使用热塑性硅石纳米材料进行尺寸选择纯化转让专利
申请号 : CN201880055915.9
文献号 : CN111278550A
文献日 : 2020-06-12
发明人 : K·J-F·刘 , J·D·基尔伯恩 , J·M·伯克
申请人 : 赛库乐米克斯公司
摘要 :
本公开涉及一种用于纯化含核酸的样品以获取分离的所需尺寸范围的核酸的方法，所述所需尺寸范围可以是大于尺寸截留值、小于尺寸截留值、或在限定的尺寸带内，所述方法包括：a)将含核酸的样品与结合缓冲液混合以提供结合混合物；b)使结合混合物与硅石纳米膜接触，其中该硅石纳米膜从结合混合物中吸附在所需尺寸范围内的核酸；以及c)从其余样品中分离结合的核酸。本文还提供了包括硅石纳米膜、结合缓冲液和一种或洗涤缓冲液的试剂盒。
权利要求 :
1.一种用于纯化含核酸的样品以获得分离的所需尺寸范围的核酸的方法，包括：a.将含核酸的样品与结合缓冲液混合以提供结合混合物；
b.使所述结合混合物与纳米膜接触，其中所述纳米膜结合所述结合混合物中的核酸；
c.在所述核酸与所述纳米膜结合之前、期间或之后，基于尺寸选择所述核酸；以及d.从其余样品中分离结合的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括在核酸结合后洗涤所述纳米膜以选择性地去除特定尺寸范围的核酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括选择性地结合特定尺寸范围的核酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括选择性地洗脱特定尺寸范围的结合的核酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括在步骤a之前沉淀特定尺寸的核酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括在核酸结合期间沉淀特定尺寸的核酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括在洗脱之后沉淀特定尺寸的核酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述所需尺寸范围的核酸结合至所述纳米膜。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述所需尺寸范围的核酸不结合至所述纳米膜。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述纳米膜包括硅石纳米膜，并且所述方法包括：a.使洗涤溶液与所述硅石纳米膜接触，以及b.除去与所述硅石纳米膜接触的洗涤溶液。
11.根据权利要求1所述的方法，其中核酸的所述所需尺寸范围包括大于截留值的所有尺寸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中核酸的所述所需尺寸范围包括小于截留值的所有尺寸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中核酸的所述所需尺寸范围是大于下限截留值和小于上限截留值的尺寸范围带。
14.根据权利要求1所述的方法，其中通过两个或更多个顺序的纯化步骤产生特定尺寸带的核酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括组合使用或顺序使用的两个或更多个尺寸选择步骤。
16.根据权利要求1所述的方法，其中从单个含核酸的样品中产生包含核酸尺寸大于截留值的第一洗脱物以及包含核酸尺寸小于截留值的第二洗脱物。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中蛋白质与所述核酸共纯化。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过至少一个结合条件确定选择性结合特定尺寸范围的核酸，其中所述至少一个结合条件选自由以下组成的组：a.pH，
b.盐的浓度，
c.存在或不存在离液盐，d.存在或不存在一价盐和/或二价盐，e.醇的类型和浓度，f.分子拥挤剂的浓度，g.分子拥挤剂的类型和分子量，h.结合时间，
i.结合期间的温度
j.存在或不存在变性剂，k.存在或不存在多胺，l.存在或不存在其他添加剂分子，m.缓冲液的体积，
n.结合期间管的运动，例如涡旋、离心、摇动、旋转，o.纳米膜的尺寸，
p.纳米膜的形状，
q.纳米膜的3D构型，r.纳米膜的数量，以及s.它们的组合。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过沉淀缓冲液的至少一个条件促进特定尺寸的沉淀，其中所述沉淀缓冲液的至少一个条件选自由以下组成的组：a.分子拥挤剂的浓度，b.分子拥挤剂的分子量，c.分子拥挤剂的类型，d.存在或不存在离液盐，e.存在或不存在一价盐和/或二价盐，f.盐的浓度和类型，g.醇的类型和浓度，h.存在或不存在多胺，i.存在或不存在变性剂，j.存在或不存在其他添加剂分子，k.pH，
l.沉淀/结合时间，m.沉淀/结合温度，n.沉淀/结合体积，o.离心时间，
p.离心温度，以及
q.它们的组合。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过洗涤缓冲液的至少一个条件确定在核酸结合之后洗涤所述纳米膜以选择性地去除特定尺寸范围的核酸，其中所述洗涤缓冲液的至少一个条件选自由以下组成的组：a.pH，
b.盐的浓度，
c.存在或不存在离液盐，d.存在或不存在一价盐和/或二价盐，e.醇的类型和浓度，f.分子拥挤剂的浓度，g.分子拥挤剂的种类，h.洗涤时间，
i.洗涤期间的温度
j.存在或不存在变性剂k.存在或不存在多胺，l.存在或不存在其他添加剂分子，m.缓冲液的体积，以及n.它们的组合。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过至少一个洗脱条件确定选择性地洗脱特定尺寸范围的核酸，其中所述至少一个洗脱条件选自由以下组成的组：a.pH，
b.盐的浓度，
c.存在或不存在离液盐，d.存在或不存在一价盐和/或二价盐，e.醇的类型和浓度，f.分子拥挤剂的浓度，g.分子拥挤剂的类型，h.洗脱时间，
i.洗脱期间的温度，j.存在或不存在变性剂，k.存在或不存在多胺，l.存在或不存在其他添加剂分子，m.洗脱体积，
n.洗脱期间管的运动，o.硅石纳米膜的尺寸，p.硅石纳米膜的形状，q.硅石纳米膜的3D构型，以及r.它们的组合。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米膜被选自由以下组成的组的一个或多个基团官能化：a.氨丙基，
b.氯丙基，
c.十八烷基，
d.辛基，
e.季铵基，
f.二乙氨基乙基，
g.磺酸基，
h.巯基，
i.硫醇基，
j.羧基，
k.羟基，
l.苯基，
m.醛基，
n.硅烷，
o.卤化物，
p.壳聚糖，
q.生物素，
r.链霉亲和素，
s.凝集素，
t.抗体，
u.蛋白质，
v.酶，
w.氨基酸，
x.寡核苷酸，
y.脂质，
z.聚乙二醇，
aa.葡聚糖，和
bb.聚合物。
23.一种用于纯化含核酸的样品以获得分离的所需尺寸范围的核酸的试剂盒，其包括纳米膜、结合缓冲液、和一种或多种洗涤缓冲液。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述结合缓冲液包含分子拥挤剂。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的试剂盒，其中所述一种或多种洗涤缓冲液包含异丙醇。
26.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述分子拥挤剂是聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
说明书 :
使用热塑性硅石纳米材料进行尺寸选择纯化
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年6月30日提交的美国临时专利申请第62/527,659号的权益，并依赖该申请的提交日期，其全部公开内容通过引用并入本文。
背景技术
[0003] 近年来，第三代测序技术彻底改变了我们对基因组的结构-功能和参考组装准确性的理解。Pacific Biosciences1(Menlo Park,CA)、Oxford Nanopore Technologies
Limited 2(Oxford,United Kingdom)、10X Genomics3(Pleasanton,CA)和BioNano
Genomics4(San Diego,CA)取得了变革性进展，这引起了人们对最高质量的高分子量(HMW)DNA以及有效处理它的新技术产生的新的需求。但是，用于处理和分析HMW DNA的绝大多数技术，例如脉冲的场凝胶电泳(PFGE)、沉淀和凝胶塞提取(gel plug extraction)以及透析纯化，最初是在分子生物学的初期发展的，并且非常缓慢且繁琐。
Limited 2(Oxford,United Kingdom)、10X Genomics3(Pleasanton,CA)和BioNano
Genomics4(San Diego,CA)取得了变革性进展，这引起了人们对最高质量的高分子量(HMW)DNA以及有效处理它的新技术产生的新的需求。但是，用于处理和分析HMW DNA的绝大多数技术，例如脉冲的场凝胶电泳(PFGE)、沉淀和凝胶塞提取(gel plug extraction)以及透析纯化，最初是在分子生物学的初期发展的，并且非常缓慢且繁琐。
[0004] 大多数长读段(long-read)测序技术的文库准备工作都遵循类似的工作流程。首先，必须分离HMW DNA(50kb-Mb+)。接下来，使用各种酶促步骤制备用于测序的DNA。在酶促加工期间，使用尺寸选择从所需的文库产品中除去较小的背景分子。这几乎完全由Beckman Coulter 磁珠完成。但是，由于磁珠的缠结， 对HMW DNA的回收
率较低(<25％)，倾向于失去最长、最期望的DNA分子。随着文库的增长和在需要多个
步骤的文库制备中，这个问题更加严重。此外，对于大多数的长读段文库而
言， (100bp-1000bp)的尺寸选择截留值太低。因此，通常使用PFGE仪器(例如
Sage Science的BLUEPIPPINTM(Beverly，MA))进行后续的尺寸选择，以通过仅分离最高分子量的文库产物来增强读段的长度。虽然BLUEPIPPINTM可以选择大尺寸的DNA(100bp-50kb)，但速度很慢(8.5小时)，并且在较长的PFGE过程中也会损坏DNA，因此后续需要进行酶促修复。所有尺寸选择步骤都必须在相对较高的浓度(>50ng/μl)下最佳地工作；随着所需的测序长度增加，DNA的质量浓度也必须增加以保持恒定的摩尔浓度。因此，对于100kbp至1Mbp范围内的读段，质量浓度需要是具有典型的Illumina测序的350-600bp的片段长度的相同摩尔浓度的样品的200-3000倍。高浓度会损害 和BLUEPIPPINTM两者的回收
率。
率较低(<25％)，倾向于失去最长、最期望的DNA分子。随着文库的增长和在需要多个
步骤的文库制备中，这个问题更加严重。此外，对于大多数的长读段文库而
言， (100bp-1000bp)的尺寸选择截留值太低。因此，通常使用PFGE仪器(例如
Sage Science的BLUEPIPPINTM(Beverly，MA))进行后续的尺寸选择，以通过仅分离最高分子量的文库产物来增强读段的长度。虽然BLUEPIPPINTM可以选择大尺寸的DNA(100bp-50kb)，但速度很慢(8.5小时)，并且在较长的PFGE过程中也会损坏DNA，因此后续需要进行酶促修复。所有尺寸选择步骤都必须在相对较高的浓度(>50ng/μl)下最佳地工作；随着所需的测序长度增加，DNA的质量浓度也必须增加以保持恒定的摩尔浓度。因此，对于100kbp至1Mbp范围内的读段，质量浓度需要是具有典型的Illumina测序的350-600bp的片段长度的相同摩尔浓度的样品的200-3000倍。高浓度会损害 和BLUEPIPPINTM两者的回收
