核酸复合物对、竞争性结构体和使用二者的PCR试剂盒

摘要

根据本申请的一个实施方式，提供了包含如下物质的核酸复合物对：包含第一决定子部分和第二标签部分的第一核酸复合物；以及包含第二决定子部分和第二标签部分的第二核酸复合物，其中，第一决定子部分包含第一靶标DNA的正向引物，第二决定子包含第一靶标DNA的反向引物，第一标签部分包含与第二标签部分的碱基序列互补的碱基序列，第二标签部分包含与第一标签部分的碱基序列互补的碱基序列。

权利要求

1.一种核酸复合物对，所述核酸复合物对包含：第一核酸复合物，所述第一核酸复合物包含第一决定子和第一标签；以及第二核酸复合物，所述第二核酸复合物包含第二决定子和第二标签，其中，所述第一决定子包含第一靶标DNA的正向引物，所述第二决定子包含所述第一靶标DNA的反向引物，所述第一标签包含与所述第二标签的碱基序列互补的碱基序列，并且所述第二标签包含与所述第一标签的碱基序列互补的碱基序列。

2.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中，所述第一决定子由以下物质构成：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)、己糖核酸(HNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、环己烯核酸(CeNA)或它们的组合，以及所述第二决定子由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

3.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中，所述第一标签由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合，以及所述第二标签由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

4.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中，所述第一核酸复合物包含第一标记，并且

所述第二核酸复合物包含第二标记，

其中，将所述第一标记配置为向所述第二标记提供能量。

5.如权利要求2所述的核酸复合物对，其中，所述第一标记包含以下物质中的至少一种：FAM、JOE、TET、HEX、VIC、OregonTAMRA、ROX、花青-3、花青-3.5、花青-5、花青-5.5、水母发光蛋白和青色荧光蛋白(CFP)。

6.如权利要求5所述的核酸复合物对，其中，所述第二标记为被配置为接受从所述第一标记发出的第一光并被配置为将所述第一光转换为第二光的物质，或者所述第二标记是被配置为吸收从所述第一标记发出的第一光的物质。

7.如权利要求4所述的核酸复合物对，其中，当所述第一标签与所述第二标签互补结合时，所述第一标记向所述第二标记提供能量。

8.如权利要求4所述的核酸复合物对，其中，所述第一标签位于所述第一决定子和所述第一标记之间，并且所述第二标签位于所述第二决定子和所述第二标记之间。

9.如权利要求4所述的核酸复合物对，其中所述第一标记位于所述第一决定子和所述第一标签之间，并且所述第二标签位于所述第二决定子和所述第二标记之间。

10.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中第一接头位于所述第一决定子和所述第一标签之间，并且第二接头位于所述第二决定子和所述第二标签之间。

11.如权利要求10所述的核酸复合物对，其中，所述第一接头包含PCR阻断剂，用于防止产生所述第一标签的扩增产物，并且所述第二接头包含PCR阻断剂，用于防止产生所述第二标签的扩增产物。

12.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中，所述核酸复合物对用于进行聚合酶链式反应(PCR)，其中，进行所述PCR以扩增所述第一靶标DNA的序列的至少部分。

13.如权利要求12所述的核酸复合物对，其中，所述核酸复合物对用于进行数字PCR。

14.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中，所述第一标签的碱基序列的长度比所述第二标签的碱基序列的长度短。

15.如权利要求1所述的核酸复合物对，其中，所述第一标签的碱基序列的部分碱基序列与所述第一决定子的碱基序列的部分碱基序列或所述第二决定子的碱基序列的部分碱基序列相同。

16.一种用于聚合酶链式反应(PCR)的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1所述的核酸复合物对。

17.如权利要求16所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含以下中的至少一种：DNA聚合酶、参与PCR的辅酶、和用于调节pH和/或盐浓度的缓冲液。

说明书

核酸复合物对、竞争性结构体和使用二者的PCR试剂盒

技术领域

[0001] 示例性的实施方式涉及核酸复合物对。

[0002] 示例性的实施方式涉及使用核酸复合物对检测靶标的方法。

[0003] 示例性的实施方式涉及与核酸复合物对一起使用的竞争性构建体。

[0004] 示例性的实施方式涉及聚合酶链式反应(PCR)试剂盒，所述试剂盒包含核酸复合物对和竞争性构建体。

背景技术

[0005] 分子诊断是通过分析基因来诊断疾病的领域，并且目前在体外诊断领域中显示出最快的发展。实际上，由于假定将由飞速的环境污染和气候变化引起的新病毒的迅速传播，已经对分子诊断进行了大量研究，分子诊断具有确保在体外诊断领域中的最高诊断准确性以及在新病毒爆发情况下快速证实感染的优点。

[0006] 在分子诊断领域，通常使用DNA测序和聚合酶链式反应(以下称为PCR)。与PCR分析相比，DNA测序仍需要昂贵的设备，并且不能快速检测靶标，因此，现在在大多数中小型医院、大型医院和健康检查中心，通过对患者的样本(例如血液)进行PCR分析来诊断患者的疾病。

[0007] 根据常规的PCR诊断方法，从一个PCR管中检测一个靶标，或分别设计多个荧光通道以使用探针根据靶标的存在或不存在而发光，并且可以使用该探针在一个PCR管中同时检测对应于荧光通道数量的多个靶标。

[0008] 然而，用于检测一个PCR管中的一个靶标的PCR方法具有浪费大量试剂以及大量时间和人工成本的问题。此外，在使用设计用于根据靶标的存在或不存在而在多个荧光通道的每一个中发光的探针的PCR方法中，探针设计困难并且存在低反应性的问题。

[0009] 因此，需要用于一次在一个PCR管中检测多种类型靶标的手段。

发明内容

[0010] 技术问题

[0011] 本申请旨在提供核酸复合物对，所述核酸复合物对被简单地设计用于样品中的靶标检测。

[0012] 本申请还旨在提供PCR试剂盒，所述试剂盒包含能够检测每个荧光通道中的多种类型的靶标的核酸复合物对。

[0013] 本申请将要解决的问题不限于上述问题，并且参考说明书和附图，本领域普通技术人员将清楚地理解本文中未提及的问题。

[0014] 技术方案

[0015] 在一个方面，本申请可提供在使用核酸复合物对的聚合酶链式反应(PCR)中使用的竞争性构建体，所述竞争性构建体包含第一核酸复合物和第二核酸复合物，所述第一核酸复合物包含第一标签以及作为第一靶标DNA的引物的第一决定子，所述第二核酸复合物包含具有第一标签的互补序列的第二标签以及作为第二靶标DNA的引物的第二决定子，其中，所述竞争性构建体包含第一额外序列和第二额外序列，所述第一额外序列具有第一决定子的至少部分碱基序列的的互补序列，所述第二额外序列具有第一标签的至少部分碱基序列的的互补序列。

[0016] 有益效果

[0017] 使用与靶标互补结合的标签的解离温度，可以将根据实施方式的核酸复合物对用于样品中的靶标检测。

[0018] 根据实施方式的PCR试剂盒包含被设计成具有不同的标签解离温度的多种类型的核酸复合物对，并因此能够用于检测每个荧光通道的多种类型的靶标。

[0019] 本申请的效果不限于上述效果，并且参考说明书和附图，本领域普通技术人员将清楚地理解本文中未提及的效果。

附图说明

[0020] 图1是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0021] 图2是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0022] 图3是说明了根据本申请的第一示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0023] 图4是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0024] 图5是说明了根据本申请的第二示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0025] 图6是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0026] 图7是说明了根据本申请的第三示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0027] 图8是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0028] 图9是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0029] 图10和图11是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一决定子111和第二决定子121的操作的图。

[0030] 图12是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120结合的方向的图。

[0031] 图13是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一标签112和第二标签122之间的结合的图。

[0032] 图14是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一标记113和第二标记123的操作的图。

[0033] 图15是根据本申请的示例性实施方式，根据第一标记113和第二标记123之间的联接行为的每个波长段(WL)的荧光(F)的图表。

[0034] 图16是说明了根据本申请的示例性实施方式的可用于PCR钳制(PCR clamping)的核酸复合物1的图。

[0035] 图17是说明了根据本申请的示例性实施方式的PCR步骤的图。

[0036] 图18和图19是说明了根据本申请的示例性实施方式的可用于PCR钳制的核酸复合物1的操作的图。

[0037] 图20是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0038] 图21是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的配对操作的图。

[0039] 图22是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0040] 图23和图24是说明了根据本申请的示例性实施方式的构建体的二级结构形成的图，其中，第一决定子111与第二决定子121结合。

[0041] 图25和图26是说明了根据本申请的示例性实施方式，形成包含第一决定子111和第二决定子121的构建体的过程的图。

[0042] 图27和图28是说明了根据本申请的示例性实施方式，包含第一决定子111和第二决定子121的构建体的二级结构形成的图。

[0043] 图29和图30是说明了根据本申请的示例性实施方式，包含核酸复合物对10的核酸构建体的二级结构形成的图。

[0044] 图31是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸构建体的二级结构形成的图。

[0045] 图32是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0046] 图33是说明了根据本申请的示例性实施方式的PCR后的检测步骤的图。

[0047] 图34和图35是说明了根据本申请的示例性实施方式的解离曲线检测步骤(S6000)的图。

[0048] 图36是说明了根据本申请的示例性实施方式，确认单位单元(UC)中存在的靶标核酸浓度的一组图表。

[0049] 图37是说明了根据本申请的示例性实施方式的竞争性构建体2的图。

[0050] 图38至图40是说明了根据本申请的示例性实施方式的竞竞争性构建体2的操作的图。

[0051] 图41是说明了根据本申请的示例性实施方式，使用核酸复合物对10和竞争性构建体2的PCR结果的图。

[0052] 图42示出了根据本申请的示例性实施方式，一个荧光通道中的荧光值与温度之间的图表以及一个荧光通道中的温度与荧光相对于温度的负变化率之间的图。

[0053] 图43是说明了根据本申请的示例性实施方式，根据用于确认存在于单位单元(UC)中的至少四种靶标核酸的实验的结果的图。

[0054] 图44和图45是说明了根据本申请的第七示例性实施方式的核酸复合物对10的使用的图。

[0055] 图46是说明了根据本申请的示例性实施方式，使用核酸复合物对10和探针复合物600进行的靶标核酸检测的图。

[0056] 图47是说明了根据本申请的示例性实施方式的探针复合物610的图。

[0057] 图48和图49是说明了根据本申请的示例性实施方式，单位单元UC中提供的溶液的PCR的图，所述单位单元包含探针复合物610和核酸复合物对10。

[0058] 图50是根据本申请的示例性实施方式的温度与荧光相对于温度的负变化率之间的图。

[0059] 图51是说明了根据本申请的示例性实施方式，通过用于确认存在于单位单元(UC)中的至少四种靶标核酸的实验而获得的结果的一组图表。

[0060] 图52是说明了根据本申请的第二示例性实施方式的探针复合物620的图。

[0061] 图53和图54是说明了根据本申请的示例性实施方式，单位单元(UC)中提供的溶液的PCR的图，所述单位单元包含探针复合物620和核酸复合物对10。

[0062] 图55是说明了根据本申请的示例性实施方式，温度与荧光相对于温度的负变化率之间的图。

[0063] 图56是说明了根据本申请的示例性实施方式，当核酸复合物对10用于数字PCR时制备样品的步骤的图。

[0064] 图57是说明了根据本申请的示例性实施方式的数字PCR中的单位单元(UC)的一组图。

[0065] 图58是说明了根据本申请的示例性实施方式，使用核酸复合物对10的数字PCR中的操作的图。

[0066] 图59是说明了根据本申请的示例性实施方式，在数字PCR中进行解离曲线检测步骤(S6000)的方法的一组图。

[0067] 图60是根据本申请的示例性实施方式的PCR仪器2000的框图。

[0068] 图61是说明了根据本申请的示例性实施方式的PCR仪器2000的操作(S7000)的流程图。

具体实施方式

[0069] 通过以下结合附图的详细描述，本申请的目的、特征和优点将更加明显。然而，本申请可以以各种方式改变并且具有多种实施方式，具体的实施方式旨在参考以下附图进行示例和详细说明。

[0070] 在附图中，为了清楚起见，夸大了层和区域的厚度，并且当将元件或层布置在不同的元件或层上时，这意味着可以将其直接布置在不同的元件或层上，或在它们之间插入第三层或元件。在整个说明书中，原则上同类的附图标记表示同类的元件。此外，在各个实施方式的附图中示出的相同概念的范围内，具有相同功能的元件将使用相同的附图标记进行描述。

[0071] 当确定对与本申请相关的已知功能或配置的详细描述不必要地使本申请的主题模糊不清时，将省略该详细描述。此外，本说明书的描述中所使用的数字(例如，第一、第二等)仅仅是用于将一个元件与另一元件区分开的识别符号。

[0072] 此外，在以下描述中使用的用于元件的词尾“模块”和“部”是考虑到易于说明而给出或进行混合，并没有不同的含义或作用。

[0073] 根据本申请的示例性实施方式，在核酸复合物对中包含第一核酸复合物和第二核酸复合物，所述第一核酸复合物包含第一决定子和第二标签，所述第二核酸复合物包含第二决定子和第二标签，第一决定子可包含第一靶标DNA的正向引物，第二决定子可包含第一靶标DNA的反向引物，第一标签可包含与第二标签的碱基序列互补的碱基序列，第二标签可包含与第一标签的碱基序列互补的碱基序列。

[0074] 在核酸复合物对中，第一决定子可以由以下物质构成：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)、己糖核酸(HNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、环己烯核酸(CeNA)或它们的组合；第二决定子可以由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA，BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

[0075] 在核酸复合物对中，第一标签可由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA，BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合；第二标签可由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA，BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

[0076] 在核酸复合物对中，第一核酸复合物可包含第一标记，第二核酸复合物可包含第二标记，其中，可将第一标记配置为向第二标记提供能量。

[0077] 在核酸复合物对中，第一标记可包含以下中的至少一种：FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Oregon TAMRA、ROX、花青-3(Cyanine-3)、花青-3.5、花青-5、花青-5.5、水母发光蛋白(Aequorin)和青色荧光蛋白(CFP)。

[0078] 在核酸复合物对中，第二标记可被配置成接受由第一标记发出的第一光并将第一光转换成第二光的材料，或者可为被配置成吸收由第一标记发处的第一光的材料。

[0079] 在核酸复合物对中，当第一标签与第二标签互补结合时，第一标记可以向第二标记提供能量。

[0080] 在核酸复合物对中，第一标签可位于第一决定子和第一标记之间，第二标签可以位于第二决定子和第二标记之间。

[0081] 在核酸复合物对中，第一标记可位于第一决定子和第一标签之间，第二标签可位于第二决定子和第二标记之间。

[0082] 在核酸复合物对中，第一接头可位于第一决定子和第一标签之间，第二接头可位于第二决定子和第二标签之间。

[0083] 在核酸复合物对中，第一接头可包括用于防止产生第一标签的扩增产物的PCR阻断剂，第二接头可包括用于防止产生第二标签的扩增产物的PCR阻断剂。

[0084] 核酸复合物对可用于PCR，可实施所述PCR以扩增第一靶标DNA序列的至少部分。

[0085] 核酸复合物对可用于数字PCR。

[0086] 在核酸复合物对中，第一标签的碱基序列的长度可以短于第二标签的碱基序列的长度。

[0087] 在核酸复合物对中，第一标签的碱基序列的部分可与第一决定子或第二决定子的碱基序列的部分是相同的。

[0088] 可提供用于PCR的试剂盒，其包含根据权利要求1的核酸复合物对。

[0089] 所述用于PCR的试剂盒可进一步包含DNA聚合酶、参与PCR的辅酶以及用于调节pH和/或盐浓度的缓冲液中的至少一种。

[0090] 根据本申请的示例性实施方式，可提供用于使用核酸复合物对的PCR的竞争性构建体，所述核酸复合物对包含第一核酸复合物以及第二核酸复合物，第一核酸复合物包含作为用于第一靶标DNA的引物的第一决定子以及第一标签，第二核酸复合物包含作为用于第二靶标DNA的引物的第二决定子以及具有第一标签的互补序列的第二标签，其中，所述竞争性构建体可包含第一额外序列以及第二额外序列，所述第一额外序列具有第一决定子的至少部分碱基序列的的互补序列，所述第二额外序列具有第一标签的至少部分碱基序列的的互补序列。

[0091] 在竞争性构建体中，第一决定子可为第一靶标DNA的正向引物，第二决定子可为第一靶标DNA的反向引物。

[0092] 在竞争性构建体中，第一决定子可为第一靶标DNA的反向引物，第二决定子可为第一靶标DNA的正向引物。

[0093] 在竞争性构建体中，第一额外序列可由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

[0094] 在竞争性构建体中，第二额外序列可由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

[0095] 在竞争性构建体中，第二核酸复合物可包含发出第一光的荧光分子，第一核酸复合物可包含淬灭剂分子，所述淬灭剂分子接受第一光然后发出第二光，或者吸收第一光。

[0096] 在竞争性构建体中，第一核酸复合物可包含发出第一光的荧光分子，第二核酸复合物可包含淬灭剂分子，所述淬灭剂分子接受第一光然后发出第二光，或者吸收第一光。

[0097] 在竞争性构建体中，在诱导第一核酸复合物和竞争性构建体之间的互补结合后从含有第一核酸复合物和竞争性构建体的管中发出的第一光可强于在诱导第一核酸复合物和第二核酸复合物之间的互补结合后从含有第一核酸复合物和第二核酸复合物的管中发出的第一光。

[0098] 在竞争性构建体中，第二额外序列可具有与第一标签的碱基序列互补的碱基序列，并且与第一标签的碱基序列互补的碱基序列中的碱基数可为第一标签和第二标签之间互补结合的碱基对数的50％或更多。

[0099] 在竞争性构建体中，与第一标签的碱基序列互补的碱基序列的碱基数可为第一标签和第二标签之间互补结合的碱基对数的75％或更多。

[0100] 在竞争性构建体中，第一额外序列可具有与第一决定子的碱基序列互补的碱基序列，并且与第一决定子的碱基序列互补的碱基序列具有10℃至35℃的退火温度。

[0101] 在竞争性构建体中，与第一决定子的碱基序列互补的碱基序列的退火温度可为20℃到30℃。

[0102] 可提供用于PCR的试剂盒，所述试剂盒包含：第一核酸复合物，所述第一核酸复合物包含第一标签和作为用于第一靶标DNA的引物的第一决定子；第二核酸复合物，所述第二核酸复合物包含作为用于第二靶标DNA的引物的第二决定子以及具有第一标签的互补序列的第二标签；以及第一额外序列和第二额外序列，所述第一额外序列具有与第一决定子的至少部分碱基序列互补的序列，所述第二额外序列具有与第一标签的至少部分碱基序列互补的序列。

[0103] 在用于PCR的试剂盒中，第一决定子可为第一靶标DNA的正向引物，第二决定子可为第一靶标DNA的反向引物。

[0104] 在用于PCR的试剂盒中，第二决定子可为第一靶标DNA的正向引物，第一决定子可为一靶标DNA的反向引物。

[0105] 在竞争性构建体中，第一额外序列可以由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

[0106] 在竞争性构建体中，第二额外序列可以由以下物质构成：DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、HNA、GNA、TNA、CeNA或它们的组合。

[0107] 在竞争性构建体中，第二核酸复合物可包含发出第一光的荧光分子，并且第一核酸复合物可包含淬灭剂分子，所述淬灭剂分子接受第一光然后发出第二光，或者吸收第一光。

[0108] 在竞争性构建体中，第一核酸复合物可包括发出第一光的荧光分子，并且第二核酸复合物可包含淬灭剂分子，所述淬灭剂分子接受第一光然后发出第二光，或者吸收第一光。

[0109] 在用于PCR的试剂盒中，PCR试剂盒中包含的至少一种竞争性构建体的总质量可以大于PCR试剂盒中所包含的至少一种第一核酸复合物的总质量和PCR试剂盒中所包含的至少一种第二核酸复合物的总质量中的至少一个。

[0110] 在用于PCR的试剂盒中，PCR试剂盒中包含的至少一种竞争性构建体的总质量可以是PCR试剂盒中所包含的至少一种第一核酸复合物的总质量和PCR试剂盒中所包含的至少一种第二核酸复合物的总质量中的至少一个的两倍或更高。

[0111] <核酸复合物1>

[0112] 1.核酸复合物1

[0113] 图1是根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0114] 如图1所示，根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100和标签200。

[0115] 1.1核酸复合物1的构造

[0116] 1.1.1决定子100

[0117] 1.1.1.1决定子100的组分

[0118] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可以包含核酸和/或核酸类似物。决定子100可以包含核酸的单位分子。决定子100可以包含核酸类似物的单位分子。决定子100可以包含核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。

[0119] 1.1.1.1.1核酸单位分子

[0120] 决定子100可以包含核酸的单位分子。

[0121] 在一个实例中，决定子100可包含作为核酸的DNA的单位分子。DNA的单位分子可为下式1表示的物质。

[0122] [式1]

[0123]

[0124] 式1的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)。或者，式1的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0125] 在另一实例中，决定子100可以包含作为核酸的RNA的单位分子。RNA的单位分子可为下式2表示的物质。

[0126] [式2]

[0127]

[0128] 式2的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式2的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0129] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可包含核酸的单位分子。

[0130] 在一个实例中，决定子100可以由核酸的单位分子构成。在具体实例中，决定子100可以由DNA的单位分子构成。或者，决定子100可以由RNA的单位分子构成。

[0131] 在另一实例中，决定子100可以由核酸的单位分子的聚合物构成。作为具体示例，决定子100可以由DNA的单位分子的聚合物构成。或者，决定子100可以由RNA单位分子的聚合物构成。

[0132] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可以包含第一核酸的单位分子和第二核酸的单位分子。决定子100可以至少包括第一核酸和第二核酸。

[0133] 决定子100中包含的第一核酸和第二核酸可以彼此直接连接。换言之，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端彼此直接连接。

[0134] 决定子100中包含的第一核酸和第二核酸可以通过特定化合物进行连接。换言之，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物进行连接。

[0135] 在一个实例中，决定子100可以以如下形式提供：将第一核酸的单位分子和第二核酸的单位分子连接。作为具体实例，决定子100可以以如下形式提供：其中，将DNA的单位分子和RNA的单位分子连接。或者，决定子100可以以如下形式提供：其中，DNA的单位分子和DNA的单位分子通过特定化合物(例如，交联剂)连接。或者，决定子100可以以如下形式提供：其中，RNA的单位分子和RNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0136] 在另一实例中，决定子100可以以如下形式提供：其中，将第一核酸的单位分子的聚合物和第二核酸的单位分子连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，将DNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子连接。此外，可将决定子100配置为如下形式：其中，将RNA的单位分子的聚合物和DNA的单位分子连接。或者，可将决定子100配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和DNA的单位分子通过特定化合物连接。或者，可将决定子100配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0137] 在又一实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，将第一核酸的单位分子的聚合物和第二核酸的单位分子的聚合物连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，将DNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子的聚合物连接。或者，可将决定子100配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和DNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。或者，可将决定子100配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。

[0138] 1.1.1.1.2核酸类似物的单位分子

[0139] 决定子100可以包含核酸类似物的单位分子。

[0140] 在一个实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的PNA的单位分子。PNA的单位分子可为下式3表示的物质。

[0141] [式3]

[0142]

[0143] 式3的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式3的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0144] 在另一实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的LNA的单位分子。LNA的单位分子可为下式4表示的物质。

[0145] [式4]

[0146]

[0147] 式4的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式4的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0148] 在另一实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的BNA的单位分子。BNA的单位分子可为下式5表示的物质。

[0149] [式5]

[0150]

[0151] 式5的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式5的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0152] 在另一实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的HNA的单位分子。HNA的单位分子可为下式6表示的物质。

[0153] [式6]

[0154]

[0155] 式6的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式6的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0156] 在另一实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的GNA的单位分子。GNA的单位分子可为下式7表示的物质。

[0157] [式7]

[0158]

[0159] 式7的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式7的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0160] 在另一实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的TNA的单位分子。TNA的单位分子可为下式8表示的物质。

[0161] [式8]

[0162]

[0163] 式8的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式8的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0164] 在另一实例中，决定子100可包含作为核酸类似物的CeNA的单位分子。CeNA的单位分子可为下式9表示的物质。

[0165] [公式9]

[0166]

[0167] 式9的碱基可为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。或者，式9的碱基可为基于嘌呤或嘧啶的衍生物，例如次黄嘌呤或黄嘌呤。

[0168] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可包含核酸类似物的单位分子。

[0169] 在一个实例中，决定子100可以由核酸类似物的单位分子构成。在具体实例中，决定子100可以由LNA的单位分子构成。

[0170] 在另一实例中，决定子100可以由核酸类似物的单位分子的聚合物构成。在具体实例中，决定子100可以由PNA的单位分子的聚合物构成。

[0171] 根据本申请的另一示例性实施方式，决定子100可包含第一核酸类似物的单位分子和第二核酸类似物的单位分子。决定子100可至少包含第一核酸类似物和第二核酸类似物。

[0172] 决定子100中包含的第一核酸类似物和第二核酸类似物可以彼此直接连接。换言之，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端彼此直接连接。

[0173] 决定子100中包含的第一核酸类似物和第二核酸类似物可以通过特定化合物连接。换言之，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0174] 在一个实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，第一核酸类似物的单位分子和第二核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将决定子100配置为其中PNA的单位分子和LNA的单位分子连接的形式。

[0175] 在另一实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，第一核酸类似物的单位分子的聚合物与第二核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，TNA的单位分子的聚合物和GNA的单位分子连接。或者，可将决定子100配置为如下形式：其中，CeNA的单位分子的聚合物和CeNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0176] 在又一实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，第一核酸类似物的单位分子的聚合物和第二核酸类似物的单位分子的聚合物连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，BNA的单位分子的聚合物和HNA的单位分子的聚合物连接。或者，可将决定子100配置为如下形式：其中，LNA的单位分子的聚合物和LNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。

[0177] 1.1.1.1.3核酸单位分子与核酸类似物单位分子的组合

[0178] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可以包含核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。决定子100可以至少包含第一核酸和第一核酸类似物。

[0179] 决定子100中包含的第一核酸和第一核酸类似物可以彼此直接连接。换言之，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端可以彼此直接连接。

[0180] 决定子100中包含的第一核酸和第一核酸类似物可以通过特定化合物连接。换言之，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端可以通过特定化合物连接。

[0181] 在一个实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，DNA的单位分子和LNA的单位分子连接。

[0182] 在另一实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，核酸类似物的单位分子的聚合物和核酸的单位分子连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，PNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子连接。

[0183] 在又一实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，核酸的单位分子的聚合物与核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和GNA的单位分子连接。

[0184] 在又一实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子的聚合物连接。在具体实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和CeNA的单位分子的聚合物连接。

[0185] 至此，已经详细描述了可以构成决定子100的物质及其构造。然而，具体实施方式仅提供用来帮助理解根据本申请的决定子100，这并不意味着决定子100应被解释为限于包含本文公开的物质。

[0186] 换言之，决定子100可以被解释为包含本说明书中未公开的核酸类似物的单位分子。此处，核酸类似物的单位分子可包含碱基，并具有其中除碱基之外的至少部分组分被化学修饰的形式。

[0187] 此外，可理解的是，在本领域普通技术人员容易设计和改变的范围内，决定子100可包含如下物质：其中式1至式9中的至少一种被化学修饰。例如，决定子100可包含脱氧胞苷三磷酸(dCTP)，其中，胞嘧啶(C)结合至式1的碱基，并且两个磷酸进一步结合至式1的磷酸。

[0188] 在下文中，将详细描述根据本申请的示例性实施方式的决定子100的操作和实例。根据先前描述的决定子100的物质特性以及下文描述的决定子100的操作和实例，将更清楚地理解决定子100的定义和功能。

[0189] 1.1.1.2决定子100的操作

[0190] 根据本申请的示例性实施方式的决定子100可以包含与特定碱基序列互补结合的区域。决定子100可以包含特异性结合特定碱基序列的区域。例如，特定碱基序列可为与决定子100的至少部分碱基序列互补的碱基序列。

[0191] 表述“决定子100包含互补结合特定碱基序列的区域”可指决定子100的至少部分区域的电性质、化学性质和物理性质中的至少一种性质与特定碱基序列相对应。

[0192] 在一个实例中，决定子100可包含其中可能出现与特定碱基序列的化学结合力的区域。换言之，决定子100可包含被配置为能够与特定碱基序列形成共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种键的区域。

[0193] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可具有独特的碱基序列。根据决定子100中所包含的核酸的单位分子和/或核酸类似物的单位分子的碱基类型(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤等)，决定子100可具有独特的碱基序列。

[0194] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可以互补地结合特定的碱基序列。决定子100可特异性结合特定的碱基序列，所述特定的碱基序列与决定子100的至少部分独特碱基序列具有互补性。决定子100可通过决定子100的独特碱基序列的至少部分与特定碱基序列之间的氢键互补地结合至该特定碱基序列。

[0195] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可确定能够互补结合到其上的不同物质。换言之，决定子100可特异性地结合至特定碱基序列，从而使得能够将决定子100的结合靶标物质确定为包含该特定碱基序列的不同物质(例如，包含特定碱基序列的ssDNA)。

[0196] 1.1.1.3决定子100的实例

[0197] 1.1.1.3.1包含核酸和/或核酸类似物的单链

[0198] 根据本申请的示例性实施方式的决定子100可为包含核酸和/或核酸类似物的单链。

[0199] 决定子100可由至少一种核酸和/或核酸类似物构成。当决定子100由多个核酸和/或核酸类似物构成时，可将决定子100中包含的多个核酸和/或核酸类似物彼此连接，从而使决定子100以单链形成。

[0200] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可特异性结合包含与决定子100的碱基序列互补的序列的核酸。决定子100的至少部分碱基序列可特异性结合具有与决定子100的碱基序列互补的序列的核酸。

[0201] 在一个实例中，决定子100的所有碱基序列可特异性结合包含与决定子100的碱基序列互补的序列的核酸。在具体实例中，当决定子100为5`-AAACGGCTCAAATTTTT-3`时，决定子100可以特异性结合包含5′-AAAAATTTGAGCCGTTT-3′的核酸。在另一具体实例中，当决定子100为5′-AAACGGCTCAAATTTTT-3′时，决定子100可以特异性结合包含5′-AAAAATTTGAG-3′的核酸。

[0202] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可包含1mer至100mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，决定子100可包含5mer至50mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，决定子100可包含15mer至30mer的核酸和/或核酸类似物。当决定子100包含至少15mer的核酸和/或核酸类似物时，与具有10mer或更少的核酸和/或核酸类似物时相比，决定子100与靶标核酸的反应性可有所改善。

[0203] 1.1.1.3.2引物

[0204] 根据本申请的示例性实施方式的决定子100可为PCR引物。

[0205] 决定子100可特异性结合特定碱基序列。特定碱基序列可为与决定子100的至少部分碱基序列互补的碱基序列。

[0206] 当进行PCR时，决定子100可结合至靶标核酸(例如，包含特定碱基序列的靶标DNA)，并且核苷酸连接至决定子100的3'端，从而使得在决定子100的3'端处进行延伸。换言之，随PCR的进行，结合至靶标核酸的决定子100可以在决定子100的3'端处通过聚合酶进行延伸，以将核苷酸(例如，dNTP或ddNTP)连接至决定子100的3'端。

[0207] 在具体实例中，当决定子100为5′-AAACGGCTCAAATTTTT-3′时，决定子100可特异性结合包含5′-AAAAATTTGAGCCGTTT-3′的靶标核酸，并且具有与临近靶标核酸的5'端的区域中的碱基互补的碱基序列的核酸的单位分子(例如核苷酸)可以连接至决定子100的3'端，从而使得决定子100的3'末端处进行延伸。

[0208] 根据本申请的示例性实施方式，核苷酸可以通过共价键连接至决定子100的3'端。在一个实例中，当决定子100由DNA的单位分子的聚合物构成时，核苷酸可以通过决定子100的3'端的糖的H基团和待连接至决定子100的3'端的核苷酸的磷酸基团的OH基团之间的共价键连接至决定子100的3'端。

[0209] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100可包含1mer至50mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，决定子100可包含5mer至30mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，决定子100可包含10mer至25mer的核酸和/或核酸类似物。当决定子100包含至少15mer的核酸和/或核酸类似物时，与包含10mer或更少的核酸和/或核酸类似物时相比，决定子100与靶标核酸的反应性可得到改善。

[0210] 根据本申请的另一实施方式，决定子100可包含至少两个或更多个核酸，并且第一核酸和第二核酸可以通过特定化合物连接。决定子100可包含至少两种核酸的单位分子，并且第一核酸(核酸的单位分子或核酸的单位分子的聚合物)和第二核酸(核酸的单位分子或核酸的单位分子的聚合物)可以通过特定化合物连接。

