物后,观察到临床和实验室反应,其中黑粪和溶血消退以及血小板计数升高。在4个剂量后,令人感兴趣的是,还证明了显著的神经学改进,具有感觉运动缺乏的临床和电生理学改进。在8个剂量的OMS646后,尽管CSA逐渐减少,但GvHD反应得到保
持,未观察到毒性。到移植后第+354天,该患者证实进一步的神经学改进和排尿缺乏开始恢复。该患者实现的快速临床益处提示,给予OMS646导致的补体介导的内皮损伤的有效抑制
可特别有效地用于治疗GVHD相关的TMA。
次输血。血液学标记证实具有血小板减少、乳糖脱氢酶(LDH)增加和裂红细胞的HSCT-TMA。
患者进入临床试验和开始接受OMS646。他的免疫抑制(环孢菌素)在初期2周被降低,和根据其类固醇难治性GvHD的历史,他仅接受低剂量皮质类固醇。他不接受其它GvHD治疗。在2个OMS646剂量后,他的血性腹泻消除和他的血液学标记改善。在4个OMS646剂量后,他能够行走。他完成8周的OMS646治疗,和在家表现良好。HSCT-TMA和GvHD的所有迹象和症状已经消除。他的神经学症状继续改进。OMS646治疗之前,该患者正在恶化,和有早期死亡的高风险。
用OMS646治疗后,观察到GvHD、HSCT-TMA和神经学症状改善,和患者在家表现良好。
活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物,从而治疗GVHD或降低GVHD的发生风险,或降低与
GVHD有关的一个或多个症状的严重性。在一个实施方案中,GVHD是活性的急性GVHD。在一个实施方案中,GVHD是慢性GVHD。在一个实施方案中,GVHD是类固醇抵抗性的(即,尽管类固醇治疗但仍持续)。在一个实施方案中,GVHD是胃肠(GI)GVHD。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在用MASP-2抑制性抗体治疗之前,确定在受试者中存在GVHD的步骤。
位,所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积,所述抗体在
90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)
2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中所述IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典补体途径完整)。
述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-
H1、CDR-H2和CDR-H3和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中,组合物包含MASP-2抑制性抗体,其包含(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含SEQ ID NO:67
的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序列的
重链CDR-H3,和b)轻链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3,或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少
90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的轻链可变区。
氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
OMS646识别的表位的至少一部分,参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和
SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区,剂量
为1mg/kg-10mg/kg(即,1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、
9mg/kg或10mg/kg),至少每周一次(例如至少每周两次或至少每周三次),持续至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周的时间。
1502,2011;Akil等,Biol Blood Marrow Transplant 21:1739-1745,2015;和Vion等,
Semin Thromb Hemost 41(06):629-643,2015,其各自通过引用结合到本文中)。
Ricart,Bone Marrow Transplant vol 46:1495-1502,2011,通过引用结合到本文中)。DAH的怀疑发病机制是隐性感染以及HSCT调节加上移入的嗜中性粒细胞导致的肺毛细管内皮
损伤,允许红细胞泄露至肺泡(E.Carreras和M.Diaz-Ricart,Bone Marrow Transplant
vol 46:1495-1502,2011)。静脉闭塞性病(VOD),亦称为窦状隙闭塞综合征(SOS),是可在造血干细胞移植(HSCT)患者中发生的另一种综合征。VOD的临床表现包括由于液体潴留导致
的显著体重增加、肝脏大小增加和血液中胆红素水平升高(参见E.Carreras和M.Diaz-
Ricart,Bone Marrow Transplant vol 46:1495-1502,2011,通过引用结合到本文中)。
她的血压增加。她需要ACE抑制剂、钙通道阻滞剂、β-阻滞剂、利尿剂和硝酸甘油用于BP控制。她经历癫痫发作和加入可乐定。脑MRI显示脑中的铁与来自她的RBC输注历史的继发性
血色素沉着病一致。血液透析在第231天开始。在第259天,由于持续的肾功能不全和肺状态恶化,她开始艾库组单抗治疗。她的TMA改善,但她发生急性肺水肿和艾库组单抗被中断。她的TMA恶化和在第269、276和278天她经历血浆交换,没有改善。她用去纤苷治疗,其由于凝血紊乱而中断和没有TMA改善。在大约第320天开始,她再次接受较低剂量的艾库组单抗。艾库组单抗再次由于肺水肿而停止。TMA持续。她还发生了艰难梭菌(C.difficile)感染。在第
379天她出院,接受了泼尼松、MMF、伏立康唑、复方增效磺胺(cotrimazole)、氨氯地平、红细胞生成素、熊去氧胆酸和奥美拉唑。
久,她的TMA消除,她的DAH消除,和她能够停止透析。随后她能够显著减少和随后停止血小板和RBC输注,同时保持稳定的或增加的血小板计数和血红蛋白值。这些结果在图62A-62E
中证实,如下:
染。他发生对保守措施无反应的TMA和具有共存在GvHD以及多种神经学并发症,和不能够行走。如实施例47所述,在OMS646治疗后,他的TMA和GvHD消除,和他的神经学并发症改善。他能够回到工作,和他的神经学状态持续改善。
OMS646的功效。
抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在给予所述受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑
制性抗体的组合物的步骤之前,鉴定患有与HSCT有关的弥漫性肺泡出血的人受试者。
位,所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积,所述抗体在
90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)
2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中所述IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典补体途径完整)。
MASP-2抑制性抗体可单独给予,或与C5抑制剂、例如艾库组单抗组合给予。
组合物,所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸
序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中,组合物包含MASP-2抑制性抗体,其包含(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含
SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-107的
氨基酸序列的重链CDR-H3,和b)轻链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和
iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3,或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的轻链可变区。
氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的轻链可变区。
OMS646识别的表位的至少一部分,参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和
SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
结合片段包含包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所
示的氨基酸序列的轻链可变区,剂量为1mg/kg-10mg/kg(即,1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg),至少每周一次(例如至少每周两次或至少每周三次),持续至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周的时间。
MASP-2抑制性抗体的组合物的步骤之前,鉴定患有与HSCT有关的静脉闭塞性病的人受试
者。
位,所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更小的IC50抑制C3b沉积,所述抗体在
90%人血清中以30nM或更小的IC50抑制C3b沉积,其中所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)
2和F(ab')2的抗体片段,其中所述抗体是单链分子,其中所述抗体是IgG2分子,其中所述抗体是IgG1分子,其中所述抗体是IgG4分子,其中所述IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中,所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和基本上不抑制经典途径(即,抑制凝集素途径,同时保留经典补体途径完整)。
合物,所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区,其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序
列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和轻链可变区,其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中,组合物包含MASP-2抑制性抗体,其包含(a)重链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列的重链CDR-H1;和ii)包含
SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列的重链CDR-H2;和iii)包含SEQ ID NO:67的95-107的
氨基酸序列的重链CDR-H3,和b)轻链可变区,其包含:i)包含SEQ ID NO:70的24-34的氨基酸序列的轻链CDR-L1;和ii)包含SEQ ID NO:70的50-56的氨基酸序列的轻链CDR-L2;和
iii)包含SEQ ID NO:70的89-97的氨基酸序列的轻链CDR-L3,或(II)其变体,包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如,与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:70具有至少90%同一性,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的轻链可变区。
包含包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示的氨基
酸序列的轻链可变区。
OMS646识别的表位的至少一部分,参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和
SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。
合片段包含包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:70所示
的氨基酸序列的轻链可变区,剂量为1mg/kg-10mg/kg(即,1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、
5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg),至少每周一次(例如至少每周两次或至少每周三次),持续至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周的时间。