率。
[0005] 因此，本领域仍然需要能够快速按尺寸选择小的和大的核酸分子的技术，这些技术不需要分开的 和PFGE纯化步骤，并且在加工过程中不会破坏核酸。
发明内容
[0006] 本公开涉及一种纯化含核酸的样品以获得所需尺寸范围的分离的核酸的方法，包括：a)将含核酸的样品与结合缓冲液混合以提供结合混合物；b)使所述结合混合物与纳米膜(例如，硅石纳米膜等)接触，其中所述纳米膜结合所述结合混合物中的核酸(例如，在所需尺寸范围内)；c)在将核酸与纳米膜结合之前、期间或之后，基于尺寸选择核酸；d)从其余样品中分离经结合的核酸。在一些实施方案中，蛋白质与核酸共纯化。
[0007] 在一些实施方案中，步骤c)包括在核酸结合后洗涤所述纳米膜以选择性地去除特定尺寸范围的核酸。在某些实施方案中，步骤c)包括选择性地结合特定尺寸范围的核酸。任选地，步骤c)包括选择性地洗脱特定尺寸范围的结合的核酸。在一些实施方案中，步骤c)包括在步骤a)之前沉淀特定尺寸的核酸。在一些实施方案中，步骤c)包括在核酸结合期间沉淀特定尺寸的核酸。在某些实施方案中，步骤c)包括在洗脱之后沉淀特定尺寸的核酸。任选地，步骤c)包括组合使用或顺序使用的两个或更多个尺寸选择步骤。
[0008] 在某些实施方案中，所需尺寸范围的核酸结合至所述纳米膜，而在其他实施方案中，所需尺寸范围的核酸不结合至所述纳米膜。典型地，所述纳米膜包括纳米膜，并且所述方法包括：a)使洗涤溶液与纳米膜接触，以及b)除去与所述纳米膜接触的洗涤溶液。
[0009] 在某些实施方案中，核酸的所需尺寸范围包括大于截留值的所有尺寸，而在其他实施方案中，核酸的所需尺寸范围包括小于截留值的所有尺寸。在一些实施方案中，核酸的所需尺寸范围是在大于下限截留值且小于上限截留值的尺寸范围带。任选地，通过两个或更多个顺序的纯化步骤产生特定尺寸带的核酸。在一些实施方案中，从单个含核酸的样品中产生包括核酸尺寸大于截留值的第一洗脱物，以及包含核酸尺寸小于截留值的第二洗脱物。
[0010] 典型地，所述方法包括通过至少一个结合条件确定选择性地结合特定尺寸范围的核酸，其中，所述至少一个结合条件选自由以下组成的组：
[0011] a.pH，
[0012] b.盐的浓度，
[0013] c.存在或不存在离液盐，
[0014] d.存在或不存在一价盐和/或二价盐，
[0015] e.醇的类型和浓度，
[0016] f.分子拥挤剂(crowder)的浓度，
[0017] g.分子拥挤剂的类型和分子量，
[0018] h.结合时间，
[0019] i.结合期间的温度
[0020] j.存在或不存在变性剂，
[0021] k.存在或不存在多胺，
[0022] l.存在或不存在其他添加剂分子，
[0023] m.缓冲液的体积，
[0024] n.结合期间管的运动，例如涡旋、离心、摇动、旋转，
[0025] o.纳米膜的尺寸，
[0026] p.纳米膜的形状，
[0027] q.纳米膜的3D构型，
[0028] r.纳米膜的数量，以及
[0029] s.它们的组合。
[0030] 在一些实施方案中，通过沉淀缓冲液的至少一个条件促进特定尺寸的沉淀，其中所述沉淀缓冲液的至少一个条件选自由以下组成的组：
[0031] a.分子拥挤剂的浓度，
[0032] b.分子拥挤剂的分子量，
[0033] c.分子拥挤剂的类型，
[0034] d.存在或不存在离液盐，
[0035] e.存在或不存在一价盐和/或二价盐，
[0036] f.盐的浓度和类型，
[0037] g.醇的类型和浓度，
[0038] h.存在或不存在多胺，
[0039] i.存在或不存在变性剂，
[0040] j.存在或不存在其他添加剂分子，
[0041] k.pH，
[0042] l.沉淀/结合时间，
[0043] m.沉淀/结合温度，
[0044] n.沉淀/结合体积，
[0045] o.离心时间，
[0046] p.离心温度，以及
[0047] q.它们的组合。
[0048] 在某些实施方案中，其中所述纳米膜被选自由以下组成的组的一个或多个基团官能化：
[0049] a.氨丙基，
[0050] b.氯丙基，
[0051] c.十八烷基，
[0052] d.辛基，
[0053] e.季铵基，
[0054] f.二乙氨基乙基，
[0055] g.磺酸基，
[0056] h.巯基(sulfhydryl)，
[0057] i.硫醇基(thiol group)，
[0058] j.羧基，
[0059] k.羟基，
[0060] l.苯基，
[0061] m.醛基，
[0062] n.硅烷，
[0063] o.卤化物，
[0064] p.壳聚糖，
[0065] q.生物素，
[0066] r.链霉亲和素，
[0067] s.凝集素，
[0068] t.抗体，
[0069] u.蛋白质，
[0070] v.酶，
[0071] w.氨基酸，
[0072] x.寡核苷酸，
[0073] y.脂质，
[0074] z.聚乙二醇，
[0075] aa.葡聚糖，和
[0076] bb.聚合物。
[0077] 本文还提供了一种用于纯化含核酸的样品以获得所需尺寸范围的分离的核酸的试剂盒，其包括纳米膜盘(disks)、结合缓冲液和一种或多种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，所述结合缓冲液包含分子拥挤剂(例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等)。在某些实施方案中，所述一种或多种洗涤缓冲液包括异丙醇。
附图说明
[0078] 图1A-1D：图1A示出了NANOBINDTM表面的扫描电子显微镜(SEM)图像，显示了微米级褶皱(folds)和纳米级硅石薄片的分层结构，其可以基于SiO2厚度进行微调(上图：20纳米(nm)SiO2，下图：150nm SiO2，左：低倍放大，右：高倍放大)。图1B示出了通过热收缩工艺制造磁性NANOBINDTM和NANOBINDTM盘，可以按比例缩放该热收缩工艺以降低成本。图1C示出了使用手动(上图)和自动(下图)平台的核酸提取方法。图1D示出了使用NANOBINDTM的核酸的结合、洗涤和洗脱，其与使用磁性颗粒和自旋柱的方案并行。处理通常只需15分钟。在详细描述中将进一步描述图1A-1D。
[0079] 图2示出了使用热塑性硅石纳米材料实现尺寸选择纯化的不同方法。“输入样品DNA”可以是任何典型的包含DNA的溶液，例如测序文库制备的结果。流程图中的“NANOBIND”表示此处定义的方法：1)-3)，得到结合了DNA的NANOBIND(结合的DNA的尺寸范围在文字
“Nanobind”后的括号中给出)和结合缓冲液，其可以包含额外的醇(结合缓冲液中的DNA的尺寸范围在文字“结合缓冲液”后的括号中给出)。洗涤步骤以文字“洗涤”表示，并同时标注有从NANOBIND洗涤掉的DNA的尺寸范围。结合至NANOBIND的DNA的尺寸范围以及后续洗脱的内容物显示在流程图的底部。
“Nanobind”后的括号中给出)和结合缓冲液，其可以包含额外的醇(结合缓冲液中的DNA的尺寸范围在文字“结合缓冲液”后的括号中给出)。洗涤步骤以文字“洗涤”表示，并同时标注有从NANOBIND洗涤掉的DNA的尺寸范围。结合至NANOBIND的DNA的尺寸范围以及后续洗脱的内容物显示在流程图的底部。
[0080] 图3示出了如实施例1所述的使用硅石纳米膜分离方法的双链DNA(dsDNA)的尺寸依赖性回收，其中所述硅石纳米膜分离方法采用在结合缓冲液中的不同异丙醇(IPA)浓度。
[0081] 图4A示出了如实施例2中所述的使用NANOBINDTM从高分子量(MW)基因组DNA(gDNA)(50kb-300kb)去除Cy5标记的单链寡核苷酸(长度为20个核苷酸)的有效性，与使用0.6X和IX 磁珠去除寡核苷酸相比。两种方法均有效地将寡核苷酸去除至不可检测的水平。图4B示出了如实施例2中所述的使用NANOBINDTM从高分子量(MW)基因组DNA(gDNA)(50kb-300kb)去除Cy5标记的双链寡核苷酸(长度为20个碱基对)的有效性，与使用0.6X和IX 磁珠去除寡核苷酸相比。两种方法均有效地将寡核苷酸去除至不可检测
的水平。图4C示出了通过QUBITTM定量测定法对DNA回收的定量，表明NANOBINDTM与
磁珠相比具有较高的回收率， 磁珠对高分子量DNA在所使用的
浓度为100ng/μl的情况下具有较低的回收率。参见实施例2。
的水平。图4C示出了通过QUBITTM定量测定法对DNA回收的定量，表明NANOBINDTM与
磁珠相比具有较高的回收率， 磁珠对高分子量DNA在所使用的
浓度为100ng/μl的情况下具有较低的回收率。参见实施例2。
[0082] 图5示出了如实施例3中所述的使用硅石纳米膜分离方法的双链DNA(dsDNA)的尺寸依赖性回收，所述硅石纳米膜分离方法采用相同结合条件，但是在洗涤步骤中采用不同的NaCl浓度。左泳道为输入样品，包含λDNA加100bp+ladder(100-3000bp)。随着洗涤缓冲液中NaCl含量的减少，分子截留值增加到更大的DNA。
[0083] 图6示出了如实施例4中所述的在pH＝9、10、11、12和13(从第2左泳道，从左至右)下进行的NANOBINDTM尺寸选择纯化的输入DNA(最左边的一个泳道)和回收的DNA(右边的多个泳道)。绿色条带显示用 Gold插入染料染色的λDNA和50bp的ladder。红色条带显示来自Alexa647标记的20个核苷酸(nt)的ssDNA寡核苷酸的荧光。NANOBINDTM尺寸选择纯化后，红色条带的强度显著降低，表明NANOBINDTM有效地去除了这些短的单链DNA寡聚物。在pH＝12和13下进行的纯化中不存在λDNA带，这表明纯化也有效地去除了较长的dsDNA。
[0084] 图7A示出了使用如本文所述的大核酸尺寸选择方法的如实施例5中所述的掺有1kb+ladder的λDNA的NANOBINDTM尺寸选择纯化。使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)驱动的沉淀法进行大核酸尺寸选择方法。PVP充当分子拥挤剂以按长度调节核酸沉淀。图7B示出了通过改变PVP浓度可在1000bp-10kb范围内调节的截留尺寸(定义为具有10％或更低的回收率的最高Mw带)。参见实施例5。
[0085] 图8示出了使用如实施例6中所述的NANOBINDTM尺寸选择纯化方法的dsDNA PCR产物的尺寸依赖性回收。
具体实施方式
[0086] 本公开涉及使用纳米膜例如NANOBINDTM从含核酸的样品中进行小尺寸和大尺寸核酸分子的快速尺寸选择的方法。纳米膜，例如NANOBINDTM，是新型的热塑性纳米材料，其可以廉价地制造，并且通常能够从含核酸的样品中提取比其他核酸结合基质更高质量的核酸。参见例如参考文献5，其通过引用将其全部内容并入本文。纳米膜的低剪切、无孔基材采用了新颖的触手结合机制，该机制将核酸(例如DNA)凝结到例如盘的表面上，并保护其免于片段化和其他损害，从而能够提取和/或纯化高质量、高MW的DNA。由于独特的基于凝结的结合机制，纳米膜的结合特性可以进行微调以赋予广泛的核酸尺寸选择能力。如本文所述，使用硅石纳米膜，例如NANOBINDTM，例如通过本文所述的单次的结合、洗涤和洗脱，本发明人能够高效地按尺寸选择小尺寸和大尺寸核酸，从而能够替代低效的 纯化和缓慢
的凝胶分离。
的凝胶分离。
[0087] 在研究和临床应用的推动下，下一代测序(NGS)经历了巨大的发展。第三代测序技术被用于对不断增加的植物、动物和微生物目录从头测序，并且同时不断完善人类参考基因组的质量。NGS还被用于更好地理解基础生物学，例如遗传多样性、宏基因组学(metagenoraics)和表观遗传学。但是，在不久的将来，临床检测如液体活检、无创产前检测和传染病检测的成熟可能成为主要驱动力。