[0211] 在一个实例中，可将决定子100配置为如下形式：其中，由DNA的单位分子的聚合物构成的第一链和由DNA的单位分子的聚合物构成的第二链通过特定化合物连接。在更具体的实例中，决定子100可以以如下形式提供：其中，第一链和第二链通过多聚脱氧肌苷接头连接。在一些情况中，可提供处于如下形式的决定子100：其中，第一链和相对短于第一链的第二链通过多聚脱氧肌苷接头连接。

[0212] 1.1.2标签200

[0213] 1.1.2.1标签200的组分

[0214] 1.1.2.1.1化合物

[0215] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含含有F、N、O和H中的至少一种以实现氢键键合的化合物。

[0216] 在一个实例中，标签200可为通过聚合含有F、N、O和H中的至少一种的单体而产生的聚合物。

[0217] 在具体实例中，标签200可由如下式10的单位分子的聚合物构成。

[0218] [式10]

[0219]

[0220] 在另一实例中，标签200可具有如下形式：其中，第一聚合物和第二聚合物通过特定化合物连接，所述第一聚合物通过聚合含有F、N、O和H中的至少一种的单体而产生，所述第二聚合物通过聚合含有F、N、O和H中的至少一种的单体而产生。

[0221] 在又一实例中，标签200可具有如下形式：其中，聚合物和任意化合物连接，所述聚合物通过聚合含有F、N、O和H中的至少一种的单体而产生。

[0222] 1.1.2.1.2核酸和/或核酸类似物

[0223] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含核酸和/或核酸类似物。标签200可包含核酸的单位分子。标签200可包含核酸类似物的单位分子。标签200可包含核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。

[0224] 1.1.2.1.2.1核酸的单位分子

[0225] 标签200可包含核酸的单位分子。

[0226] 在一个实例中，标签200可包含作为核酸的DNA的单位分子。DNA的单位分子可为由上述式1表示的物质。

[0227] 在另一实例中，标签200可包含作为核酸的RNA的单位分子。RNA的单位分子可为由上述式2表示的物质。

[0228] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含核酸的单位分子。

[0229] 在一个实例中，标签200可由核酸的单位分子构成。在具体实例中，标签200可由DNA的单位分子构成。或者，标签200可由RNA的单位分子构成。

[0230] 在另一实例中，标签200可由核酸的单位分子的聚合物构成。在具体实例中，标签200可由DNA的单位分子的聚合物构成。或者，标签200可由RNA的单位分子的聚合物构成。

[0231] 根据本申请的另一实施方式，标签200可包含第一核酸的单位分子和第二核酸的单位分子。标签200可至少包含第一核酸和第二核酸。

[0232] 标签200中包含的第一核酸和第二核酸可以彼此直接连接。换言之，标签200可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端彼此直接连接。

[0233] 标签200中包含的第一核酸和第二核酸可以通过特定化合物连接。换言之，标签200可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0234] 在一个实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，第一核酸的单位分子和第二核酸的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子和RNA的单位分子连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子和DNA的单位分子通过特定化合物连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，RNA的单位分子和RNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0235] 在另一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，第一核酸的单位分子的聚合物和第二核酸的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和DNA的单位分子连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和DNA的单位分子通过特定化合物连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0236] 在又一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，第一核酸的单位分子的聚合物和第二核酸的单位分子的聚合物连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子的聚合物连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和DNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。

[0237] 1.1.2.1.2.2核酸类似物的单位分子

[0238] 标签200可包含核酸类似物的单位分子。

[0239] 在一个实例中，标签200可包含作为核酸类似物的PNA的单位分子。PNA的单位分子可为由上述式3表示的物质。

[0240] 在另一实例中，标签200可包含作为核酸类似物的LNA的单位分子。LNA的单位分子可为由上述式4表示的物质。

[0241] 在又一实例中，标签200可包含作为核酸类似物的BNA的单位分子。BNA的单位分子可为由上述式5表示的物质。

[0242] 在又一实例中，标签200可包含作为核酸类似物的HNA的单位分子。HNA的单位分子可为由上述式6表示的物质。

[0243] 在又一实例中，标签200可包含作为核酸类似物的GNA的单位分子。GNA的单位分子可为由上述式7表示的物质。

[0244] 在又一实例中，标签200可包含作为核酸类似物的TNA的单位分子。TNA的单位分子可为由上述式8表示的物质。

[0245] 在又一实例中，标签200可包含作为核酸类似物的CeNA的单位分子。CeNA的单位分子可为由上述式9表示的物质。

[0246] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含核酸类似物的单位分子。

[0247] 在一个实例中，标签200可以由核酸类似物的单位分子构成。在具体实例中，标签200可以由LNA的单位分子构成。

[0248] 在另一实例中，标签200可以由核酸类似物的单位分子的聚合物构成。在具体实例中，标签200可以由PNA的单位分子的聚合物构成。

[0249] 根据本申请的另一实施方式，标签200可包含第一核酸类似物的单位分子和第二核酸类似物的单位分子。标签200可以至少包含第一核酸类似物和第二核酸类似物。

[0250] 标签200中包含的第一核酸类似物和第二核酸类似物可以彼此直接连接。换言之，标签200可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端彼此直接连接。

[0251] 标签200中包含的第一核酸类似物和第二核酸类似物可以通过特定化合物连接。换言之，标签200可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0252] 在一个实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，第一核酸类似物的单位分子和第二核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，PNA的单位分子和LNA的单位分子连接。

[0253] 在另一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，第一核酸类似物的单位分子的聚合物和第二核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，TNA的单位分子的聚合物和GNA的单位分子连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，CeNA的单位分子的聚合物和CeNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0254] 在又一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，第一核酸类似物的单位分子的聚合物和第二核酸类似物的单位分子的聚合物连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，BNA的单位分子的聚合物和HNA的单位分子的聚合物连接。或者，可将标签200配置为如下形式：其中，LNA的单位分子的聚合物和LNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。

[0255] 1.1.2.1.2.3核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子的组合

[0256] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。标签200可以至少包含第一核酸和第一核酸类似物。

[0257] 标签200中包含的第一核酸和第一核酸类似物可以彼此直接连接。换言之，标签200可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端彼此直接连接。

[0258] 标签200中包含的第一核酸和第一核酸类似物可以通过特定化合物连接。换言之，标签200可以以如下形式提供：其中，第一核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0259] 在一个实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子和LNA的单位分子连接。

[0260] 在另一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，核酸类似物的单位分子的聚合物和核酸的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，PNA的单位分子的聚合物和RNA的单位分子连接。

[0261] 在又一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物和GNA的单位分子连接。

[0262] 在又一实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子的聚合物连接。在具体实例中，可将标签200配置为如下形式：其中，RNA的单位分子的聚合物和CeNA的单位分子的聚合物连接。

[0263] 至此，已经详细描述了可构成标签200的物质及其构造。然而，具体实施方式仅提供用于帮助理解根据本申请的标签200，这并不意味着标签200应被解释为限于包含本文公开的物质。

[0264] 换言之，可以理解为标签200包含本文未公开的化合物。

[0265] 此外，可以理解为标签200包含本文未公开的核酸类似物的单位分子。此处，核酸类似物的单位分子包含碱基，并且与核苷酸相比，除碱基以外的至少部分组分可以被化学修饰。

[0266] 此外，可以理解为标签200包含如下物质：其中在本领域普通技术人员容易设计和修饰的范围内，式1至10中的至少一种被化学修饰。例如，标签200可包含胸苷二磷酸(TDP)，其中，胸苷(T)结合至式2的碱基，并且一个磷酸进一步结合至式2的磷酸。

[0267] 在下文中，将详细描述根据本申请的示例性实施方式的标签200的操作和实例。根据上文描述的标签200的物质特性以及下文将描述的标签200的操作和实例，将更清楚地理解标签200的定义和功能。

[0268] 1.1.2.2标签200的操作

[0269] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含互补结合特定碱基序列的区域。标签200可包含特异性结合特定碱基序列的区域。在一个实例中，特定碱基序列可为与标签200的至少部分碱基序列互补的碱基序列。

[0270] 表述“标签200包含互补结合特定碱基序列的区域”可指标签200的至少部分区域中的电性质、化学性质和物理性质中的至少一种性质与特定碱基序列相对应。

[0271] 在一个实例中，标签200可包含其中可能发生与特定碱基序列的化学结合力的区域。换言之，标签200可包含被配置为可与特定碱基序列形成共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种键的区域。

[0272] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含互补结合不同核酸复合物1的区域。标签200可包含互补结合不同核酸复合体1的标签200的区域。

[0273] 在一个实例中，当标签200由化合物构成时，标签200中包含的化合物可具有独特的化学结构。标签200可根据标签200中所包含的化合物的元素之间的距离和标签200中所包含的化合物的元素类型而具有独特的化学结构。

[0274] 标签200可互补结合具有特定化学结构的不同核酸复合物1的标签200。通过与对应于标签200的独特化学结构的特定化学结构的氢键键合，标签200可互补结合至不同核酸复合物1的标签200。

[0275] 在具体实例中，当标签200和不同核酸复合物1的标签200具有式10的单位分子的聚合物时，标签200的氢可以通过氢键键合至不同核酸复合物1的标签200的氢上，并且标签200的氮可以通过氢键键合至不同核酸复合物1的标签200的氢上。

[0276] 在另一实例中，当标签200包含核酸和/或核酸类似物的单位分子时，标签200可具有独特的碱基序列。标签200可根据标签200中所包含的核酸的单位分子和/或核酸类似物的单位分子的碱基类型(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤等)而具有独特的碱基序列。

[0277] 标签200可互补结合包含特定碱基序列的不同核酸复合物1的标签200。通过与对应于标签200的至少部分独特碱基序列的特定碱基序列的氢键键合，标签200可互补结合至不同核酸复合物1的标签200。

[0278] 在具体实例中，当标签200和不同核酸复合物1的标签200具有DNA单位分子的聚合物时，标签200的碱基序列中的胞嘧啶(C)可与不同核酸复合物1的标签200的碱基序列中的鸟嘌呤(G)形成氢键，标签200的碱基序列中的腺嘌呤(A)可与标签200的碱基序列中的胸腺嘧啶(T)形成氢键。

[0279] 1.1.2.3标签200的实例

[0280] 1.1.2.3.1包含核酸和/或核酸类似物的单链

[0281] 根据本申请的示例性实施方式的标签200可为包含核酸和/或核酸类似物的单链。

[0282] 标签200可由至少一种核酸和/或核酸类似物构成。当标签200由多个核酸和/或核酸类似物构成时，标签200中包含的多个核酸和/或核酸类似物可以彼此连接，以使得标签200以单链形成。

[0283] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可特异性结合不同核酸复合物1的标签200，所述不同核酸复合物1的标签200包含与标签200的碱基序列互补的序列。标签200的至少部分碱基序列可特异性结合至不同核酸复合物1的标签200。

[0284] 在一个实例中，标签200的所有碱基序列可特异性结合至不同核酸复合物1的标签200。在具体实例中，当标签200为AAAAAAAAAA(SEQ ID NO：5)时，标签200可特异性结合包含TTTTTTTTTT(SEQ ID NO：7)的不同核酸复合物1的标签200。

[0285] 在另一实例中，标签200的部分碱基序列可特异性结合不同核酸复合物1的标签200。在具体实例中，当标签200为AAAAAAAAAA(SEQ ID NO：5)时，标签200可特异性结合包含TTTTTTTT(SEQ ID NO：3)的不同核酸复合物1的标签200。标签200的至少两个碱基(即AA)可不参与键合。

[0286] 与此相关的根据本申请示例性实施方式的核酸复合物1的操作将在2.2(涉及标签200)和2.4(涉及根据实施例7的核酸复合物对10的应用)中详细描述。

[0287] 根据本申请的示例性实施方式，标签200包含1mer至50mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，标签200包含3mer至25mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，标签200包含5mer至20mer的核酸和/或核酸类似物。

[0288] 1.1.2.3.2用于PCR钳制的探针

[0289] 根据本申请的示例性实施方式的标签200可为用于PCR钳制的探针。标签200可为包含核酸和/或核酸类似物的单链，其与PCR中使用的引物具有至少一个不同的碱基序列。

[0290] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可以形成为与决定子100的碱基序列具有至少一个不同的碱基序列。标签200可特异性结合具有类似于与决定子100结合的特定碱基序列的序列的核酸。

[0291] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可以防止决定子100错配结合至与决定子100的靶标碱基序列相似的相似序列(即，对应于决定子100的至少部分碱基序列的碱基序列)。标签200可以特异性地结合至与靶碱基序列相似的相似序列，以防止决定子100错配结合至与靶碱基序列相似的相似序列。

[0292] 在具体实例中，当标签200为5`-GAACGCCATC-3时，决定子100为5′-TACGAATGCCATC-3′，决定子100特异性结合的靶碱基序列为3′-ATGCTTACGGTAG-5′，标签200可以特异性结合至3′-ATGCTTGCGGTAG-3′中的5`-CTTGCGGTAG-3`，所述5`-CTTGCGGTAG-3`是与靶标碱基序列相似的相似序列。因此，标签200可以防止决定子100与相似序列的错配结合。

[0293] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可包含1mer至50mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，标签200包含5mer至30mer的核酸和/或核酸类似物。优选地，标签200包含10mer至25mer的核酸和/或核酸类似物。当标签200包含至少15mer或更多的核酸和/或核酸类似物时，与标签200包含10mer或更少的核酸和/或核酸类似物时相比，标签200与相似序列的反应性可得到改善。

[0294] 至此，已经详细说明了包含决定子100和标签200的核酸复合物1中的每个元件(即，决定子100和标签200)的材料、操作和实例。

[0295] 在下文中，将详细描述核酸复合物1的元件(包括决定子100和标签200)之间的位置关系。

[0296] 1.2核酸复合物1的元件之间的位置关系

[0297] 图2是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0298] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100和标签200。核酸复合物1的决定子100和标签200可具有预定的位置关系。

[0299] 根据本申请的示例性实施方式，可将决定子100和标签200连接。换言之，决定子100的一端和标签200的一端可彼此直接连接。

[0300] 可以基于化学结合力将决定子100的一端和标签200的一端连接。可以基于共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种将决定子100的一端和标签200的一端连接。在一个实例中，决定子100和标签200可以通过共价键连接。

[0301] 在具体实例中，决定子100和标签200可以以以下形式连接：其中，标签200的3'端和决定子100的5'端直接连接(参见图2(a))。当决定子100和标签200各自由DNA的单位分子的聚合物构成时，决定子100和标签200可通过标签200的3'端的糖的H基团和决定子100的5'端的磷酸基团的OH基团的共价键连接。

[0302] 在另一具体实例中，决定子100和标签200可以以以下形式连接：其中，标签200的5'端和决定子100的3'端直接连接(参见图2(b))。当决定子100和标签200各自由DNA的单位分子的聚合物构成时，决定子100和标签200可通过决定子100的3'端的糖的H基团和标签
200的5'端的磷酸基团的OH基团的共价键连接。

[0303] 根据本申请的另一实施方式，决定子100和标签200可通过另外的材料连接。在一个实例中，决定子100的一端和标签200的一端可通过特定的化合物连接。将参考与其相关的具体实例对核酸复合体1的元件之间的位置关系(在下文4.2中描述)进行详细描述。

[0304] 上文中，描述了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1。除了包含标记300，以下将描述的根据第一示例性实施方式的核酸复合物1与上述所述核酸复合物1相同。因此，为了说明第一示例性实施方式，将相同的附图标记分配给与上述实施方式的组件相同的组件，并且将省略其详细描述。

[0305] 2.根据第一示例性实施方式的核酸复合物1

[0306] 2.1根据第一示例性实施方式的核酸复合物1的构造

[0307] 图3是说明了根据本申请的第一示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0308] 如图3所示，根据本申请的第一示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200和标记300。

[0309] 2.1.1标记300

[0310] 2.1.1.1标记300的组分

[0311] 2.1.1.1.1颗粒

[0312] 根据本申请的示例性实施方式，标记300可包括具有物理性质(例如，尺寸)和化学性质(例如，化学结构变化)的小物质。

[0313] 在一个实例中，标记300可为金属纳米颗粒。标记300可包含过渡金属、后过渡金属和/或类金属，或者可为尺寸为数纳米到数百纳米(约10-9m)的颗粒。

[0314] 在另一实例中，标记300可为磁性纳米颗粒。标记300可为包含铁氧化物(Fe2O3或Fe3O4)、铁素体(Fe3O4中的一个Fe变为不同的磁性原子(例如，CoFe2O4或MnFe2O4))、和/或合金(与贵金属合金化，以用于提高电导率和稳定性并解决由磁性原子引起的氧化问题，例如FePt或CoPt)，并具有数纳米至数百纳米的大小(约10-9m)。

[0315] 在又一实例中，标记300可为乳胶珠。标记300可为包含无定形聚合物(如聚苯乙烯)并具有胶体尺寸的球形聚合物颗粒。

[0316] 2.1.1.1.2能量供体/受体

[0317] 标记300可包含供能的颗粒。标记300可包含接受能量的颗粒。标记300可包含提供和接受能量的颗粒。

[0318] 由标记300提供或接受的能量可以包括化学能、电能、光能和磁场能中的至少一种。

[0319] 根据本申请的示例性实施方式，标记300可包含供能的颗粒。

[0320] 在一个实例中，标记300可为提供电子能量的颗粒。在具体实例中，标记300可为失去电子的氧化性物质。

[0321] 在另一实例中，标记300可为提供荧光共振能量的颗粒。在具体实例中，标记300可为发光物质。标记300可为当投射光时发出其自己的波长的光的荧光分子。例如，标记300可为FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Oregon TAMRA、ROX、花青-3、花青-3.5、花青-5、花青-5.5、水母发光蛋白或青色荧光蛋白(CFP)。

[0322] 根据本申请的示例性实施方式，标记300可包括接受能量的颗粒。

[0323] 在一个实例中，标记300可为接受电子能量的颗粒。在具体实例中，标记300可为获得电子的还原性物质。

[0324] 在另一实例中，标记300可为接受荧光共振能量的颗粒。在具体实例中，标记300可为淬灭材料。标记300可为黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher，BHQ)。例如，BHQ可为如下式11至式14中的任一种。

[0325] [式11]

[0326]

[0327] [式12]

[0328]

[0329] [式13]

[0330]

[0331] [式14]

[0332]

[0333] 在另一具体实例中，标记300可为荧光转换材料。标记300可为通过接受来自水母发光蛋白的能量而发出508nm的绿色荧光的绿色荧光蛋白(GFP)。或者，标记300可为通过接受来自青色荧光蛋白(CFP)的能量而发出535nm的黄色荧光的黄色荧光蛋白(YFP)。

[0334] 至此，已经详细描述了构成标记300的物质。然而，具体的实例仅用于帮助理解根据本申请的标记300，并且这并不意味着标记300应被解释为限于包含本文公开的物质。

[0335] 在下文中，将详细描述根据本申请的示例性实施方式的标记300的操作和实例。根据已经在上文描述的标记300的物质特性以及将在下文描述的标记300的操作和实例，将进一步详细地理解标记300的定义和功能。

[0336] 2.1.1.2标记300的操作

[0337] 根据本申请的示例性实施方式的标记300可以涉及对核酸复合物1进行标记。标记300可以充当用于确定关于核酸复合物1的信息的标记物。根据标记300的特性，通过确定关于包含该标记300的核酸复合体1的信息，可由标记300表示所述核酸复合体1。

[0338] 根据本申请的示例性实施方式，基于关于标记300的颗粒的信息(例如，颗粒的尺寸、移动性、定位等)，可以检测核酸复合物1的信息。

[0339] 在具体实例中，当标记300为具有物理性质的颗粒时，可根据是否检测到标记300来确定核酸复合物1的存在或不存在。在另一具体实例中，当标记300为具有物理性质的颗粒时，可根据标记300的位置来确定核酸复合物1的聚集程度。在又一具体实例中，当标记300为具有物理性质的颗粒时，根据标记300的移动路径，可确定核酸复合物1是否移动以及移动的信息(例如，速度)。

[0340] 根据本申请的另一示例性实施方式，可用如下方式检测包含标记300的核酸复合物1的信息：检测由标记300产生的化学信号、电信号、光学信号和磁信号中的至少一种。

[0341] 在具体实例中，当标记300为发射能量的物质时，可基于所发射的能量(即信号)来确定核酸复合物1的存在与否和/或核酸复合物1的分布。

[0342] 在本申请的又一个示例性实施方式中，可通过检测由标记300产生的化学信号、电信号、光学信号和磁信号中的至少一种来检测包含所述标记300的核酸复合物1的信息。

[0343] 在具体实例中，当标记300为接受能量并发射不同于所接受的能量的能量的物质或吸收能量的物质时，可根据在特定环境条件下检测到的标记300的特性来确定核酸复合体1的信息。

[0344] 2.1.1.3标记300的实例

[0345] 2.1.1.3.1金纳米颗粒

[0346] 根据本申请的示例性实施方式的标记300可为金纳米颗粒。标记300可以是包含金并具有数纳米至数百纳米的尺寸的颗粒。

[0347] 根据本申请的示例性实施方式，可用检测关于标记300的颗粒的信息(例如，颗粒的尺寸、移动性、定位等)的方式，对包含所述标记300的核酸复合物1进行标记。

[0348] 在一个实例中，可根据通过光学传感器等是否检测到对应于标记300的尺寸的颗粒来确定所述标记300的存在或不存在。根据是否检测到标记300，可确定核酸复合物1的存在或不存在。

[0349] 在另一实例中，通过借由检测标记300来分析分布，可确定标记300的聚集程度。根据标记300的聚集程度，可确定核酸复合体1的聚集程度。

[0350] 在又一实例中，可根据标记300的移动路径来确定核酸复合物1的移动及其信息(例如，速度)。

[0351] 根据本申请的另一示例性实施方式，可用检测标记300的颗粒反应性的信息的方式对包含所述标记300的核酸复合物1进行标记。

[0352] 在一个实例中，通过对根据向标记300施加一定电压而检测的电流进行分析的方法(例如，循环伏安法)，可确定标记300的颗粒的存在或不存在。根据是否检测到标记300，可确定核酸复合体1的存在或不存在。

[0353] 在另一示例中，通过对根据向标记300施加一定电压而检测到的电流进行分析的方法(例如，循环伏安法)，可确定标记300的分布。根据标记300的分布，可确定核酸复合物1的分布。

[0354] 2.1.1.3.2荧光物质

[0355] 根据本申请的示例性实施方式的标记300可为荧光物质。标记300可为当投射光时发射具有独特波长的光的荧光分子。

[0356] 根据本申请的示例性实施方式，可以以对由标记300产生的化学信号、电信号、光学信号和磁信号中的至少一种进行检测的方式来检测包含标记300的核酸复合物1的信息。

[0357] 在一个实例中，可通过检测由标记300产生的光学信号来确定标记300的颗粒的存在或不存在。通过检测由标记300产生的特定波长段中的信号，可确定标记300的存在或不存在。通过检测由标记300产生的特定波长段中的信号是否超过阈值，可确定标记300的颗粒的存在或不存在。根据是否检测到标记300，可确定核酸复合体1的存在或不存在。

[0358] 在另一实例中，通过检测由标记300产生的光学信号，可确定标记的分布。核酸复合体1的分布可根据标记300的分布来确定。

[0359] 2.1.1.3.3淬灭剂物质

[0360] 根据本申请的示例性实施方式的标记300可为淬灭剂物质。当投射特定波长段中的能量时，标记300可为吸收所述能量的淬灭剂分子，或者可为转换投射的特定波长段的能量并发射经转换的能量的物质。

[0361] 根据本申请的示例性实施方式，可对由标记300产生的化学信号、电信号、光学信号和磁信号中的至少一种进行检测，从而检测包含标记300的核酸复合物1的信息。

[0362] 在一个实例中，通过确定检测的光学信号是否受标记300影响，可确定标记300的存在或不存在。相比在特定环境条件(例如，核酸复合物1的输入等)建立之前由标记300产生的光学信号，当在特定环境条件建立后由标记300产生的光学信号时，可基于是否存在变化和/或变化的程度来对标记300进行标记。根据标记300的标记，可对包含标记300的核酸复合物1进行标记。

[0363] 至此，已经详细地描述了包含决定子100、标签200和标记300的核酸复合物1中的每种元件(即，决定子100、标签200和标记300)的材料、操作和实例。

[0364] 在下文中，将详细描述核酸复合物1的元件(包括决定子100、标签200和标记300)之间的位置关系。

[0365] 2.2核酸复合物1的元件之间的位置关系

[0366] 图4是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0367] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200和标记300。核酸复合物1的决定子100、标签200和标记300可具有预定的位置关系。

[0368] 根据本申请的示例性实施方式，可将决定子100、标签200和标记300连接。决定子100、标签200和标记300可以通过化学结合力连接。决定子100、标签200和标记300可以通过共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种连接。

[0369] 根据本申请的示例性实施方式，标签200可以位于决定子100和标记300之间(参见图4(a))。

[0370] 决定子100可以连接至标签200的一端。决定子100的一端可以通过化学键连接至标签200的一端。决定子100的一端可以直接与标签200的一端连接。或者，标签200的一端和决定子100的一端可以通过特定化合物连接。

[0371] 标记300可以连接到标签200的另一端(即，与标签200的一端不同的端)。标记300的一端可以通过化学键连接至标签200的另一端。标签200的另一端和标记300的一端可以彼此直接连接。或者，标签200的另一端和标记300的一端可以通过特定化合物连接。

[0372] 根据本申请的示例性实施方式，在根据图2(a)和图2(b)的核酸复合物1中，可以进一步包含标记300，并且可以提供被配置为如下的核酸复合物1：标签200连接在标记300和决定子100之间。

[0373] 根据本申请的另一示例性实施方式，标记300可以位于决定子100与标签200之间(参见图4(b))。

[0374] 决定子100可以连接至标记300的一端。决定子100的一端可以通过化学键连接至标记300的一端。标记300的一端和决定子100的一端可以彼此直接连接。或者，标记300的一端和决定子100的一端可以通过特定化合物连接。

[0375] 标签200可以连接至标记300的另一端(即，与标记300的一端不同的端)。标签200的一端可以通过化学键连接至标记300的另一端。标记300的另一端和标签200的一端可以彼此直接连接。标记300的另一端和标签200的一端可以通过特定化合物连接。

[0376] 根据本申请的示例性实施方式，在图2(a)和图2(b)的核酸复合物1中，可进一步包含标记300，并且可提供被配置为如下的核酸复合物1：标记300连接在决定子100和标签200之间。

[0377] 根据本申请的又一示例性实施方式，决定子100可位于标签200和标记300之间(见图4(c))。

[0378] 标签200可以连接至决定子100的一端。标签200的一端可以通过化学键连接至决定子100的一端。决定子100的一端和标签200的一端可以彼此直接连接。或者，决定子100的一端和标签200的一端可以通过特定化合物连接。

[0379] 标记300可以连接至决定子100的另一端(即，与所述决定子100的一端不同的端)。标记300的一端可以通过化学键连接至决定子100的另一端。决定子100的另一端和标记300的一端可以彼此直接连接。决定子100的另一端和标记300的一端可以通过特定化合物连接。

[0380] 根据本申请的示例性实施方式，在根据2(a)和2(b)的核酸复合物1中，可进一步包含标记300，并且可以提供被配置为如下的核酸复合物1：决定子100连接在标签200和标记300之间。

[0381] 在上文中，已经描述了根据本申请的第一示例性实施方式的核酸复合物1。下文将描述的根据第二示例性实施方式的核酸复合物1除了不包含标记300而是进一步包含接头400外，与根据第一示例性实施方式的核酸复合物1相同。因此，为了描述第二示例性实施方式，与上述实施方式的组件共有的组件由相同的附图标记表示，并且将省略其详细描述。

[0382] 3.根据第二示例性实施方式的核酸复合物1

[0383] 3.1根据第二示例性实施方式的核酸复合物1的构造

[0384] 图5是说明了根据本申请的第二示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0385] 如图5所示，根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200和接头400。

[0386] 3.1.1接头400

[0387] 3.1.1.1接头400的材料

[0388] 3.1.1.1.1化合物

[0389] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可为含有H、O、F、N、S、C和P中的至少一种的化合物。接头400可以具有预定的长度，并包含具有H、O、F、N、S、C和P中的至少一种的化合物。

[0390] 在一个实例中，接头400可包含具有至少一个单键的碳。在具体实例中，接头400可包含如下的式15的化合物。作为示例，接头400可为六乙二醇。

[0391] [式15]

[0392]

[0393] 在另一实例中，接头400可包含具有共振结构的碳。或者，接头400可包含具有至少一个双键的碳。在具体实例中，接头400可包含无碱基(abasic)呋喃。例如，接头400可包含如下的式16的化合物。

[0394] [式16]

[0395]

[0396] 3.1.1.1.2核酸和/或核酸类似物

[0397] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可包含核酸类似物和/或修饰的核酸。接头400可包含修饰的核酸的单位分子。接头400可包含核酸类似物的单位分子。接头400可包含修饰的核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。

[0398] 3.1.1.1.2.1修饰的核酸的单位分子

[0399] 接头400可包含修饰的核酸的单位分子。

[0400] 在一个实例中，修饰的核酸的单位分子可为作为核酸的DNA的单位分子的碱基的至少部分结构被修饰的分子。

[0401] 在另一实例中，修饰的核酸的单位分子可为作为核酸的RNA的单位分子的碱基的至少部分结构被修饰的分子。

[0402] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可包含修饰的核酸的单位分子。

[0403] 在一个实例中，接头400可由修饰的核酸的单位分子组成。在具体实例中，接头400可由RNA的单位分子组成，在所述RNA的单位分子中的碱基的部分被修饰。

[0404] 在另一实例中，接头400可由修饰的核酸的单位分子的聚合物组成。在具体实例中，接头400可由DNA的单位分子的聚合物组成，所述DNA的单位分子中的碱基被完全修饰。

[0405] 根据本申请的另一示例性实施方式，接头400可包含第一修饰核酸的单位分子和第二修饰核酸的单位分子。接头400可至少包含第一修饰核酸和第二修饰核酸。

[0406] 接头400中包含的第一修饰核酸和第二修饰核酸可彼此直接连接。换言之，接头400可以以如下形式提供：其中，第一修饰核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端与第二修饰核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端直接连接。

[0407] 接头400中包含的第一修饰核酸和第二修饰核酸可通过特定化合物连接。换言之，接头400可以以如下形式提供：其中，第一修饰核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端与第二修饰核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0408] 在一个实例中，可将接头400配置为其中第一修饰核酸的单位分子与第二修饰核酸的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为其中碱基的至少部分被修饰的DNA的单位分子和碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子连接的形式。或者，可将接头400配置为如下形式：其中，碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子与碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0409] 在另一实例中，可将接头400配置为其中第一修饰核酸的单位分子的聚合物和第二修饰核酸的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为如下形式：其中，DNA的单位分子的聚合物与RNA的单位分子连接，其中，所述DNA的单位分子的碱基的至少部分被修饰，所述RNA的单位分子的碱基的至少部分被修饰。或者，可将接头400配置为如下形式：其中，碱基的至少部分被修饰的DNA的单位分子的聚合物与碱基的至少部分被修饰的DNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0410] 在又一实例中，可将接头400配置为其中第一修饰核酸的单位分子的聚合物和第二修饰核酸的单位分子的聚合物连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为如下形式：其中，碱基的至少部分被修饰的DNA的单位分子的聚合物和碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子的聚合物连接。或者，可将接头400配置为如下形式：其中，碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子的聚合物和碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。

[0411] 3.1.1.1.2.2核酸类似物的单位分子

[0412] 接头400可包含核酸类似物的单位分子。

[0413] 在一个实例中，接头400可包含核酸类似物PNA的单位分子。PNA的单位分子可为由上文所示的式3表示的物质。

[0414] 在另一实例中，接头400可包含核酸类似物LNA的单位分子。LNA的单位分子可为由上文所示的式4表示的物质。

[0415] 在又一实例中，接头400可包含核酸类似物BNA的单位分子。BNA的单位分子可为由上文所示的式5表示的物质。

[0416] 在又一实例中，接头400可包含核酸类似物HNA的单位分子。HNA的单位分子可为由上文所示的式6表示的物质。

[0417] 在又一实例中，接头400可包含核酸类似物GNA的单位分子。GNA的单位分子可为由上文所示的式7表示的物质。

[0418] 在又一实例中，接头400可包含核酸类似物TNA的单位分子。TNA的单位分子可为由上文所示的式8表示的物质。

[0419] 在又一实例中，接头400可包含核酸类似物CeNA的单位分子。CeNA的单位分子可为由上文所示的式9表示的物质。

[0420] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可包含核酸类似物的单位分子。

[0421] 在一个实例中，接头400可由核酸类似物的单位分子构成。在具体实例中，接头400可由LNA的单位分子构成。

[0422] 在另一实例中，接头400可由核酸类似物的单位分子的聚合物构成。在具体实例中，接头400可由PNA的单位分子的聚合物构成。

[0423] 根据本申请的另一示例性实施方式，接头400可包含第一核酸类似物的单位分子和第二核酸类似物的单位分子。接头400可至少包含第一核酸类似物和第二核酸类似物。