[0088] 尺寸选择纯化是NGS文库制备不可或缺的一部分，其中某些制备需要多达10个纯化步骤，使用旋转柱、磁性颗粒和凝胶纯化的组合来纯化酶促反应系，并确保仅对正确制备的文库分子进行测序。通常，尺寸选择纯化首先用于从正确制备的文库分子中除去小分子，例如衔接子二聚体、寡核苷酸、酶和盐。在一些情况下，必须进行两次纯化以确保充分除去衔接子二聚体。通常使用第二尺寸选择步骤来进一步分离特定尺寸的文库分子。大量纯化步骤意味着高回收率是非常重要的。在短读段(short-read)NGS中，差的尺寸选择会阻止精确的比对和装配，尤其是在诸如mate pair测序的方法中。在长读段NGS中，过量的短DNA会损害平均读段长度并降低组装质量。
[0089] 目前没有一种技术可以满足上述所有尺寸选择的需求(表1)。Beckman Coutler磁性颗粒由于易于处理、可调节的截留值(100bp-1kb)和自动化能力而得到
广泛使用。旋转柱也可以使用，但截留值较低(150bp)且不可调节，从而限制了其应用。对于需要更高的截留值的NGS应用(例如长读段和mate pair测序)，凝胶纯化是唯一的方法，尽管它非常繁琐、缓慢且变化很大。使用纳米膜的尺寸选择是唯一能够提供磁性颗粒的速度与凝胶纯化的灵活尺寸筛选能力的技术，可解决NGS文库制备中多个纯化步骤的问题。
广泛使用。旋转柱也可以使用，但截留值较低(150bp)且不可调节，从而限制了其应用。对于需要更高的截留值的NGS应用(例如长读段和mate pair测序)，凝胶纯化是唯一的方法，尽管它非常繁琐、缓慢且变化很大。使用纳米膜的尺寸选择是唯一能够提供磁性颗粒的速度与凝胶纯化的灵活尺寸筛选能力的技术，可解决NGS文库制备中多个纯化步骤的问题。
[0090] 为了进一步说明，表1显示NANOBIND尺寸选择纯化方法消除了使用不同方法进行NGS文库纯化的需求。它的尺寸截留值是 颗粒的100倍，可与凝胶纯化媲美。它
去除的小分子是 的最高达20倍，从而无需进行顺序纯化。它对全部尺寸的DNA
文库具有较高的回收率，并且处理速度快。
去除的小分子是 的最高达20倍，从而无需进行顺序纯化。它对全部尺寸的DNA
文库具有较高的回收率，并且处理速度快。
[0091] 表1
[0092]
[0093] NANOBINDTM是一种与传统的柱和磁性颗粒相比具有许多优势的核酸样品制备技术。NANOBINDTM不是多孔膜或数百万个独立微粒，而是一种覆盖有高密度的微米结构和纳米结构的硅石的固态磁盘(直径1-5mm)。该盘是采用工业卷对卷(roll-to-roll)工艺由热收缩膜廉价地制造的，每个盘的成本为几美分。纳米结构的盘格式能够实现无与伦比的结合能力、DNA质量和纯度。单个盘可以结合10毫克以上的DNA，是同类柱和颗粒法的数百倍。盘格式还可以保护DNA免受损坏，从而能够从各种样品(包括细胞、细菌、血液和植物)中快速提取高分子量(MW)DNA。正是该唯一能够提取超高MW兆碱基DNA的固相技术具有足够的质量进行基因组作图。通过可使用常规仪器手动或自动执行的结合、洗涤和洗脱过程进行处理。
高的DNA质量在包括PacBio和Oxford Nanopore的平台上得到优越的测序数据。盘格式还通过更有效的洗涤和最小化的污染物残留消除了流体死体积(fluidic dead volume)，提高了纯度。此外，通过减小NANOBINDTM盘的尺寸和缓冲液的体积，可以有效地处理小至1μL和10个细胞的样品。这些特性使NANOBINDTM盘可以实现比任何磁性颗粒或旋转柱系统更广泛的尺寸选择能力、更高的产量和更高的纯度。
高的DNA质量在包括PacBio和Oxford Nanopore的平台上得到优越的测序数据。盘格式还通过更有效的洗涤和最小化的污染物残留消除了流体死体积(fluidic dead volume)，提高了纯度。此外，通过减小NANOBINDTM盘的尺寸和缓冲液的体积，可以有效地处理小至1μL和10个细胞的样品。这些特性使NANOBINDTM盘可以实现比任何磁性颗粒或旋转柱系统更广泛的尺寸选择能力、更高的产量和更高的纯度。
[0094] 如本文所述，为进行用诸如NANOBINDTM的纳米膜的DNA尺寸选择而采用的新颖触手结合机制，导致其性能与现有技术方法例如 或旋转柱的性能之间存在许多显著差异。结合到纳米膜上的核酸主要由沉淀力驱动。纳米膜充当沉淀种子，从而使得DNA凝结在NANOBINDTM盘的表面上。大多数DNA核酸分子与其他核酸分子结合，而不与盘本身结合。
一小部分核酸分子将其余的沉淀分子锚定到纳米膜上。该机制意味着可以调节沉淀条件，以使沉淀并随后结合的核酸与未结合的核酸之间的尺寸截留值可以改变为比采用
磁珠更高的分子量。这种方法对于NANOBINDTM来说是可行的，因为其微米结
构和纳米结构的表面可作为有效的用于DNA凝结的种子，并且可以作为使沉淀的DNA紧紧系紧并随后释放的无孔的系链(tether)。这种方法对于 磁珠是不可行的，因为
它会导致磁珠和DNA的不溶的DNA缠结，这里DNA不能被洗脱。这种方法对于旋转柱也是不可行的，因为沉淀的DNA会堵塞柱子。
一小部分核酸分子将其余的沉淀分子锚定到纳米膜上。该机制意味着可以调节沉淀条件，以使沉淀并随后结合的核酸与未结合的核酸之间的尺寸截留值可以改变为比采用
磁珠更高的分子量。这种方法对于NANOBINDTM来说是可行的，因为其微米结
构和纳米结构的表面可作为有效的用于DNA凝结的种子，并且可以作为使沉淀的DNA紧紧系紧并随后释放的无孔的系链(tether)。这种方法对于 磁珠是不可行的，因为
它会导致磁珠和DNA的不溶的DNA缠结，这里DNA不能被洗脱。这种方法对于旋转柱也是不可行的，因为沉淀的DNA会堵塞柱子。
[0095] 因此，使用纳米膜进行尺寸选择的截留值范围(100bp-100kb)是任何磁性颗粒或柱方法的100倍。使用纳米膜进行尺寸选择还可以使高分子量gDNA文库的回收率是磁性颗TM
粒和自动凝胶纯化的最高5倍，从而使试剂成本和样品输入量减少>50％。同时，NANOBIND具有更高的纯化率，且衔接子二聚体污染减少至1/19，从而减少了浪费的测序读段。最终，使用纳米膜进行尺寸选择的速度是凝胶纯化的8.5倍，以快速的<1小时的结合、洗涤和洗脱过程代替了缓慢的8.5小时的BluePippin纯化。
粒和自动凝胶纯化的最高5倍，从而使试剂成本和样品输入量减少>50％。同时，NANOBIND具有更高的纯化率，且衔接子二聚体污染减少至1/19，从而减少了浪费的测序读段。最终，使用纳米膜进行尺寸选择的速度是凝胶纯化的8.5倍，以快速的<1小时的结合、洗涤和洗脱过程代替了缓慢的8.5小时的BluePippin纯化。
[0096] 除了用于NGS文库制备之外，使用纳米膜进行尺寸选择的方法还可以用于PCR纯化、酶促反应系清洗(cleanup)或需要根据尺寸分离核酸分子的任何应用。
[0097] 如本文所述，使用诸如NANOBINDTM的纳米膜的小尺寸选择方法得到尺寸范围为10bp-30000bp的核酸的可调截留值。“小尺寸选择”方法可以除去低于截留值的小分子，例如dNTP、过量的引物、酶和反应副产物(如引物二聚体)，同时回收大于截留值的文库产物，包括高分子量DNA。与使用其他方法(例如使用 或旋转柱的方法)获得的核酸
的纯化率和回收率相比，可以获得高纯化率(>99.9％)，同时保持高MW DNA(例如50kb-1Mb+)的优异回收率(例如>90％)。
的纯化率和回收率相比，可以获得高纯化率(>99.9％)，同时保持高MW DNA(例如50kb-1Mb+)的优异回收率(例如>90％)。
[0098] 如本文所述，使用诸如NANOBINDTM的纳米膜的大尺寸选择方法得到尺寸范围为200bp-100kb的核酸的可调截留值。大尺寸选择方法可以用于除去低于截留值的核酸分子，例如，以获得用于增强的测序读段长度的测序文库。如下所述，分子拥挤可以用于通过用即时快速的结合、洗涤和洗脱过程代替缓慢且繁琐的PFGE分离，从而将不需要的短文库产物与所需的长文库产物分离，并加快文库制备。可以在例如200bp-100kb的范围快速地(例如，小于1小时的过程)实现高纯化率(例如>99％)，并且具有高分子量DNA(例如50kb-1Mb+)的高回收率(例如>90％)。相反，没有其他磁性颗粒或旋转柱技术能够在千碱基范围内进行尺寸选择。
[0099] 如本文所述，可以顺序地执行多个尺寸选择程序，使得能够选择DNA尺寸在最小值和最大值之间的带。例如，这可以是两个小尺寸选择的组合、两个大尺寸选择的组合、或小尺寸选择之后是大尺寸选择的组合、或大尺寸选择之后是小尺寸选择的组合。
[0100] 如本文所述，尺寸消除(size depletion)可以用于去除大于截留值的核酸。这是通过以下步骤实现的：首先使用纳米膜在样品上进行大尺寸或小尺寸选择，然后获取含有低于截留值的未结合核酸的结合缓冲液并进行第二次纳米膜纯化以回收该核酸。
[0101] 如本文所述，蛋白质可以与核酸共纯化。大多数纯化方法的目的是获取反应混合物，并且仅返回尺寸选择的核酸级分，同时去除所有其他试剂，包括但不限于酶、缓冲液和dNTP。如本文所述，在一些实施方案中，能够将核酸和蛋白质一起纯化的方法，使得例如可以在共纯化中从其余试剂中分离出核酸和酶两者。
[0102] 用于分离核酸的方法
[0103] 本公开描述了包括用于结合(例如，吸附)本文所述的核酸的例如硅石纳米膜的方法。如本文所用，术语“纳米膜”是指聚合物核上的硅石层、金属层或其他层的三维构型，其可以包含尺寸范围为数十纳米到数微米的结构，例如微米褶皱、纳米褶皱和薄片。术语“薄层”、“褶皱”、“褶层”、“薄片”，“碎片”等是用于描述这种结构在纳米膜表面上的外观的描述性术语。这些三维结构是由于聚合物核的热收缩引起的应力而产生的。参见，例如，图1A为硅石纳米膜形貌的实例。
[0104] 纳米膜可以包含另外的层或涂层以赋予另外的性质。例如，磁性层例如铁、镍或坡莫合金可以沉积在例如硅石层之下、之上或之间，以使得能够例如用磁体操纵纳米膜。
[0105] 纳米膜可以涂覆有硅石，并且被称为硅石纳米膜。本文所用的术语“硅石(silica)”是指硅的氧化物、二氧化硅和二氧化硅衍生物，例如SiO2晶体和其他形式的SiO2，例如由SiO2、沸石、无定形二氧化硅、玻璃粉、硅酸、水玻璃、石英、硼硅酸盐、以及硅酸铝和活性硅酸盐组成的硅藻类(diatoms)。纳米膜可以不包含实际的硅石，而是覆盖有诸如硅烷、硅醇官能化的葡聚糖、硅醇或硅氧烷的类硅石的聚合物或涂层，以实现相同的功能。
[0106] 另外，该表面可以被增强纳米膜的尺寸选择性结合和释放性能的其他基团官能化或涂覆。官能化可以包括但不限于氨丙基、氯丙基、十八烷基、辛基、季铵基、二乙氨基乙基、磺酸基、巯基、硫醇基、羧酸、羟基、胺基、醛基、苯基、硅烷、卤化物、壳聚糖、生物素、链霉亲和素、凝集素、抗体、蛋白质、酶、氨基酸、寡核苷酸、脂质、聚乙二醇、葡聚糖和其他聚合物分子。用例如胺基官能化表面可以用于通过改变DNA与纳米膜的结合方式来驱动尺寸选择。在低pH下，胺基带正电，并且因此会静电结合DNA分子。与较小的DNA分子相比，较大的DNA分子具有更多可能的与胺基的接触点，并且因此结合点也更多。因此，较大的DNA分子所经受的净结合力要比小分子的更大，这是由于胺官能团介导的pH依赖性。以这种方式，官能团可以用于改变纳米膜DNA纯化的尺寸选择特性。用氨基酸赖氨酸对硅石表面进行官能化已被证明是对DNA样品进行尺寸选择性纯化的有效方法6。一般而言，不同的官能团会改变DNA与纳米膜的结合方式，从而得到调节其尺寸选择特性的不同方式。
[0107] 如本文所用，术语“聚合物”是指能够热收缩的任何聚合物基材。在一些实施方案中，聚合物是热塑性聚合物。如本文所用，术语“热塑性”是指在大于特定温度时变得柔软或可模塑并且在冷却后返回固态的聚合物。热塑性塑料可以包括例如聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯(PS)、聚烯烃(PO)、环状聚烯烃(PO)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯、聚碳酸酯和聚酰胺聚合物等。
[0108] 如本文所用，术语“结合”是指接近纳米膜表面的(DNA)分子的可逆或不可逆固定。这可以包括但不限于吸附、物理吸附、化学吸附、静电吸引、共价键合和拓扑缠结。