[0424] 在接头400中包含的第一核酸类似物和第二核酸类似物可以直接彼此连接。换言之，接头400可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端直接连接。

[0425] 在接头400中包含的第一核酸类似物和第二核酸类似物可通过特定化合物连接。换言之，接头400可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第二核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0426] 在一个实例中，可将接头400配置为其中第一核酸类似物的单位分子和第二核酸类似物的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为其中PNA的单位分子和LNA的单位分子连接的形式。

[0427] 在另一实例中，可将接头400配置为其中第一核酸类似物的单位分子的聚合物和第二核酸类似物的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为其中TNA的单位分子的聚合物和GNA的单位分子连接的形式。或者，可将接头400配置为如下形式：其中，CeNA的单位分子的聚合物和CeNA的单位分子通过特定化合物连接。

[0428] 在又一实例中，可将接头400配置为其中第一核酸类似物的单位分子的聚合物和第二核酸类似物的单位分子的聚合物连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为其中BNA的单元分子的聚合物和HNA的单元分子的聚合物连接的形式。或者，可将接头400配置为如下形式：其中，LNA的单位分子的聚合物和LNA的单位分子的聚合物通过特定化合物连接。

[0429] 3.1.1.1.2.3核酸类似物的单位分子与修饰的核酸的单位分子的组合[0430] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可包含核酸类似物的单位分子和修饰的核酸的单位分子。接头400可至少包含第一核酸类似物和第一修饰核酸。

[0431] 接头400中包含的第一核酸类似物和第一修饰核酸可彼此直接连接。换言之，接头400可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第一修饰核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端直接连接。

[0432] 接头400中包含的第一核酸类似物和第一修饰核酸可以通过特定化合物连接。换言之，接头400可以以如下形式提供：其中，第一核酸类似物的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端和第一修饰核酸的单位分子(或单位分子的聚合物)的一端通过特定化合物连接。

[0433] 在一个实例中，可将接头400配置为其中核酸类似物的单位分子和修饰的核酸的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为如下形式：其中，LNA的单位分子与碱基的至少部分被修饰的DNA的单位分子连接。

[0434] 在另一实例中，可将接头400配置为其中核酸类似物的单位分子的聚合物和修饰的核酸的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为如下形式：其中，PNA的单位分子的聚合物与碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子连接。

[0435] 在又一实例中，可将接头400配置为其中修饰的核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为如下形式：其中，碱基的至少部分被修饰的DNA的单位分子的聚合物与GNA的单位分子连接。

[0436] 在又一实例中，可将接头400配置为其中核酸类似物的单位分子的聚合物和修饰的核酸的单位分子的聚合物连接的形式。在具体实例中，可将接头400配置为如下形式：其中，碱基的至少部分被修饰的RNA的单位分子的聚合物与CeNA的单位分子的聚合物连接。

[0437] 至此，已经详细描述了用于构成接头400的材料及其构造。然而，具体实施方式仅提供用以帮助理解根据本申请的接头400，这并不意味着接头400应被理解为限于包含本文公开的材料。

[0438] 换言之，可理解接头400包含本文未公开的化合物。

[0439] 此外，可以理解的是，接头400包含本文中未公开的核酸类似物的单位分子。此处，所述核酸类似物的单位分子可包含碱基，并具有与核苷酸相比其中除碱基以外的至少部分物质被化学修饰的形式。

[0440] 此外，可理解的是，在本领域的普通技术人员可以容易地设计或修饰接头400的范围内，接头400包含以下物质：其中式1至10以及式15和式16中的至少一种被化学修饰。

[0441] 下文将详细描述根据本申请的示例性实施方式的接头400的操作和实例。根据上文所述的接头400的材料特性以及将要描述的接头400的操作和实例，将更具体地理解接头400的定义和功能。

[0442] 3.1.1.2接头400的操作

[0443] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可用于连接决定子100与标签200。接头400可设置在决定子100和标签200之间。决定子100和标签200可以通过接头400连接。

[0444] 连接子400可以直接结合至决定子100的一端，或者可以通过特定化合物连接。接头400可以基于化学结合力与决定子100的一端连接。接头400可基于共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种与决定子100的一端连接。

[0445] 接头400可以直接结合至标签200的一端，或者可以通过特定化合物连接。接头400可以通过化学结合力与标签200的一端连接。接头400可以基于共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种与标签200的一端连接。

[0446] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可以用于将决定子100与标签200隔开。接头400可用于将决定子100的一端与标签200的一端隔开。

[0447] 根据本申请的示例性实施方式，当将核酸复合物1用于PCR时，接头400可将决定子100与标签200隔开，以阻断读取决定子100的碱基序列的DNA聚合酶对标签200的碱基序列进行读取。这将在下文的3.1.1.3.1(PCR阻断剂)中进一步详细描述。

[0448] 3.1.1.3接头400的实例

[0449] 3.1.1.3.1PCR阻断剂

[0450] 根据本申请的示例性实施方式的接头400可为PCR阻断剂。

[0451] PCR阻断剂可阻断与PCR阻断剂连接的一个区域中的信息，以免被不同的物质(例如，DNA聚合酶)获取。PCR阻断剂可防止产生与PCR阻断剂连接的任一区域的碱基序列的扩增产物。PCR阻断剂可防止DNA聚合酶获取与PCR阻断剂连接的任一区域的信息。

[0452] 除非另外特别定义，本文所使用的“扩增产物”可为由至少一个PCR循环而产生的物质。本文所使用的“扩增产物”可为通过PCR借由共价键连接至少两个核苷酸而产生的物质。

[0453] 除非另有特别定义，本文所使用的“A的扩增产物”可为所生产的具有与A的碱基序列互补的碱基序列的物质。本文所使用的“A的扩增产物”可为所产生的具有与A的碱基序列互补的核苷酸或多核苷酸。可按照如下方式，通过延伸来产生多核苷酸：至少一个核苷酸的糖的H基团与另一核苷酸的磷酸基团的OH基团反应以形成共价键。

[0454] 接头400可防止与接头400连接的决定子100的扩增产物的产生。此外，接头400可防止与接头400连接的标签200的扩增产物的产生。

[0455] 根据本申请的示例性实施方式，接头400可具有预定长度。

[0456] 在一个实例中，接头400可以以超过至少 的长度形成。优选地，接头400以超过至少 的长度形成。优选地，接头400以超过至少 的长度形成。

[0457] 在另一实例中，接头400可以以超过至少1mer的长度形成。优选地，接头400以超过至少3mer的长度形成。优选地，接头400以超过至少5mer的长度形成。

[0458] 在具体实例中，接头400可以包含去除碱基的核酸的单位分子。接头400可为从中去除碱基的DNA单位分子的聚合物。接头400可为从中去除碱基的RNA单位分子的聚合物。

[0459] 在另一具体实例中，接头400可包含其中碱基被修饰的核酸的单位分子。接头400可为其中碱基被修饰的DNA单位分子的聚合物。接头400可为其中碱基被修饰的RNA单位分子的聚合物。

[0460] 在又一具体实例中，接头400可包含核酸类似物的单位分子。接头与400可为PNA的单位分子的聚合物。接头400可为LNA的单位分子的聚合物。

[0461] 在又一具体实例中，接头400可为含有碳的链结构。在具体实例中，接头400可为聚乙二醇(PEG)。

[0462] 至此，已经详细描述了包含决定子100、标签200和接头400的核酸复合物1的每种组分(即，决定子100、标签200和接头400)的材料、操作和实例。

[0463] 在下文中，将详细描述核酸复合物1的组分(包括决定子100、标签200和接头400)之间的位置关系。

[0464] 3.2核酸复合物1的组分之间的位置关系

[0465] 图6是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0466] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200和接头400。核酸复合物1的决定子100、标签200和接头400可具有预定的位置关系。

[0467] 根据本申请的示例性实施方式，决定子100、标签200和接头400可以连接。接头400的与决定子100连接的一侧可以与接头400的与标签200连接的一侧不同。接头400可位于决定子100和标签200之间。

[0468] 决定子100的一端和接头400的一端可以直接连接，或通过特定化合物连接。标签200的一端和接头400的另一端(与接头400的一端不同的端)可以直接连接，或通过特定化合物连接。

[0469] 在一个实例中，决定子100的一端可通过化学键直接连接至接头400的一端，并且标签200的一端可以通过化学键直接连接至接头400的另一端。

[0470] 在另一实例中，接头400的一端可与决定子100的一端直接连接，并且接头400的另一端可以通过特定化合物与标签200的一端连接。

[0471] 在又一实例中，接头400的一端可以通过特定化合物与决定子100的一端连接，并且接头400的另一端可以与标签200的一端直接连接。

[0472] 在又一实例中，接头400的一端可以通过特定化合物与决定子100的一端连接，并且接头400的另一末端可以通过特定化合物与标签200的一端连接。

[0473] 在具体实例中，决定子100、标签200和接头400可以以如下方式连接：标签200的3'端与接头400的一端连接，并且接头400的另一端(与所述接头400的一端不同的端)与决定子100的5'端连接(参见图6(a))。

[0474] 在另一具体实例中，决定子100、标签200和接头400可以以如下方式连接：标签200的3'端和接头400的一端连接，并且接头400的另一端与决定子100的3'端连接(参见图6(b))。

[0475] 在又一具体实例中，决定子100、标签200和接头400可以以如下方式连接：标签200的5'端与接头400的一端连接，并且接头400的另一端与决定子100的5'端连接(参见图6(c))。

[0476] 在又一具体实例中，决定子100、标签200和接头400可以以如下方式连接：标签200的5'端与接头400的一端连接，并且接头400的另一端与决定子100的3'端连接(参见图6(d))。

[0477] 上文中，已经描述了根据本申请的第二示例性实施方式的核酸复合物1。下文中将描述的根据第三示例性实施方式的核酸复合物1除了进一步包含标记300外，与上述核酸复合物1相同。因此，在第三示例性实施方式的描述中，与上述示例性实施方式中的组件相同的组件由相同的附图标记表示，并且省略其详细描述。

[0478] 4.根据第三示例性实施方式的核酸复合物1

[0479] 4.1根据第三示例性实施方式的核酸复合物1的构造

[0480] 图7是说明了根据本申请的第三示例性实施方式的核酸复合物1的图。

[0481] 如图7所示，根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200、标记300和接头400。

[0482] 4.2核酸复合物1的组分之间的位置关系

[0483] 图8是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1的组分之间的位置关系的图。

[0484] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200、标记300和接头400。决定子100、标签200、标记300和接头400可通过化学结合力连接。决定子
100、标签200、标记300和接头400可以基于共价键、氢键、离子键和疏水键中的至少一种连接。

[0485] 核酸复合物1的决定子100、标签200、标记300和接头400可具有预定的位置关系。

[0486] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供如下核酸复合物1：其中的标记300、标签200、接头400和决定子100顺序连接(参见图8(a))。

[0487] 标记300可以连接至标签200的一端。标记300的一端可以通过化学键连接至标签200的一端。标签200的一端和标记300的一端可以彼此直接连接。或者，标签200的一端和标记300的一端可以通过特定化合物连接。

[0488] 接头400可以连接至标签200的另一端(即，与所述标签200的一端不同的端)。接头400的一端可以通过化学键连接至标签200的另一端。标签200的另一端和接头400的一端可以彼此直接连接。或者，标签200的另一端和接头400的一端可以通过特定化合物连接。

[0489] 决定子100可以连接至接头400的另一端(即，与所述接头400的一端不同的端)。决定子100的一端可以通过化学建连接至接头400的另一端。接头400的另一端和决定子100的一端可以彼此直接连接。备选地，接头400的另一端和决定子100的一端可以通过特定化合物连接。

[0490] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供如下核酸复合物1：所述核酸复合物1类似于根据图6(a)至图6(d)的核酸复合物1，但是进一步包含标记300，并且被配置为标记300、标签200、接头400和决定子100顺序连接。

[0491] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供其中的标签200、标记300、接头400和决定子100顺序连接的核酸复合物1(参见图8(b))。

[0492] 标签200可以连接至标记300的一端。标签200的一端可以通过化学键连接至标记300的一端。标记300的一端和标签200的一端可以彼此直接连接。或者，标记300的一端和标签200的一端可以通过特定化合物连接。

[0493] 接头400可以连接至标记300的另一端(即，与所述标记300的一端不同的端)。接头400的一端可以通过化学键连接至标记300的另一端。标记300的另一端和接头400的一端可以彼此直接连接。或者，标记300的另一端和接头400的一端可以通过特定化合物连接。

[0494] 决定子100可以连接至接头400的另一端(即，与所述接头400的一端不同的端)。决定子100的一端可以通过化学键连接至接头400的另一端。接头400的另一端和决定子100的一端可以彼此直接连接。或者，连接体400的另一端和决定子100的一端可以通过特定化合物连接。

[0495] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供如下核酸复合物1：所述核酸复合物1类似于根据图6(a)至图6(d)的核酸复合物1，但是进一步包含标记300，并且被配置为标签200、标记300，接头400和决定子100顺序连接。

[0496] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供其中的标签200、接头400、标记300和决定子100顺序连接的核酸复合物1(参见图8(c))。

[0497] 标签200可以连接至接头400的一端。标签200的一端可以通过化学键连接至接头400的一端。接头400的一端和标签200的一端可以彼此直接连接。或者，接头400的一端和标签200的一端可以通过特定化合物连接。

[0498] 标记300可以连接至接头400的另一端(即，与所述接头400的一端不同的端)。标记300的一端可以通过化学键连接至接头400的另一端。接头400的另一端和标记300的一端可以彼此直接连接。或者，接头400的另一端和标记300的一端可以通过特定化合物连接。

[0499] 决定子100可以连接至标记300的另一端(即，与所述标记300的一端不同的端)。决定子100的一端可以通过化学键连接至标记300的另一端。标记300的另一端和决定子100的一端可以彼此直接连接。或者，标记300的另一端和决定子100的一端可以通过特定化合物连接。

[0500] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供如下核酸复合物1：所述核酸复合物1类似于根据图6(a)至图6(d)的核酸复合物1，但是进一步包含标记300，并且被配置为标签200、接头400、标记300和决定子100顺序地连接。

[0501] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供其中标签200、接头400、决定子100和标记300顺序连接的核酸复合物1(参见图8(d))。

[0502] 标签200可以连接至接头400的一端。标签200的一端可以通过化学键连接至接头400的一端。接头400的一端和标签200的一端可以彼此直接连接。或者，接头400的一端和标签200的一端可以通过特定化合物连接。

[0503] 决定子100可以连接至接头400的另一端(即，与所述接头400的一端不同的端)。决定子100的一端可以通过化学键连接至接头400的另一端。接头400的另一端和决定子100的一端可以彼此直接连接。或者，接头400的另一端和决定子100的一端可以通过特定化合物连接。

[0504] 标记300可以连接至决定子100的另一端(即，与所述决定子100的一端不同的端)。标记300的一端可以通过化学键连接至决定子100的另一端。决定子100的另一端和标记300的一端可以彼此直接连接。或者，决定子100的另一端和标记300的一端可以通过特定化合物连接。

[0505] 根据本申请的示例性实施方式，可以提供如下核酸复合物1：所述核酸复合物1类似于根据图6(a)至图6(d)的核酸复合物1，但是进一步包含标记300，并且被配置为标签200、接头400、决定子100和标记300顺序地连接。

[0506] 至此，已经详细描述了根据本申请的多个示例性实施方式的核酸复合物1。然而，根据本申请的核酸复合物1可以以如下形式呈现：除上述组分之一之外，进一步包含不同组分，具有多个特定组分和/或一些修饰的元件。

[0507] 因此，为了解释本申请的范围，本申请的范围应根据解释该范围中描述的术语和权利要求这一基本原理来确定，不应被理解为限于本文所公开的构造和形式。

[0508] 在下文中，将详细描述包含至少两个核酸复合物1的核酸复合物对10的构造和操作。

[0509] <核酸复合物对10>

[0510] 1.核酸复合物对10的构造

[0511] 图9是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0512] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10可至少包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。核酸复合物对10可由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成。核酸复合物对10可以以一对第一核酸复合物110和第二核酸复合物120提供。

[0513] 第一核酸复合物110可为根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1中的任一种。第一核酸复合物110可包含第一决定子111、第一标签112、第一接头114和第一标记113中的至少一种组分。在一个实例中，第一核酸复合物110可包含第一决定子111、第一标签112、第一标记113和第一接头114。在另一实例中，第一核酸复合物110可包含第一决定子
111、第一标签112和第一个标记113。在又一实例中，第一核酸复合物110可包含第一决定子
111、第一标签112和第一接头114。在又一实例中，第一核酸复合物110可包含第一决定子
111和第一标签112。

[0514] 第二核酸复合物120可为根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1中的任一种。第二核酸复合物120可包含第二决定子121、第二标签122、第二接头124和第二标记123中的至少一种组分。在一个实例中，第二核酸复合物120可包含第二决定子121、第二标签122、第二标记123和第二接头124。在另一实例中，第二核酸复合物120可包含第二决定子
121、第二标签122和第二标记123。在又一实例中，第二核酸复合物120可包含第二决定子
121、第二标签122和第二接头124。在又一实例中，第二核酸复合物120可包含第二决定子
121和第二标签122。

[0515] 第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的组分

[0516] 根据本申请的示例性实施方式，第一核酸复合物110可由与第二核酸复合物120相同的组分构成。

[0517] 在一个实例中，当第一核酸复合物110由第一决定子111和第一标签112构成时，第二核酸复合体120也可由第二决定子121和第二标签122构成。

[0518] 在另一实例中，当第一核酸复合物110由第一决定子111、第一标签112、第一标记113和第一接头114构成时，第二核酸复合体120也可由第二决定子121、第二标签122、第二标记123和第二接头124构成。

[0519] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一核酸复合物110可由与第二核酸复合物120的组分不同的组分构成。

[0520] 在一个实例中，当第一核酸复合物110由第一决定子111、第一标签112和第一标记113构成时，第二核酸复合体120可由第二决定子121和第二标签122构成。

[0521] 在另一实例中，当第一核酸复合物110由第一决定子111、第一标签112和第一接头114构成时，第二核酸复合体120可由第二决定子121、第二标签122，第二标记123和第二接头124构成。

[0522] 1.1第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的组分之间的位置关系[0523] 根据本申请的示例性实施方式，第一核酸复合物110的组分之间的位置关系可与第二核酸复合物120的组分之间的位置关系相同。

[0524] 在一个实例中，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120由相同的组分构成时，第一核酸复合物110的组分之间的位置关系可与第二核酸复合物120的组分之间的位置关系相同。

[0525] 在具体实例中，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含决定子100、标签200和标记300时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可各自具有决定子100、标签
200和标记300顺序连接的形式。

[0526] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一核酸复合物110的组分之间的位置关系可不同于第二核酸复合物120的组分之间的位置关系。

[0527] 在一个实例中，由于第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在组成成分上部分不同，第一核酸复合物110的组分之间的位置关系可与第二核酸复合物120的组分之间的位置关系不同。

[0528] 在具体实例中，当第一核酸复合物110包含第一决定子111、第一标签112、第一标记113和第一接头114，并且第二核酸复合物120包含第二决定子121、第二标签122和第二标记123时，第一核酸复合物110可具有第一决定子111、第一接头114、第一标签112和第一标记113顺序连接的形式，并且第二核酸复合物120可具有第二决定子121、第二标签122和第二标记123顺序连接的形式。

[0529] 在另一个实例中，当第一核酸复合物110具有与第二核酸复合物120相同的组成成分时，第一核酸复合物110的组分之间的位置关系可与第二核酸复合物120的组分之间的位置关系不同。

[0530] 在具体实例中，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含决定子100、标签200、标记300和接头400时，第一核酸复合物110可具有决定子100、接头400、标签200和标记
300顺序连接的形式，并且第二核酸复合体120可具有决定子100、标记300、接头400和标签
200顺序连接的形式。

[0531] 1.2第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的组分之间的功能

[0532] 根据本申请的示例性实施方式，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在对应的组分之间可具有相同的功能。

[0533] 此处，与第一决定子111相对应的组分可以是第二决定子121。与第一标签112相对应的组分可以是第二标签122。与第一标记113相对应的组分可以是第二标记123。与第一接头114相对应的组分可以是第二接头124。

[0534] 在第一核酸复合物110和第二核酸复合物120之间的对应组分之间具有相同功能的核酸复合物对10的一个实例中，第一决定子111和第二决定子121可以充当PCR引物，第一标记113和第二标记123可用于产生信号(例如，发光或进行氧化/还原)。

[0535] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可包含在对应的组分之间具有不同功能的组分。

[0536] 在一个实例中，第一标记113可以用于产生特定信号(例如，发射第一波长段的光)，而第二标记123可以用于吸收该特定信号(例如，吸收第一波长段的光)。

[0537] 当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含具有与对应的组分的功能不同的功能的至少一种组分时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以包含具有与对应组分相同的功能的至少一种组分。

[0538] 在一个实例中，第一标记113可以用于产生特定信号(例如，发射第一波长段的光)，而第二标记123可以用于吸收该特定信号(例如，吸收第一波长段的光)。此处，第一决定子111和第二决定子121可充当PCR引物。

[0539] 或者，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含具有与对应的组分不同的功能的至少一种组分时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以不包含具有与对应的组分相同的功能的至少一种组分。

[0540] 在一个实例中，第一标记113可以用于产生特定信号(例如，发射第一波长段的光)，而第二标记123可以用于吸收该特定信号(例如，吸收第一波长段的光)。此处，第一标签112可以充当用于PCR钳制的探针，第二标签122可以不充当用于PCR钳制的探针。

[0541] 1.3用于第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的物质

[0542] 根据本申请的示例性实施方式，在第一核酸复合物110和第二核酸复合物120之间的对应的组成成分可以由相同的物质组成。

[0543] 在一个实例中，第一决定子111和第二决定子121(与第一决定子111相对应的组分)可以由DNA的单位分子的聚合物构成，第一标签112和第二标签122(与第一标签112相对应的组分)可以由上文所示式10的聚合物构成。

[0544] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120之间对应的组成成分可以由不同的物质组成。

[0545] 在一个实例中，第一决定子111可以由DNA的单位分子的聚合物构成，第二决定子121(与第一决定子111相对应的组分)可以由PNA的单位分子的聚合物构成。

[0546] 当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含由不同于对应组分的物质构成的至少一种组分时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以包含由与对应组分相同的物质构成的至少一种组分。

[0547] 在一个实例中，第一决定子111可以由DNA的单位分子的聚合物构成，第二决定子121(与第一决定子111相对应的组分)可以由LNA的单位分子的聚合物构成。此处，第一标签
112和第二标签122可以由上文所示的式10构成。

[0548] 或者，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含由不同于对应组分的物质构成的至少一种组分时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可不包含由与对应组分相同的物质构成的至少一种组分。

[0549] 在一个实例中，第一决定子111可以由DNA的单位分子的聚合物构成，第二决定子121(与第一决定子111相对应的组分)可以由LNA的单位分子的聚合物构成。此处，第一标签
112可以由DNA的单位分子的聚合物构成，第二标签122可以由PNA的单位分子的聚合物构成。此处，第一标记113可以由荧光分子构成，第二标记123可以由淬灭剂分子构成。

[0550] 1.4第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的物理性质

[0551] 根据本申请的示例性实施方式，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在对应组分之间可具有相同的物理性质。此外，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在对应组分之间可具有不同的物理性质。

[0552] 当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在对应的组分之间具有不同物理性质时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可包含与对应的组分具有相同物理性质的至少一种组分。

[0553] 或者，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在对应的组分之间具有不同物理性质时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可不包含与对应组分具有相同物理性质的至少一种组分。

[0554] 作为示例，物理性质可包括物理长度、重量、光学性质(例如，波长段、强度等)、与特定物质的结合力、颜色、导热率和/或强烈程度。

[0555] 在下文中，关于各种物理性质中的长度，将描述第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的具体实施方式。

[0556] 为了简单起见，将省略涉及物理性质中的其它性质的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的具体实施方式的描述，但是本领域普通技术人员可以容易地理解第一核酸复合物110和第二核酸复合物120能够具有相同或不同的性质，因此，在解释本说明书的范围时，物理性质不应限于长度。

[0557] 根据本申请的示例性实施方式，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120在对应组分之间可具有相同的物理长度。在具体实例中，当第一决定子111是长度为10mer的单链核酸(例如DNA)时，第二决定子121也可以是长度为10mer的单链核酸(例如DNA)。

[0558] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可具有不同物理长度的对应组分。在具体实例中，第一标签112可具有长度为10mer的单链核酸(例如DNA)，第二标签122可具有长度为7mer的单链核酸(例如DNA)。

[0559] 当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含具有不同物理长度的至少一种对应组分时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可包含与对应组分具有相同物理长度的至少一种组分。

[0560] 在一个实例中，当第一标签112是长度为10mer的单链核酸(例如，PNA)时，第二标签122可以是长度为7mer的单链核酸(例如，PNA)。此处，当第一决定子111是长度为10mer的单链核酸(例如DNA)时，第二决定子121可以是长度为10mer的单链核酸(例如DNA)。

[0561] 或者，当第一核酸复合物110和第二核酸复合物120包含与对应组分具有不同物理长度的至少一种组分时，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可不包含与对应组分具有相同物理长度的至少一种组件。

[0562] 在一个实例中，当第一标签112是长度为10mer的单链核酸(例如PNA)时，第二标签122可以是长度为7mer的单链核酸(例如PNA)。此处，当第一决定子111是长度为17mer的单链核酸(例如DNA)时，第二决定子121可以是长度为15mer的单链核酸(例如DNA)。

[0563] 至此，已经详细描述了核酸复合物对10中包含的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的构造。

[0564] 具体实施方式仅提供用以帮助理解根据本申请的核酸复合物对10，并不意味着应将核酸复合物对10理解为限于本文公开的构造。

[0565] 具体而言，根据本申请的核酸复合物对10可以以如下形式提供：其中包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120以及额外的核酸复合物1。

[0566] 此外，核酸复合物对10中包含的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以具有上述所述特征以外的特征，或者第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可具有上述所述特征中至少两个或更多个不同特征。

[0567] 在下文中，将详细描述根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的操作和实例。根据上述描述的核酸复合物对10的构造及将在下文描述的它的操作和实例，将更清楚地理解核酸复合物对10的定义和功能。

[0568] 然而，为了便于描述，除非根据需要而另外单独说明，则假定核酸复合物对10由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成，第一核酸复合物110包含第一决定子111、第一接头114、第一标签112和第一标记113，第二核酸复合物120包含第二决定子121、第二接头124、第二标签122和第二标记123。

[0569] 这是为了防止在每种情况下不必要地重复描述示例性实施方式，但这不意味着应当根据上述假设以有限的方式解释在下文描述的各种示例性实施方式中使用的核酸复合物对10。

[0570] 2.核酸复合物对10的操作

[0571] 2.1决定子100

[0572] 根据本发明示例性实施方式的第一决定子111可以互补地结合至第一靶标碱基序列。本文所使用的“第一靶标碱基序列”可以指与第一决定子111的至少部分碱基序列互补的碱基序列。

[0573] 第一决定子111和第一靶标碱基序列之间的互补结合可以意味着它们基于电性质、化学性质和物理性质中的至少一种而彼此关联。在一个实例中，通过第一靶碱基序列与第一决定子111的至少一个碱基之间的氢键键合，第一决定子111与第一靶碱基序列可以彼此互补地结合。

[0574] 结合如下中的至少一种，可确定第一决定子111与第一靶标碱基序列之间的结合力：第一靶标碱基序列的单位分子的类型、第一靶标碱基序列的单位分子的碱基类型、以及参与与第一决定子111互补结合的碱基数。

[0575] 结合如下中的至少一种，可确定第一决定子111与第一靶标碱基序列之间的结合力：第一决定子111的单位分子的类型、第一决定子111的单位分子的碱基类型、以及参与与第一靶标碱基序列互补结合的碱基数。

[0576] 在一个实例中，相比与第一靶标碱基序列结合的第一决定子111的单位分子由DNA的单位分子组成时，当与第一靶标碱基序列结合的第一决定子111的单位分子由PNA的单位分子组成时，第一靶碱基序列和第一决定子111之间的结合力可较高。

[0577] 在另一实例中，相比与第一靶标碱基序列结合的第一决定子111的至少部分区域中包含的碱基具有较低的C-G含量时，当与第一靶标碱基序列结合的第一决定子111的至少部分区域中包含的碱基具有较高的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)含量时，第一靶标碱基序列与第一决定子111之间的结合力可较高。

[0578] 在又一实例中，相比与第一靶标碱基序列结合的第一决定子111的至少部分区域中有5bp碱基时，当与第一靶标碱基序列结合的第一决定子111的至少部分区域中有10bp碱基时，第一靶标碱基序列与第一决定子111之间的结合力可较高。

[0579] 根据本申请的示例性实施方式的第二决定子121可以互补地结合至第二靶标碱基序列。本文所使用的“第二靶标碱基序列”可意指与第二决定子121的至少部分碱基序列互补的碱基序列。

[0580] 第二决定子121和第二靶标碱基序列之间的互补结合可意味着它们基于电性质、化学性质和物理性质中的至少一种而彼此关联。在一个实例中，通过第二靶碱基序列与第二决定子121的至少一个碱基之间的氢键键合，第二决定子121与第二靶碱基序列可以彼此互补地结合。

[0581] 结合如下中的至少一种，可确定第二决定子121与第二靶标碱基序列之间的结合力：第二靶标碱基序列的单位分子的类型、第二靶标碱基序列的单位分子的碱基类型、以及参与与第二决定子121互补结合的碱基数。

[0582] 结合如下中的至少一种，可确定第二决定子121与第二靶标碱基序列之间的结合力：第二决定子121的单位分子的类型、第二决定子121的单位分子的碱基类型、以及参与与第二靶标碱基序列互补结合的至少一个碱基。

[0583] 在一个实例中，相比与第二靶标碱基序列结合的第二决定子121的单位分子由DNA的单位分子组成时，当与第二靶标碱基序列结合的第二决定子121的单位分子由PNA的单位分子组成时，第二靶标碱基序列和第二决定子121之间的结合力可较高。

[0584] 在另一实例中，相比与第二靶标碱基序列结合的第二决定子121的至少部分区域中包含的碱基具有较低的C-G含量时，当与第二靶标碱基序列结合的第二决定子121的至少部分区域中包含的碱基具有较高的C-G含量时，第二靶标碱基序列与第二决定子121之间的结合力可较高。

[0585] 在又一实例中，相比与第二靶标碱基序列结合的第二决定子121的至少部分区域中包含有5bp碱基时，当与第二靶标碱基序列结合的第二决定子121的至少部分区域中包含有10bp碱基时，第二靶标碱基序列与第二决定子121之间的结合力可较高。

[0586] 根据本申请的示例性实施方式，第一决定子111和第二决定子121可特异性结合相关物质。第一靶标核酸可以与第二靶标核酸有关，所述第一靶标核酸包含与第一决定子111互补结合的第一靶标碱基序列，所述第二靶标核酸包含与第二决定子121互补结合的第二靶碱基序列。第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可分别作用于相关物质。之后第一决定子111和第二决定子121可以彼此关联。

[0587] 在一个实例中，第一决定子111和第二决定子121可以特异性结合相同的核酸。第一靶标核酸和第二靶标核酸可以相同。

[0588] 此处，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可以包含在单链核酸中。

[0589] 或者，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可以包含在双链核酸中，其中，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可为双链中的任一链。

[0590] 或者，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可以包含在双链核酸中，其中，第一靶标碱基序列可以包含在双链的一条链中，第二靶标碱基序列可以包含在双链的另一链中。

[0591] 图10和图11是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一决定子111和第二决定子121的操作的图。

[0592] 第一决定子111和第二决定子121可以分别互补结合至相关物质。第一决定子111和第二决定子121可以互补结合至相同核酸。此处，相同的核酸可以是包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的单链核酸。

[0593] 当第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列包含在单链核酸中时，第一决定子111可以互补结合第一靶标碱基序列，第二决定子121可以互补结合不同于第一靶标碱基序列的区域中的第二靶标碱基序列。此处，与第一决定子111连接的第一标签112和与第二决定子121连接的第二标签122可以分别基于第一决定子111和第二决定子121而设置在同一侧(参见图10(a))。

[0594] 或者，当第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列包含在单链核酸中时，第一决定子111可以互补结合至第一靶标碱基序列，第二决定子121可互补结合至与第一靶标碱基序列不同的区域中的第二靶标碱基序列。此处，与第一决定子111连接的第一标签112和与第二决定子121连接的第二标签122可以分别基于第一决定子111和第二决定子121而设置在相反侧(参见图10(b))。

[0595] 第一决定子111和第二决定子121可以互补结合至相关物质。第一决定子111和第二决定子121可以互补结合至相同核酸。此处，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可以包含在双链核酸中，其中，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可以包含在双链的任一链中。

[0596] 第一决定子111可以互补结合至第一靶标碱基序列，第二决定子121可以互补结合至包含在包含第一靶标碱基序列的任一链中的第二靶标碱基序列(参见图11(a))。