[0109] 本公开的合适的纳米膜的实例包括NANOBINDTM硅石纳米膜(Circulomics Inc.,Baltimore,Maryland)。可以廉价地制造本公开的纳米膜，例如NANOBINDTM5。参考文献5在此通过引用将其全部内容并入本文。例如，可以通过二氧化硅沉积、热收缩和冲模来制造硅石纳米膜(图1B)。膜沉积成本低廉，并且通过使用类似于Mylar压片的工业卷对卷工艺容易缩
7
放，Mylar压片可以每天制造数百米的材料(数百万次提取)，每次提取的成本<0.01美元 。
在一些实施方案中，可以将纳米膜磁化以用于手动或自动处理(图1C)。可以通过本文所述的结合、洗涤和洗脱方案进行处理，该处理可以在短短15分钟内完成(图1D)。在一些实施方案中，可以将纳米膜冲压成盘或其他形状以促进加工。
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放，Mylar压片可以每天制造数百米的材料(数百万次提取)，每次提取的成本<0.01美元 。
在一些实施方案中，可以将纳米膜磁化以用于手动或自动处理(图1C)。可以通过本文所述的结合、洗涤和洗脱方案进行处理，该处理可以在短短15分钟内完成(图1D)。在一些实施方案中，可以将纳米膜冲压成盘或其他形状以促进加工。
[0110] 在某些实施方案中，诸如NANOBINDTM的纳米膜能够通过新颖的触手结合机制进行尺寸选择。参考文献5通过引用将其全部内容并入本文。不像其他技术中核酸以易于发生构象构的方式结合并散布在微粒上或整个多孔膜上，而NANOBINDTM的例如低剪切、无孔结构会将核酸凝结到盘表面，例如，以单个大分子复合体的形式，保护其免于片段化和其他损害，以产生如本文所述的高质量、高分子量的核酸。结合是由核酸凝结到盘上驱动的，例如，而核酸凝结到盘上又由无数包括溶解度、静电相互作用、盐桥和熵的分子力驱动8-10。正是这种独特的凝结驱动的结合机制使得尺寸选择纯化可以在比任何现有技术更广泛的核酸尺寸范围内进行。通过改变纯化缓冲液的条件，可以微调大的和小的DNA凝结并结合到纳米膜表面的倾向。还参见WO 2016/123101A1和US20150037802A1，其对包括NANOBINDTM的纳米膜的描述通过引用将其全部内容并入本文。参考文献8-10中的每个通过引用将其全部内容并入本文。
[0111] 尺寸截留值描述了这样一个阈值：小于该阈值将不能有效地回收核酸分子，而大于该阈值则可以有效地回收核酸分子。截留尺寸可以定义为核酸回收率介于低尺寸回收率和高尺寸回收率的极限表现之间的一半的核酸尺寸。例如，如果以0％的效率回收低分子量的核酸分子(例如10bp)，而以100％的效率回收高分子量的核酸分子(例如50kbp)，则截留尺寸是有50％的回收率的分子量。
[0112] 尺寸截留值也可以描述这样一个阈值：大于该阈值将不能有效地回收核酸分子，而小于该阈值则可以有效地回收核酸分子。截留尺寸可以定义为核酸回收率介于低尺寸回收率和高尺寸回收率的极限表现之间的一半的核酸的尺寸。例如，如果以100％的效率回收低分子量的核酸分子(例如10bp)，而以0％的效率回收高分子量的核酸分子(例如50kbp)，则截留尺寸为具有50％的回收率的分子量。
[0113] 如本文所用，术语“一种或多种核酸”或“一种或多种核酸分子”可互换使用，并且包括“一种或多种多核苷酸”和“一种或多种寡核苷酸”。该术语还包括DNA、RNA或cDNA的聚合物，其可以是单链或双链的，可以是合成的或从天然来源获得的(例如，分离和/或纯化的)，其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸间键，例如氨基磷酸键或硫代磷酸键，而不是未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。该术语还包括具有其他常见核酸修饰的核酸，所述核酸修饰包括，但不限于荧光团、猝灭剂、甲基化碱基。待处理的核酸可以描述为基因组DNA(gDNA)、线粒体DNA(mtDNA)、质粒DNA(pDNA)、无细胞DNA(cfDNA)、循环核酸、无细胞RNA(cfRNA)、microRNA、核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、非编码的RNA(ncRNA)。高分子量DNA是大的未片段化DNA，典型地长度大于20kb，通常长度为数百kb(最大至100kb、200kb、300kb、500kb等)，并且有时长度为Mb(最大至1Mb、2Mb、5Mb+等)。
[0114] 如本文所用，术语“所需尺寸范围”在涉及DNA尺寸使用时用于描述一组DNA尺寸，其是所描述的方案步骤的输入或整个尺寸选择过程中所包含的一小组DNA尺寸。作为实例，输入的DNA样品是包含的DNA长度为10bp-500,000bp的文库制备产品；在该样品中不存在短于10bp的DNA分子和长于500,000bp的DNA分子。所有其他尺寸均以相同的数字表示。在该实施例中，所需尺寸范围是截留尺寸大于300bp的所有DNA分子。因此，所需尺寸范围包括含有长度为300bp至500,000bp的DNA的一小组输入分子；不存在所需尺寸范围短于300bp的DNA分子和超过500,000bp的DNA分子。作为另一实例，以大于或小于该DNA尺寸的DNA的回收百分比来定义限值。使用与上述相同的输入样品：DNA长度为10bp至500,000bp，不存在短于10bp的DNA分子和超过500,000bp的DNA分子。所有其他尺寸均以相同的数字表示。所需尺寸范围包括使得长度大于300bp的DNA分子的平均回收率为90％、而长度短于300bp的DNA分子的平均回收率为10％的回收率。因此，较长的DNA分子被优先回收。
[0115] 含核酸的样品，例如含DNA的样品，包括不同尺寸(长度)的核酸，例如DNA分子。根据本发明的方法允许单链以及双链核酸的尺寸选择。通常，核酸分子是线性、双链DNA分子。含核酸的样品可以具有多种来源，包括生物样品和在核酸加工过程中获得的人工样品。生物样品可以包括体液，例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰、口腔拭子、头发、牙齿、骨骼、或其他临床样品如培养的细胞、组织和固定组织。在一些实施方案中，本方法用于从较大的gDNA中提纯含较小的cfDNA的体液样品。在一些实施方案中，本方法用于从细菌培养物例如大肠杆菌细菌培养物中的较大的gDNA中提纯小质粒DNA。在一些实施方案中，本方法可以用于纯化不同尺寸的质粒。在一些实施方案中，本方法可用于纯化尺寸不同的构建体，例如质粒、黏粒、F黏粒(fosmids)、酵母人工染色体和细菌人工染色体。根据一些实施方案，含核酸的样品是经提取的核酸样品或被进一步处理(例如通过剪切或通过酶促反应的方式)的经
提取的核酸样品。在一些实施方案中，核酸样品是测序文库制备物。在一些实施方案中，本方法用于纯化包含不同尺寸RNA种类的总RNA样品。在一些实施方案中，本方法用于从总RNA样品中分离小的RNA级分。在一些实施方案中，本方法用于从总RNA样品中分离较大的rRNA或mRNA。
提取的核酸样品。在一些实施方案中，核酸样品是测序文库制备物。在一些实施方案中，本方法用于纯化包含不同尺寸RNA种类的总RNA样品。在一些实施方案中，本方法用于从总RNA样品中分离小的RNA级分。在一些实施方案中，本方法用于从总RNA样品中分离较大的rRNA或mRNA。
[0116] 根据一些实施方案，含核酸的样品包含片段化的核酸，例如DNA，例如剪切的DNA。根据其他实施方案，含核酸的样品包含剪切的基因组DNA或剪切的cDNA。因此，根据一些实施方案，含核酸的样品是由尺寸剪切程序例如针剪切、声剪切、超声剪切、酶消化、流体动力剪切和转座酶介导的片段化产生的溶液。这种含核酸的样品包含不同尺寸的核酸片段。可能希望仅获得特定尺寸或尺寸范围的DNA。所述片段化的核酸可以被末端修复以提供具有平端(blunt end)的核酸片段。因此，根据一些实施方案，含核酸的样品包含不同尺寸的线性、平端的DNA片段。
[0117] 根据某些实施方案，在酶促反应后获得含核酸的样品。提供可以使用本公开的方法处理的含核酸的样品的示例性酶促反应包括，但不限于：聚合酶链反应、连接反应、损伤修复、末端修复、聚-A加尾、逆转录、核酸酶消化、转座、甲基化、转录、环介导的等温扩增、身体标记和末端标记。因此，根据一些实施方案，含核酸的样品是由扩增程序产生的溶液，并且包含扩增产物，例如PCR产物。根据某些实施方案，含核酸的样品是通过衔接子连接步骤获得的衔接子连接样品。在这种酶促反应中，可能希望从未使用的反应物、酶、反应副产物和反应缓冲液中提纯所需的酶促反应产物。酶促反应产物通常可以根据尺寸与反应副产物和未使用的反应物区分开。在一些实施方案中，从较小的PCR引物、dNTP和引物二聚体提纯较大的PCR扩增产物。在其他实施方案中，从较小的预连接输入(例如未连接的衔接子)提纯较大的连接产物，例如gDNA-衔接子。
[0118] 在一些实施方案中，酶促反应是用于测序的文库制备中的一系列步骤中的一个步骤。用于测序反应的典型文库制备包括衔接子连接。根据典型的实施方案，衔接子是经修饰的或未经修饰的核酸寡聚物。衔接子也可以与酶、其他蛋白质或其他非核酸分子(包括但不限于生物素)复合。衔接子可以是单链的，双链的，包含发夹，具有平端或具有悬在5'或3'末端的一个或多个核苷酸。可以将单链的衔接子连接至样品核酸的5'端、或3'端、或5'端和3'端。双链衔接子，包括带有发夹的那些，可以通过平端或粘性末端连接。
[0119] 根据某些实施方案，发夹衔接子可以利用聚合酶促进的引物延伸连接至样品DNA分子。
[0120] 根据某些实施方案，在测序文库的制备期间，特别是在第三代测序文库的制备期间，获得含核酸的样品。根据典型的实施方案，样品中的核酸分子具有连接在它们的5'末端、或3'末端、或3'和5'两个末端上的核酸衔接子(例如本文所定义)。因此，样品可以包括未连接的样品核酸分子、连接的样品核酸分子、未连接的衔接子、连接的衔接子二聚体、三聚体、和衔接子的其他组合，以及其他试剂，包括但不限于缓冲液种类和酶。根据本发明的方法能够对5'和/或3'端侧接衔接子的双链或单链核酸(例如DNA分子)进行尺寸选择纯化，从而有效地去除各个污染物。连接后，DNA分子通常比未连接的衔接子更长，因此可以根据尺寸进行纯化。
[0121] 根据某些实施方案，在消化未保护的核酸分子之后使用根据本发明的方法，以留下受保护的核酸分子。消化包括但不限于核酸外切酶lll、核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶VIII、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、T7核酸外切酶I。
[0122] 根据某些实施方案，在完成文库(最终文库分子)之后使用该方法以仅选择特定尺寸或尺寸范围的文库分子。在其他实施方案中，该方法用于核酸原料，使得仅将特定尺寸或尺寸范围的核酸分子输入到文库制备中。在其他实施方案中，在文库制备中的扩增步骤之后进行尺寸选择。在其他实施方案中，在文库制备期间在但不限于poly-A加尾、末端修复、核酸酶消化、损伤修复、衔接子连接和/或转座步骤之后进行尺寸选择。
[0123] 本文所使用的离液剂或盐是指在一级结构保持完整的同时改变或破坏蛋白质、核酸、和蛋白质-核酸复合物的二级结构、三级结构和/或四级结构的化合物。在溶液中，在离液条件下，由于离液化合物干扰稳定生物分子中的分子内相互作用(例如氢键、范德华力和疏水作用)，所以破坏了生物分子(例如蛋白质、蛋白质-核酸复合物、和核酸)的分子内相互作用。离液化合物通常具有大体积的离子，由于其尺寸，它们会干扰分子间相互作用并降低溶剂的极性，从而破坏分子间和分子内的氢键。因此，许多蛋白质沉淀出来；然而，双链核酸片段的螺旋结构得以维持。通过向反应溶液中添加离液化合物，可以沉淀蛋白质，而核酸仍保留在溶液中。在离液条件下，核酸与二氧化硅基基质的结合具有极大的优势。离液盐包括，例如，胍盐溶液(例如6mol/L，例如氯化胍)和高浓度锂盐(例如4.5mol/L高氯酸锂)。其他实例包括硫氰酸胍、异硫氰酸胍和碘化钠。