[0597] 第一决定子111和第二决定子121可以互补结合至相关物质。第一决定子111和第二决定子121可以互补结合至相同核酸。此处，第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列可以包含在双链核酸中，其中，第一靶标碱基序列可以包含在双链的一条链中，第二靶标碱基序列可以包含在双链的另一链中。对应于第一靶标碱基序列的核酸的一个区域和对应于第二靶标碱基序列的核酸的一个区域可以以单链的形式存在。

[0598] 第一决定子111可以互补结合至包含在一条链中的第一靶标碱基序列，第二决定子121可以互补结合至包含在另一条链中的第二靶标碱基序列(参见图11(b))。

[0599] 如图11所示，尽管未具体示出，如图10所示，与第一决定子111连接的第一标签112和与第二决定子121连接的第二标签122可以分别基于第一决定子111和第二决定子121而设置在同一侧。

[0600] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一靶标核酸和第二靶标核酸可以之后彼此关联，所述第一靶标核酸包含第一决定子111所特异性结合的第一靶碱基序列，所述第二靶标核酸包含第二决定子121所特异性结合的第二靶碱基序列。

[0601] 在一个实例中，当在PCR中使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10时，第一决定子111特异性结合至第一靶标碱基序列，并且核苷酸可以在决定子100的3'端延伸，以具有与第一靶标碱基序列互补的序列。此处，通过延伸形成的多核苷酸的碱基序列可以包含第二靶标核酸。换言之，第二靶标碱基序列可以包含在通过在第一决定子111的3'端延伸而形成的多核苷酸中。

[0602] 在此类构造中，第一靶标核酸和第二靶标核酸可以之后彼此关联。在与之相关的具体示例性实施方式中，将参考将在下文描述的图27和图28来详细理解这一点。

[0603] 2.2标签200

[0604] 根据本申请的示例性实施方式的第一标签112可以互补结合至另一核酸复合物1(即，不同于第一核酸复合物110的核酸复合物1)。

[0605] 在一个实例中，第一标签112可以互补结合至第二核酸复合物120的第二标签122。

[0606] 在具体实例中，第一标签112可以包含具有与第二标签122的化学结构互补的化学结构的化合物。第二标签122可以包含具有与第一标签112的化学结构互补的化学结构的化合物。

[0607] 在另一具体实例中，第一标签112可以包含与第二标签122的碱基序列互补的碱基序列。第一标签112可以包含核酸和/或核酸复合物1，所述核酸和/或核酸复合物1包含与第二标签122的碱基序列互补的碱基序列。第二标签122可以包含与第一标签112的碱基序列互补的碱基序列。第二标签122可以包含核酸和/或核酸复合物1，所述核酸和/或核酸复合物1包含与第一标签112的碱基序列互补的碱基序列。

[0608] 根据本申请的示例性实施方式，取决于第一标签112和第二标签122的结合方向，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的结合方向可以变化。

[0609] 在一个实例中，根据暴露于第一标签112和第二标签122外部的元件的排列方式(即元件之间的距离、元件的类型等)，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的结合方向可以变化。在另一实例中，取决于第一标签112和第二标签122的碱基序列，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的结合方向可以变化。

[0610] 在具体实例中，根据第一标签112的5'至3'方向的碱基序列与第二标签122的5'至3'方向的碱基序列之间的关系，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的结合方向可以变化。

[0611] 图12是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120结合的方向的图。

[0612] 参考图12(a)，第一标签112可以包含与第二标签122互补的序列，使得临近第一决定子111的第一标签112的一个区域互补结合至与第二决定子121隔开的第二标签122的一个区域。第二标签122可以包含与第一标签112互补的序列，使得临近第二决定子121的第二标签122的一个区域互补结合至与第一决定子111隔开的第一标签112的一个区域。

[0613] 在具体实例中，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以以决定子100、接头400、标签200和标记300顺序连接的形式体现。第一标签112可以具有碱基序列CCCCCAAAA，例如与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列。第二标签122可以具有碱基序列TTTTGGGGG，例如与第二接头124相邻的第二标签122的碱基序列。

[0614] 优选地，第一标签112具有碱基序列5`-CCCCCAAAA-3`，例如与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列。第二标签122可以具有碱基序列5`-TTTTGGGGG-3`，例如与第一接头124相邻的第二标签122的碱基序列。

[0615] 或者，优选地，第一标签112具有碱基序列3`-CCCCCAAAA-5`，例如与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列。第二标签122可以具有碱基序列3`-TTTTGGGGG-5`，例如与第二接头124相邻的第二标签122的碱基序列。

[0616] 当核酸复合物对10体现为使得与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域互补结合与第一决定子111间隔开的第一标签112的一个区域时，第一决定子111可以基于第一标签112和第二标签122设置在一侧，并且第二决定子121可以基于第一标签112和第二标签122设置在相对侧。

[0617] 当核酸复合物对10体现为使得与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域互补结合与第一决定子111间隔开的第一标签112的一个区域时，第一决定子111与第一标签112连接的部分可以基于穿过第一标签112和第二标签122的假想表面二设置在第一侧，并且第二决定子121与第二标签122连接的部分可以基于穿过第一标签112和第二标签122的假想表面而设置在第二侧。基于假想表面，第一侧和第二侧可以彼此相对。

[0618] 参考图12(b)，第一标签112可以包含与第二标签122互补的序列，使得与第一决定子111相邻的第一标签112的一个区域互补结合与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域。第二标签122可以包含与第一标签112互补的序列，使得与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域互补结合与第一决定子111相邻的第一标签112的一个区域。

[0619] 在具体实例中，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以以决定子100、接头400、标签200和标记300顺序连接的形式体现。第一标签112可以具有碱基序列CCCCCAAAA，例如与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列。第二标签122可以具有碱基序列GGGGGTTTT，例如与第二接头124相邻的第二标签122的碱基序列。

[0620] 第一标签112优选具有碱基序列5`-CCCCCAAAA-3`，例如与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列。第二标签122可以具有碱基序列3`-GGGGGTTTT-5`，例如与第一接头124相邻的第二标签122的碱基序列。

[0621] 或者，第一标签112优选具有碱基序列3`-CCCCCAAAA-5`，例如与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列。第二标签122可以具有碱基序列5`-GGGGGTTTT-3`，例如与第二连接子124相邻的第二标签122的碱基序列。

[0622] 当核酸复合物对10体现为使得与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域互补结合与第一决定子111相邻的第一标签112的一个区域时，第一决定子111可以基于第一标签112和第二标签122设置在一侧，并且第二决定子121可以基于第一标签112和第二标签122设置在同一侧。

[0623] 当核酸复合物对10体现为使得与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域互补结合与第一决定子111相邻的第一标签112的一个区域时，第一决定子111与第一标签112连接的部分可以基于穿过第一标签112和第二标签122的假想表面而设置在第一侧，并且第二决定子121与第二标签122连接的部分可以基于穿过第一标签112和第二标签122的假想表面而设置在第二侧。基于假想表面，第一侧和第二侧可以而在同一侧。

[0624] 根据本申请的示例性实施方式，根据第一标签112和第二标签122的碱基序列，与第一核酸复合物110和第二核酸复合物120有关的其它物质的形状可以改变。取决于第一标签112和第二标签122的碱基序列，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的至少一个靶核酸的形状可以改变。在这方面，将在下文的1.2二级结构的形成中对此进行详细描述。

[0625] 在下文中，除非另有单独说明，为了解释第一标签112和第二标签122之间的互补结合，假定与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域互补地结合与第一决定子111间隔开的第一标签112的一个区域。

[0626] 这是为了防止不必要的重复描述，并且显而易见的是未假定：第一标签112和第二标签122之间的互补结合不包括与第二决定子121相邻的第二标签122的一个区域和与第一决定子111相邻的第一标签112的一个区域之间的互补结合。

[0627] 根据本申请的示例性实施方式，第一标签112可以包含与第二标签122互补结合的区域。第一标签112可以互补结合至第二标签122的至少部分区域。

[0628] 在一个实例中，第一标签112可以互补结合至第二标签122的整个区域。在具体实例中，第一标签112的碱基序列可以互补结合第二标签122的整个碱基序列。第一标签112可以不具有不与第二标签122结合的碱基。第二标签122的碱基序列可以互补结合第一标签112的整个碱基序列。第二标签122可以不具有不与第一标签112的碱基序列结合的碱基。

[0629] 在另一实例中，第一标签112可以具有与第二标签122的碱基序列互补的碱基序列，并且第一标签112的碱基序列和第二标签122的碱基序列可能至少一个碱基有所不同。第二标签122可以具有与第一标签112的碱基序列互补的碱基序列，并且第二标签122的碱基序列和第一标签112的碱基序列可能至少一个碱基有所不同。此处，第一标签112和第二标签122可错配，并基于第一标签112和第二标签122中包含的互补碱基序列之间的结合而彼此结合。

[0630] 在又一实例中，第一标签112可以互补结合至第二标签122的部分区域。在具体实例中，第一标签112的碱基序列可以互补结合至第二标签122的部分碱基序列。第一标签112可以不具有不与第二标签122结合的碱基。第二标签122可以包含不与第一标签112的碱基序列结合的碱基。

[0631] 图13是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一标签112和第二标签122之间的结合的图。

[0632] 第一标签112可以互补结合第二标签122的部分区域。第一标签112的碱基序列和第二标签122的碱基序列可以具有彼此互补结合的区域，并且第一标签112可以进一步包含与第二标签122的碱基序列不互补结合的区域。

[0633] 与第一标签112和第二标签122没有互补结合的区域(NBR)相比，第一标签112和第二标签122中形成互补结合的区域(BR)可以与第一标签112和第一决定子111连接的部分相对邻近。第一标签112和第二标签122之间没有互补键。与不和第二标签122互补结合的第一标签112的碱基相比，与第二标签122互补结合的第一标签112的碱基可以与第一决定子111相邻(参见图13(a))。

[0634] 与第一标签112和第二标签122中不互补结合的区域(NBR)相比，第一标签112和第二标签122中形成互补结合的区域(BR)可以与第一标签112和第一决定子111连接的部分相对隔开。与不和第二标签122互补结合的第一标签112的碱基相比，与第二标签122互补结合的第一标签112的碱基可与第一决定子111间隔开(参见图13(b))。

[0635] 第一标签112和第二标签122形成互补结合的区域(BR)可以位于不与第二标签122互补结合的第一标签112的第一区域(NBR)和不与第二标签122结合的第一标签112的第二区域(NBR)之间。第一标签112可以包含不与第二标签122互补结合的第一靶标碱基序列、与第二标签122互补结合的第二靶标碱基序列以及不与第二标签122互补结合的第三靶标碱基序列。第一标签112可以通过顺次连接以下而形成：不与第二标签122互补结合的第一靶标碱基序列、与第二标签122互补结合的第二靶标碱基序列以及不与第二标签122互补结合的第三碱基序列(参见图13(c))。

[0636] 在一些情况下，当第一标签112进一步包含不与第二标签122的碱基序列互补结合的碱基序列时，第二标签122可以进一步包含不与第一标签112的碱基序列互补结合的碱基序列。

[0637] 在一个实例中，不互补结合第一标签112的第二标签122的碱基可以在第一标签112与第二标签122互补结合的区域的第一方向(例如，基于第二标签122的5'至3'方向)上形成。

[0638] 在另一实例中，不互补结合第一标签112的第二标签122的碱基可以在第一标签112与第二标签122互补结合的区域的第二方向(例如，基于第二标签122的3'至5'方向)上形成。

[0639] 在又一实例中，不互补结合第一标签112的第二标签122的碱基可以在第一标签112与第二标签122互补结合的区域的第一方向(例如，基于第二标签122的5'至3'方向)上形成；以及在第一标签112与第二标签122互补结合的区域的第二方向(例如，基于第二标签
122的3'至5'方向)上形成。

[0640] 2.3标记300

[0641] 根据本申请的示例性实施方式，第一标记113和第二标记123可参与核酸复合物对10的标记。在一个实例中，由于与第二标记123相关的作用，第一标记113可参与核酸复合物对10的标记。第二标记123可通过与第一标记113的联接动作而参与核酸复合物对10的标记。

[0642] 根据本申请的示例性实施方式，第一标记113可以与第二标记123相关联。当第一标记113和第二标记123布置得足够靠近以进行联接作用时，在第一标记113和第二标记123之间可能发生联接动作(以下称为联接动作)。

[0643] 在一个实例中，第一标记113和第二标记123之间的联接动作可以通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合而发生。

[0644] 在另一实例中，当在第一决定子111所结合的第一靶标碱基序列与第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列之间存在关联时，第一标记113和第二标记123之间的联接动作可能发生。

[0645] 根据本申请的示例性实施方式，可以以在第一标记113和第二标记123之间发生能量递送的形式实现联接动作。

[0646] 作为能量递送的一个方面，第一标记113可以向第二标记123提供能量，第二标记123可以接收来自第一标记113的能量。作为能量递送的另一方面，第二标记123可以向第一标记113提供能量，并且第一标记113可以接收来自第二标记123的能量。作为能量递送的又一方面，第一标记113可以向第二标记123提供能量，并接受来自第二标记123的能量。第二标记123可以向第一标记113提供能量，并接受来自第一标记113的能量。

[0647] 根据在第一标记113和第二标记123之间是否发生能量递送，由第一标记113和第二标记123之间的联接动作产生的物理性质可以变化。物理性质可以是化学性质、电性质、光学性质和磁性质中的至少一种。在具体实例中，根据在第一标记113和第二标记123之间是否发生能量递送，从包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)检测到的光学性质可以变化。变化的光学性质可以是光强度的变化或光的波长范围的变化。

[0648] 根据本申请的示例性实施方式，基于根据第一标记113和第二标记123之间是否发生联接动作而变化的物理性质，可以确定第一标记113和第二标记123之间的关联。因此，可以用如下方式对核酸复合物对10进行标记：根据第一标记113和第二标记123是否关联来确认核酸复合物对10的信息。

[0649] 在下文中，将进一步详细描述第一标记113和第二标记123的操作。

[0650] 然而，为了帮助理解本申请，假定第一标记113是当光入射时发射第一波长范围的光的荧光分子，并且第二标记123是当第一波长范围的光入射时吸收光的黑洞淬灭剂分子。

[0651] 图14是说明了根据本申请的示例性实施方式的第一标记113和第二标记123的操作的图。

[0652] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10将由第一标记113和第二标记123之间的“有效联接距离(LD)”进行定义。

[0653] 此处，“有效联接距离(LD)”可以指距第一标记113或第二标记123的参考距离，在其中，第一标记113和第二标记123之间可发生联接动作。此处，“有效联接距离(LD)”可以指第一标记113与第二标记123之间的临界距离，在其中，第一标记113与第二标记123之间可发生联接动作。此处，“有效联接距离(LD)”可以指第二标记123与第一标记113之间的间隔的临界距离，在其中，第一标记113与第二标记123之间可发生联接动作。

[0654] 可以基于第一标记113和第二标记123的性质来确定有效联接距离(LD)。换言之，当第一标记113为荧光分子，而第二标记123为淬灭剂分子时，可以根据荧光分子和淬灭剂分子之间的特性来确定有效联接距离(LD)。在一个实例中，当淬灭剂分子与荧光分子之间的距离为 (埃)并且进行了联接动作时，有效联接距离(LD)可为

[0655] 当第一标记113和第二标记123彼此相邻地布置以使第一标记113和第二标记123之间的距离在有效联接距离(LD)之内时，第一标记113和第二标记123可以进行联接动作(参见图14(a))。

[0656] 当第一标记113和第二标记123进行联接动作时，第一标记113可以发射第一波长段的光，并且第二标记123可以吸收第一波长段的光。结果，当使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光时，可能无法从单位单元(UC)检测到第一波长段的光。或者，结果，当使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光时，从单位单元(UC)检测到的第一波长段的光的强度可能降低。

[0657] 当将第一标记113和第二标记123隔开以使第一标记113和第二标记123之间的距离超过有效联接距离(LD)时，第一标记113和第二标记123可能不进行联接动作(参见图14(b))。

[0658] 当第一标记113和第二标记123不进行联接动作时，第一标记113可以发射第一波长段的光，而第二标记123可以不发射第一波长段的光。结果，当使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC；例如管)的光时，可以从单位单元(UC)检测到第一波长段的光。

[0659] 根据本申请的示例性实施方式，基于第一标签112和第二标签122是否结合，可对第一标记113和第二标记123之间的距离进行改变。基于第一标签112和第二标签122是否接合，可确定第一标记113和第二标记123之间的距离。

[0660] 在具体实例中，当第一标签112和第二标签122结合时，第一标记113和第二标记123可以彼此相邻布置。当第一标签112和第二标签122互补结合时，与第一标签112连接的第一标记113和与第二标签122连接的第二标记123可以彼此相邻布置。

[0661] 此外，当第一标签112和第二标签122不结合时，第一标记113和第二标记123可以彼此隔开。当第一标签112和第二标签122彼此不互补结合时，与第一标签112连接的第一标记113和与第二标签122连接的第二标记123可以布置为彼此隔开。

[0662] 因此，根据本申请的示例性实施方式，可以基于第一标签112和第二标签122是否结合来确定第一标记113和第二标记123之间是否进行联接作用。

[0663] 图15是根据本申请的示例性实施方式，根据第一标记113和第二标记123之间的联接动作的每个波长段(WL)的荧光(F)的图表。

[0664] 根据本申请的示例性实施方式的第一标记113和第二标记123之间的联接动作可引起光学特性的改变。第一标记113和第二标记123之间的联接动作之前包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光学特性可以不同于第一标记113和第二标记123之间的联接动作之后包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光学特性。

[0665] 在一个实例中，当使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光时，第一标记113和第二标记123之间的联接动作可能引起所检测信号的波长段(例如，光的波长段)变化。

[0666] 在另一实例中，当使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光时，第一标记113和第二标记123之间的联接动作可能引起特定波长段的信号强度变化。

[0667] 在又一实例中，当使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光时，第一标记113和第二标记123之间的联接动作可能引起由于光学装置的设置或极限而在开启/关闭之间的信号改变。

[0668] 在具体实例中，在使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光中，当第一标记113和第二标记123的联接动作发生于单位单元(UC)的检测值超过光学装置中的荧光阈值(TF)的状态时，单位单元(UC)的检测值可能会降低至小于所述荧光阈值(TF)(参见图15(a))。

[0669] 此处，荧光阈值(TF)可为由光学装置的设置或极限确定的可使用光学装置检测的最低荧光值。

[0670] 当单位单元(UC)的检测值由于联接动作从初始状态降低至小于荧光阈值(TF)时(即，单位单元(UC)的检测值超过光学装置的荧光阈值(TF))，光学装置的信号可以从“开启”状态改变为“关闭”状态。

[0671] 或者，当单位单元(UC)的检测值由于联接动作从初始状态降低至小于荧光阈值(TF)时，光学装置的信号连续检测单位单元(UC)的荧光值，然后可以改变为“关闭”状态。

[0672] 在具体实例中，在使用光学装置检测包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光中，当第一标记113和第二标记123的联接作用处于单位单元(UC)的检测值超过检测区域(DR)中的荧光阈值(TF)的状态时，单位单元(UC)的检测值可能会降低至小于检测区域(DR)中的荧光阈值(TF)(参见图15(b))。

[0673] 此处，检测区域(DR)可为由光学装置的设置或极限确定的能够利用该光学装置检测荧光值的波长段范围。

[0674] 此处，荧光阈值(TF)可为由光学装置的设置或极限确定的能够该光学装置检测荧光值的最低荧光值。

[0675] 从初始状态开始(即，单位单元(UC)的检测值超过光学装置的荧光阈值(TF))，当单位单元(UC)的检测值根据联接动作而降低至小于荧光阈值(TF)时，光学装置的信号可以从“开启”状态改变为“关闭”状态。

[0676] 从初始状态开始，当根据联接动作使单位单元(UC)的检测值减小至小于荧光阈值(TF)时，光学装置的信号可以连续检测单位单元(UC)的荧光值，然后改变为“关闭”状态。

[0677] 2.4接头400

[0678] 根据本申请的示例性实施方式，当进行PCR时，第一接头114可以防止产生第一标签112的扩增产物。此外，当进行PCR时，第二接头124可防止产生第二标签122的扩增产物。

[0679] 在进行PCR之后，第一接头114和第二接头124可以允许第一标签112和第二标签122保持为单链核酸。单链核酸的第一标签112和第二标签122可以在特定环境条件下互补结合。

[0680] 根据本发明示例性实施方式的第一接头114和第二接头124可允许与核酸复合物对10结合通过PCR产生具有恒定长度的扩增产物的长度。在这方面，将在1.核酸复合物对10的应用#1-PCR中进一步详细描述。

[0681] 已对本申请中公开的核酸复合物对10的结构和一般操作进行了公开。

[0682] 根据本申请的核酸复合物对10可以用于使用核酸的多个领域。

[0683] 例如，核酸复合物对10可以用于质粒的合成、DNA芯片的制造以及作为DNA测序的引物。在另一实例中，核酸复合物对10可以用于避免PCR中特定碱基序列的扩增。在又一实例中，核酸复合物对10可以用于确定样品中靶标核酸的存在或不存在。

[0684] 在下文中，将详细描述核酸复合物1和核酸复合物对10的使用的具体实施方式。

[0685] 然而，为了便于描述，除非根据需要而单独描述，否则假定第一决定子111为正向引物，第二决定子121为反向引物，第一接头114和第二接头124为PCR阻断剂，第一标签112和第二标签122是由DNA构成的单链，第一标记113为荧光分子，第二标记123为淬灭剂分子。

[0686] 这是为了防止不必要的重复描述，应基于上述所述的物质、构造、实例和说明书的精神合理理解第一决定子111、第一接头114、第一标签112、第一标记113、第二决定子121、第二接头124、第二标签122和第二标记123，并且第一决定子111、第一接头114、第一标签112、第一标记113、第二决定子121、第二接头124、第二标签122和第二标记123不应被理解为限于上述假定。

[0687] <核酸复合物1的应用>

[0688] 1.核酸复合物1的应用#1-PCR钳制

[0689] 1.1核酸复合物1的构造

[0690] 图16是说明了根据本申请的示例性实施方式的可用于PCR钳制的核酸复合物1的图。

[0691] 根据本申请的示例性实施方式，可以进行PCR钳制的核酸复合物1可以至少包含决定子100和标签200。根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可包含决定子100、标签200和接头400。

[0692] 决定子100可为引发PCR的正向引物或反向引物。其详细描述已在1.1.1.3.2(引物)中示出，并且将省略重复的内容。

[0693] 标签200可为包含核酸和/或核酸类似物的单链体。标签200可为用于PCR钳制的探针。标签200的碱基序列和决定子100的碱基序列可以相差至少一个碱基。其详细描述已在1.1.2.3.2(用于PCR钳制的探针)中示出，并且将省略重复的内容。

[0694] 接头400可为具有预定长度的化合物。接头400可为PCR阻断剂。其详细说明已在3.1.1.3.1(PCR的阻断剂)中示出，并且将省略重复的内容。

[0695] 1.2核酸复合物1的操作

[0696] 1.2.1PCR概述

[0697] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1可以用于PCR。

[0698] 图17是说明了根据本申请的示例性实施方式的PCR步骤的图。

[0699] PCR可以包括热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)。

[0700] 根据本申请的示例性实施方式，可进行关于包含核酸复合物1的单位单元(UC)的PCR步骤。包含核酸复合物1的单位单元(UC)可为其中温度改变以进行PCR反应的单位单元(UC)。包含核酸复合物1的单位单元(UC)可为提供多个样品以进行PCR反应的单位单元(UC)。在一个实例中，单位单元(UC)可为在其中进行PCR反应的管。

[0701] 可以将至少一个样品提供至单位单元(UC)。可以将在PCR步骤中使用的至少一种样品提供给单位单元(UC)。例如，在单位单元(UC)中，可以包含核酸复合物1。在单位单元(UC)中，可进一步包含以下中的至少一种：参与聚合的酶(例如聚合酶)、碱基片段(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、参与PCR的辅酶(例如MgCl2或MgSO4)、为PCR提供优化的pH和/或盐浓度的缓冲液。

[0702] 单位单元(UC)的PCR步骤通常可以包括：1)热变性步骤(S2000，变性步骤)，用于通过调节单位单元(UC)的温度来将双链DNA分开；2)退火步骤(S3000)，用于通过调节单位单元(UC)的温度使引物与包含特定碱基序列的靶标核酸(例如分开的单链DNA)结合；以及，3)聚合步骤(S4000，延伸步骤)，用于通过调节单位单元(UC)的温度在结合靶标核酸的引物的一端处产生靶标核酸的扩增产物。

[0703] 上述所述的热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)可以重复地顺序进行。

[0704] 在热变性步骤(S2000)中调节的温度可为使双链DNA分开的温度。优选地，将热变性步骤(S2000)中的单位单元(UC)的温度保持在80℃以上。优选地，将热变性步骤(S2000)中的单位单元(UC)的温度保持在90℃以上。优选地，将热变性步骤(S2000)中的单位单元(UC)的温度保持在95℃以上。优选地，将热变性步骤(S2000)中的单位单元(UC)的温度保持在95℃。

[0705] 在退火步骤(S3000)中调节的温度可为引物结合至靶标核酸的温度。优选地，将退火步骤(S3000)中的单位单元(UC)的温度保持在约40℃至60℃。优选地，将退火步骤(S3000)中的单位单元(UC)的温度保持在约45℃至55℃。优选地，将退火步骤(S3000)中的单位单元(UC)的温度保持在约50℃。

[0706] 在聚合步骤(S4000)中调节的温度可为用于从结合靶标核酸的引物的一端产生靶标核酸的扩增产物的温度。优选地，将聚合步骤(S4000)中的单位单元(UC)的温度保持在约50℃至70℃。优选地，将退火步骤(S3000)中的单位单元(UC)的温度保持在约55℃至65℃。
优选地，将退火步骤(S3000)中的单位单元(UC)的温度保持在约60℃。

[0707] 在下文中，当将根据本申请的示例性实施方式的将能够进行PCR钳制的核酸复合物1提供至单位单元(UC；例如管)时，将详细描述进行PCR时的核酸复合物1的示意图。

[0708] 1.2.2核酸复合物1的操作

[0709] 图18和图19是说明了根据本申请的示例性实施方式的可用于PCR钳制的核酸复合物1的操作的图。

[0710] 参考图18，在热变性步骤(S2000)中，可以将单位单元(UC)中存在的双链DNA变性为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可以将双链DNA分开为两条单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可以将通过两条单链DNA的氢键键合而形成的双链DNA分开为两条单链DNA。

[0711] 在热变性步骤(S2000)中分开得到的至少一个单链DNA可以包含靶标碱基序列(即，与决定子100的至少部分碱基序列互补的碱基序列)。存在于单位单元(UC)中的至少一个单链DNA可以包含靶标碱基序列。

[0712] 在退火步骤(S3000)中，在热变性步骤(S2000)后，决定子100可以结合至靶标核酸，所述靶标核酸包括存在于单位单元(UC)中的单链DNA的靶标碱基序列。决定子100可以互补结合至单位单元(UC)中存在的单链DNA的靶标碱基序列。决定子100可以互补结合至靶标碱基序列，并引发包含靶标碱基序列的靶标核酸的至少部分区域的扩增产物的产生。

[0713] 当决定子100(即核酸复合物1的决定子100)为正向引物时，可以向单位单元(UC)提供单独的反向引物。该反向引物可以是核酸复合物1。该反向引物可以不是核酸复合物1。

[0714] 在退火步骤(S3000)中，反向引物可以结合至具有反向引物的碱基序列的互补序列的单链DNA。反向引物可以互补结合至具有反向引物的碱基序列的互补序列的单链DNA。

[0715] 当决定子100为反向引物时，可以在单位单元(UC)中提供单独的正向引物。该正向引物可以是核酸复合物1。该正向引物可以不是核酸复合物1。

[0716] 在退火步骤(S3000)中，正向引物可以结合至具有正向引物的碱基序列的互补序列的单链DNA。正向引物可以互补结合至具有正向引物的碱基序列的互补序列的单链DNA。

[0717] 在聚合步骤(S4000)中，使用决定子100作为起点，可以产生与决定子100所结合的靶标核酸的至少部分的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，靶标核酸的至少部分的扩增产物可以从决定子100的3'端延伸。

[0718] 在聚合步骤(S4000)中，使用反向引物作为起点，可以产生反向引物所结合的单链DNA的至少部分的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，反向引物所结合的单链DNA的至少部分的扩增产物可以在反向引物的3'端处延伸。

[0719] 根据本申请的示例性实施方式，当正向引物和反向引物是核酸复合物1时，当完成至少两个PCR循环时，可以产生构建体，所述构建体中第一标签112位于双链DNA的一侧，而第二标签122位于双链DNA的另一侧(与所述双链DNA的一侧不同的侧)。换言之，当正向引物和反向引物是核酸复合物1时，当完成至少两个PCR循环时，可以产生构建体，所述构建体中第一标签112位于正向引物的5'端，第二标签122位于反向引物的5'端。

[0720] 这将在下文的1.2二级结构的形成中详细描述。

[0721] 参考图19，在热变性步骤(S2000)中，可以将存在于单位单元(UC)中的双链DNA变性为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可以将包含靶标碱基序列的双链DNA变性为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可以将包含靶标碱基序列的双链DNA分开为两条单链DNA。

[0722] 可能存在相似的碱基序列，其中至少一个碱基序列与单位单元(UC)中的靶标碱基序列不同。在单位单元(UC)中可能存在单链DNA和/或包含相似碱基序列的单链DNA。相似的碱基序列可以指与靶标碱基序列相比省略或置换了部分碱基序列的碱基序列。

[0723] 在热变性步骤(S2000)中，可以将包含相似碱基序列的双链DNA变性为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可以将包含相似碱基序列的双链DNA分开为两条单链DNA。

[0724] 相似的碱基序列和靶标碱基序列可以包含在相同的核酸中。在具体实例中，相似的碱基序列和靶标碱基序列可以包含在DNA的同一链中。相似的碱基序列和靶标碱基序列可以包含在不同的核酸中。在具体实例中，相似的碱基序列和靶标碱基序列可以包含在DNA的不同链中。

[0725] 在退火步骤(S3000)中，在热变性步骤(S2000)之后，决定子100可以结合至靶标核酸，所述靶标核酸包括存在于单位单元(UC)中的单链DNA的靶标碱基序列。决定子100可以互补结合至单位单元(UC)的单链DNA的靶碱基序列。

[0726] 在退火步骤(S3000)中，在热变性步骤(S2000)后，标签200可以结合至包含单位单元(UC)中存在的单链DNA的相似碱基序列的核酸。标签200可以互补结合至单位单元(UC)中单链DNA的相似碱基序列。

[0727] 当标签200互补结合至相似的碱基序列时，标签200可以防止决定子100错配并结合至相似的碱基序列。当标签200互补结合至相似的碱基序列时，标签200可以防止决定子100非特异性地结合至相似的碱基序列。

[0728] 在聚合步骤(S4000)中，使用决定子100作为起点，可以产生决定子100所结合的靶标核酸的至少部分的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，靶标核酸的至少部分的扩增产物可以从决定子100的3'端延伸。

[0729] 在聚合步骤(S4000)中，可以防止以标签200为起点产生包含相似碱基序列的单链DNA的扩增产物。

[0730] 在一个实例中，标签200可以与接头400连接。通过将标签200与接头400连接，可以防止以标签200为起点产生包含相似碱基序列的单链DNA的扩增产物。通过将标签200与接头400连接，可以防止产生包含相似碱基序列的单链DNA的扩增产物。

[0731] 因为在标签200的3'端的糖的H基团用于与接头400连接，可以防止在标签200的3'末端方向上产生包含相似碱基序列的单链DNA的扩增产物。

[0732] 在具体实例中，当接头400是聚乙二醇(PEG)时，标签200可以与接头400以如下方式连接：标签200的H基团与接头400的OH基团反应以形成共价键。结果，通过的标签200的3'端(在反应中延伸核苷酸处)预先引入糖的H基团，可以防止在标签200的3'端方向上产生包含相似碱基序列的单链DNA扩增产物。

[0733] 在一些情况中，在聚合步骤(S4000)中，标签200可以与相似的碱基序列解离。根据基于标签200的碱基序列的类型和长度以及标签200的组成而确定的标签200的结合力，在聚合步骤(S4000)中，标签200与相似碱基序列之间的结合可以解离。

[0734] 如上所述，当在PCR中使用根据本发明示例性实施方式的核酸复合物1时，可以产生与靶标碱基序列有关的核酸的扩增产物，并且可以避免产生与相似碱基序列有关的核酸的扩增产物。因此，当在PCR中使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物1时，可以得到能够更精确地扩增期望的DNA的优点。