[0124] 本公开涉及一种用于分离所需尺寸范围的核酸的方法，该方法包括：a)将含核酸的样品与结合缓冲液混合以提供结合混合物，b)使所述结合混合物与纳米膜接触，其中所述纳米膜结合所述结合混合物中的具有特定尺寸的核酸，c)任选地用洗涤缓冲液洗涤结合的核酸和纳米膜，以进一步去除杂质或促进尺寸选择，以及d)从所述纳米膜分离或洗脱特定尺寸的结合的核酸。
[0125] 在一些实施方案中，通过至少一种结合条件促进获得所需核酸尺寸范围，其中至少一种结合条件选自：i)pH，ii)盐浓度，iii)存在或不存在离液盐，iv)存在或不存在一价盐和/或二价盐，v)醇的类型和浓度，vi)分子拥挤剂(crowder)的浓度，vii)分子拥挤剂的种类，viii)结合时间，ix)结合期间的温度，x)存在或不存在变性剂，xi)不存在其他分子种类，xii)缓冲液体积，xiii)结合期间管的运动，例如涡旋、离心、摇动、旋转，xiv)纳米膜的尺寸，xv)纳米膜的形状，xvi)纳米膜的3D构型，xvii)纳米膜的数量，及xviii)它们的组合。
[0126] 小尺寸选择
[0127] 通常，小尺寸选择纳米膜的核酸纯化遵循以下顺序：1)将包含待纯化的核酸和待去除的污染物的样品分装到例如微量离心管中；2)将结合缓冲液加入样品中，然后加入例如醇和纳米膜；混合这些成分；以及将该混合物孵育，在此期间核酸与纳米膜结合；3)从微量离心管中除去与醇或没有与醇混合的结合缓冲液，在管中留下结合至纳米膜上的核酸；4)向微量离心管中加入通常含有醇、水、缓冲剂和盐的洗涤缓冲液，并将管倒转5-10次；5)将洗涤缓冲液从管中去除；6)将洗脱缓冲液添加到管中，使纳米膜完全浸没；在该步骤中，核酸与纳米膜分离，并处于洗脱缓冲液的溶液中；7)将含有核酸的洗脱缓冲液转移到单独的管中，该管从而包含最终的纯化核酸。
[0128] 在一些实施方案中，本文描述的方案由自动机器人例如KingfisherTM
(ThermoFisher)或 和Maxprep (Promega)来执行。
(ThermoFisher)或 和Maxprep (Promega)来执行。
[0129] 结合至纳米膜
[0130] 在一些实施方案中，本方法涉及分离尺寸等于或大于截留值的核酸以获得所需尺寸范围的分离的核酸。在某些实施方案中，使用本发明方法获得的核酸的所需尺寸范围大于或等于截留值，该截留值可以在10个碱基对(bp)(对于双链核酸)或10个核苷酸(nt)(对于单核苷酸)至大于或等于约30000bp或30000nt变化，例如，>10bp(或nt)、>25bp(或nt)、>50bp(或nt)、>100bp(或nt)、>150bp(或nt)、>200bp(或nt)、>250bp(或nt)、>300bp(或nt)、>
350bp(或nt)、>400bp或(nt)、>500bp或(nt)、>600bp或(nt)、>700bp或(nt)、>800bp或(nt)、>900bp或(nt)、>1000bp或(nt)、>2500bp或(nt)、>3000bp或(nt)、>4000bp或(nt)、>5000bp或(nt)、>6000bp或(nt)、>7000bp或(nt)、>8000bp或(nt)、>9000bp或(nt)、>10000bp或(nt)、>20000bp或(nt)、>30000bp或(nt)(在本文中称为“小尺寸选择”)。
350bp(或nt)、>400bp或(nt)、>500bp或(nt)、>600bp或(nt)、>700bp或(nt)、>800bp或(nt)、>900bp或(nt)、>1000bp或(nt)、>2500bp或(nt)、>3000bp或(nt)、>4000bp或(nt)、>5000bp或(nt)、>6000bp或(nt)、>7000bp或(nt)、>8000bp或(nt)、>9000bp或(nt)、>10000bp或(nt)、>20000bp或(nt)、>30000bp或(nt)(在本文中称为“小尺寸选择”)。
[0131] 如本文所用，术语“结合条件”是指如本文所述的影响尺寸截留值的那些条件。结合条件会受到结合缓冲液的成分、结合时间、结合温度、纳米膜的尺寸、形状和构型等的影响。
[0132] 在某些实施方案中，可以将结合缓冲液设计为有助于降低尺寸截留值。在其他实施方案中，可以将结合缓冲液设计为有助于提高尺寸截留值。在某些实施方案中，可以通过选择性变性特定尺寸或范围的双链核酸来定制尺寸截留值。在一些实施方案中，这可以通过调节结合缓冲液以有利于双链核酸而非单链核酸的结合，然后通过选择性地使较短的核酸而非较长的核酸变性来实现。以这种方式，可以防止较短的核酸结合并可以将较短的核酸从样品中除去。在一些实施方案中，这可以通过调节结合缓冲液的pH来实现。例如，pH较高的碱性更强的溶液会破坏核酸的二级结构。在某些实施方案中，可以调节结合缓冲液的pH以改变双链和单链核酸的级分。单链和双链核酸具有以尺寸依赖的方式结合至纳米膜的不同倾向。因此，在一些实施方案中，改变pH改变了返回的核酸的截留值。在其他实施方案中，结合缓冲液的pH可用于影响纳米膜的表面电荷，使得相比双链核酸更偏好单链核酸，相比较长的核酸更偏好较短的核酸。在这些实施方案中，pH可以在5-13的范围变化，例如pH＝5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5或13。
[0133] 在其他实施方案中，可以将变性剂加入结合缓冲液中以选择性变性特定尺寸或范围的核酸。变性剂以尺寸依赖的方式破坏核酸二级结构；较短的核酸具有较低的解链温度，并且可以在较低的变性剂浓度下变性。因此，通过优先融化较短的核酸，结合截留值转移到较长的核酸长度。例如，浓度为0.1M-5M的甜菜碱可以用作变性剂。
[0134] 在某些实施方案中，可以通过选择性地调节特定尺寸或范围的核酸的溶解度来定制尺寸截留值。在一些实施方案中，这可以通过调节结合缓冲液的盐浓度来实现。这可以包括在结合缓冲液中存在或不存在离液盐、存在或不存在一价盐(例如氯化钠、氯化钾)和/或二价盐(例如氯化镁)。较高的离液盐、一价盐和二价盐的浓度会降低所有核酸的溶解度，并且可以降低尺寸截留值。离液盐如GuHCl的浓度可以为0.001M-8M。一价盐如NaCl的浓度可以在0.001M-6M变化。二价盐如MgCl2的浓度可以为0.01mM-1000mM。
[0135] 在某些实施方案中，可以通过调节结合缓冲液中醇的浓度来调节核酸的溶解度并因此调节尺寸截留值。合适的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。较高的醇浓度会降低核酸的溶解度，并可以降低尺寸截留值。醇的浓度可以在约0％至约99％变化，例如0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％。
[0136] 在某些实施方案中，DNA在不含醇的结合溶液中结合。
[0137] 在某些实施方案中，可以通过改变结合缓冲液的体积来调节核酸的溶解度并因此调整尺寸截留值。在结合条件下，较高的结合体积导致较低的核酸浓度。较短的核酸在较低的浓度下结合效果不如较长的核酸分子；因此，增加结合缓冲液的体积将结合截留值转移至较长的核酸分子。结合缓冲液的体积可以是输入样品体积的0.1倍至输入样品体积的10倍。核酸浓度可以在接近零浓度至最高500ng/μl变化。
[0138] 在某些实施方案中，可以通过添加不同浓度和/或组成的分子拥挤剂(包括但不限于聚乙二醇、Ficoll、BSA、线性丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮和糖原)来调节尺寸截留值。与没有拥挤剂的溶液相比，对于完全溶解在溶液中的分子，拥挤剂倾向于降低聚集或吸附分子的自由能。因此，拥挤剂驱动DNA与纳米膜的结合。众所周知，拥挤剂的作用是尺寸依赖的11，对与拥挤剂相似尺寸的分子的作用最大。拥挤剂因此改变了核酸分子的结合截留值。聚乙二醇的浓度可以在约0％至约40％变化。聚乙烯吡咯烷酮的浓度可以在约0％至约40％变化。Ficoil的浓度可以在约0％至约20％变化。线性丙烯酰胺和糖原可以在约0至约500ng/μl变化。BSA可以在约0至约10mg/ml变化。
[0139] 在某些实施方案中，多胺如精胺、亚精胺、尸胺或腐胺可以用于调节尺寸截留值。已知精胺和亚精胺以长度依赖的方式诱导核酸的沉淀12。因此，这些多胺可以用于调节沉淀以及与纳米膜的结合的尺寸依赖性。
[0140] 在某些实施方案中，表面活性剂可以用于以尺寸依赖的方式改变结合溶液的表面张力，从而改变核酸的溶解度。表面活性剂包括但不限于TWEEN 20、十二烷基硫酸钠、Triton-X100、Triton-X114、NP40、西曲溴铵、十二烷基三甲基溴化铵。全部可以在0％至
10％变化。因此，这些表面活性剂可以用于调节沉淀以及与纳米膜的结合的尺寸依赖性。
10％变化。因此，这些表面活性剂可以用于调节沉淀以及与纳米膜的结合的尺寸依赖性。
[0141] 在某些实施方案中，可以通过调节结合时间来调节尺寸截留值。较短的核酸分子需要更长的时间才能从溶液中出来并吸附到纳米膜上。因此，较长的结合时间将结合截留值转移到较短的核酸分子上。结合时间可以在1分钟到5天调节。
[0142] 在某些实施方案中，可以通过调节结合温度来调节尺寸截留值。较高的温度以尺寸依赖的方式融化核酸二级结构，较短的核酸比较长的核酸在较低的温度融化。因此，通过优先融化较短的核酸，结合截留值转移到较长的核酸长度。在其他实施方案中，温度可以用于选择性地调节特定尺寸或范围的核酸的溶解度。结合温度可以在约-20℃至约70℃调节。
[0143] 在某些实施方案中，结合条件包括结合期间的运动，包括但不限于涡旋、摇动、倒转、离心、旋转、敲击。为了结合至纳米膜，DNA必须足够接近纳米膜的表面以遇到本文所述的吸引力。由于较大的DNA分子的每个分子扫过的溶液更多，因此与较小的DNA分子相比，它们遇到纳米膜的可能性更大。这可以通过使用诸如更快地摇动或涡旋的运动来改变，使得纳米膜在溶液中更快地运动，从而增加其遇到短的DNA分子并与其结合的可能性，但不会显著改变较大的DNA分子的高结合概率。
[0144] 在某些实施方案中，结合条件包括纳米膜的尺寸、形状和构型。所使用的形状包括但不限于圆形、正方形、星形、新月形、环形。构型包括但不限于管、球、立方体和皱缩的。纳米膜的不同构型可用于改变流体流过表面的方式。例如，皱缩的构型会减少预期的流过表面不直接面向溶液的部分的流量。由于较小的DNA分子在流过纳米膜表面的流量低时不太可能遇到纳米膜表面，因此它们不太可能结合到皱缩的纳米膜上。
[0145] 在某些实施方案中，结合条件包括纳米膜的数量。纳米膜的数量可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、10000、100000、1×106、1×
107、1×108、1×109。为了与纳米膜结合，DNA必须足够靠近纳米膜表面以遇到本文所述的吸引力。由于较大的DNA分子的每个分子扫过的溶液更多，因此与较小的DNA分子相比，它们遇到纳米膜的可能性更大。这可以通过增加纳米膜的数量来改变，因为这会增加短的DNA分子的遇到概率并结合，但不会显著改变较大的DNA分子的高结合概率。
107、1×108、1×109。为了与纳米膜结合，DNA必须足够靠近纳米膜表面以遇到本文所述的吸引力。由于较大的DNA分子的每个分子扫过的溶液更多，因此与较小的DNA分子相比，它们遇到纳米膜的可能性更大。这可以通过增加纳米膜的数量来改变，因为这会增加短的DNA分子的遇到概率并结合，但不会显著改变较大的DNA分子的高结合概率。
[0146] 本文所述的前述条件的任何组合可以用于改变本方法的尺寸选择参数。
[0147] 在某些实施方案中，选择结合缓冲液，使得核酸和蛋白质都结合至纳米膜，并且因此可以从样品的其余部分中共纯化。在其他实施方案中，选择结合缓冲液以使得与样品中的核酸结合的蛋白质不会被破坏，并且可以通过使核酸与纳米膜结合而被共纯化。
[0148] 洗涤和洗脱
[0149] 在一些实施方案中，洗涤根据小尺寸选择方法结合的核酸。在此，可以执行一个或多个洗涤步骤。通常，执行该步骤以有效地去除未结合的组分和杂质，例如来自先前反应的核苷酸和酶。如果含核酸的样品是在测序文库的制备过程中获得的，则这是特别合适的。另外，洗涤步骤可以用于除去核酸尺寸级分，留下所需尺寸的级分。此外，洗涤步骤也适合去除在结合过程中使用的痕量的离液盐或其他盐(如果它们会干扰预期的下游过程)。
[0150] 如本文所用，术语“洗涤条件”是指如本文所述的影响尺寸截留值的那些条件。洗涤条件可能会受到洗涤缓冲液的成分、洗涤时间、洗涤温度、纳米膜的尺寸、形状和构型等的影响。
[0151] 根据一些实施方案，用于洗涤的溶液包含至少一种盐和/或至少一种醇。可以在洗涤溶液中使用的盐包括但不限于盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乙酸钠、乙酸钾或其他盐。作为醇，可以使用通常具有1-5个碳原子的短链的带支链或直链的醇进行洗涤。同样，可以在洗涤溶液中使用醇的混合物。合适的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。通常，在洗涤溶液中使用异丙醇和/或乙醇。
[0152] 在一些实施方案中，该方法还包括洗涤纳米膜以去除不在所需的尺寸范围内的核酸。在某些实施方案中，通过洗涤去除特定核酸尺寸是由选自以下的洗涤溶液的至少一种条件来促进的：i)pH，ii)盐浓度，ii)存在或不存在离液盐，iii)存在或不存在一价盐和/或二价盐，iv)醇浓度，v)分子拥挤剂浓度，vi)分子拥挤剂的种类，vii)洗涤时间，viii)洗涤期间的温度，ix)存在或不存在变性剂，x)其他添加剂分子如精胺、亚精胺、表面活性剂，xi)洗涤溶液的体积，xii)洗涤溶液的温度，和xiii)它们的组合。
[0153] 在某些实施方案中，可以调节洗涤溶液的pH以改变双链和单链核酸的级分。单链和双链核酸具有以尺寸依赖的方式结合至纳米膜的不同倾向。因此，在一些实施方案中，改变pH改变了从纳米膜洗涤掉的核酸分子的截留值。在其他实施方案中，洗涤溶液的pH可以用于影响纳米膜的表面电荷，使得相比较长的核酸更偏好较短的核酸。在这些实施方案中，pH可以在5-13的范围变化，例如pH＝5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5或13。
[0154] 在某些实施方案中，可以通过调节洗涤溶液中醇的浓度来调节核酸的溶解度，并因此调节尺寸截留值。合适的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。较高的醇的浓度会降低核酸的溶解度，并可以降低尺寸截留值。醇的浓度可以在约0％至约99％变化，例如0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％。
[0155] 在某些实施方案中，可以通过调节洗涤溶液中盐的浓度来调节核酸的溶解度，并因此调节尺寸截留值。合适的盐包括但不限于盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍碘化钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乙酸钠、乙酸钾。较高的盐的浓度会降低核酸的溶解度，并可以降低尺寸截留值。盐(例如但不限于氯化钠)的浓度可以在约0mM至约5000mM变化，例如0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、400mM、
500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1500mM、2000mM、2500mM、3000mM、3500mM、
4000mM、4500mM、5000mM。
500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1500mM、2000mM、2500mM、3000mM、3500mM、
4000mM、4500mM、5000mM。
[0156] 在一些实施方案中，该方法在洗涤溶液中不包含醇。
[0157] 在一些实施方案中，该方法在洗涤溶液中包含多胺，例如精胺或亚精胺。已知精胺和亚精胺以长度依赖的方式诱导核酸沉淀12。因此，这些多胺可以用于调节纳米膜的洗涤的尺寸依赖性。
[0158] 在某些实施方案中，可以通过调节洗涤溶液中分子拥挤剂的浓度来调节核酸的溶解度，并且因此调节尺寸截留值。合适的分子拥挤剂包括但不限于聚乙二醇、Ficoll、BSA、线性丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮和糖原。较高的分子拥挤剂的浓度会降低核酸的溶解度，并且可以降低尺寸截留值。分子拥挤剂的浓度可以在约0％至约40％变化，例如0％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％。
[0159] 在某些实施方案中，可以通过调节洗涤溶液中表面活性剂的浓度来调节核酸的溶解度，并因此调节尺寸截留值。表面活性剂包括但不限于TWEEN 20、十二烷基硫酸钠、Triton-X100、Triton-X114、NP40、西曲溴铵、十二烷基三甲基溴化铵。全部可以在0％至
10％变化。
10％变化。
[0160] 可以使用实现结合的核酸从纳米膜上解吸的任何洗脱溶液。已知可以从硅石表面有效地洗脱核酸的经典的洗脱溶液包括但不限于水、洗脱缓冲液(例如TE缓冲液、低EDTATE缓冲液)、以及盐含量为150mM或更小至约10mM的低盐溶液或无盐溶液。
[0161] 在一些实施方案中，进行一个或多个洗脱步骤以洗脱纯化的尺寸选择的核酸。然后，通常将包含核酸和缓冲液的洗脱液从含有纳米膜的管中取出，以用于下游应用。然而，在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含用于纯化的核酸和/或蛋白质的下游操作的试剂。然后在纳米膜仍存在于溶液中的情况下启动并且完成下游反应。反应完成时，将结合缓冲液添加到例如微量离心管中，并且将核酸重新结合到保留在例如管中的同一纳米膜上。
[0162] 在一些实施方案中，该方法还包括特异性洗脱所需尺寸范围的核酸，并使非所需尺寸范围的核酸仍结合在纳米膜上。在某些实施方案中，截留值通过选自以下的洗脱溶液的至少一个条件来促进：i)pH，ii)盐的浓度，ii)存在或不存在离液盐，iii)存在或不存在一价盐和/或二价盐，v)分子拥挤剂的浓度，vi)分子拥挤剂的种类，vii)洗脱时间，viii)洗脱期间的温度，ix)存在或不存在变性剂，x)其他添加剂分子，例如精胺、亚精胺、表面活性剂、xi)洗脱溶液的体积，xii)洗脱溶液的温度，及xiii)它们的组合。
[0163] 在其他实施方案中，不进行纳米膜的洗涤。在一些实施方案中，将纳米膜盘从结合缓冲液中移出，并且不经洗涤就洗脱核酸。在其他实施方案中，将纳米膜盘从结合缓冲液中移出并使用而无需洗脱核酸。
[0164] 大尺寸选择
[0165] 在某些实施方案中，本公开的纳米膜，例如NANOBINDTM，能够选择大的核酸片段，用于从含核酸的样品中去除，以实现大反应产物(范围为200bp(或nt)至100kb)的可调截留值。在某些实施方案中，使用本发明方法获得的核酸的所需尺寸范围大于或等于约200个碱基对(bp)(对于双链核酸)或200个核苷酸(nt)(对于单链核酸)，或大于或等于约500bp或
500nt，例如≥1000bp(或nt)、≥2000bp(或nt)、≥3000bp(或nt)、≥5000bp(或nt)、≥
7000bp(或nt)、≥8000bp(或nt)、≥9000bp(或nt)、≥10,000bp或(nt)、>20,000bp或(nt)、≥30,000bp或(nt)、≥40,000bp或nt、≥50,000bp或(nt)、≥60,000bp或(nt)、≥70,000bp或(nt)、≥80,000bp或(nt)、≥90,000bp或(nt)、≥100,000bp(nt)(nt)(本文中也称为“大尺寸选择”)。
500nt，例如≥1000bp(或nt)、≥2000bp(或nt)、≥3000bp(或nt)、≥5000bp(或nt)、≥
7000bp(或nt)、≥8000bp(或nt)、≥9000bp(或nt)、≥10,000bp或(nt)、>20,000bp或(nt)、≥30,000bp或(nt)、≥40,000bp或nt、≥50,000bp或(nt)、≥60,000bp或(nt)、≥70,000bp或(nt)、≥80,000bp或(nt)、≥90,000bp或(nt)、≥100,000bp(nt)(nt)(本文中也称为“大尺寸选择”)。
[0166] 在某些实施方案中，大尺寸选择方法结合了分子拥挤剂13。如本领域众所周知的，“分子拥挤剂”是由于排除体积效应而可赋予基于尺寸的结合的化合物。用于本方法的合适的分子拥挤剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，例如PVP(Mw10,000)、PVP(Mw29,000)、PVP(Mw40,000)、PVP(Mw55,000)、PVP(Mw360,000)、PVP(Mwl,300,000)；聚乙二醇(PEG)，例如PEG 1000、PEG 2000、PEG3000、PEG 4000、PEG 5000、PEG 6000、PEG 7000、PEG 8000、PEG 9000、PEG 10,000、PEG 11,000、PEG 12,000、PEG 13,000、PEG 14,000、PEG15,000、PEG 16,
000、PEG 17,000、PEG 18,000、PEG 19,000和PEG20,000；糖原；ficoil；BSA；麦芽糖糊精；线性丙烯酰胺。在其他实施方案中，可以使用分子拥挤剂的混合物。参考文献13通过引用将其全部内容并入本文。拥挤剂的浓度可以在约0％至约40％调节。
000、PEG 17,000、PEG 18,000、PEG 19,000和PEG20,000；糖原；ficoil；BSA；麦芽糖糊精；线性丙烯酰胺。在其他实施方案中，可以使用分子拥挤剂的混合物。参考文献13通过引用将其全部内容并入本文。拥挤剂的浓度可以在约0％至约40％调节。
[0167] 在一些实施方案中，在类似于本文概述的纳米膜纯化方法之前进行尺寸选择沉淀和制粒步骤。在一些实施方案中，在类似于本文所述的纳米膜纯化方法之后进行尺寸选择沉淀和制粒步骤。在一些实施方案中，用于大尺寸选择的方法与纳米膜纯化方法同时发生。
[0168] 在一些实施方案中，使用单独的尺寸选择沉淀步骤。该方法可以示例如下：1)将包含但不限于水、缓冲液、盐和PVP(Mw360,000)的沉淀缓冲液添加到含核酸的样品中；2)将样品-缓冲液在室温下以8000g离心30分钟，在此步骤中，核酸将沉淀在管底部；3)从管中去除上清液；4)向管中加入70％的醇，并在室温以8000g离心2分钟；5)从管中取出70％的醇的上清液，并将核酸沉淀重悬于洗脱缓冲液中。
[0169] 在一些实施方案中，大尺寸选择与纳米膜纯化方法同时发生，其通常遵循以下顺序：1)将含有待纯化的核酸和待去除的污染物的样品分装到例如微量离心管中；2)将结合缓冲液加入样品中，随后加入但不限于醇和纳米膜；混合这些成分；将该混合物孵育，在此期间核酸结合至纳米膜；3)从微量离心管中除去结合缓冲液/醇混合物，在管中留下结合至纳米膜上的核酸；4)将包含但不限于醇、水、缓冲液和盐的洗涤缓冲液加入到微量离心管中，并将该管倒转5-10次；5)将洗涤缓冲液从管中去除；6)将洗脱缓冲液添加到管中，使得纳米膜被完全浸没；在该步骤中，核酸与纳米膜分离，并处于洗脱缓冲液的溶液中；7)将含有核酸的洗脱缓冲液转移至例如单独的管，该管因此包含最终的纯化核酸。
[0170] 在某些实施方案中，通过在本文所述的沉淀步骤中或本文所述的结合步骤期间优化分子拥挤剂的量(例如0.1％-40％)和/或类型(例如分子量为10,000至1,300,000的PVP)来调节大尺寸选择方法。在某些实施方案中，通过优化沉淀或结合时间(2分钟-60分钟)、温度(4℃-50℃)和/或它们的组合来调节大尺寸选择方法。