[0735] 根据本申请的另一示例性实施方式，可以进行PCR钳制的核酸复合物1可以包含决定子100和标签200。

[0736] 决定子100可以是引发PCR反应的正向引物或反向引物。决定子100可以引发包含靶标碱基序列的核酸的至少部分区域的扩增产物的产生。

[0737] 标签200可以包含核酸类似物。在具体实例中，标签200可以由PNA的单位分子的聚合物构成。标签200可以具有其中至少部分区域与决定子100不同的碱基序列。标签200可以具有决定子100的碱基序列的部分序列被删除或者部分序列被置换的碱基序列。

[0738] 标签200可以结合至相似的碱基序列。标签200可以结合至相似的碱基序列，以防止决定子100结合至相似的碱基序列。

[0739] 标签200可以结合至相似的碱基序列，以防止包含相似的碱基序列的单链DNA扩增。在一个实例中，标签200可以由核酸类似物的单位分子构成，并且不可被DNA聚合酶延伸。结果，标签200可以防止包含相似碱基序列的单链DNA的扩增。

[0740] <核酸复合物对10的应用>

[0741] 1.核酸复合物对10的应用#1-PCR

[0742] 1.1核酸复合物对10在提供引物对中的应用

[0743] 1.1.1核酸复合物对10的构造

[0744] 图20是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0745] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10可包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。第一核酸复合物110可至少包含第一决定子111和第一标签112。第二核酸复合物120可至少包含第二决定子121和第二标签122。

[0746] 第一决定子111可以是正向引物或反向引物。当第一决定子111是正向引物时，第二决定子121可以是反向引物。当第一决定子111是反向引物时，第二决定子121可以是正向引物。

[0747] 在具体实例中，第一决定子111可以互补结合与特定疾病有关的第一靶标碱基序列，第二决定子121可以互补结合与相同特定疾病有关的第二靶标碱基序列。

[0748] 第一标签112可以互补结合第二标签122。在一个实例中，第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的碱基序列。在另一实例中，第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的化合物。

[0749] 1.1.2核酸复合物对10的操作

[0750] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10可以用于PCR。核酸复合物对10可以在PCR中充当正向引物和反向引物。第一核酸复合物110可以用作正向引物，而第二核酸复合物120可以用作反向引物。或者，第一核酸复合物110可以用作反向引物，第二核酸复合物120可以用作正向引物。

[0751] 当在PCR中使用核酸复合物对10时，可以将核酸复合物对10提供至待进行PCR的单位单元(UC)。

[0752] 当将核酸复合物对10提供至单位单元(UC)时，核酸复合物对10可以具有第一标签112和第二标签122彼此互补结合的状态。可以将其中的第一标签112和第二标签122彼此互补结合的核酸复合物对10提供给单位单元(UC)。这是因为核酸复合物对10可以以第一标签
112和第二标签122彼此互补结合的形式合成。

[0753] 或者，在将核酸复合物对10提供至单位单元(UC)之后，第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。

[0754] 图21是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的配对操作的图。

[0755] 在进行PCR之前，可以进行配对步骤(S1000)。在热变性步骤(S2000)之前，可以进行配对步骤(S1000)。

[0756] 配对步骤(S1000)可为诱导第一标签112和第二标签122的互补结合的步骤。换言之，可以通过调节单位单元(UC)的温度来诱导单位单元(UC)中包含的核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的互补结合。

[0757] 在配对步骤(S1000)中调节的温度可为第一标签112和第二标签122彼此互补结合的温度。优选地，在配对步骤(S1000)中调节的温度是第一标签112和第二标签122彼此互补结合的区域的退火温度。

[0758] 根据本申请的示例性实施方式，在配对步骤(S1000)后，核酸复合物对10可以用于PCR。在配对步骤(S1000)后，核酸复合物对10可以经历热变性步骤(S2000)。在配对步骤(S1000)后，核酸复合物对10可以按照热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)的序列进行PCR。在配对步骤(S1000)后，核酸复合物对10可以经受至少一个PCR循环，所述PCR循环包括热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)。

[0759] 根据本申请的另一示例性实施方式，在配对步骤(S1000)后，可以分配含有核酸复合物对10的单位单元(UC)的溶液。在配对步骤(S1000)后，可以将包含核酸复合物对10的单位单元(UC)的溶液分配至较小的单位(例如管或孔)中。这将在下文的4.核酸复合物对10的应用#4-数字PCR中详细描述。

[0760] 1.1.3根据第四示例性实施方式的核酸复合物对10的应用

[0761] 图22是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0762] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10可以包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。第一核酸复合物110可以至少包含第一决定子111、第一标签112和第一标记113。第二核酸复合物120可至少包含第二决定子121、第二标签122和第二标记123。

[0763] 第一决定子111可以是正向引物或反向引物。当第一决定子111是正向引物时，第二决定子121可以是反向引物。当第一决定子111是反向引物时，第二决定子121可以是正向引物。

[0764] 在具体实例中，第一决定子111可以互补结合与特定疾病有关的第一靶标碱基序列，第二决定子121可以互补结合与相同疾病有关的第二靶标碱基序列。

[0765] 第一标签112可以互补结合第二标签122。在一个实例中，第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的碱基序列。在另一实例中，第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的化合物。

[0766] 第一标记113和第二标记123可以进行联接动作。在一个实例中，当第一标记113是荧光分子时，第二标记123可以是吸收或转换从第一标记113发射的光的淬灭剂分子。

[0767] 第一标记113和第二标记123之间的联接动作可以与第一标签112和第二标签122之间的结合相关联。在一个实例中，通过第一标签112和第二标签122之间的结合，可测定第一标记113和第二标记123之间的联接动作。

[0768] 类似于上述所述的示例性实施方式，在配对步骤(S1000)后，可以分配包含核酸复合物对10的单位单元(UC)的溶液。在配对步骤(S1000)后，可以将包含核酸复合物对10的单位单元(UC)的溶液分配成较小的单位。

[0769] 可以调节较小单位单元(UC)中所分配的溶液的温度。通过调节较小单位单元(UC)中所分配的溶液的温度，分配至较小单位单元(UC)中的核酸复合物对10可以根据调节的温度诱导或解离第一标签112和第二标签122之间的结合。优选地，通过提高较小单位单元(UC)中所分配的溶液的温度，分配至较小单位单元(UC)中的核酸复合物对10使第一标签112和第二标签122之间的结合解离。

[0770] 根据第一标签112和第二标签122之间的结合的解离，温度调节之前的较小单位单元(UC)的物理性质可能不同于温度调节之后的较小单位单元(UC)的物理性质。在一个实例中，当使用光学装置检测较小单位单元(UC)的光学性质时，在将单位单元(UC)的温度调节升高之前获得的检测值可以小于在将单位单元(UC)的温度调节升高之后获得的检测值。

[0771] 1.2二级结构的形成

[0772] 1.2.1二级结构的形成

[0773] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第一决定子111和第二决定子121可以特异性结合相关物质。

[0774] 在一个实例中，核酸复合物对10可以特异性结合核酸(即相关物质)，所述核酸包含与第一决定子111互补结合的第一靶标碱基序列和与第二决定子121互补结合的第二靶标碱基序列。第一决定子111和第二决定子121可以特异性结合包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸。

[0775] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。在一个实例中，根据第一标签112和第二标签122之间的互补结合，可以改变其中的第一决定子111和第二决定子121连接的构建体的形状。

[0776] 根据本申请的示例性实施方式，根据第一标签112和第二标签122之间的互补结合，其中的第一决定子111和第二决定子121连接的构建体可以具有二级结构。作为示例，根据第一标签112和第二标签122之间的互补结合，其中的第一决定子111和第二决定子121连接的构建体可以具有发夹状结构。

[0777] 根据本申请的示例性实施方式，通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成的二级结构的形状可以根据第一标签112和第二标签122的结合方向而变化。已经在上述2.2标签200中详细描述了第一标签112和第二标签122之间的结合操作，将省略重复的描述。

[0778] 图23和图24是说明了根据本申请的示例性实施方式，其中的第一决定子111与第二决定子121结合的构建体的二级结构的形成的图。

[0779] 参考图23，第一决定子111可以结合至包含第一靶标碱基序列的核酸。第二决定子121可以结合至包含第二靶标碱基序列的核酸。第一决定子111和第二决定子121可以结合至包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸。

[0780] 第一标签112可以互补结合至第二标签122。第一标签112和第二标签122可以具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121隔开的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。第一标签112和第二标签122可具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列和与第二接头124隔开的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。在一个实例中，第一标签112和第二标签122可以具有能够彼此结合的碱基序列，如图12(a)所示。

[0781] 根据本申请的示例性实施方式，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以形成圈样结构。包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以互补结合第一决定子111和第二决定子121。当第一标签112和第二标签122彼此互补结合时，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以具有圈样结构，其中，所述第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列分别与第一决定子111和第二决定子121连接。包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸的圈样结构可以通过在与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121隔开的第二标签122的碱基序列之间形成互补结合而形成，其中，所述第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列分别与第一决定子111和第二决定子
121连接。

[0782] 本文所使用的“圈样结构”可以以如下方式形成：所形成的具有任意曲率的环结构的至少部分区域以双链形成，并且由于环结构的至少部分区域的开口而不形成完整的圆形。

[0783] 根据本申请的示例性实施方式，取决于第一标签112和第二标签122之间的互补结合，可以测定与第一决定子111和第二决定子121连接的核酸是否形成圈样结构。取决于第一标签112和第二标签122之间的互补结合，可以测定第一标记113和第二标记123是否联接。取决于与第一决定子111和第二决定子121连接的核酸是否具有圈样结构，第一标记113和第二标记123是否进行联接动作可以有所变化。

[0784] 参考图24，第一决定子111可以结合至包含第一靶标碱基序列的核酸。第二决定子121可以结合至包含第二靶标碱基序列的核酸。第一决定子111和第二决定子121可以结合至包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸。

[0785] 第一标签112可以互补结合第二标签122。第一标签112和第二标签122可以具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121相邻的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。第一标签112和第二标签122可具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列和与第二接头124相邻的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。在一个实例中，第一标签112和第二标签122可以具有能够以图12(b)所示的形式结合的碱基序列。

[0786] 根据本申请的示例性实施方式，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以形成发夹样结构。包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以分别互补结合第一决定子111和第二决定子121。当第一标签112和第二标签122彼此互补结合时，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以形成圈样结构，其中，所述第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列分别与第一决定子111和第二决定子121连接。当第一标签112和第二标签122以与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121相邻的第二标签122的碱基序列形成互补结合的形式彼此互补结合时，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸可以形成发夹样结构，其中，所述第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列分别与第一决定子111和第二决定子121连接。

[0787] 本文所使用的术语“发夹状结构”可表示形成环结构和与该环状结构联接的茎结构。此处，所形成的具有任意曲率的环结构的至少部分区域具有双链，茎结构以从双链中包含的各单链的末端延伸的核酸彼此联接的方式形成。

[0788] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第一决定子111和第二决定子121可以特异性结合至相关物质。

[0789] 在一个实例中，核酸复合物对10可以特异性结合核酸(即相关物质)，所述核酸包含与第一决定子111互补结合的第一靶标碱基序列和与第二决定子121互补结合的第二靶标碱基序列。

[0790] 在另一实例中，根据本申请的另一示例性实施方式，第一靶标核酸和第二靶标核酸之后可以相关联，所述第一靶标核酸包含第一决定子111所特异性结合的第一靶标碱基序列，所述第二靶标核酸包含第二决定子121所特异性结合的第二靶标碱基序列。之后，第一决定子111和第二决定子121可以以形成包含第一决定子111和第二决定子121的双链核酸构建体的形式相关联。

[0791] 图25和图26是说明了根据本申请的示例性实施方式的形成包含第一决定子111和第二决定子121的构建体的过程的图。

[0792] 参考图25，可以将核酸复合物对10和各种样品提供至进行PCR的单位单元(UC)。在一个实例中，包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的双链DNA可以存在于单位单元(UC)中。可以在单位单元(UC)中提供双链DNA，其中，在双链DNA中，第一靶标碱基序列包含在第一链中，第二靶标碱基序列包含在第二链中，并且第一和第二链彼此互补连接。

[0793] 在热变性步骤(S2000)中，可以通过调节单位单元(UC)的温度使存在于单位单元(UC)中的双链DNA变性为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可使包含第一靶标碱基序列的第一链和包含第二靶标碱基序列的第二链之间的互补结合解离。

[0794] 在退火步骤(S3000)中，第一核酸复合物110的第一决定子111可以互补结合至第一链。在退火步骤(S3000)中，第二核酸复合物120的第二决定子121可以互补结合至第二链。

[0795] 在退火步骤(S3000)中，与结合至第一链的第一决定子111连接的第一标记113和与结合至第二链的第二决定子121连接的第二标记123可以不进行联接动作。第一标记113和第二标记123彼此相对远地间隔开，因此彼此之间可能不进行联接动作。第一标记113和第二标记123可以彼此隔开比有效联接距离(LD)更远的距离，并且因此彼此之间可以不进行联接动作。在具体实例中，当第一标记113是荧光分子，第二标记123是淬灭剂分子时，由于第一标记113可发出荧光。

[0796] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生包含第一决定子111所结合的第一靶标碱基序列的第一链的至少部分的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生包含第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列的第二链的至少部分的扩增产物。

[0797] 将一个循环设置为包括热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)，并且对于单位单元(UC)可进行至少一个或多个循环的PCR。

[0798] 参考图26，在PCR的第一个循环后的热变性步骤(S2000)中，可以通过调节单位单元(UC)的温度将存在于单位单元(UC)中的双链DNA分开为单链DNA。

[0799] 在热变性步骤(S2000)中，可以产生单链核酸，所述单链核酸包含第一决定子111和含有第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物。包含第一决定子111和第一链的扩增产物的单链核酸可以包含第二靶标碱基序列。

[0800] 在热变性步骤(S2000)中，可以产生单链核酸，所述单链核酸包含第二决定子121和含有第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物。包含第二决定子121和第二链的扩增产物的单链核酸可以包含第一靶标碱基序列。

[0801] 在退火步骤(S3000)中，第一决定子111可以互补结合至包含第二决定子121和含有第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物的单链核酸。在退火步骤(S3000)中，第二决定子121可以互补结合至包含第一决定子111和含有第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物的单链核酸。

[0802] 在退火步骤(S3000)中，如在PCR的第一个循环中一样，第一决定子111可以互补结合至包含第一靶标碱基序列的第一链。此外，在退火步骤(S3000)中，如在PCR的第一个循环中一样，第二决定子121可以互补结合至包含第二靶标碱基序列的第二链。

[0803] 在退火步骤(S3000)中，与结合至第一链的第一决定子111所连接的第一标记113和与结合至第二链的第二决定子121所连接的第二标记123可以不进行联接动作。第一标记113和第二标记123彼此间隔相对大的距离，因此可不进行联接动作。第一标记113和第二标记123可以彼此隔开比有效联接距离(LD)更远的距离，因此可以不进行联接动作。在具体实例中，当第一标记113是荧光分子，第二标记123是淬灭剂分子时，由于第一标记113可发出荧光。

[0804] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以生产第一决定子111所结合的单链核酸的扩增产物，所述单链核酸包含第二决定子121和含有第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，当产生包含第二决定子121和第二链的扩增产物的单链核酸的扩增产物时，第二接头124可以防止第二标签122的扩增产物产生。

[0805] 在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以生产第二决定子121所结合的单链核酸的扩增产物，所述单链核酸包含第一决定子111和第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，当产生包含第一决定子111和第一链的扩增产物的单链核酸的扩增产物时，第一接头114可以防止第一标签112的扩增产物产生。

[0806] 在聚合步骤(S4000)中，如在PCR的第一循环中一样，使用第一决定子111作为起点，可以产生第一链的至少部分的扩增产物，所述第一链包含第一决定子111所结合的第一靶标碱基序列。此外，在聚合步骤(S4000)中，如在PCR的第一循环中一样，使用第二决定子121作为起点，可以产生第二链的至少部分的扩增产物，所述第二链包含第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列。

[0807] 当进行至少两个或更多个循环的PCR时，可以产生双链核酸构建体，所述双链核酸构建体在单位单元(UC)中包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列，并且进一步包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。在包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列并包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的双链核酸构建体中，第一标签112和第二标签122可以保持在单链形式。

[0808] 根据本申请的示例性实施方式，保持为单链形式的第一标签112和第二标签122在PCR完成后仍然保持单链，从而可以形成第一标签112和第二标签122之间的互补结合。结果，在PCR完成后，根据第一标签112和第二标签122之间是否存在互补结合，检测第一标记113和第二标记123，从而可检测靶标核酸的存在。核酸复合物对10的具体实施方式将在1.3用于靶标检测的核酸复合物对的应用中更具体地描述。

[0809] 图27和图28是说明了根据本申请的示例性实施方式的包含第一决定子111和第二决定子121的构建体的二级结构的形成的图。

[0810] 参考图27，包含第一核酸复合物110、第二核酸复合物120、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的结构可以形成二级结构。在一个实例中，通过PCR产生的包含第一核酸复合物110、第二核酸复合物120、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的结构可以形成二级结构。

[0811] 第一标签112可以互补结合第二标签122。保持为单链形式的第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。保持为单链核酸的第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。

[0812] 第一标签112和第二标签122可以具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121隔开的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。第一标签112和第二标签122可以具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列和与第二接头124隔开的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。在一个实例中，第一标签112和第二标签122可以具有以如图12(a)所示的形式彼此结合的碱基序列。

[0813] 根据本申请的示例性实施方式，尽管包含第一决定子111、第二决定子121、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸构建体具有双链形式，包含第一决定子111、第二决定子121、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸构建体可以形成圈样结构。暴露于第一决定子111的5'端的第一标签112和暴露于第二决定子121的5'端的第二标签122可以互补地结合。包含第一决定子111、第二决定子121、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸构建体可以具有通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合而形成的圈样结构。

[0814] 参考图28，包含第一核酸复合物110、第二核酸复合物120、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的构建体可以形成二级结构。在一个实例中，通过PCR产生的包含第一核酸复合物110、第二核酸复合物120、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的构建体可以形成二级结构。

[0815] 第一标签112可以互补结合第二标签122。保持为单链形式的第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。保持为单链核酸的第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。

[0816] 第一标签112和第二标签122可以具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121相邻的第二标签122的碱基序列之间的互补结合形成。第一标签112和第二标签122可以具有如下碱基序列：所述碱基序列允许与第一接头114相邻的第一标签112的碱基序列和与第二接头124相邻的碱基序列之间的互补结合形成。在一个实例中，第一标签112和第二标签122可以具有能够以如图12(a)所示的形式彼此结合的碱基序列。

[0817] 根据本申请的示例性实施方式，即使包含第一决定子111、第二决定子121、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸构建体可以具有双链形式，包含第一决定子111、第二决定子121、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸构建体可以形成发夹样结构。暴露于第一决定子111的5'端的第一标签112和暴露于第二决定子121的5'端的第二标签
122可以互补结合。包含第一决定子111、第二决定子121、第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的核酸构建体可以具有通过互补结合第一标签112和第二标签122而形成的发夹样结构。

[0818] 1.2.2实验例#1：涉及二级结构的形成

[0819] 图29和30是说明了根据本申请的示例性实施方式的包含核酸复合物对10的核酸构建体的二级结构的形成的图。

[0820] 在该实验过程中，将Tris-HCl(pH 9.0)、盐(KCl)、MaCl2、dNTP混合物、蛋白稳定剂、PCR增强剂(大分子)和快速热启动Taq DNA聚合酶引入PCR板的管(或孔)中[0821] 将第一核酸复合物对10引入PCR板的第一管中。第一核酸复合物对10由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成。

[0822] 第一核酸复合物110通过顺序连接第一标记113、第一标签112、第一接头114和第一决定子111而形成，其中，第一标记113为FAM，第一标签112为AAAAAAAA(SEQ ID NO：1)，第一接头114是18个原子的六乙二醇间隔物(间隔物18)，第一决定子111为TACGCCTGCTACTTTCACG(SEQ ID NO：2)。

[0823] 第二核酸复合物120通过顺序连接第二标记123、第二标签122、第二接头124和第二决定子121而形成，其中，第二标记123为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第二标签122为TTTTTTTT(SEQ ID NO：3)，第二接头124为间隔物18，第二决定子121为ATATTTAAGGGCATAATTTCCG(SEQ ID NO：4)。

[0824] 将第二核酸复合物对10引入PCR板的第二管中。第二核酸复合物对10由第三核酸复合物1和第四核酸复合物1组成。

[0825] 第三核酸复合物1通过顺序连接第三标记300、第三标签200、第三接头400和第三决定子100而形成，其中，第三标记300为FAM，第三标签200为AAAAAAAAAA(SEQ ID NO：5)，第三接头400为间隔物18，第三决定子100为AGGTAAACGCTCCTCTGAA(SEQ ID NO：6)。

[0826] 第四核酸复合物1通过顺序连接第四标记300、第四标签200、第四接头400和第四决定子100而形成，其中，第四标记300为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第四标签200为TTTTTTTTTT(SEQ ID NO：7)，第四接头400为间隔物18，第四决定子100为GCGAGTTACGAAGACAAAA(SEQ ID NO：8)。

[0827] 将第三核酸复合物对10引入PCR板的第三管中。第三核酸复合物对10由第五核酸复合物1和第六核酸复合物1组成。

[0828] 第五核酸复合物1通过顺序连接第五标记300、第五标签200、第五接头400和第五决定子100而形成，其中，第五标记300为FAM，第五标签200为AACCTTGGGA(SEQ ID NO：9)，第五接头400为间隔物18，第五决定子100为AGCTCCTATTGCCAACGTA(SEQ ID NO：10)。

[0829] 第六核酸复合物1通过顺序连接第六标记300、第六标签200、第六接头400和第六决定子100而形成，其中，第六标记300为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第六标签200为TCCCAAGGTT(SEQ ID NO：11)，第六接头400为间隔物18，第六决定子100为AATCTTTGTGTGGAGCATC(SEQ ID NO：12)。

[0830] 通过调节其中引入有核酸复合物对10和其它酶的管的温度对管中的溶液进行PCR反应。如图29所示，将管的温度在95℃下保持10分钟，并将热变性步骤(S2000；95℃，10秒)、退火步骤(S3000；50℃，40秒)和聚合步骤(S4000；60℃，20秒)的过程设为一个循环，并重复进行40个循环。在该实验中，使用了Bio-Rad CFX96(许可证号10-205)。

[0831] 此后，将第一管、第二管和第三管在冰箱中稳定预定时间或更长时间，然后对第一管、第二管和第三管中的溶液进行电泳实验。

[0832] 参考图30，第一管的结果对应于第二列(即，无探针PCR扩增子T1)。证实了第一管中包含第一核酸复合物对10的核酸构建体(即，第一核酸复合物110、第二核酸复合物120、包含第一靶标碱基序列的第一靶标核酸的至少部分的扩增产物、以及包含第二靶标碱基序列的第二靶标核酸的至少部分的扩增产物)的质量为180bp。

[0833] 作为对照，进行了使用第四管的实验，所述第四管包含与第一管相同的酶，并包含正向引物(TACGCCTGCTACTTTCACG(SEQ ID NO：2))和反向引物(ATATTTAAGGGCATAATTTCCG(SEQ ID NO：4))代替第一核酸复合物110和第二核酸复合物120，并且结果对应于第五列(即，PCR扩增子T1)。证实了包含正向引物和反向引物的扩增产物(即，核酸的至少部分的扩增产物，包含正向引物、反向引物、包含与正向引物互补的序列和与反向引物互补的序列的核酸的至少部分的扩增产物)的质量为143bp。

[0834] 图31是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸构建体的二级结构的形成的图。

[0835] 具体而言，如图31(a)所示，如果在单位单元(UC)中核酸复合物对10的第一标签112与另一核酸复合物对10的第二标签122互补结合，根据至少两种扩增产物的质量，从电泳凝胶获得的结果应显示质量为143×2＝286bp。

[0836] 然而，图30中所示的第一管的结果示出了180bp的质量，并且鉴于第一标签112和第二标签122的质量为16bp，质量差异约为180-143-16＝21bp。然而，考虑到荧光分子、淬灭剂分子和接头400的质量(如图32(b)所示)，有理由认为形成了二级结构。

[0837] 由此，可以证实包含核酸复合物对10的核酸构建体形成二级结构。

[0838] 如此，第二管的结果为230bp，在第三列示出(即，无探针PCR扩增子T2)；第五管的结果为191bp，在第六栏示出(即，PCR扩增子T2)，所述第五管包含与第二管的酶相同的酶，并进一步包含正向引物(AGGTAAACGCTCCTCTGAA(SEQ  ID  NO：6))和反向引物(GCGAGTTACGAAGACAAAA(SEQ ID NO：8))代替第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。

[0839] 此外，第三管的结果为150bp，在第四列示出(即，无探针PCR扩增子T3)；第六管的结果为113bp，在第七列示出(即，PCR扩增子T3)，所述第六管包含与第三管相同的酶，并进一步包含正向引物(AGCTCCTATTGCCAACGTA(SEQ  ID  NO：10))和反向引物(AATCTTTGTGTGGAGCATC(SEQ ID NO：12))代替第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。

[0840] 结果，包含核酸复合物对10的核酸构建体的质量并未两倍超过不包含核酸复合物对10的核酸构建体的质量，证实了包含核酸复合物对10的核酸构建体的第一标签112未互补结合至包含另一核酸复合物对10的核酸构建体的第二标签122，因此，通过包含核酸复合物对10的核酸构建体的第一标签112和第二标签122之间的互补结合而形成二级结构。

[0841] 至此，已经详细描述了与核酸复合物对10有关的核酸的二级结构的形成以及由此形成的二级结构的形状。然而，简要说明和详细描述了本申请中公开的核酸复合物1和相关操作，以使本领域的普通技术人员可以容易地理解本说明书，并且在解释本说明书的范围时，不应被解释为限于附图或具体描述。

[0842] 在下文中，根据光学装置的检测信号(其由于二级结构的形成或解离而可能变化)，将详细描述用于确定单位单元(UC)中是否存在待检测的靶核酸的应用的实例。

[0843] 1.3核酸复合物对10在靶标检测中的应用

[0844] 1.3.1核酸复合物对10的构造

[0845] 图32是说明了根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的图。

[0846] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10可包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。第一核酸复合物110可包含第一决定子111、第一标签112、第一标记113和第一接头114。第二核酸复合物120可包含第二决定子121、第二标签122、第二标记123和第二接头124。

[0847] 第一决定子111可以是正向引物或反向引物。当第一决定子111是正向引物时，第二决定子121可以是反向引物。当第一决定子111是反向引物时，第二决定子121可以是正向引物。

[0848] 在具体实例中，第一决定子111可以互补地结合至与特定疾病有关的第一靶标碱基序列，第二决定子121可以互补地结合至与相同疾病有关的第二靶标碱基序列。

[0849] 第一标签112可以互补结合第二标签122。在一个实例中，第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的碱基序列。在另一实例中，第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的化合物。

[0850] 第一接头114可以防止产生第一标签112的扩增产物。在具体实例中，通过第一决定子111和第一靶标碱基序列之间互补结合来产生包含第一靶标碱基序列的第一靶标核酸的至少部分区域的扩增产物后，第一靶标核酸的至少部分区域的扩增产物与第二决定子121结合，以引发包含第一决定子111的单链核酸的扩增，然后第一接头114可以阻止产生第一标签112的扩增产物。

[0851] 第二接头124可以防止产生第二标签122的扩增产物。在具体实例中，通过第二决定子121和第二靶标碱基序列之间互补结合来产生包含第二靶标碱基序列的第二靶标核酸的至少部分区域的扩增产物后，第二靶标核酸的至少部分区域的扩增产物结合至第一决定子111，以引发包含第二决定子121的单链核酸的扩增，然后第二接头124可以阻止产生第二标签122的扩增产物。

[0852] 在具体实例中，第一接头114和第二接头124可以是PCR阻断剂。

[0853] 第一标记113可以与第二标记123联接。当获得包含第一标记113和第二标记123的单位单元(UC)的光学装置检测值时，第一标记113和第二标记123联接时获得的检测值可能与第一标记113和第二标记123未联接时获得的检测值不同。在一个实例中，第一标记113可以是荧光分子，第二标记123可以是淬灭剂分子，并且当进行联接动作时，从第一标记113发出的光可以被第二标记123吸收，当不进行联接动作时，可以使用光学装置检测从第一标记113发出的光。

[0854] 1.3.2核酸复合物对10的操作

[0855] 根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10可以用作PCR中的引物。

[0856] 根据本申请的示例性实施方式，可以通过检测包含核酸复合物对10的单位单元(UC)的信号来确定核酸复合物对10中的联接，并可通过确定酸复合物对10的联接来检测单位单元(UC)中靶标核酸的存在。

[0857] 具体而言，当在单位单元(UC)中存在包含第一决定子111所互补结合的第一靶标碱基序列和第二决定子121所互补结合的第二靶标碱基序列的核酸时，单位单元(UC)的光学装置检测值在特定温度下可发生改变。

[0858] 例如，在第一标签112和第二标签122之间的结合解离的温度下，根据第一标记113和第二标记123之间的联接的变化，可证实光学装置获得的单位单元(UC)的检测值可发生变化。

[0859] 结果，根据光学装置获得的检测值是否在特定温度下变化，可以确定单位单元(UC)中是否存在待检测的靶核酸。

[0860] 在下文中，将描述用于确定单位单元(UC)中是否存在靶标核酸的详细操作。

[0861] 图33是说明了根据本申请的示例性实施方式的PCR后的检测步骤的图。

[0862] 根据本申请的示例性实施方式，可以进行对于完成PCR的单位单元(UC)的稳定步骤(S5000)。可以以使单位单元(UC)的温度降低到预定温度以下的方式进行稳定步骤(S5000)。可以以使单位单元(UC)中的溶液的温度降低到至少40℃或更低并保持预定时间的方式进行稳定步骤(S5000)。

[0863] 所调节的稳定步骤(S5000)的温度可为诱导第一标签112和第二标签122之间结合的温度。优选地，在稳定步骤(S5000)中，单位单元(UC)的温度保持不超过20℃。优选地，在稳定步骤(S5000)中，单位单元(UC)的温度保持不超过15℃。优选地，稳定步骤(S5000)中的单位单元(UC)的温度保持不超过10℃。优选地，稳定步骤(S5000)中的单位单元(UC)的温度保持不超过5℃。

[0864] 根据稳定步骤(S5000)，可形成核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的互补结合。如上所述，由于第一标签112和第二标签122之间的结合，包含第一决定子111和第二决定子121的核酸可以形成二级结构。

[0865] 在稳定步骤(S5000)之后，可进行获得解离曲线的步骤(S6000)。可对已经历稳定步骤(S5000)的单位单元进行获得解离曲线的步骤(S6000)。

[0866] 此处，“解离曲线”是指在包含使第一标签112和第二标签122解离的温度的温度范围内，荧光值相对于单位单元(UC)的温度的图表。

[0867] 在获得解离曲线的步骤(S6000)中，随着单位单元(UC)中包含的溶液的温度升高，可对单位单元(UC)中包含的溶液的荧光值进行检测。在获得解离曲线的步骤(S6000)中，随着单位单元(UC)中包含的溶液的温度以恒定速率升高，可对单位单元(UC)中包含的溶液的荧光值进行检测。

[0868] 或者，在获得解离曲线的步骤(S6000)中，随着单位单元(UC)中包含的溶液的温度降低，可对单位单元(UC)中包含的溶液的荧光值进行检测。在获得解离曲线的步骤(S6000)中，随着单位单元(UC)中包含的溶液的温度以恒定速率降低，可对单位单元(UC)中包含的溶液的荧光值进行检测。

[0869] 在获得解离曲线的步骤(S6000)中，可以检测单位单元(UC)中包含的溶液的多个波长段的荧光值。在获得解离曲线的步骤(S6000)中，可以检测在单位单元(UC)中包含的溶液的多个波长段的一些荧光值。在获得解离曲线的步骤(S6000)中，可以从单位单元(UC)中包含的溶液中检测多个波长段的荧光值中的预先设定的一些波长段(或一些波长段组)的荧光值。

[0870] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，当由于第一标记113和第二标记123之间的联接动作，实现了第二标记123使从第一标记113发出的光熄灭时，在获得解离曲线的步骤(S6000)中获得的解离曲线可为示出了荧光值随温度升高而降低的图表(参见图34(a))。具体而言，当第一标签112和第二标签122在稳定步骤(S5000)中互补结合时，从第一标记113发出的光可由于第二标记123而被熄灭。随着单位单元(UC)的温度升高，当第一标签112和第二标签122之间的互补结合解离时，从第一标记113发出的光可不会因第二标记123而熄灭，因而可发出来自第一标记113的光。

[0871] 根据本申请的示例性实施方式，可以从根据所检测的温度的荧光图表获得微分图表。换言之，可将根据获得解离曲线的检测步骤(S6000)的根据温度的荧光图转换为温度与荧光相对于温度的变化率之间的关系图。可将如图34(a)所示的根据温度的荧光图表显示为如图34(b)所示的温度与荧光相对于温度的变化率之间的关系图。

[0872] 根据温度与荧光相对于温度的变化率之间的关系图，可以获得解离峰值。本文所使用的“解离峰值”可以指核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的互补结合解离的温度。或者，本文所使用的“解离峰值”可以指基于在获得解离曲线的步骤(S6000)中获得的荧光值，荧光值的变化最大或最小的点处的温度。或者，本文所使用的“解离峰值”可以指在示出基于解离曲线而获得的温度与荧光值相对于温度的负变化之间的关系的图表上(见图34(b)和图35(b))，对应于最大点的温度或对应于最小点的温度。或者，“解离峰值”可以指，当基于解离曲线在特定温度范围内，荧光改变大于参考量时，荧光减少了对应于改变的荧光量的1/2的荧光量的点的温度。或者，本文所使用的“解离峰值”可以指一种类型的核酸复合物对10的荧光值降低到预定比率以下的温度。

[0873] 在一个实例中，参考图34(b)，T1是对应于示出了温度与荧光值相对于温度的负变化之间的关系的图表(基于解离曲线而获得)中的最小点的温度，因此，T1可为解离峰值。

[0874] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，当由于第一标记113和第二标记123之间的联接动作而使从第一标记113发出的光被第二标记123转换成可检测的光时，在获得解离曲线的步骤(S6000)中获得的解离曲线可以是其中荧光值随着温度的升高而增加的图表(参见图35(a))。具体而言，当第一标签112和第二标签122在稳定步骤(S5000)中彼此互补结合时，来自第一标记113的光可以被第二标记123转换成可检测的光t。当第一标签112和第二标签122之间的互补结合随着单位单元(UC)的温度升高而解离时，来自第一标记113的光可不被第二标记123转换，因此光学装置无法检测到来自第一标记113的光，确定为光熄灭状态。

[0875] 在一个实例中，参考图35(b)，T1是对应于示出了温度与荧光值相对于温度的负变化之间的关系的图表(基于解离曲线而获得)中的最大点的温度，因此，T1可为解离峰值。

[0876] 在使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10确定单位单元(UC)中是否存在靶标核酸时，当荧光值相对于温度的负变化/温度在特定温度下超过参考值时，基于在获得解离曲线的步骤(S6000)中获得的信息，可以确定单位单元(UC)中存在与解离峰值相关的靶标核酸。

[0877] 1.3.3实验例#2：涉及核酸复合物对10用于靶标检测

[0878] 在使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10确定单位单元(UC)中是否存在靶标核酸时，能够确定靶标核酸的浓度。

[0879] 图36是说明了根据本申请的示例性实施方式，确定单位单元(UC)中存在的靶核酸的浓度的图。

[0880] 在该实验过程中，将Tris-HCl(pH 9.0)、盐(KCl)、MaCl2、dNTP混合物、蛋白稳定剂、PCR增强剂(大分子)和快速热启动Taq DNA聚合酶引入PCR板的管(或孔)中[0881] 将第一核酸复合物对10引入PCR板的第一管至第五管中。第一核酸复合物对10由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成。具体而言，可将第一核酸复合物110和第二核酸复合物120各自以高达1.5pmol/Rxn引入。

[0882] 第一核酸复合物110通过顺序连接第一标记113、第一标签112、第一接头114和第一决定子111而形成，其中，第一标记113为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第一标签112为ACCGCGCGGG(SEQ ID NO：13)，第一接头114为间隔物18，第一决定子111为TGGAGATACACCTACATTG(SEQ ID NO：14)。

[0883] 第二核酸复合物120通过顺序连接第二标记123、第二标签122、第二接头124和第二决定子121而形成，其中，第二标记123为FAM，第二标签122为CCCGCGCGGT(SEQ ID NO：15)，第二接头124为间隔物18，第二决定子121为GCTGGACCATCTATTTCATC(SEQ ID NO：16)。

[0884] 通过调节其中引入有核酸复合物对10和其它酶的管的温度对该管中的溶液进行PCR反应。如图29所示，将管的温度在95℃下保持10分钟，然后将包含热变性步骤(S2000；95℃，10秒)、退火步骤(S3000；50℃，40秒)和聚合步骤(S4000；60℃，20秒)的过程重复40个循环。在该实验中，使用Bio-Rad CFX96(许可证号10-205)。

[0885] 此后，检测第一管的解离曲线，然后如图36所示，获得了温度与荧光相对于温度之间的关系图。

[0886] 当存在与第一决定子111和第二决定子121相对应的靶标(HPV16)的105个拷贝时(R1)，检测到最小的相对于温度的荧光/温度的最小值。

[0887] 当存在与第一决定子111和第二决定子121相对应的靶标(HPV16)的104个拷贝时(R2)，检测到相对于温度的荧光/温度的最小值，所述最小值比R1的最小值相对较大。

[0888] 当存在与第一决定子111和第二决定子121相对应的靶标(HPV16)的103个拷贝时(R3)，检测到相对于温度的荧光/温度的最小值，所述最小值比R2的最小值相对较大。

[0889] 当存在与第一决定子111和第二决定子121相对应的靶标(HPV16)的102个拷贝时(R4)，检测到相对于温度的荧光/温度的最小值，所述最小值比R3的最小值相对较大。

[0890] 当存在与第一决定子111和第二决定子121相对应的靶标(HPV16)的10个拷贝时(R5)，获得了在不同于R1至R4具有最小值的温度的温度下具有最小值的图表，在这种情况下，不清楚数据是否由于核酸复合物对10而为最小值，因此该数据没有用于分析。

[0891] 结果，在相对于温度的荧光值/温度的负变化率的图表中，可以基于是否在特定温度检测到解离峰值来确定单位单元(UC)中是否存在靶标核酸，并且证实了通过特定地确定相对于温度的荧光值/温度的负变化率的图表中的解离峰的最小值或最大值，可以评估靶标核酸的浓度。

[0892] 1.3.4根据第五示例性实施方式的核酸复合物对10的应用

[0893] 随着第一标签112和第二标签122之间的互补序列中涉及的碱基序列的数量增加，第一标签112和第二标签122之间的互补结合可以在高温下解离。然而，当第一标签112和第二标签122之间的互补序列中涉及的碱基序列的数量高于参考值时，第一标签112或第二标签122可以自身形成发夹结构。

[0894] 当发生此类现象时，可以在稳定步骤(S5000)中抑制第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成。换言之，第一标签112可以自身形成发夹结构，因此第二标签122可不与第一标签112结合。

[0895] 在根据本申请的第五示例性实施方式的核酸复合物1中，当设计第一标签112和第二标签122时，如果在第一标签112中包含胞嘧啶(C)，可将第一标签112设计为不包含鸟嘌呤(G)。此外，如果第二标签122中包含鸟嘌呤(G)，则可将第二标签122设计为不包含胞嘧啶(C)。

[0896] 在根据本申请的第五示例性实施方式的核酸复合物1中，根据需要，当设计第一标签112和第二标签122时，如果第一标签112中包含腺嘌呤(A)，则可将第一标签112设计为不包含胸腺嘧啶(T)。此外，如果第二标签122中包含胸腺嘧啶(T)，则可将第二标签122设计为不包含腺嘌呤(A)。

[0897] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由于解离峰值中涉及的结合是第一标签112和第二标签122之间的结合，几乎不需要更改第一标签112和第二标签122的碱基序列(即，解离峰值中涉及的碱基序列)，这取决于待检测的靶标。

[0898] 结果，根据解离峰值中涉及的第一标签112和第二标签122的碱基序列，可以容易地设计根据本申请示例性实施方式的核酸复合物对10，并且也可以使用根据第五示例性实施方式的核酸复合物对10。

[0899] 1.4核酸复合物对10用于靶标检测的应用的改进实例

[0900] 1.4.1竞争性构建体的构造(2)

[0901] 图37是说明了根据本申请的示例性实施方式的竞争性构建体2的图。

[0902] 根据本申请的示例性实施方式，在使用核酸复合物对10的PCR中，可以进一步使用竞争性构建体2。换言之，可将竞争性构建体2提供至包含核酸复合物对10的单位单元(UC)中，并且可以进行单位单元(UC)的PCR。

[0903] 竞争性构建体2可以包含标签竞争区500和引物竞争区600。

[0904] 标签竞争区500可以包含核酸的单位分子。标签竞争区500可以由核酸的单位分子组成。标签竞争区500可以由核酸的单位分子的聚合物构成。

[0905] 标签竞争区500可包括核酸类似物的单位分子。标签竞争区500可由核酸类似物的单位分子构成。标签竞争区500可由核酸类似物的单位分子的聚合物构成。

[0906] 标签竞争区500可包含核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。标签竞争区500可由核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子构成。标签竞争区500可由核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子的聚合物构成。标签竞争区500可由核酸类似物的单位分子和核酸的单位分子的聚合物构成。标签竞争区500可由核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子的聚合物构成。

[0907] 标签竞争区500可具有与核酸复合物1的标签200的碱基序列互补的序列。标签竞争区500可包含与核酸复合物1的标签200的至少部分碱基序列互补的序列。优选地，标签竞争区500包含与标签200的碱基序列的90％互补的序列。优选地，标签竞争区500包含与标签200的碱基序列的85％互补的序列。优选地，标签竞争区500包含与标签200的碱基序列的
80％互补的序列。标签竞争区500可包含与标签200的碱基序列的75％互补的序列。

[0908] 根据本申请的示例性实施方式，可将标签竞争区500设计为随着标记300的波长增加而具有相对较长的与标签200互补结合的碱基序列。

[0909] 引物竞争区600可包含核酸的单位分子。引物竞争区600可由核酸的单位分子构成。引物竞争区600可由核酸单位分子的聚合物构成。

[0910] 引物竞争区600可包含核酸类似物的单位分子。引物竞争区600可由核酸类似物的单位分子构成。引物竞争区600可由核酸类似物的单位分子的聚合物构成。

[0911] 引物竞争区600可包含核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子。引物竞争区600可由核酸的单位分子和核酸类似物的单位分子构成。引物竞争区600可由核酸类似物的单位分子的聚合物和核酸的单位分子构成。引物竞争区600可由核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子构成。引物竞争区600可由核酸的单位分子的聚合物和核酸类似物的单位分子的聚合物构成。

[0912] 引物竞争区600可包含与核酸复合物1的决定子100的碱基序列互补的序列。引物竞争区600可包含与核酸复合物1的决定子100的至少部分碱基序列互补的序列。优选地，引物竞争区600具有对应于10℃至35℃的退火温度的序列，并且引物竞争区600的序列可为与引物互补的序列。优选地，引物竞争区600具有对应于20℃至30℃的退火温度的序列，并且引物竞争区600的序列可为与引物互补的序列。

[0913] 根据本申请的示例性实施方式，可将引物竞争区60设计为随着标记300的波长增加而具有相对较长的与决定子200的碱基序列互补结合的碱基序列。

[0914] 竞争性构建体2可相对于核酸复合物1来体现。竞争性构建体2可具有与核酸复合物1的决定子100的至少部分碱基序列互补的序列，并具有与核酸复合物1的标签200的至少部分碱基序列互补的序列。

[0915] 竞争性构建体2可以相对于核酸复合物对10来体现。对于包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸复合物对10，可提供关于第一核酸复合物110的竞争性构建体2，但是可不提供关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2。或者，对于包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸复合物对10，可以提供关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2，但是可不提供关于第一核酸复合物110的竞争性构建体2。或者，对于包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸复合物对10，可提供关于第一核酸复合物110的第一竞争性构建体2，并且可提供关于第二核酸复合物120的第二竞争性构建体2。

[0916] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第一标签112和第一标签竞争区500之间的互补结合力可以小于第一标签112和第二标签122之间的互补结合力。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第一标签112和第一标签竞争区500之间的互补结合形成的碱基序列的数量可以小于由第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成的碱基序列的数量。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比可以小于由第一标签112和第一标签竞争区500之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比。

[0917] 这可能是为了防止第一标签112和第一标签竞争区500之间的活性结合对第一标签112和第二标签122之间的结合进行抑制。

[0918] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第二标签122和第二标签竞争区500之间的互补结合力可以小于第一标签112和第二标签122之间的互补结合力。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第二标签122和第二标签竞争区500之间的互补结合形成的碱基序列的数量可以小于由第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成的碱基序列的数量。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比可以小于由第二标签122和第二标签竞争区500之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比。

[0919] 这可能是为了防止第二标签122和第二标签竞争区500之间的活性结合对第一标签112和第二标签122之间的结合进行抑制。

[0920] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第一决定子111和第一引物竞争区600之间的互补结合力可以小于第一决定子111和第一靶标碱基序列之间的互补结合力。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第一决定子111和第一引物竞争区600之间的互补结合形成的碱基序列的数量可以小于由第一决定子111和第一靶标碱基序列之间的互补结合形成的碱基序列的数量。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第一决定子111和第一靶标碱基序列之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比可以小于由第一决定子111和引物竞争区600之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比。

[0921] 这可能是为了防止第一决定子111和第一引物竞争区600之间的活性结合对第一决定子111和第一靶标碱基序列之间的结合进行抑制。

[0922] 在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，第二决定子121和第二引物竞争区600之间的互补结合力可以小于第二决定子121和第二靶标碱基序列之间的互补结合力。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第二决定子121和第二引物竞争区600之间的互补结合形成的碱基序列的数量可以小于由第二决定子121和第二靶标碱基序列之间的互补结合形成的碱基序列的数量。在根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10中，由第二决定子121和第二靶标碱基序列之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比可以小于由第二决定子121和引物竞争区600之间的互补结合形成的碱基序列中的C-G数与A-T数的比。

[0923] 这可能是为了防止第二决定子121和第二引物竞争区600之间的活性结合对第二决定子121和第二靶标碱基序列之间的结合进行抑制。

[0924] 根据本申请的示例性实施方式，竞争性构建体2可以体现为如下形式：其中，将PCR阻断剂置于标签竞争区500和引物竞争区600之间。此外，根据本申请的示例性实施方式，竞争性构建体2可以体现为如下形式：其中，标签竞争区500、PCR阻断剂、引物竞争区600和3'磷酸化(Phosphorylation)连接。

[0925] 1.4.2竞争性构建体2的操作

[0926] 图38至图40是说明了根据本申请的示例性实施方式的竞争性构建体2的操作的图。

[0927] 在下文中，为了便于描述，将在如下假设下提供描述：经受PCR的单位单元(UC)中存在四种第一核酸复合物110、四种第二核酸复合物120、关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、包含第一靶标碱基序列的第一链和包含第二靶标碱基序列的第二链。

[0928] 然而，图38至图40以及描述仅仅是用于帮助理解本发明的附图和描述，并且其在如下假设下提供：在单位单元(UC)中存在四种第一核酸复合物110、四种第二核酸复合物120、关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、包含第一靶标碱基序列的第一链和包含第二靶标碱基序列的第二链；这并不意味着在实际中通过在单位单元(UC)中提供四种第一核酸复合物110、四种第二核酸复合物120、关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体
2、包含第一靶碱基序列第一链以及包含第二靶标碱基序列的第二链来进行PCR。

[0929] 参考图38，在进行PCR的单位单元(UC)中，可以存在四种第一核酸复合物110、四种第二核酸复合物120、关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、包含第一靶标碱基序列的第一链和包含第二靶标碱基序列的第二链。

[0930] 在一个实例中，在单位单元(UC)中，可以存在其中第一链和第二链彼此互补结合的双链DNA。

[0931] 在热变性步骤(S2000)中，可以通过调节单位单元(UC)的温度将单位单元(UC)中存在的双链DNA转化为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，包含第一靶标碱基序列的第一链和包含第二靶标碱基序列的第二链之间的互补结合可以解离。

[0932] 在退火步骤(S3000)中，第一核酸复合物110的第一决定子111可互补结合至第一链。第一决定子111可互补结合至第一链的第一靶标碱基序列。在退火步骤(S3000)中，第二核酸复合物120的第二决定子121可互补结合至第二链。第二决定子121可互补结合至第二链的第二靶标碱基序列。

[0933] 在退火步骤(S3000)中，不参与反应的关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、三种第一核酸复合物110和三种第二核酸复合物120可在单位单元(UC)中流动。

[0934] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生包含第一决定子111所结合的第一靶碱基序列的第一链的至少部分的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生包含第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列的第二链的至少部分的扩增产物。

[0935] 在聚合步骤(S4000)中，不参与反应的关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、三种第一核酸复合物110和三种第二核酸复合物120可以在单位单元(UC)中流动。

[0936] 根据本申请的示例性实施方式，可以对单位单元(UC)进行至少一个PCR循环，每个循环由热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)组成。

[0937] 参考图39，在第一个循环后的热变性步骤(S2000)中，可以通过调节单位单元(UC)的温度将单位单元(UC)中存在的双链DNA分开为单链DNA。

[0938] 在热变性步骤(S2000)中，可以产生单链核酸，所述单链核酸包含第一决定子111和含有第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物。包含第一决定子111和第一链的扩增产物的单链核酸可包含第二靶标碱基序列。

[0939] 在热变性步骤(S2000)中，可将单位单元(UC)中存在的双链DNA分开为单链核酸，所述单链核酸包含第二决定子121和第二链的扩增产物。包含第二决定子121和第二链的扩增产物的单链核酸可包含第一靶标碱基序列。

[0940] 在热变性步骤(S2000)中，不参与反应的关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、三种第一核酸复合体110和三种第二核酸复合体120可以在单位单元(UC)中流动。

[0941] 在退火步骤(S3000)中，第一决定子111可以互补结合至包含第二决定子121和第二链的扩增产物的单链核酸。在退火步骤(S3000)中，第二决定子121可以互补结合至包含第一决定子111和第一链的扩增产物的单链核酸。

[0942] 在退火步骤(S3000)中，如在PCR的第一个循环中一样，第一决定子111可以互补结合至包含第一靶标碱基序列的第一链。此外，在退火步骤(S3000)中，如在PCR的第一个循环中一样，第二决定子121可以互补结合至包含第二靶标碱基序列的第二链。

[0943] 在退火步骤(S3000)中，不参与反应的关于两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、一种第一核酸复合体110和一种第二核酸复合体120可以在单位单元(UC)中流动。

[0944] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生第一决定子111所结合的包含第二决定子121和第二链的扩增产物的单链核酸的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生第二决定子121所结合的包含第一决定子111和第一链的扩增产物的单链核酸的扩增产物。

[0945] 在聚合步骤(S4000)中，如在PCR的第一循环中一样，使用第一决定子111作为起点，可以产生第一链的至少部分的扩增产物，所述第一链包含第一决定子111所结合的第一靶标碱基序列。此外，在聚合步骤(S4000)中，如在PCR的第一循环中一样，使用第二决定子121作为起点，可以产生第二链的至少部分的扩增产物，所述第二链包含第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列。

[0946] 在聚合步骤(S4000)中，不参与反应的两种第一核酸复合物110的竞争性构建体2、一种第一核酸复合体110和一种第二核酸复合体120可以在单位单元(UC)中流动。

[0947] 当完成至少两个PCR循环时，可以在单位单元(UC)中产生双链核酸构建体，所述双链核酸构建体包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列，并且进一步包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。在包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列并进一步包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的双链核酸构建体中，第一标签112和第二标签122可以保持为单链形式。

[0948] 根据本申请的示例性实施方式，以单链形式保持的第一标签112和第二标签122在PCR完成后仍然保持为单链，从而可以形成第一标签112和第二标签122之间的互补结合。结果，取决于PCR完成后是否存在第一标签112和第二标签122之间的互补结合，检查第一标记113和第二标记123是否联接，以确认靶标核酸的存在。

[0949] 然而，当正在流动的一种第二核酸复合物120的第二标签122在聚合步骤(S4000)中互补结合至双链核酸构建体的第一标签112时，可能存在获取关于靶标核酸(即，待检测的靶标DNA)存在以及靶标核酸的浓度的不正确数据的问题，其中，所述双链核酸构建体包含第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列，并进一步包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120(参见图40(a))。

[0950] 此外，在单位单元(UC)中流动的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120中，即使没有通过PCR形成扩增产物，也可能由于第一标记113和第二标记123之间的联接，通过在第一标记113和第二标记123之间形成互补结合而产生信号。换言之，尽管在单位单元(UC)中不存在靶标核酸，但是由于检测到由第一标记113和第二标记123之间的联接引起的信号，可能存在获取不正确数据的问题。

[0951] 为了改善该问题，可以进一步使用竞争性构建体2来进行PCR。根据如图38和图39所示的PCR过程，PCR完成后流动的竞争性构建体2可以互补结合至未参与反应的第一核酸复合物110(参见图40(b))。换言之，由于在PCR完成之后流动的竞争性构建体2与未参与反应的第一核酸复合物110反应，可以防止获取关于靶核酸的存在和靶核酸的浓度的不正确数据的问题，所述问题由流动但不参与反应的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的反应而产生。

[0952] 1.4.3实验例#3：涉及竞争性构建体2的操作

[0953] 根据本申请的示例性实施方式，当使用核酸复合物对10和竞争性构建体2来确定单位单元(UC)中靶标核酸的存在时，检测靶标核酸存在的准确性可得到改善。

[0954] 图41是说明了根据本申请的示例性实施方式，使用核酸复合物对10和竞争性构建体2的PCR结果的图。

[0955] 在该实验过程中，将Tris-HCl(pH 9.0)、盐(KCl)、MaCl2、dNTP混合物、蛋白稳定剂、PCR增强剂(大分子)和快速热启动Taq DNA聚合酶引入PCR板的管(或孔)中[0956] 将核酸复合物对10引入PCR板的第一管至第四管中。核酸复合物对10由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成。

[0957] 第一核酸复合物110通过顺序连接第一标记113、第一标签112、第一接头114和第一决定子111而形成，其中，第一标记113为FAM，第一标签112为AACCTTGGGA(SEQ ID NO：9)，第一接头114为间隔物18，第一决定子111为AGCTCCTATTGCCAACGTA(SEQ ID NO：10)。

[0958] 第二核酸复合体120通过顺序连接第二标记123、第二标签122、第二接头124和第二决定子121而形成，其中，第二标记123为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第二标签122为TCCCAAGGTT(SEQ ID NO：11)，第二接头124为间隔物18，第二决定子121为GCGAGTTACGAAGACAAAA(SEQ ID NO：8)。

[0959] 将各1.5pmol/Rxn的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120引入第一管至第四管中。

[0960] 未向PCR板的第一管中提供竞争性构建体2，向PCR板的第二管至第四管中的每一个提供了关于第二核酸复合体120的竞争性构建体2。

[0961] 将1.5pmol/Rxn的竞争性构建体2引入至第二管中。将3pmol/Rxn的竞争性构建体2引入至第三管中。将12pmol/Rxn的竞争性构建体2引入至第二管中。

[0962] 引入第二管中的关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2的浓度约为第一核酸复合物110的浓度的一倍。引入第二管中的关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2的浓度约为第二核酸复合物120的浓度的一倍。引入第三管中的关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2的浓度约为第一核酸复合物110的浓度的两倍。引入第三管中的关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2的浓度约为第二核酸复合物120的浓度的两倍。引入第四管中的关于第二核酸复合体120的竞争性构建体2的浓度约为第一核酸复合物110的浓度的八倍。引入第四管中的关于第二核酸复合物120的竞争性构建体2的浓度约为第二核酸复合物120的浓度的八倍。

[0963] 关于第二核酸复合体120的竞争构建体2通过顺序连接引物竞争区600、PCR阻断剂和标签竞争区500而形成，其中，标签竞争区500为AAAAAAAACCTT(SEQ ID NO：17)，PCR阻断剂为间隔物18，而引物竞争区600为CCACACAAAGATT(SEQ ID NO：18)。

[0964] 通过调节其中引入有核酸复合物对10和其它酶第一管至第四管的温度对管中的溶液进行PCR反应。如图29所示，将管的温度在95℃下保持10分钟，将热变性步骤(S2000；95℃，10秒)、退火步骤(S3000；50℃，40秒)和聚合步骤(S4000；60℃，20秒)的过程设为1个循环，并重复进行50个循环。在该实验中，使用Bio-Rad CFX96(许可证号10-205)。

[0965] 作为实验的结果，当在未提供竞争性构建体2的第一管中存在对应于第一决定子111的第一靶标碱基序列和对应于第二决定子121的第二靶标碱基序列时，能够通过检测约
38℃下的解离峰值来检测靶标核酸(R1)。

[0966] 然而，即使在未提供竞争性构建体2的第一管中不存在与第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列和与第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列，在约40℃下检测到约-600[-d/(RFU/dT)]的峰值(R2)，这表明了检测精度降低的现象，这取决于对应于第一决定子111的第一靶标碱基序列和对应于第二决定子121的第二靶标碱基序列的存在。

[0967] 当在提供了第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)的一倍的竞争性构建体2的第二管中存在对应于第一决定子111的第一靶标碱基序列和对应于第二决定子121的第二靶标碱基序列时，能够通过检测约38℃下的解离峰值来检测靶标核酸的存在(R3)。

[0968] 然而，当在提供有第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)的一倍的竞争性构建体2的第二管中不存在与第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列和与第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列时，在约40℃下检测到约-800[-d/(RFU/dT)]的峰值(R4)，这表明了检测精度降低的现象，这取决于对应于第一决定子111的第一靶标碱基序列和对应于第二决定子121的第二靶标碱基序列的存在。

[0969] 当在提供有第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)的两倍的竞争性构建体2的第三管中存在对应于第一决定子111的第一靶碱标基序列和对应于第二决定子121的第二靶标碱基序列时，能够通过检测约38℃下的解离峰值来进行靶标检测(R5)。

[0970] 此外，当在提供有第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)的两倍的竞争性构建体2的第三管中不存在与第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列和与第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列时，在约38℃下未检测到超过-200[-d/(RFU/dT)]的峰值(R6)。

[0971] 当在提供有第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)的八倍的竞争性构建体2的第四管中存在对应于第一决定子111的第一靶标碱基序列和对应于第二决定子121的第二靶标碱基序列时，能够通过检测约38℃下的解离峰值来进行靶标检测(R7)。

[0972] 此外，当在提供有第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)的八倍的竞争性构建体2的第四管中不存在与第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列和与第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列时，在约38℃下未检测到超过-200[-d/(RFU/dT)]的峰值(R8)。

[0973] 因此，当以相对于第一核酸复合物110(或第二核酸复合物120)一定比率(例如1:2)提供竞争性构建体2，以使用核酸复合物对10检测靶标核酸的存在时，证实了取决于与第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列和与第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列的存在的检测精度得到提高。

[0974] 2.核酸复合物对10的应用#2-多重PCR

[0975] 根据本申请的示例性实施方式，基于核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的结合，通过确认第一标记113和第二标记123之间的联接，可确认靶标核酸的存在。

[0976] 根据本申请的另一示例性实施方式，通过改变使多种核酸复合物对10的一个标签200(即第一标签112)与另一个标签200(即第二标签122)之间的联接解离的温度，可以检查第一标记113和第二标记123之间的结合发生改变的特定温度，从而确定单位单元(UC)中多种类型的靶标核酸的存在。

[0977] 具体而言，利用如下特性，可对附有相同标记的多种类型的核酸复合物对10分别进行标记：其中，用于保持根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的结合的结合保持力(bond retention force)可以根据核酸复合物1的组分和结构而变化。

[0978] 2.1结合保持力

[0979] 2.1.1结合保持力的定义

[0980] 根据第一标签112和第二标签122之间的结合，根据本申请的示例性实施方式的包含第一决定子111和第二决定子121的核酸构建体可以形成二级结构。在上文1.2二级结构的形成中已经对此进行了详细描述，并且将省略重复的描述。

[0981] 此处，与用于单纯使第一标签112和第二标签122之间的互补结合解离而施加的最小外力相比，在包含第一决定子111和第二决定子121的核酸构建体中，在通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成二级结构时，用于使第一标签112和第二标签122之间的结合解离而需施加的最小外力可能更高。

[0982] 换言之，与单纯在第一标签112和第二标签122之间形成的互补结合相比，在包含第一决定子111和第二决定子121的核酸构建体中，当通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成二级结构时，第一标签112和第二标签122之间的结合力可更高。

[0983] 在说明书中，在包含第一决定子111和第二决定子121的核酸构建体中，当通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合形成核酸构建体的二级结构时，用以解离核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的结合的最小外力被称为“结合保持力”。

[0984] 下文将详细描述影响结合保持力的与核酸复合物对10有关的一些因素。

[0985] 2.1.2影响结合保持力的因素

[0986] 2.1.2.1第一标签112和第二标签122的单位核酸类型

[0987] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标签112和第二标签122的核酸和/或核酸类似物的单位分子的类型相关。根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可根据构成第一标签112和第二标签122的核酸的单位分子的结合力而增加或降低。

[0988] 在一个实例中，当第一标签112的核酸和/或核酸类似物的单位分子的结合力增加，核酸复合物对10的结合保持力可增加。在另一实例中，当构成第二标签122的核酸和/或核酸类似物的单位分子的结合力增加，核酸复合物对10的结合保持力可增加。

[0989] 在具体实例中，与构成第一标签112的单位分子为DNA时相比，构成第一标签112的单位分子为PNA时，核酸复合物对10的结合保持力可增加。在另一具体实例中，与构成第二标签122的单位分子为DNA时相比，构成第二标签122的单位分子是LNA时，核酸复合物对10的结合保持力可增加。在又一实例中，与构成第一标签112的单位分子为PNA并且构成第二标签122的单位分子为DNA时相比，构成第一标签112和第二标签122的单位分子均为PNA时，结合保持力可能更高。

[0990] 2.1.2.2第一标签112和第二标签122的碱基序列中的碱基种类

[0991] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标签112和第二标签122的碱基序列有关。根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可根据第一标签112和第二标签122的碱基序列中碱基的种类而提高或降低。

[0992] 在具体实例中，根据本申请示例性实施方式的结合保持力可根据互补结合第二标签122的第一标签112中所包含的碱基序列中碱基的种类而提高或降低。

[0993] 在一个实例中，构成第一标签112的碱基序列中参与和第二标签122结合的碱基序列中的胞嘧啶(C)越多，核酸复合物对10的结合保持力越高。在另一实例中，构成第一标签112的碱基序列中参与和第二标签122结合的碱基序列中的鸟嘌呤(G)越多，核酸复合物对
10的结合保持力越高。在又一实例中，假设第一标签112长度相同，第一标签112的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)/腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)比率越高，核酸复合物对10的结合保持力越高。

[0994] 在又一具体实例中，根据本申请示例性实施方式的结合保持力可根据互补结合第一标签112的第二标签122中所包含的碱基序列中碱基的种类而提高或降低。

[0995] 在一个实例中，构成第二标签122的碱基序列中参与和第一标签112结合的碱基序列中的胞嘧啶(C)越多，核酸复合物对10的结合保持力越高。在另一实例中，构成第二标签122的碱基序列中参与和第一标签112结合的碱基序列中的鸟嘌呤(G)越多，核酸复合物对
10的结合保持力越高。在又一实例中，假设第二标签122长度相同，第二标签122的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)/腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)比率越高，核酸复合物对10的结合保持力越高。

[0996] 2.1.2.3第一标签112和第二标签122的碱基序列的碱基排列

[0997] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标签112和第二标签122的碱基序列相关。根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可根据第一标签112和第二标签122的碱基序列中碱基的排列而提高或降低。

[0998] 在具体实例中，结合保持力可根据第一标签112的碱基序列中的碱基排列而提高或降低。

[0999] 在一个实例中，尽管构成第一标签112的碱基序列包含五个胞嘧啶(C)和五个腺嘌呤(A)，通过由5`-CCCCCAAAAA-3`构成的第一标签112与由5`-TTTTTGGGGG-3`构成的第二标签122之间的结合引起的结合保持力和通过由5`-CCAAAAACCC-3`构成的第一标签112与由5`-GGGTTTTTGG-3`构成的第二标签122之间的结合引起的结合保持力可能彼此不同。

[1000] 在另一实例中，尽管构成第一标签112的碱基序列包含五个鸟嘌呤(G)和五个腺嘌呤(A)，根据是鸟嘌呤(G)位于第一标记113附近还是鸟嘌呤(G)位于第一接头114附近，结合保持力可变化。

[1001] 在另一具体实例中，结合保持力可根据第二标签122的碱基序列中碱基排列而提高或降低。

[1002] 在一个实例中，即使当构成第二标签122的碱基序列由五个胞嘧啶(C)和五个腺嘌呤(A)组成时，通过由5`-CCCCCAAAAA-3`构成的第二标签122与由5`-TTTTTGGGGG-3`构成的第一标签112之间的结合引起的结合保持力和通过由5`-CCAAAAACCC-3`构成的第二标签122与由5`-GGGTTTTTGG-3`构成的第一标签112之间的结合引起的结合保持力可能不同。

[1003] 在另一个实例中，即使当构成第二标签122的碱基序列由五个鸟嘌呤(G)和五个腺嘌呤(A)组成时，核酸复合物对10的结合保持力可根据鸟嘌呤(G)位于第二标记123附近还是位于第二接头124附近而变化。