[0171] 在一些实施方案中，通过以下结合条件中的至少一种来调节大尺寸选择方法的截留值：i)pH，ii)盐的浓度，iii)存在或不存在离液盐，iv)存在或不存在一价盐和/或二价盐，v)醇的类型和浓度，vi)分子拥挤剂的浓度和分子量，vii)分子拥挤剂的种类，viii)沉淀/结合时间，ix)沉淀/结合期间的温度，x)存在或不存在变性剂，xi)存在或不存在其他分子种类，xii)缓冲液体积，xiii)结合期间管的运动，例如涡旋、离心、摇动、旋转，xiv)纳米膜的尺寸，xv)纳米膜的形状，xvi)纳米膜的3D构型，和xvii)它们的组合。
[0172] 在某些实施方案中，分子拥挤剂用于调节尺寸选择的截留值。分子拥挤剂以高度依赖于所讨论的分子拥挤剂和分子种类的浓度和尺寸的方式改变分子种类的溶液自由能11，13。这使得可以使用分子拥挤剂以高度依赖于核酸尺寸的方式来调节核酸的溶解度。例如，在某些实施方案中，较高百分比的分子拥挤剂，例如PVP，增加了排除体积效应，使得较小的分子逐渐从溶液中带出。在另一个实施例中，较高分子量的分子拥挤剂，例如PVP 360,
000，可以用于将分子拥挤效应转移到较大的分子上，并倾向于驱动较大尺寸的核酸的沉淀和聚集。
000，可以用于将分子拥挤效应转移到较大的分子上，并倾向于驱动较大尺寸的核酸的沉淀和聚集。
[0173] 高通量、低通量和带通量纯化
[0174] 在某些实施方案中，本方法可以用于回收所需尺寸范围的核酸，该所需尺寸范围大于尺寸截留值(即高通量(high pass))。例如，本文描述了高通量方法。
[0175] 在其他实施方案中，本方法可以用于回收小于尺寸截留值的核酸(即低通量(low pass))。低通量纯化通常遵循以下顺序：1)将包含待纯化的核酸和待去除的污染物的样品分装到例如微量离心管中；2)将结合缓冲液加入样品中，然后加入例如醇和纳米膜；混合这些成分；将该混合物孵育，在此期间，大于截留值长度的核酸与纳米膜结合；3)从微量离心管中移出结合缓冲液/醇混合物；该结合缓冲液/结合混合物包含低于截留值长度的小核酸；4)通过添加例如但不限于更多的醇来调节移出的结合缓冲液/醇/核酸；5)向该溶液中加入第二纳米膜，然后孵育，在此期间其余的核酸与纳米膜结合；6)从微量离心管中除去第二结合溶液；7)将含有例如醇、水、缓冲液和盐的洗涤缓冲液加入微量离心管中，并将该管倒转例如5-10次；8)将洗涤缓冲液从管中去除；9)将洗脱缓冲液添加到管中，使纳米膜被完全浸没；在该步骤中，核酸与纳米膜分离，并处于洗脱缓冲液的溶液中；10)将含有尺寸小于截留值尺寸的核酸的洗脱缓冲液转移至例如单独的管中，该管包含最终的纯化核酸。
[0176] 在一些实施方案中，可以通过遵循与本文所述的高通量方法相似但具有高pH结合缓冲液的方法来实现低通量方法。
[0177] 在某些实施方案中，本方法的顺序应用可以用于允许选择DNA尺寸在最小值和最大值之间的带(即，带通量(band-pass))。因此，使用结合条件，使得尺寸大于截留值C1的核酸分子结合至纳米膜，从而在结合缓冲液的溶液中留下小于C1的那些核酸分子。然后将结合缓冲液转移到另一个微量离心管中，例如，并且向原始缓冲液中添加具有例如较高醇含量的其他缓冲液。然后加入第二纳米膜。缓冲液条件使得尺寸大于截留值C2的核酸分子结合至纳米膜。然后，如本公开中其他部分所述，通过洗涤和洗脱继续该方法。选择处于最小值为C2和最大值为C1之间的带中的最终回收的核酸分子。
[0178] 在某些实施方案中，通过遵循图2中所示顺序的方案，回收处于所需尺寸范围的DNA。例如，本文提供的实施例遵循以Elute(C1>DNA>C2)结尾的路径，其中C2＝0。本文提供的实施例遵循以Elute(C1>DNA>C2)结尾的路径，其中C1>C2>0。
[0179] 在某些实施方案中，可以进行纯化以获得具有下限C1和上限C3的所需DNA尺寸范围。该方法在图2中示出，以Elute(C3>DNA>C1)结尾。该纯化通常遵循以下顺序：1)将包含待纯化的核酸和待去除的污染物的样品分装到例如微量离心管中；2)将结合缓冲液加入至样品中，然后加入例如醇和纳米膜；混合这些成分；将该混合物孵育，在此期间，大于截留值长度C1的核酸与纳米膜结合；3)从微量离心管中除去结合缓冲液/醇混合物；4)将包含例如醇、水、缓冲液和盐的洗涤缓冲液添加到微量离心管中，并将该管倒转例如5-10次，大于尺寸截留值C3的核酸与纳米膜分开，并且处于洗涤缓冲液的溶液中；5)从管中除去含有大于尺寸截留值C3的核酸的洗涤缓冲液；6)将洗脱缓冲液添加到管中，使纳米膜完全浸没；在该步骤中，结合的核酸与纳米膜分开，并处于洗脱缓冲液的溶液中；7)将含有尺寸大于下限截留值C1且小于上限截留值C3的核酸分子的洗脱缓冲液转移到例如单独的管中，该管包含最终的纯化核酸。
[0180] 在某些实施方案中，可以进行纯化，从而回收高通量的级分和低通量的级分。如本文所述遵循低通量方法。在步骤3)中，留在微量离心管中的纳米膜具有与其结合的尺寸大于截留值的核酸。与本文所述的低通量方法平行，如本公开中其他部分所述，洗涤和洗脱该纳米膜。结果通常是两种洗脱液，一种洗脱液含有大于截留值的核酸，另一种洗脱液含有小于截留值的核酸。
[0181] 测序文库
[0182] 根据本公开的方法特别适合在测序文库例如第三代测序文库的背景下进行尺寸选择。例如，可以使用本领域已知的方法来制备适合于第三代测序的测序文库。用于此类长读段测序技术(例如，数万甚至数十万个碱基对的序列)的文库制备遵循类似的工作流程。
通常，分离出高分子量(50kb-Mb+)DNA。接下来，通常使用各种酶促反应(例如连接、末端修复和标记)制备用于测序的DNA。在酶促处理过程中，可以进行本发明中所述的小尺寸选择反应纯化，以去除小的背景分子(例如，可调截留值为50nt或bp至30000nt或bp的哪些)，例如来自文库产品的引物二聚体、酶和衔接子寡核苷酸。
通常，分离出高分子量(50kb-Mb+)DNA。接下来，通常使用各种酶促反应(例如连接、末端修复和标记)制备用于测序的DNA。在酶促处理过程中，可以进行本发明中所述的小尺寸选择反应纯化，以去除小的背景分子(例如，可调截留值为50nt或bp至30000nt或bp的哪些)，例如来自文库产品的引物二聚体、酶和衔接子寡核苷酸。
[0183] 在某些实施方案中，测序文库的制备通常涉及从含核酸的样品中产生多个双链线性DNA片段。例如，DNA(例如基因组DNA或cDNA)可以通过剪切(例如声波、水力剪切、超声、雾化或酶促断裂)来片段化，以提供适合于后续测序的DNA片段。片段的长度可以基于随后用于测序的测序平台的测序能力来选择。在本公开的一些实施方案中，在制备文库期间使用本文所述的用于选择较大的核酸分子(例如，可调截留值为200bp至100kbp的那些)的方法来选择较大的核酸分子进行分离。
[0184] 本公开还涉及试剂盒，其包括如本文所述的纳米膜、如本文所述的结合缓冲液，以及任选地洗涤溶液和洗脱溶液也包括在如本文所述的试剂盒中。通常，试剂盒包含硅石纳米膜和结合缓冲液，其中如本文所述的结合缓冲液包含醇和离液盐。通常，该醇是异丙醇。在某些实施方案中，结合缓冲液还包含分子拥挤剂，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、PVP
(Mw360,000)8000。
(Mw360,000)8000。
[0185] 实施例
[0186] 实施例1
[0187] 该实施例表明，可以使用硅石纳米膜以长度依赖的方式从含有不同长度的双链DNA的样品中选择性地回收双链DNA。可以调整DNA的尺寸依赖性回收率以改变对较小和较大的DNA分子的尺寸依赖。这种方法适用于将样品中的DNA尺寸分布调整到所需尺寸范围，例如在测序文库的制备中的所需尺寸范围。
[0188] 在该实施例中，输入样品是11.25μl的溶液，该溶液包含来自购自ThermoFisher的噬菌体λ的200ng/μl的48,502bp的线性DNA和100ng/μl的100bp+dsDNAladder(ThermoFisher Scientific Inc.part#SM0321)。将样品在1.5ml的管中与7.5ul结合缓冲液(8M GuHCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)和100％异丙醇和TE(10mM Tris-HCl(pH＝8)，1mM EDTA)混合，使得最终异丙醇浓度为45％至40％，并且最终体积为60ul。将直径为3毫米(mm)的圆形硅石纳米膜添加到溶液中，并在Hula混合器(ThermoFisher，cat#
15920D)上混合10分钟。混合后，除去溶液，将硅石纳米膜留在微量离心管中。将500μl的初始洗涤缓冲液(50％EtOH、25mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH＝9)，1mM EDTA)加入到装有硅石纳米膜的管中，并将该管颠倒7次。然后从微量离心管中除去该初始洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入30μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，0.1mM EDTA)，并将管在室温放置10分钟以洗脱DNA。
15920D)上混合10分钟。混合后，除去溶液，将硅石纳米膜留在微量离心管中。将500μl的初始洗涤缓冲液(50％EtOH、25mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH＝9)，1mM EDTA)加入到装有硅石纳米膜的管中，并将该管颠倒7次。然后从微量离心管中除去该初始洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入30μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，0.1mM EDTA)，并将管在室温放置10分钟以洗脱DNA。
[0189] 图3示出了在1％琼脂糖凝胶上电泳的回收的DNA。从图3可以明显看出，随着异丙醇百分比的变化，长度依赖性回收存在显著差异。随着异丙醇浓度从45％降低到40％，DNA截留值(定义为具有10％或更低回收率的最高Mw带)从300bp变为3000bp。
[0190] 实施例2
[0191] 在该实施例中，硅石纳米膜用于回收较长的双链DNA，同时去除短的、单链或双链的DNA寡聚物。该方法适用于从PCR扩增反应中去除未使用的单链引物，或从连接反应中去除未使用的单链或双链衔接子。
[0192] 在该实施例中，输入样品为25μl的溶液，该溶液包含1)从培养的GM 12878细胞中提取的100ng/μl基因组DNA和20nM的Alexa647标记的20nt长的单链DNA寡核苷酸，或2)从培养的GM12878细胞中提取的100ng/μl基因组DNA和20nM的Alexa647标记的20bp长的双链DNA寡核苷酸。将3.57μl的结合缓冲液(8M GuHCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)添加到1.5ml微量离心管中的样品中，并通过敲击混合。然后将28.57μl的100％异丙醇和一个3mm直径的硅石纳米膜添加到管中，并在Hula混合器(ThermoFisher，cat#15920D)上混合10分钟。混合后，除去溶液，将硅石纳米膜留在微量离心管中。加入500μl洗涤缓冲液(60％EtOH，
50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将该管倒转7次。然后从微量离心管中除去第二洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入25μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，
0.1mM EDTA)，并将管在室温放置10分钟以洗脱DNA。