[1004] 2.1.2.4第一标签112和第二标签122之间互补结合所涉及的碱基数量[1005] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标签112和第二标签122之间的互补结合中涉及的碱基的数量相关。根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可根据第一标签112和第二标签122之间的互补结合中涉及的碱基数量而提高或降低。

[1006] 在具体实例中，当第一标签112和第二标签122之间的互补结合所涉及的碱基数量增加，核酸复合物对10的结合保持力可提高。结合至第二标签122的第一标签112的碱基数量越高，核酸复合物对10的结合保持力越高。结合至第一标签112的第二标签122的碱基数量越高，核酸复合物对10的结合保持力越高。

[1007] 2.1.2.5第一标签112和第二标签122之间的相对碱基序列

[1008] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标签112和第二标签122之间的相对碱基序列相关。结合保持力可根据第一标签112和第二标签122之间的结合方向而提高或降低。

[1009] 第一标签112和第二标签122之间的结合方向已在2.2标签200和1.2二级结构的形成中详细描述，并且将省略重复的描述。

[1010] 在具体实例中，其中与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121隔开的第二标签122的碱基序列形成互补结合的核酸复合物对10的结合保持力()可不同于其中与第一决定子111相邻的第一标签112的碱基序列和与第二决定子121相邻的第二标签122的碱基序列形成互补结合的核酸复合物对10的结合保持力。

[1011] 2.1.2.6第一标签112和第二标签122之间错配的碱基序列数量

[1012] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标签112和第二标签122之间的错配的碱基序列相关。结合保持力可根据第一标签112和第二标签122之间错配的碱基序列的存在和/或错配的碱基序列的数量而提高或降低。

[1013] 在具体实例中，当在第一标签112和第二标签122之间存在错配的碱基序列时，结合保持力可降低。在一个实例中，假设第一标签112具有碱基序列5`-AAACCCGG-3`，与第二标签122具有5`-CCGGTTTT-3`时相比，第二标签122具有碱基序列5`-CCGGGTTT-3`时，其结合保持力可更高。

[1014] 2.1.2.7第一标记113和/或第二标记123的相对位置

[1015] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标记113和/或第二标记123的位置相关。结合保持力可根据第一核酸复合物110的各组分与第一标记113之间的位置关系而提高或降低。结合保持力可根据第二核酸复合物120的各组分与第二标记123之间的位置关系而提高或降低。

[1016] 在具体实例中，当第一核酸复合物110由顺序连接第一标记113、第一标签112、第一接头114和第一决定子111而形成时，由顺序连接第二标签122、第二接头124、第二标记123和第二决定子121形成的第二核酸复合物120可比由顺序连接第二标记123、第二标签
122、第二接头124、和第二决定子121形成的第二核酸复合物120具有更高的结合保持力。

[1017] 2.1.2.8第一标记113和/或第二标记123的种类

[1018] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一标记113和/或第二标记123的种类相关。根据第一标记113的种类，结合保持力可以提高或降低。根据第二标记123的种类，结合保持力可以提高或降低。

[1019] 在具体实例中，其中第一标记113为FAM的核酸复合物对10的结合保持力可以不同于其中第一标记113为HEX的核酸复合物对10的结合保持力。其中第二标记123为FAM的核酸复合物对10的结合保持力可以不同于其中第二标记123为HEX的核酸复合物对10的结合保持力。

[1020] 2.1.2.9扩增产物碱基序列中的碱基的种类

[1021] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与包含第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物和/或包含第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物相关，所述扩增产物由第一决定子111和/或第二决定子121之间的互补结合以及PCR形成。结合保持力可以根据包含第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物中所包含的碱基序列中的碱基种类而提高或降低，所述扩增产物由第一决定子111和/或第二决定子121之间的互补结合以及PCR形成。结合保持力可以根据包含第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物中所包含的碱基序列中的碱基种类而提高或降低，所述扩增产物由第一决定子111和/或第二决定子121之间的互补结合以及PCR形成。

[1022] 在具体实例中，包含第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物中包含的碱基序列中的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)越多，结合保持力越高。包含第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物中包含的碱基序列中的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)越多，结合保持力越高。

[1023] 2.1.2.10扩增产物的长度

[1024] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与包含第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物和/或包含第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物相关，所述扩增产物由第一决定子111和/或第二决定子121之间的互补结合以及PCR形成。结合保持力可根据包含第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物的长度而提高或降低，所述扩增产物由第一决定子111和/或第二决定子121之间的互补结合以及PCR形成。结合保持力可根据包含第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物的长度而提高或降低，所述扩增产物由第一决定子111和/或第二决定子121之间的互补结合以及PCR形成。

[1025] 在一个实例中，随着包含第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物变化，结合保持力可提高或降低。在另一实例中，随着包含第一决定子111以及含有第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物的的核酸链长度变化，结合保持力可提高或降低。在又一实例中，随着包含第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物的长度变化，结合保持力可提高或降低。在另一实例中，随着包含第二决定子121以及含有第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物的的核酸链长度变化，结合保持力可提高或降低。

[1026] 2.1.2.11第一决定子111和/或第二决定子121的碱基序列

[1027] 根据本申请的示例性实施方式的结合保持力可与第一决定子111和/或第二决定子121的碱基序列相关。结合保持力可与第一靶标碱基序列和/或第二靶标碱基序列相关。结合保持力可与第一决定子111靶向的特定疾病和/或第二决定子121靶向的特定疾病相关。结合保持力可与第一决定子111和第二决定子121靶向的特定疾病相关。

[1028] 在一个实例中，结合保持力可根据第一决定子111的碱基序列中的碱基的种类而提高或降低。在另一实例中，结合保持力可根据第一决定子111的碱基序列中碱基的排列而提高或降低。在又一实例中，结合保持力可根据第一决定子111的碱基序列的长度而提高或降低。在再一实例中，结合保持力可根据第二决定子121的碱基序列中的碱基的种类而提高或降低。在再一实例中，结合保持力可根据第二决定子121的碱基序列中碱基的排列而提高或降低。在再一实例中，结合保持力可根据第二决定子121的碱基序列的长度而提高或降低。

[1029] 2.2核酸复合物对10的构造

[1030] 根据本申请的示例性实施方式，可使用至少第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10。

[1031] 第一核酸复合物对10可包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。第一核酸复合物110可包含第一决定子111、第一接头114、第一标签112和第一标记113。第一核酸复合物110可通过顺序连接第一决定子111、第一接头114、第一标签112和第一标记113而形成。第二核酸复合物120可包含第二决定子121、第二接头124、第二标签122和第二标记123。第二核酸复合物120可通过顺序连接第二决定子121、第二接头124、第二标签122和第二标记123而形成。

[1032] 第二核酸复合物对10可包含第三核酸复合物1和第四核酸复合物1。第三核酸复合物1可包含第三决定子100、第三接头400、第三标签200和第三标记300。第三核酸复合物1可通过顺序连接第三决定子100、第三接头400、第三标签200和第三标记300而形成。第四核酸复合物1可包含第四决定子100、第四接头400、第四标签200和第四标记300。第四核酸复合物1可以通过顺序连接第四决定子100、第四接头400、第四标签200和第四标记300来形成。

[1033] 第一决定子111和第二决定子121可为引物。当第一决定子111为正向引物时，第二决定子121可为反向引物。当第一决定子111为反向引物时，第二决定子121可为正向引物。

[1034] 在具体实例中，第一决定子111可为用于扩增第一链的引物，所述第一链包含与第一疾病有关的第一靶标碱基序列；第二决定子121可为用于扩增第二链的引物，所述第二链包含与第一疾病有关的第二靶标碱基序列。

[1035] 第三决定子100和第四决定子100可为引物。当第三决定子100为正向引物时，第四决定子100可为反向引物。当第三决定子100为反向引物时，第四决定子100可为正向引物。

[1036] 在具体实例中，第三决定子100可为用于扩增第三链的引物，所述第三链包含与第二疾病有关的第三靶标碱基序列；第四决定子100为用于扩增第四链的引物，所述第四链包含与第二疾病有关的第四靶标碱基序列。

[1037] 根据本申请的示例性实施方式，第一决定子111、第二决定子121、第三决定子100和第四决定子100可具有类似的退火温度。换言之，在引物设计中，可以使用程序来计算上述组分结合至靶标碱基序列的退火温度(Tm)。由于在单位单元(UC)退火的步骤(S3000)中，第一决定子111、第二决定子121、第三决定子100和第四决定子100结合至各自的靶标碱基序列，可将第一决定子100、第二决定子121、第三决定子100和第四决定子100的退火温度设计为彼此类似。

[1038] 第一标签112和第二标签122可彼此互补结合。第三标签200和第四标签200可彼此互补结合。第一核酸复合物对10的结合保持力可与第二核酸复合物对10的结合保持力不同。在具体实例中，参与第一标签112和第二标签122之间的互补结合的碱基序列可由四个C-G和三个A-T组成。参与第三标签200和第四标签200之间的互补结合的碱基序列可由五个C-G和五个A-T组成。第一标签112和第二标签122之间的结合保持力可小于第三标签200和第四标签200之间的结合保持力。

[1039] 第一标记113可包含第一信号产生物质。第三标记300可包含用与第一标记113相同的信号进行检测的相同信号检测物质。

[1040] 本文使用的“相同信号检测物质”可以包括相同类型的物质。在一个实例中，当第一核酸复合物对10中包含的第一信号物质为JOE，第二核酸复合物对10中包含的第二信号物质可为JOE。

[1041] 此处，“相同信号检测物质”可包含基于设备规格的以相同的信号(例如，在与预定的波长段相对应的波长段范围内包含的信号)进行检测的多种类型的不同物质。在一个实例中，当第一核酸复合物对10中包含的第一信号物质是发射波长为548λ的TET时，可根据设备规格使用相同波长范围内的光来检测信号物质JOE和TET，并且此处，JOE和TET可为相同信号检测物质。

[1042] 第二标记123可包含第一信号转换物质，所述第一信号转换物质对第一标记113的第一信号进行转换。第四标记300可包含第二信号转换物质，所述第二信号转换物质将用与第一标记113的第一信号相同的信号进行检测的第三标记300的信号进行转换。当第一标记113和第三标记300由相同的物质形成时，第二标记123和第四标记300可为相同的物质。当第一标记113和第三标记300为相同的物质时，第二标记123和第四标记300可为不同的物质。

[1043] 第一标记113和第二标记123可以进行联接动作。基于第一标签112和第二标签122是否结合，第一标记113和第二标记123可以进行联接动作。第三标记300和第四标记300可以进行联接动作。基于第三标签200和第四标签200是否结合，第三标记300和第四标记300可以进行联接动作。

[1044] 第一标签112和第二标签122之间的结合保持力可以不同于第三标签200和第四标签200之间的结合保持力。

[1045] 根据本申请的示例性实施方式，当通过增加包含第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10的单位单元(UC)的温度来测量光学信号时，可分别检测第一标记113和第二标记123之间的联接解离的时间点以及第三标记300和第四标记300之间的联接解离的时间点。当通过增加包含第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10的单位单元(UC)的温度来测量光学信号时，第一标记113和第二标记123之间的联接解离的温度与第三标记300和第四标记300之间的联接解离的温度可以彼此不同。

[1046] 根据本申请的示例性实施方式，当通过增加温度来测量从包含第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10的单位单元(UC)发射的光学信号时，可以分别检测第一标记113和第二标记123之间的联接解离的时间点以及第三标记300和第四标记300之间的联接解离的时间点。当通过增加温度来测量从包含第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10的单位单元(UC)发射的光学信号时，第一标记113和第二标记123之间的联接解离的温度与第三标记300和第四标记300之间的联接解离的温度可以彼此不同。

[1047] 第一接头114、第二接头124、第三接头400和第四接头400可为PCR阻断剂。第一接头114可以防止产生第一标签112的扩增产物。第二接头124可以防止产生第二标签122的扩增产物。第三接头400可以防止产生第三标签200的扩增产物。第四接头400可以防止产生第四标签200的扩增产物。

[1048] 根据本申请的示例性实施方式，可使用多种类型的核酸复合物对10在一个单位单元(UC)中检测多种类型的靶标核酸。

[1049] 根据本申请的示例性实施方式，使用多种类型的核酸复合物对10，可在一个单位单元(UC)中就每个荧光通道对一种靶标核酸进行检测，并且可以使用多个荧光通道在一个单位单元(UC)中对多种类型的靶标核酸进行检测。

[1050] 根据本申请的示例性实施方式，由于多种类型的核酸复合物对10和多种类型的核酸复合物1之间的结合保持力不同，可在每个荧光通道中检测多种类型的靶标核酸。

[1051] 考虑到上文2.1结合保持力中所述的各种因素，可以将用于检测每个荧光通道的多种类型的靶标核酸的多种核酸复合物对10设计为具有不重叠的结合保持力。考虑到上文2.1结合保持力中所述的各种因素，可以将用于检测每个荧光通道的多种类型的靶标核酸的多种核酸复合物对10设计为具有不重叠的解离峰值。

[1052] 在一个实例中，通过改变核酸复合物对10中包含的荧光物质(即，第一标记113)与核酸复合物对10的每个组分之间的位置关系，即使在第一标签112和第三标签200具有相同的碱基序列并且第二标签122和第四标签200具有相同的碱基序列时，第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10可被设计为使得第一核酸复合物对10的解离峰值和第二核酸复合物对10的解离峰值不同。

[1053] 用于在一个荧光通道中检测多种类型的靶标核酸的多种类型的核酸复合物1可具有至少一种不同的决定子100序列。换言之，第一决定子111的碱基序列可以与第三决定子100的碱基序列不同。或者，第二决定子121的碱基序列可以与第四决定子100的碱基序列不同。或者，第一决定子111的碱基序列可与第三决定子100的碱基序列不同，第二决定子121的碱基序列可与第四决定子100的碱基序列不同。

[1054] 为了在一个单位单元中在一个荧光通道中检测多种类型的靶标核酸，可将多个解离峰值各自分配至对应于不同靶标碱基序列的核酸复合物对10。例如，当与第一核酸复合物对10相对应的解离峰值为40℃时，可以将与第二核酸复合物对10相对应的解离峰值设计为55℃。

[1055] 2.3核酸复合物对10的操作

[1056] 根据本申请的示例性实施方式，可以进行PCR以检测多种类型的靶标核酸。根据本申请的示例性实施方式，可以进行PCR以检测每个荧光通道的多种类型的靶标核酸。

[1057] 除了与第一核酸复合物对10反应的靶标核酸和与第二核酸复合物对10反应的靶标核酸可以彼此不同之外，上文1.3.2核酸复合物对10的操作中已描述了PCR中的热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)，因此将省略详细描述。

[1058] 可以对包含完成PCR的多种类型的核酸复合物对10的单位单元(UC)进行稳定步骤(S5000)。在稳定步骤(S5000)中，可以诱导第一标签112和第二标签122之间的互补结合以及第三标签200和第四标签200之间的互补结合。

[1059] 随着稳定化步骤(S5000)的进行，可以进行获得解离曲线的步骤(S6000)。换言之，可以根据单位单元(UC)的温度来检测荧光值。可以通过对根据检测温度的荧光值进行分析来获得温度与荧光相对于温度的负变化率之间的图表，并可确定解离峰值。

[1060] 更具体而言，当使用设计成在第一温度下具有解离峰值的第一核酸复合物对10和设计成在第二温度下具有解离峰值的第二核酸复合物对10进行PCR时，基于在第一温度下是否确定到解离峰，可确定第一核酸复合物对10的第一靶标碱基序列(即，与第一决定子111的至少部分互补的序列)和第二靶标碱基序列(即，与第二决定子121的至少部分互补的序列)的存在；并且基于在第二温度下是否确定到解离峰值，可以确定第二核酸复合物对10的第三靶标碱基序列(即，与第三决定子100的至少部分互补的序列)和第四靶标碱基序列(即，与第四决定子100的至少部分互补的序列)的存在。

[1061] 图42示出了根据本申请的示例性实施方式，一个荧光通道中荧光相对于温度的图表以及荧光相对于温度的负变化率/温度的图表。

[1062] 第一标记113和第三标记300是用相同信号检测的信号产生物质，第二标记123可为吸收从第一标记113发出的光的信号转换物质，第四标记300可为吸收从第三标记300发出的光的信号转换材料。

[1063] 当在单位单元(UC)中存在与第一核酸复合物对10有关的靶标核酸和与第二核酸复合物对10有关的靶标核酸时，在荧光相对于温度的图表上，在对应于与第一核酸复合物对10相关的解离峰值的温度(T1)下和对应于与第二核酸复合物对10相关的解离峰值的温度(T2)下从单位单元(UC)检测到的荧光值可能增加(参见图42(a))。

[1064] 换言之，当在单位单元(UC)中存在与第一核酸复合物对10有关的靶标核酸以及与第二核酸复合物对10有关的靶标核酸时，包含第一核酸复合物对10的核酸构建体可具有通过第一标签112和第二标签122之间的结合而形成的二级结构，第二核酸复合物对10可具有通过第三标签200和第四标签200之间的结合而形成的二级结构。

[1065] 当通过升高温度来检测从单位单元(UC)产生的荧光值时，由于第一标签112和第二标签122之间的结合解离，可发出被第二标记123吸收的第一标记113的光。结果，在荧光相对于温度的图表上，在对应于与第一核酸复合物对10相关的解离峰值的温度(T1)下，从单位单元(UC)检测到的荧光水平可能增加。

[1066] 此外，当通过升高温度来检测从单位单元(UC)产生的荧光值时，由于第三标签200和第四标签200之间的结合解离，可发出被第四标记300吸收的第三标记300的光。结果，在荧光相对于温度的图表上，在对应于与第二核酸复合物对10相关的解离峰值的温度(T2)下，从单位单元(UC)检测到的荧光水平可能增加。

[1067] 根据本申请的示例性实施方式，可以将温度-荧光图表转换为荧光相对于温度的负变化率/温度的图表。

[1068] 当在单位单元(UC)中存在与第一核酸复合物对10相关的靶标核酸和与第二核酸复合物对10相关的靶标核酸时，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在对应于与第一核酸复合物对10相关的解离峰的温度(T1)下和对应于与第二核酸复合物对10相关的解离峰的温度(T2)下，可确定最大点或最小点。

[1069] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，当在对应于与第一核酸复合物对10相关的解离峰值的温度(T1)下和对应于与第二核酸复合物对10相关的解离峰的温度(T2)下确定最小点时，可确认与第一核酸复合物对10有关的靶标核酸和与第二核酸复合物对10有关的靶标核酸的存在。

[1070] 第一标记113和第三标记300可为用相同信号检测的信号产生物质，第二标记123可为吸收从第一标记113发出的光的信号转换物质，第四标记300可为吸收从第三标记300发出的光的信号转换物质。当在单位单元(UC)中存在与第一核酸复合物对10有关的靶标核酸和与第二核酸复合物对10有关的靶标核酸时，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在对应于第一温度(即，与第一核酸复合物对10有关的解离峰值)的温度和对应于第二温度(即，与第二核酸复合物对10有关的解离峰值)的温度下可以得到确认(参见图42(b))。

[1071] 可使用设备基于可区分的范围设计第一温度和第二温度之间的至少温度差。在一个实例中，优选地，设计多种类型的核酸复合物对10，以使第一温度和第二温度之间的温度差在1℃至10℃的范围内。

[1072] 根据本申请的示例性实施方式，基于对与核酸复合物对10相关的解离峰值的检测，可以确定在单位单元(UC)中是否存在与核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1073] 可以基于核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间的结合保持力对解离峰值进行调节。因此，与基于归因于结合至靶标核酸的区域的解离所引起的荧光值的变化而用于确定是否存在靶标核酸的另一探针相比，基于不与靶标核酸结合的区域(即，第一标签112和第二标签122)的结合保持力，使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10来确定靶标核酸的存在，实现了第一标签112、第二标签122以及基于第一标签112和第二标签122的解离峰值的设计更简单、更灵活的优点。

[1074] 此外，在使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10确定是否存在靶标核酸时，无需提供另一探针的结合位置，从而即使通过对称PCR也能够检测靶标核酸，实现检测灵敏度更高的优点。

[1075] 包含本申请中公开的核酸复合物对10的PCR试剂盒可包含两种或更多种核酸复合物对10。PCR试剂盒可包含至少两种或更多种核酸复合物对10。PCR试剂盒可以进一步包含参与聚合的酶、碱基片段、参与PCR的辅酶和用于为PCR提供最佳pH和/或盐浓度的缓冲液中的至少一种。

[1076] PCR试剂盒可以以如下形式实现：其中，将包含至少一种物质的组合物放入一个容器(例如，装有包含一种类型的核酸复合物对10的组合物的容器)中，并且将多个容器(例如，装有包含一种类型的核酸复合物对10的组合物的容器和装有包含另一类型的核酸复合物对10的组合物的容器)放入一个包装中进行销售。PCR试剂盒可以以包含至少一种物质的组合物装在一个容器中的形式体现。PCR试剂盒可以以至少一种物质被干燥并放入容器中的形式体现。

[1077] PCR试剂盒可包含X种或更少类型的核酸复合物对10。值X取决于根据多种类型的核酸复合物对10的一个标签200(即第一标签112)和另一标签200(即第二标签122)之间的互补结合的解离、以及取决于设备的用于检测信号的温度范围以区分多个解离峰值的最小解离峰值差(_T)。值X可取决于设备可以区分的波长范围内的组数。值X可取决于多种类型的核酸复合物对10中包含的信号物质的类型。

[1078] 例如，当可检测到信号的最低温度为10℃，最高温度为70℃，并且_T为5℃，可通过一个荧光通道分别检测的靶标核酸的种类数为(70-10)/5＝12，可以被设备区分的波长范围内的组数为五，X值可以是12*5＝60。

[1079] 因此，当用于PCR的组合物包含根据本申请的示例性实施方式的多种类型的核酸复合物对10时，能够在一个管中确定60种不同种类的靶标核酸是否存在。当用于PCR的组合物包含60种根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10时，使用五个荧光通道能够在一个管中确定60种不同种类的靶标核酸是否存在。

[1080] 当根据本申请的示例性实施方式的第一标记113和第二标记123联接时，可以将第二标记123设计为淬灭从第一标记113发出的光(在下文中，信号淬灭型)。或者，当根据本申请的示例性实施方式的第一标记113和第二标记123联接时，可将第二标记123设计为转换从第一标记113发出的光并由装置进行检测(在下文中，信号发射型)。

[1081] 当在PCR中使用多种类型的核酸复合物对10时，可将至少第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10设计为相同类型(例如，将第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10设计为信号淬灭型)，或不同类型(例如，将第一核酸复合物对10设计为信号发射型，而将第二核酸复合物对10设计为信号淬灭型)。

[1082] 当PCR试剂盒包含X种或更少类型的核酸复合物对10时，试剂盒可由设计为信号淬灭型的X/2种核酸复合物对10和设计为信号发射型的X/2种核酸复合物对10组成。在这种情况下，在一个管中可检测的靶标核酸的种类数可增加。

[1083] 当多种类型的核酸复合物对中的一些被设计为信号淬灭型而其它的多种类型的核酸复合物对被设计为信号发射型时，在相同条件下(例如，信号测量的最低温度为10℃，最高温度为70℃，_T为5℃，并且设备可检测的波长段中的组数为5)，与可检测靶标核酸的种类数量有关的X值可翻倍至60*2＝120。

[1084] 2.4实验例4：涉及核酸复合物对10的应用

[1085] 根据本申请的示例性实施方式，可以使用多种类型的核酸复合物对10来确定单位单元(UC)中多种类型的靶标核酸的存在。

[1086] 图43是说明了根据本申请示例性实施方式，根据用于确定单位单元中(UC)中存在的至少四种靶标核酸的实验的结果的图。

[1087] 在该实验过程中，将Tris-HCl(pH 9.0)、盐(KCl)、MaCl2、dNTP混合物、蛋白稳定剂、PCR增强剂(大分子)和快速热启动Taq DNA聚合酶引入PCR的管(或孔)中。

[1088] 将第一核酸复合物对10至第四核酸复合物对10引入PCR板的第一管中。

[1089] 第一核酸复合物对10由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成。第二核酸复合物对10由第三核酸复合物110和第四核酸复合物120组成。第三核酸复合物对10由第五核酸复合物110和第六核酸复合物120组成。第四核酸复合物对10由第七核酸复合物110和第八核酸复合物120组成。

[1090] 引入1pmol/Rxn的第一核酸复合物110。引入1pmol/Rxn的第二核酸复合物120。引入1pmol/Rxn的第三核酸复合物110。引入1pmol/Rxn的第四核酸复合物120。引入1pmol/Rxn的第五核酸复合物110。引入1pmol/Rxn的第六核酸复合物120。引入1pmol/Rxn的第七核酸复合物110。引入1pmol/Rxn的第八核酸复合物120。

[1091] 第一核酸复合物110通过顺序连接第一标记113、第一标签112、第一接头114和第一决定子111而形成，其中，第一标记113是淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第一标签112为CCCGCGCG(SEQ ID NO：19)，第一接头114为间隔物18，第一决定子111为TGGAGATACACCTACATTG(SEQ ID NO：14)。

[1092] 第二核酸复合物120通过顺序连接第二标记123、第二标签122、第二接头124和第二决定子121而形成，其中，第二标记123为FAM，第二标签122为CGCGCGGG(SEQ ID NO：20)，第二接头124是间隔物18，第二决定子121是GCTGGACCATCTATTTCATC(SEQ ID NO：16)。

[1093] 第三核酸复合物110通过顺序连接第三标记113、第三标签112、第三接头114和第三决定子111而形成，其中，第三标记113为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第三标签112为AAAAAAAA(SEQ ID NO：1)，第三接头114为间隔物18，第三决定子111为TACGCCTGCTACTTTCACG(SEQ ID NO：2)。

[1094] 第四核酸复合物120通过顺序连接第四标记123、第四标签122、第四接头124和第四决定子121而形成，其中，第四标记123为FAM，第四标记122为TTTTTTTT(SEQ ID NO：3)，第四接头124为间隔物18，第四决定子121为ATATTTAAGGGCATAATTTCCG(SEQ ID NO：4)。

[1095] 第五核酸复合物110通过顺序连接第五标记113、第五标签112、第五接头114和第五决定子111而形成，其中，第五标记113为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第五标签112为AAAAAAAAAA(SEQ ID NO：5)，第五接头114为间隔物18，第五决定子111为AGGTAAACGCTCCTCTGAA(SEQ ID NO：6)。

[1096] 第六核酸复合物120通过顺序连接第六标记123、第六标签122、第六接头124和第六决定子121而形成，其中，第六标记123为FAM，第六标签122为TTTTTTTTTT(SEQ ID NO：7)中，第六接头124为间隔物18，第六决定子121为GCGAGTTACGAAGACAAAA(SEQ ID NO：8)。

[1097] 第七核酸复合物110通过顺序连接第七标记113、第七标签112、第七接头114和第七决定子111而形成的，其中，第七标记113为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第七标签112为AACCTTGGGA(SEQ ID NO：9)，第七接头114为间隔物18，第七决定子111为AGCTCCTATTGCCAACGTA(SEQ ID NO：10)。

[1098] 第八核酸复合物120通过顺序连接第八标记123、第八标签122、第八接头124和第八决定子121而形成，其中，第八标记123为FAM，第八标签122为TCCCAAGGTT(SEQ ID NO：11)，第八接头124为间隔物18，第八决定子121为AATCTTTGTGTGGAGCATC(SEQ ID NO：12)。

[1099] 将关于第一核酸复合体110的竞争性构建体2、关于第四核酸复合体120的竞争性构建体2、关于第六核酸复合体120的竞争性构建体2和关于第八核酸复合体120的竞争性构建体2提供至PCR板的第一管。

[1100] 引入2pmol/Rxn的关于第一核酸复合物110的竞争性构建体2。引入8pmol/Rxn的关于第四核酸复合物120的竞争性构建体2。引入2pmol/Rxn的关于第六核酸复合物120的竞争性构建体2。引入8pmol/Rxn的关于第八核酸复合物120的竞争性构建体2。

[1101] 关于第一核酸复合物110的竞争性构建体2通过顺序连接引物竞争物600、PCR阻断剂和标签竞争物500而形成，其中，标签竞争物500为CGCGCG(SEQ ID NO：21)，PCR阻断剂为间隔物18，引物竞争物600为GGTGTATCTCCA(SEQ ID NO：22)。

[1102] 关于第四核酸复合物120的竞争性构建体2通过顺序连接引物竞争物600、PCR阻断剂和标签竞争物500而形成，其中，标签竞争物500为AAAAAA(SEQ ID NO：23)，PCR阻断剂为间隔物18，引物竞争物600为TATGCCCTTAAATAT(SEQ ID NO：24)。

[1103] 关于第六核酸复合物120的竞争性构建体2通过顺序连接引物竞争物600、PCR阻断剂和标签竞争物500而形成，其中，标签竞争物500为AAAAAAAA(SEQ ID NO：1)，PCR阻断剂为间隔物18，引物竞争物600为GTAACTCGC(SEQ ID NO：25)。

[1104] 关于第八核酸复合物120的竞争性构建体2通过顺序连接引物竞争物600、PCR阻断剂和标签竞争物500而形成，其中，标签竞争物500为AACCTTGG(SEQ ID NO：26)，PCR阻断剂为间隔物18，引物竞争物600为CCACACAAAGATT(SEQ ID NO：18)。

[1105] 通过调节其中引入有多种类型的核酸复合物对10中的每一种、竞争性构建体2和其它酶的管的温度，对管中的溶液进行PCR反应。如图29所示，将管的温度在95℃下保持10分钟，并且将热变性步骤(S2000)(95℃，10秒)、退火步骤(S3000)(50℃，40秒)、和聚合步骤(S4000)(60℃，20秒)的序列设为1个循环，并重复进行40个循环。在该实验中，使用Bio-Rad CFX96(许可证号10-205)。

[1106] 此后，获得第一管的解离曲线，并如图43所示，然后获得荧光相对于温度的负变化率/温度的图表。

[1107] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在12.5℃下确定了第二核酸复合物对10的最小解离峰值。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在12.5℃下确定了第三标签200和第四标签200的最小解离峰值。因此，可以确定在单位单元(UC)中存在与第二核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1108] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在25.5℃下确定了第三核酸复合物对10的最小解离峰值。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在25.5℃下确定了第五标签200和第六标签200的最小解离峰值。因此，可以确定在单位单元(UC)中存在与第三核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1109] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在35.5℃下确定了第四核酸复合物对10的最小解离峰值。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在35.5℃下确定了第七标签200和第八标签200的最小值。因此，确定了在单位单元(UC)中存在与第四核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1110] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在48.5℃下确定了第一核酸复合物对10的最小解离峰值。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，在48.5℃下确定了第一标签112和第二标签122的最小解离峰值。因此，确定了在单位单元(UC)中存在与第一核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1111] 结果，根据本申请的示例性实施方式，获得荧光相对于温度的负变化率/温度的图表，以确定在特定温度下解离峰值的检测，从而可以确定在单位单元(UC)中是否存在靶标核酸。

[1112] 2.5根据第七示例性实施方式的核酸复合物对10的应用

[1113] 图44和图45是说明了根据本申请的第七示例性实施方式的核酸复合物对10的使用的图。

[1114] 参考图44，核酸复合物对10可包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。

[1115] 第一核酸复合物110可至少包含第一决定子111、第一标签112和第一标记113。在一个实例中，第一核酸复合物110可包含第一决定子111、第一标签112、第一标记113和第一接头114。

[1116] 第二核酸复合物120可至少包含第二决定子121、第二标签122和第二标记123。在一个实例中，第二核酸复合物120可包含第二决定子121、第二标签122、第二标记123和第二接头124。

[1117] 根据本申请的示例性实施例，第一标签112和第二标签122可以彼此互补结合。第一标签112和第二标签122可包含彼此互补结合的区域。

[1118] 根据本申请的示例性实施方式，第一标签112和第二标签122的物理长度可相同。例如，第一标签112的碱基序列可以仅包括与第二标签122互补结合的碱基序列。第二标签
122的碱基序列可以仅包括与第一标签112互补结合的碱基序列。在具体实例中，当将第一标签112配置为具有碱基序列AAAAAAAA(SEQ ID NO：1)时，可以将第二标签122配置为具有碱基序列TTTTTTTT(SEQ ID NO：3)。

[1119] 根据本申请的另一示例性实施方式，第一标签112和第二标签122的物理长度可以彼此不同。

[1120] 例如，第一标签112可包含与第二标签122互补结合的区域，以及与第二标签122不互补结合的区域。第二标签122的碱基序列可以仅包含与第一标签112互补结合的碱基序列。在具体实例中，当将第一标签112配置为具有碱基序列AAAAAAAA(SEQ ID NO：1)时，可以将第二标签122配置为具有碱基序列5`-TTTTTT-3`。

[1121] 例如，第一标签112可以包含与第二标签122互补结合的区域，以及与第二标签122不互补结合的区域。第二标签122可以包含与第一标签112互补结合的区域以及与第一标签112不互补结合的区域。第一标签112可以具有与第二标签122不同的物理长度。在具体实例中，当将第一标签112配置为具有碱基序列AAAAAAAA(SEQ ID NO：1)时，可将第二标签122配置为具有碱基序列5`-TTTTTG-3`。