50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将该管倒转7次。然后从微量离心管中除去第二洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入25μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，
0.1mM EDTA)，并将管在室温放置10分钟以洗脱DNA。
[0193] 该实施例的结果在图4中示出。图4A)显示在1％琼脂糖凝胶上电泳后尺寸选择的样品。每个凝胶图像将输入样品(左泳道)与 纯化样品(0.6X和1X磁珠标准实
验方案)和NANOBINDTM尺寸选择的纯化样品进行比较。上方的条带代表用 安全插
入染料染色的gDNA。 纯化和NANOBINDTM尺寸选择均显示了大gDNA的回收。下
方的条带代表Alexa647标记的20nt单链DNA寡核苷酸(图4A)或Alexa647标记的20bp双链
DNA寡核苷酸(图4B)。在两个输入泳道中都可以看到这些，但是在纯化样品中却看不到，这表明NANOBINDTM和 都能有效去除这些短的单链DNA寡聚物。因此，硅石纳米膜
可以用于从反应混合物中去除短的单链寡聚物，例如扩增引物或衔接子。图4C)显示了从硅石纳米膜和 纯化中的总体回收率。硅石纳米膜纯化的回收率为88±20％，而
纯化的回收率则显著较低，对于0.6X为34±24％，对于1X为17±8％。
验方案)和NANOBINDTM尺寸选择的纯化样品进行比较。上方的条带代表用 安全插
入染料染色的gDNA。 纯化和NANOBINDTM尺寸选择均显示了大gDNA的回收。下
方的条带代表Alexa647标记的20nt单链DNA寡核苷酸(图4A)或Alexa647标记的20bp双链
DNA寡核苷酸(图4B)。在两个输入泳道中都可以看到这些，但是在纯化样品中却看不到，这表明NANOBINDTM和 都能有效去除这些短的单链DNA寡聚物。因此，硅石纳米膜
可以用于从反应混合物中去除短的单链寡聚物，例如扩增引物或衔接子。图4C)显示了从硅石纳米膜和 纯化中的总体回收率。硅石纳米膜纯化的回收率为88±20％，而
纯化的回收率则显著较低，对于0.6X为34±24％，对于1X为17±8％。
[0194] 实施例3
[0195] 在这个实施例中，硅石纳米膜用于回收较长的双链DNA，同时去除低于可变的截留TM长度的双链DNA。通过改变NANOBIND 的洗涤条件而不是初始结合条件来改变回收的DNA截留长度。它具有从反应混合物(例如在测序文库制备中)去除小的dsDNA的功能，以将DNA文库偏置为较长的读段长度，或在平端连接步骤后去除dsDNA衔接子。
[0196] 在该实施例中，输入样品为11.25μl的溶液，该溶液包含来自购自ThermoFisher的噬菌体λ的200ng/μl的48,502bp的线性DNA和100ng/μl的100bp+dsDNA ladder(ThermoFisher Scientific Inc.part#SM0321)。
[0197] 将样品在1.5ml管中与7.5ul结合缓冲液(8M GuHCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)和100％异丙醇和TE(10mM Tris-HCl(pH＝8)，1mM EDTA)混合，使得最终的异丙醇浓度为45％，并且最终体积为60ul。将直径为3毫米(mm)的圆形硅石纳米膜添加到溶液中，并在Hula混合器(ThermoFisher，cat#15920D)上混合10分钟。混合后，除去溶液，将硅石纳米膜留在微量离心管中。将500μl洗涤缓冲液(60％EtOH，0或25或50或100或500mM NaCl，
10mM Tris-HCl(pH＝9)，1mM EDTA)添加到装有硅石纳米膜的管中，并将该管倒转7次。然后从微量离心管中除去该洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入30μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，0.1mM EDTA)，并将该管在室温放置10分钟以洗脱DNA。
10mM Tris-HCl(pH＝9)，1mM EDTA)添加到装有硅石纳米膜的管中，并将该管倒转7次。然后从微量离心管中除去该洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入30μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，0.1mM EDTA)，并将该管在室温放置10分钟以洗脱DNA。
[0198] 图5示出了在1％琼脂糖凝胶上电泳的回收的DNA。从图5可以明显看出，随着洗涤液中NaCl的变化，长度依赖性回收存在显著差异。随着洗涤液中NaCl浓度从0增加到500mM，DNA截留值(定义为具有10％或更低回收率的最高Mw带)从100bp变为1500bp。
[0199] 实施例4
[0200] 在该实施例中，硅石纳米膜用于回收较短(<1000bp)的dsDNA，同时除去DNA混合物中长的双链DNA和未使用的单链引物。该实施例证实了本方法可以用于从例如千碱基对至兆碱基对gDNA的PCR扩增中纯化扩增子。
[0201] 在该实施例中，输入样品是12.5μl的混合物，该混合物包含40nM的50bp的ladder(Thermo Fisher Scientific Inc.，part#SM0371)，140ng/μl的线性λ噬菌体DNA(长度为48kbp，购自Thermo Fisher Scientific Inc.)和20nM Aiexa647标记的20nt长的DNA寡聚物。
[0202] 在1.5ml微量离心管中将25μl含1.5M GuHCl且pH值为9、10、11、12或13的结合缓冲液添加到样品中，并通过敲击混合。然后将37.5μl的100％异丙醇和一个3mm直径的硅石纳米膜添加到每个管中，并通过敲击混合。放置20分钟以使DNA结合。20分钟后，将溶液除去，将硅石纳米膜留在微量离心管中。将500μl初始洗涤缓冲液(70％EtOH，0.5M GuHCI，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)添加到含有硅石纳米膜的管中，并将管倒转5-10次。然后从微量离心管中除去该初始洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入500μl的第二洗涤缓冲液(70％EtOH，50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将管倒转5-10次。然后从微量离心管中除去该第二洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。加入50μl水，并将管在55℃放置20分钟以洗脱DNA。
[0203] 图6示出了输入样品和使用pH＝9、10、11、12和13的结合缓冲液NANOBTNDTM尺寸选择纯化的DNA。未标记的DNA用 Gold插入染料染色。20nt寡核苷酸用Alexa647染料标记。在NANOBINDTM尺寸选择纯化的样品中，Alexa647寡核苷酸几乎被完全去除，这表明硅石纳米膜有效去除了短的单链DNA寡聚物。在pH＝12和13实施的纯化中不存在λDNA带，这表明高pH下的纯化也有效去除了较长的dsDNA。
[0204] 实施例5
[0205] 在该实施例中，在1000bp至10000bp之间的大于可调的截留尺寸的双链DNA被回收。截留尺寸定义为具有10％或更低回收率的最高Mw带。该方案可用于第三代长读段测序，TM
其中其可以用于代替耗时和耗样品的BLUE PIPPIN 尺寸选择仪器。
其中其可以用于代替耗时和耗样品的BLUE PIPPIN 尺寸选择仪器。
[0206] 在该实施例中，输入样品是25μl混合物，该混合物包含100ng/μl的1kbp+ladder(Thermo Fisher Scientific Inc.part#SMI331)和来自购自ThermoFisher的噬菌体λ的200ng/μl的48,502bp的线性DNA。
[0207] 将7.5μl的5M NaCl和25μl的2X PVP(Mw＝360,000)溶液添加到样品中，并通过敲击混合。2X PVP溶液是10质量/体积％、8质量/体积％、6质量/体积％、4质量/体积％、3.5质量/体积％和3质量/体积％的聚乙烯吡咯烷酮(Mw＝360,000)(Sigma Aldrich，part#PVP360-100G)溶液。将所得的溶液在8000g和室温下离心30分钟。除去上清液，留下DNA沉淀。接下来，将200μl的70％EtOH添加至管中，并在室温以8000g离心2分钟。除去EtOH上清液，并通过在室温将微量离心管打开2分钟来干燥DNA沉淀。将沉淀重悬于25μl的洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝9)，0.1mM EDTA)中，并在室温孵育10分钟，间歇敲击。
[0208] 该实施例说明了如本文所述的NANOBINDTM大尺寸选择方法的沉淀步骤部分。
[0209] 从图7可以明显看出，随着沉淀缓冲液中PVP浓度的变化，长度依赖性回收率存在显著差异。随着缓冲液中PVP浓度从5％降低到1.5％，DNA截留值(定义为具有10％或更低回收率的最高Mw带)从1000bp变为10000bp。
[0210] 实施例6
[0211] 该实施例说明了如何使用硅石纳米膜通过回收PCR扩增产物同时去除引物、dNTP和酶来清洁PCR扩增反应系。
[0212] 输入样品为12.5μl的包含目标DNA、DNA引物寡聚物、dNTP和聚合酶的混合物。通过变性、退火和延伸步骤使反应系热循环来产生DNA扩增子。将25μl结合缓冲液(6M盐酸胍，10mM Tris-HCl(pH＝6.8)，1mM EDTA)，1个硅石纳米膜和37.5μl的100％异丙醇添加至PCR扩增样品中。然后将其混合并放置1小时，之后，将所有液体从管中除去，留下硅石纳米膜。
加入700μl的初始洗涤缓冲液(70％EtOH，0.5M GuHCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将管倒转5-10次。然后从微量离心管中除去该初始洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。
然后加入500μl的第二洗涤缓冲液(70％EtOH，50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将管倒转5-10次。然后从微量离心管中除去该第二洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。
加入50μl缓冲液，并将管在55℃放置10分钟以洗脱DNA。洗脱液中含有PCR扩增子，但dNTP和引物的含量降低至小于其输入质量的0.2％。
加入700μl的初始洗涤缓冲液(70％EtOH，0.5M GuHCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将管倒转5-10次。然后从微量离心管中除去该初始洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。
然后加入500μl的第二洗涤缓冲液(70％EtOH，50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA)，并将管倒转5-10次。然后从微量离心管中除去该第二洗涤缓冲液，留下硅石纳米膜。
加入50μl缓冲液，并将管在55℃放置10分钟以洗脱DNA。洗脱液中含有PCR扩增子，但dNTP和引物的含量降低至小于其输入质量的0.2％。
[0213] 硅石纳米膜纯化的回收率示于图8。从图中可以明显看出，产品回收率存在长度依赖性，其中较短的产品回收率要比较长的产品低。
[0214] 参考文献
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