[1122] 为了使用根据本申请的示例性实施方式的多种类型的核酸复合物对10检测靶标核酸，可以使用至少第一核酸复合物对10和第二核酸复合物对10。

[1123] 在具体实例中，第一核酸复合物对10可包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。第二核酸复合物对10可包含第三核酸复合物110和第四核酸复合物120。

[1124] 根据示例性实施方式的多种类型的核酸复合物对10的第一标签112和第三标签112的碱基序列可以相同。

[1125] 在根据本申请示例性实施方式的多种类型的核酸复合物对10中，即使当第一标签112和第三标签112具有相同的碱基序列时，由第一标签112的碱基序列和第二标签122的碱基序列之间的互补结合引起的结合保持力可以不同于由第三标签121和第四标签122的碱基序列之间的互补结合引起的结合保持力。

[1126] 在一个示例中，即使当第一标签112和第三标签112具有相同的碱基序列时，与第一标签112的碱基序列互补结合的第二标签122的碱基序列的长度可以短于与第三标签112的碱基序列互补结合的第四标签122的碱基序列的长度(参见图44(a)、图44(b))。

[1127] 当与第一标签112的碱基序列互补结合的第二标签122的碱基长度短于与第三标签112的碱基序列互补结合的第四标签122的碱基序列的长度时，由第一标签112的碱基序列和第二标签122的碱基序列之间的互补结合引起的结合保持力可以小于由第三标签112的碱基序列和第四标签122的碱基序列之间的互补结合引起的结合保持力。

[1128] 在另一实例中，即使当第一标签112和第三标签112具有相同的碱基序列时，第二标签122与第一标签112的互补结合的位置也可以与第四标签122和第三标签112互补结合的位置不同。

[1129] 在具体实例中，第二标签122与第一标签112互补结合的位置可以与第四标签122和第三标签112互补结合的位置部分重叠，并且一部分可以不重叠。在另一具体实例中，第二标签122与第一标签112互补结合的位置可以不与第四标签122和第三标签112互补结合的位置重叠。

[1130] 根据第二标签122与第一标签112互补结合的位置处的碱基序列的构造以及第四标签122与第三标签112互补结合的位置的构造，由第一标签112的碱基序列和第二标签122的碱基序列之间的互补结合引起的结合保持力可以不同于由第三标签112的碱基序列和第四标签122的碱基序列之间的互补结合引起的结合保持力。

[1131] 在2.2标签200中已经提供了结合第一标签112(或第三标签112)和第二标签122(或第四标签122)的方法的详细描述(例如，当第一标签112和第二标签122具有不同长度时，第二标签122与第一标签112的互补结合的位置以及核酸复合物对10的操作的详细描述)，因此将省略重复的描述。

[1132] 此外，根据参与第一标签112(或第三标签112)和第二标签122(或第四标签122)之间的互补结合的碱基序列的种类、数量和物质特性的结合保持力的变化已在2.1结合保持力中详细描述，因此将省略重复的描述。

[1133] 如上所述，即使当第一标签112和第三标签112相同时，第一标签112和第二标签122之间的结合保持力以及第三标签112和第四标签122之间的结合保持力可能彼此不同。

[1134] 在具体实例中，即使当第一标签112和第三标签112相同，结合至第一标签112的第二标签122的长度被设计为不同于结合至第三标签112的第四标签122的长度时，第一标签112和第二标签122之间的结合保持力以及第三标签112和第四标签122之间的结合保持力可能彼此不同。

[1135] 即使当第一标签112和第三标签112相同，而结合至第一标签112的第二标签122的长度和结合到第三标签112的第四标签122的长度彼此不同时，包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体的二级结构可通过第一标签112和第二标签122之间的互补结合而形成(参见图45(a))。

[1136] 即使当第一标签112和第三标签112相同，而结合至第一标签112的第二标签122的长度和结合至第三标签112的第四标签122的长度彼此不同时，包含第三核酸复合物110和第四核酸复合物120的核酸构建体的二级结构可通过第三标签112和第四标签122之间的互补结合而形成(参见图45(b))。

[1137] 即使当第一标签112和第三标签112相同，而结合至第一标签112的第二标签122的长度和结合至第三标签112的第四标签122的长度彼此不同时，基于第一核酸复合物对10的结合保持力和第二核酸复合物对10的结合保持力彼此不同这一事实，通过根据温度检测荧光值(并对荧光相对于温度的负变化率/温度的图表进行分析)，可以确定第一靶标碱基序列和第二靶标碱基序列的存在，并可以确定第三靶标碱基序列和第四靶标碱基序列的存在。

[1138] 因此，在用于在一个单位单元(UC)中使用多种类型的核酸复合物对10来检测多种类型的靶标核酸的示例性实施方式中，通过将与第一标签112互补结合的第二标签122以及与第三标签112互补结合的第四标签122构建为具有不同碱基序列(甚至在第一标签112和第三标签112被构建为具有相同碱基序列时)，可在一个单位单元(UC)中检测多种类型的靶标核酸。

[1139] 此处，第一核酸复合物110的第一决定子111和第三核酸复合物110的第三决定子111可以包含不同碱基序列。具体而言，第一决定子111可以互补结合至与第一疾病有关的第一靶标碱基序列，第三决定子111可以互补结合至与第二疾病有关的第一靶标碱基序列。

[1140] 或者，可将第一核酸复合物110的第一决定子111和第三核酸复合物110的第三决定子111构建为具有相同碱基序列。具体而言，与第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列和与第三决定子111相对应的第三靶标碱基序列可以相同。第一靶标碱基序列和第三靶标碱基序列可为与非疾病特异性保守区域的至少部分区域相对应的碱基序列。此处，第二决定子121可以互补结合至与第一疾病有关的第二靶标碱基序列，第四决定子121可以互补结合至与第二疾病相关的第四靶标碱基序列。

[1141] 2.6根据第八示例性实施方式的核酸复合物对10的应用

[1142] 2.6.1使用核酸复合物对10和探针复合物600检测靶标核酸

[1143] 当根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10经受PCR以确定在单位单元(UC)中是否存在靶标核酸时，核酸复合物对10结合至靶标核酸的第一靶标碱基序列和/或第二靶标碱基序列。

[1144] 因此，在其中产生PCR扩增产物的区域中，除第一靶标碱基序列和/或第二靶标碱基序列之外的其余区域中可能存在探针复合物600结合区(PR)(例如，包含第一靶碱基序列的第一链、通过扩增产生的具有与包含第一靶碱基序列的第一链相同的碱基序列的链、包含第二靶标碱基序列的第二链、以及通过扩增产生的具有与包含第二靶标碱基序列的第一链相同的碱基序列的链)。

[1145] 换言之，当探针复合物600结合至除第一靶标碱基序列和/或第二靶标碱基序列之外的其余区域的至少一个区域时，可以检测与探针复合物600有关的靶标核酸的存在。

[1146] 结果，根据第一标记方法(即，使用核酸复合物对10检测靶标核酸的方法)和第二标记方法(即，使用探针复合物600检测靶标核酸的方法)来检测靶标核酸的两种方法均可以在一个单位单元(UC)中进行。

[1147] 在具体实例中，第二标记方法可为Taqman法、分子信标法、TOCE法、PNA探针法、蝎型法(scorpion method)或它们的组合。这仅为参考具体实例而进行描述，可用作第二标记方法的方法不限于上述所述实例。

[1148] 根据本文公开的标记方法，与常规方法相比，可以通过一个单位单元(UC)(即PCR管)对几乎2至20倍的较大种类的靶标核酸进行确定。

[1149] 为了使用第一标记方法和第二标记方法对样品中的靶标核酸进行检测，可能需要进行设计以避免与第一标记方法有关的解离峰值和与第二标记方法有关的离解峰值重叠的过程。本文所使用的“解离峰值”可以指在说明了基于解离曲线的荧光相对于温度的负变化率的图表中的最大点或最小点所对应的温度值。

[1150] 根据本申请的示例性实施方式，当用于所提供的单位单元(UC)的光学装置总共有四个可检测的解离峰值(例如T1、T2、T3和T4)时，可将核酸复合物对10和探针复合物600以如下形式进行设计：其中，将在第一温度窗口中包含的解离峰值分配至第一标记方法，并将在第二温度窗口中包含的解离峰值分配至第二标记方法。在一个实例中，可以将T1和T2分配为与第一标记方法有关的解离峰值，可将T3和T4分配为与第二标记方法有关的解离峰值。

[1151] 或者，根据本申请的另一示例性实施方式，当用于所提供的单位单元(UC)的光学装置总共有四个可检测的解离峰值(例如T1、T2、T3和T4)时，可将核酸复合物对10和探针复合物600以如下形式设计：将与一些温度相对应的解离峰值分配至第一标记方法，将与未分配至第一标记方法的温度相对应的解离峰值分配至第二标记方法。在一个实例中，可将T1和T3分配为与第一标记方法有关的解离峰值，可将T2和T4分配为与第二标记方法有关的解离峰值。

[1152] 在更具体的实例中，当可由光学装置从单位单元(UC)中检测到信号的最低温度为35℃，最高温度为60℃并且_T为5℃时，对于一个荧光通道，可检测到六个最大解离峰值(例如35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃)。

[1153] 在一个实例中，可以将多种类型的核酸复合物对10设计为将35℃、40℃和45℃分配为对应于第一标记方法的解离峰值，并可将探针复合物600设计为将50℃、55℃和60℃分配为对应于第二种标记方法的解离峰值。当探针复合物600与探针结合区(PR)的结合需要在使用以此类形式设计的核酸复合物对10和探针复合物600的PCR中进行时，获得了如下的优点：考虑到PCR中的退火温度，可以将相对较高的温度(例如50℃、55℃和60℃)分配为与探针复合物600相关的解离峰值，并可将35℃、40℃和45℃分配为与核酸复合物对10相关的解离峰值。

[1154] 在另一实例中，可将核酸复合物对10设计为将35℃、45℃和55℃分配为与第一标记方法相对应的解离峰值，并可将探针复合物600设计为将40℃、50℃和60℃分配为与第二标记方法相对应的解离峰值。当难以设计多种类型的核酸复合物对10和多种探针复合物600以使解离峰值具有5℃的差异时，使用以此种形式设计的核酸复合物对10和探针复合物
600，通过使用解离峰值的差为10℃的多种类型的核酸复合物对10和多种探针复合物600，可获得能够利用相对宽的温度范围的优点。

[1155] 图46是说明了根据本申请的示例性实施方式的使用核酸复合物对10和探针复合物600检测靶标核酸的图。

[1156] 根据本申请的示例性实施方式，当将核酸复合物对10用作与包含探针复合物600结合的探针结合区(PR)的扩增产物的产生有关的引物时(参见图46(a))，能够用核酸复合物对10和探针复合物600检测的靶标核酸的种类数可为能够使用探针复合物600检测的靶标核酸的种类数(N1)*能够用核酸复合物对10检测的靶标核酸的种类数(N2)。

[1157] 在具体实例中，在分配至第一标记方法的解离峰值的温度为40℃、45℃或50℃，分配至第二标记方法的解离峰值的温度为55℃、60℃和65℃，并且能够检测共计五个荧光波长段(或荧光材料)的情况下，当将核酸复合物对10用作与包含探针复合物600结合的探针结合区(PR)的扩增产物的产生有关的引物时，能够用核酸复合物对10和探针复合物600检测的靶标核酸的种类数可为3*5*3*5＝225。

[1158] [表1]

[1159]

[1160]

[1161]

[1162]

[1163]

[1164] 根据本申请的另一示例性实施方式，当与包含探针复合物600结合的探针结合区(PR)的扩增产物的产生有关的引物不是核酸复合物对10时(参见图46(b))，能够用核酸复合物对10和探针复合物600检测的靶标核酸的种类数可为能够用探针复合物600检测的靶标核酸的种类数(N1)+能够用核酸复合物对10检测的靶标核酸的种类数(N2)。

[1165] 在更具体的实例中，当分配至第一标记方法的解离峰值的温度为40℃、45℃或50℃，分配至第二标记方法的解离峰值的温度为55℃、60℃和65℃，并且能够检测共计五个荧光波长段(或荧光材料)时，尽管与包含探针复合物600结合的探针结合区(PR)的扩增产物的产生有关的引物不是核酸复合物对10，能够用核酸复合物对10和探针复合物600检测共3*5+3*5＝30种靶标核酸。

[1166] [表2]

[1167]

[1168] 目前为止，上文已经描述了用于检测单位单元(UC)中靶标核酸的存在而在单位单元(UC)中所使用的核酸复合物对10和探针复合物600的设计和操作。

[1169] 在下文中，将详细描述根据本申请的一些示例性实施方式的使用探针复合物600和核酸复合物对10检测靶标核酸的方法。

[1170] 2.6.2根据第一示例性实施方式的探针复合物610

[1171] 2.6.2.1根据第一示例性实施方式的探针复合物610的构造

[1172] 图47是说明了根据本申请的示例性实施方式的探针复合物610的图。

[1173] 根据本申请的示例性实施方式的探针复合物610可至少包含决定子611、第一标记612和第二标记613。

[1174] 决定子611可包含核酸的单位分子和/或核酸类似物的单位分子。核酸的单位分子的实例可由上文所示的式1和式2表示。核酸类似物的单位分子的实例可由上文所示的式3至式9表示。

[1175] 第一标记612可为能量供体。第一标记612可为发射能量的分子。能量供体的实例可为FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Oregon TAMRA、ROX、花青-3、花青-3.5、花青-5、花青-5.5、水母发光蛋白或青色荧光蛋白(CFP)。

[1176] 第二标记613可为能量受体。第二标记613可为接受能量的分子。能量受体的实例可为黑洞淬灭剂(BHQ)、绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。

[1177] 决定子611可连接至第一标记612和第二标记613。第一标记612可连接至决定子611的一侧，第二标记613可连接至决定子611的另一侧。决定子611和第一标记612可以彼此直接连接或通过特定化合物连接。决定子611和第二标记613可以直接连接，或通过特定化合物连接。

[1178] 决定子611可包含互补结合特定碱基序列的区域。决定子611可包含互补结合待检测的靶标核酸的至少部分的区域。语句“决定子611包含互补结合靶标核酸的至少部分的区域”可以指决定子611的至少部分区域对应于电性质、化学性质和物理性质的至少一种性质，并且与待检测的靶标核酸的至少部分有关联。

[1179] 决定子611可互补结合探针结合区(PR)。决定子611可特异性结合探针结合区(PR)。此处，“探针结合区(PR)”可以指能够互补结合至决定子611的特定碱基序列。

[1180] 根据本申请的示例性实施方式，可基于决定子611和探针结合区(PR)之间的结合解离的温度来确定解离峰值。决定子611和探针结合区(PR)之间的结合力可基于决定子611和探针结合区(PR)之间的结合中使用的碱基的种类、序列和数量而确定，因此，可以基于决定子611和探针结合区(PR)之间的结合中使用的碱基的种类、序列和数量来确定解离峰值。

[1181] 第一标记612和第二标记613可包含其中进行联接动作的区域。第一标记612可包含提供能量的区域。第二标记613可包含接收能量的区域。

[1182] 第一标记612和第二标记613之间的联接动作可取决于它们之间的距离。当第一标记612和第二标记613进行联接动作时，与第一标记612和第二标记613之间的联接动作进行之前相比，从单位单元(UC)检测到的光学特性可改变。

[1183] 在具体实例中，当第一标记612和第二标记613进行联接动作时，从第一标记612发出的光可被第二标记613吸收。在另一具体实例中，当第一标记612和第二标记613进行联接动作时，从第一标记612发出的光的波长段和强度可被第二标记613改变。

[1184] 根据本申请的示例性实施方式，可基于决定子611和探针结合区(PR)之间的结合来确定第一标记612和第二标记613之间的联接动作是否进行。

[1185] 具体而言，当探针复合物610的决定子611未形成双链(所述双链可由探针复合物610的决定子611与探针结合区(PR)之间的结合引起)时，因为第一标记612和第二标记613由于探针复合物610的自聚集而彼此相邻，第一标记612和第二标记613可以进行联接动作。

[1186] 当探针复合物610退火至探针结合区(PR)时，第一标记612和第二标记613可至少彼此隔开决定子611的长度。结果，第一标记612和第二标记613可不进行联接动作。

[1187] 2.6.2.2根据第一示例性实施方式的探针复合物610的操作

[1188] 根据本申请的第一示例性实施方式的探针复合物610可用于PCR中以检测靶标核酸。

[1189] 具体而言，可将根据第一示例性实施方式的探针复合物610提供至单位单元(UC)。除了探针复合物610之外，单位单元中可进一步包含参与聚合的酶(例如聚合酶)、碱基片段(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、参与PCR的辅酶(例如MgCl2、MgSO4)和用于提供PCR的最佳pH和/或盐浓度的缓冲液中的至少一种。

[1190] 通过调节单位单元(UC)的温度，可以对单位单元(UC)中的溶液顺序地进行热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)。

[1191] 可对已完成PCR的单位单元(UC)实施稳定步骤(S5000)和获取解离曲线的步骤(S6000)。基于所获得的解离曲线，可以获得荧光相对于温度的负变化率/温度的图表。在温度与荧光相对于温度的负变化率之间的图表上，可以确定解离峰值。

[1192] 解离峰值可与探针复合物610的决定子611从探针结合区(PR)解离的温度有关。在最大程度上，解离峰值可对应于探针复合物610的决定子611从探针结合区(PR)解离的温度。

[1193] 在使用多种类型的探针复合物610对多种类型的靶标核酸进行检测时，可通过调节决定子611靶向的探针结合区(PR)的碱基序列以及决定子611与探针结合区(PR)之间的结合力来设计多种类型的探针复合物610，以具有不同的解离峰值。

[1194] 样品中存在的靶标核酸的种类可以通过确定与解离峰值相对应的探针复合物610的种类来鉴别，所述解离峰值通过对在获得解离曲线的步骤(S6000)中获得的图表进行分析而得以确定。靶标核酸可为对应于探针结合区(PR)的序列。靶标核酸可为包含探针结合区(PR)的特定核酸。

[1195] 简而言之，在使用探针复合物610检测靶标核酸的存在的方法中，当对单位单元(UC)检测根据温度的荧光值时，可确定荧光值降低或升高的特定温度，并因此可以确定靶标核酸的存在。在使用探针复合物610检测靶标核酸的存在的方法中，基于根据单位单元(UC)的温度的荧光值，可获得荧光根据温度的负速率/温度的图表，并且可以根据解离峰值的存在来确定靶标核酸的存在。

[1196] 根据本申请的第一示例性实施方式的探针复合物610的决定子611可以由PNA的单位分子的聚合物构成。因此，探针复合物610的决定子611不能被DNA聚合酶分解。这是因为PNA具有与DNA不同的结构。

[1197] 然而，根据本申请的第一示例性实施方式的探针复合物610的决定子611可由DNA的单位分子的聚合物构成。因此，探针复合物610的决定子611可被DNA聚合酶分解。

[1198] 为此，根据本申请示例性实施方式的探针复合物610可以处于DNA聚合酶与用于抑制探针复合物610的决定子611的裂解的酶结合的状态。或者，在使用根据本申请示例性实施方式的探针复合物610的PCR中，可以使用缺乏特定结构域活性的DNA聚合酶。在具体实例中，通过使用缺乏核酸外切酶活性的DNA聚合酶进行PCR，可以防止探针复合物610的决定子611的裂解。

[1199] 2.6.2.3使用根据第一示例性实施方式的探针复合物610和核酸复合物对10检测靶标核酸的方法

[1200] 为了使用根据本申请示例性实施方式的探针复合物610和核酸复合物对10对靶标核酸进行检测，可以使单位单元(UC)经受热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)、聚合步骤(S4000)、稳定步骤(S5000)和获得解离曲线的步骤(S6000)。将热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)的序列设置为一个循环，并且可以重复进行多于一个循环。

[1201] 可以将至少一种核酸复合物对10和至少一种探针复合物610提供给单位单元(UC)。

[1202] 根据本申请的示例性实施方式，当将多种类型的探针复合物610提供至单位单元(UC)时，可以将所述多种类型的探针复合物610设计为在探针结合区(PR)和每个探针复合物610的决定子611之间具有不同的结合力。在具体实例中，当将多种类型的探针复合物610提供至单位单元(UC)时，可将多种类型的探针复合物610设计为具有不同的探针结合区(PR)和每个探针复合物610的决定子611之间的结合解离的温度。

[1203] 根据本申请的示例性实施方式，当将多种类型的核酸复合物对10提供至单位单元(UC)时，可以将多种类型的核酸复合物对10设计为在第一标签112和第二个标签122之间具有不同的结合解离力。在具体实例中，当将多种类型的核酸复合物对10提供至单位单元(UC)时，根据第一标签112和第二标签122之间的互补结合，可以基于碱基的数量、碱基的种类和单位核酸的种类将所述多种类型的核酸复合物对10设计为具有不同的解离峰值。

[1204] 可将PCR中使用的酶、碱基片段、辅酶和/或缓冲液进一步提供至单位单元(UC)。可以提供至单位单元(UC)的PCR试剂盒可包含根据第一示例性实施方式的探针复合物610，核酸复合物对10，以及PCR中使用的酶、碱基片段、辅酶和缓冲液中的至少一种。

[1205] 在一个实例中，当光学装置能够检测共计六个解离峰值时，PCR试剂盒可包含三种根据第一示例性实施方式的探针复合物610以及三种核酸复合物对10，所述三种探针复合物分别对应于三个解离峰值，所述三种核酸复合物对10分别对应于三个解离峰值。

[1206] PCR试剂盒可以以如下形式体现：其中，包含至少一种物质的组合物装在一个容器(例如，装有包含一种核酸复合物对10的组合物的容器)中，以及一个包装中装有多个容器(例如，装有具有一种核酸复合物对10的组合物的容器和装有具有不同种类的核酸复合物对10的组合物的容器)。PCR试剂盒可以以包含至少一种物质的组合物的形式体现，并在一个容器中出售。PCR试剂盒可以以其中至少一种物质为干燥的的形式体现，并在一个容器中出售。

[1207] 图48和图49是说明了根据本申请的示例性实施方式的提供至单位单元(UC)的溶液的PCR的图，所述单位单元(UC)包含探针复合物610和核酸复合物对10。

[1208] 根据本申请的示例性实施方式，可根据不对称PCR方法进行使用探针复合物610和核酸复合物对10的PCR。

[1209] 下文中将描述根据不对称方法的PCR。与第二核酸复合物120相比，根据不对称方法的PCR可以在单位单元(UC)中包含相对较大比例的第一核酸复合物110。或者，在根据不对称方法的PCR混合溶液中，与单位单元(UC)中的第一核酸复合物110相比，可以包含相对较大比例的第二核酸复合物120。

[1210] 在热变性步骤(S2000)中，可以通过调节单位单元(UC)的温度将双链DNA分开为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可将双链DNA分开为两条单链DNA，所述双链DNA包含与第一核酸复合体110的第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列、与第二核酸复合物120的第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列和/或探针结合区(PR)。

[1211] 在退火步骤(S3000)中，第一核酸复合物110、第二核酸复合物120和/或探针复合物610可以结合至分开为单链的DNA的至少部分区域。具体而言，第一核酸复合物110可以互补结合至第一靶标碱基序列。第二核酸复合物120可以互补结合至第二靶标碱基序列。探针复合物610可以互补结合至探针结合区(PR)。

[1212] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生包含第一决定子111所结合的第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生包含第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物。

[1213] 根据本申请的示例性实施方式，当将第一决定子111或第二决定子121用作与探针复合物610有关的引物时，在聚合步骤(S4000)中，结合至探针结合区(PR)的探针复合物610可以与探针结合区(PR)分开。在聚合步骤(S4000)中，结合至探针结合区(PR)的探针复合物610可以不分解。

[1214] 在具体实例中，在将第一决定子111或第二决定子121用作与探针复合物610相关的引物时，使用第一决定子111或第二决定子121作为起点，在第一链或第二链的扩增产物引发后，在产生与探针复合物610所结合的区域相邻的碱基序列的扩增产物时，探针复合物610可与探针结合区(PR)分开。

[1215] 根据本申请的示例性实施方式，即使当第一决定子111或第二决定子121不用作与探针复合物610有关的引物时，根据聚合步骤(S4000)中与探针复合物610有关的引物的引发，在产生与探针复合物610相邻区域中的包含探针结合区(PR)的核酸的扩增产物时，结合至探针结合区(PR)的探针复合物610可与探针结合区(PR)分开。在聚合步骤(S4000)中，结合至探针结合区(PR)的探针复合物610可以不分解。

[1216] 在PCR的一个循环后，在热变性步骤(S2000)中，单位单元(UC)中的双链DNA可分开为单链DNA。此处，包含聚合步骤(S4000)中形成的至少一种核酸复合物1的双链DNA也可以分开为两条DNA单链。

[1217] 在PCR的一个循环后，在退火步骤(S3000)中，第一核酸复合物110或第二核酸复合物120可以结合至单元单元(UC)中单链的第一靶标碱基序列和/或第二靶标碱基序列。在一些情况下，第一核酸复合物110可以结合至包含第二核酸复合物120的单链DNA。第二核酸复合物120可以结合至包含第一核酸复合物110的单链DNA。

[1218] 在PCR的一个循环后，在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生包含第二决定子121的核酸的扩增产物。在PCR的一个循环后，在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生包含第一决定子111的核酸的扩增产物。

[1219] 根据本申请的示例性实施方式，当将第一决定子111或第二决定子121用作与探针复合物610有关的引物时，在聚合步骤(S4000)中，结合至探针结合区(PR)的探针复合物610可以与探针结合区(PR)分开。

[1220] 在经受至少两个PCR循环的单位单元(UC)所包含的溶液中，可能流动着包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体、包含第一核酸复合物110的核酸构建体、包含第二核酸复合物120的核酸构建体以及不包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体。

[1221] 此外，在经受两个PCR循环的单位单元(UC)所包含的溶液中，在PCR之前，提供的第二核酸复合物120的浓度与第一核酸复合物110的浓度不同(不对称PCR方法)，包含第一核酸复合物110的单链DNA和/或包含第二核酸复合物120的单链DNA可以在反应后保留在单位单元(UC)中。

[1222] 在PCR完成后，可以进行稳定步骤(S5000)。在稳定步骤(S5000)中，探针复合物610可结合至包含剩余单链DNA的探针结合区(PR)的链，所述剩余单链DNA为包含第一核酸复合物110的剩余单链DNA或包含第二核酸复合物120的剩余单链DNA。

[1223] 此外，在稳定步骤(S5000)中，可以在包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体的第一标签112和第二标签122之间形成互补结合。

[1224] 在稳定步骤(S5000)后，可以进行关于单位单元(UC)的获得解离曲线(S6000)的步骤。此处，基于从单位单元(UC)获得的荧光相对于温度的图表，可以获得荧光相对于温度的负变化率/温度的图表，从而确定单位单元(UC)的解离峰值。

[1225] 参考图50，根据本申请的示例性实施方式，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，最大点可在温度T1和T2处示出。或者，根据本申请的示例性实施方式，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，最小点可在温度T1和T2处示出。或者，根据本申请的示例性实施方式，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，最大点可以在温度T1处示出，最小点可在温度T2处示出。

[1226] 在具体实例中，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，示出最小点的T1可为与核酸复合物对10有关的解离峰值(参见图50(a))。此处，可以将核酸复合物对10设计为进行信号淬灭型联接。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，示出最小点的T2可为与探针复合物610有关的解离峰值(参见图50(b))。此处，可以将探针复合物610设计为进行信号发射型联接。

[1227] 在更具体的实例中，将40℃、45℃和50℃分配为与多种类型的核酸复合物对10有关的解离峰值，设计了15种不同种类的核酸复合物对10，它们的每种标记有总计五种荧光材料；将55℃、60℃和65℃分配为与多种类型的探针复合物610有关的解离峰值，并设计了15种不同种类的探针复合物610，它们的每种标记有总计五种荧光材料，然后可以对包含核酸复合物对10和探针复合物610的单位单元(UC)进行PCR。

[1228] 此处，当与探针复合物610有关的引物是核酸复合物对10时，在对应于FAM的荧光通道中检测45℃的解离峰值和60℃的解离峰值，可以确定在单位单元(UC)中存在与表1中的靶标ID 101相对应的靶标核酸。

[1229] 此处，当与探针复合物610有关的引物不是核酸复合物对10时，在对应于FAM的荧光通道中检测45℃的解离峰值和60℃的解离峰值，可以确定在单位单元(UC)中存在与表1所示的靶标ID 1相对应的靶标核酸和与表1所示的靶标ID 21相对应的靶标核酸。

[1230] 2.6.2.4实验例#5：根据第一示例性实施方式的探针复合物610和核酸复合物对10的

[1231] 根据本申请的示例性实施方式，可以使用探针复合物610和核酸复合物对10确有定靶标核酸的存在。

[1232] 图51是说明了根据本申请示例性实施方式，通过用于确定单位单元(UC)中存在的至少四种靶标核酸的实验获得的结果的一组图表。

[1233] 在该实验过程中，将Tris-HCl(pH 9.0)、盐(KCl)、MaCl2、dNTP混合物、蛋白稳定剂、PCR增强剂(大分子)和快速热启动Taq DNA聚合酶引入PCR板的管(或孔)中。

[1234] 将与第一核酸复合物对10和探针复合物610相关的各自的引物引入PCR板的第一管中。

[1235] 第一核酸复合物对10由第一核酸复合物110和第二核酸复合物120组成。引入0.5pmol/Rxn的第一核酸复合物110，并引入8pmol/Rxn的第二核酸复合物120。

[1236] 第一核酸复合物110通过顺序连接第一标记113、第一标签112、第一接头114和第一决定子111而形成，其中，第一标记113为FAM，第一标签112为AAAAAAAAAA(SEQ ID NO：5)，第一接头114为间隔物18，第一决定子111为AGGTAAACGCTCCTCTGAA(SEQ ID NO：6)。

[1237] 第二核酸复合物120通过顺序连接第二标记123、第二标签122、第二接头124和第二决定子121而形成，其中，第二标记123为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，第二标签122为TTTTTTTTTT(SEQ ID NO：7)，第二接头124为间隔物18，第二决定子121为GCGAGTTACGAAGACAAAA(SEQ ID NO：8)。

[1238] 探针复合物610通过顺序连接第一标记612、决定子611和第二标记613而形成。引入2pmol/Rxn的探针复合物610。第一标记612为淬灭剂分子(Iowa FQ(IowaQuenchers))，决定子611为CACTCATATACAGC(SEQ ID NO：27)，第二标记613为FAM。

[1239] 提供了与探针复合物610有关的正向引物和反向引物。引入0.5pmol/Rxn的正向引物，并引入8pmol/Rxn的反向引物。

[1240] 与探针复合物610有关的正向引物为AGCTCCTATTGCCAACGTA(SEQ ID NO：10)，反向引物为GTGTGGAGCATCTTGTAATC(SEQ ID NO：28)。

[1241] 调节其中引入有核酸复合物对10、探针复合物610以及与探针复合物610有关的正向引物和反向引物的管的温度，从而对管中的溶液进行PCR。如图29所示，在将管的温度在95℃下保持约10分钟后，将热变性步骤(S2000)(95℃，10秒)、退火步骤(S3000)(50℃，40秒)和聚合步骤(S4000)(60℃，20秒)的序列设为一个循环，并重复进行40个循环。在该实验中，使用Bio-Rad CFX96(许可证号10-205)。

[1242] 此后，获得了上述所述管的解离曲线，并且如图51所示，然后获得了根据温度的荧光的图表和荧光相对于温度的负变化率/温度的图表。

[1243] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表中，关于核酸复合物对10的解离峰值，在23.5℃确定了最小值。因此，可以确定在单位单元(UC)中存在与核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1244] 在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，关于探针复合物610的解离峰值，在43.5℃确定了最大值。因此，可以确定在单位单元(UC)中存在与探针复合物610有关的靶标核酸。

[1245] 结果，通过获得荧光相对于温度的负变化率/温度的图表，并基于在特定温度下是否检测到解离峰值，可以确定核酸复合物对10的靶标核酸的存在和探针复合物610的靶标核酸的存在。

[1246] 2.6.3根据第二示例性实施方式的探针复合物620

[1247] 2.6.3.1根据第二示例性实施方式的探针复合物620的构造

[1248] 图52是说明了根据本申请的第二示例性实施方式的探针复合物620的图。

[1249] 根据本申请的第二示例性实施方式的探针复合物620可由在物理上区别的第一探针类似物和第二探针类似物组成。

[1250] 第一探针类似物可包含决定子621和第一配对部分622。第一探针类似物可以通过将第一配对部分622连接至决定子621来体现。第二探针类似物可以包含第二配对部分623、第一标记624和第二标记625。

[1251] 决定子621可包含核酸的单位分子和/或核酸类似物的单位分子。核酸的单位分子的实例可以由式1和式2表示。核酸类似物的单位分子的实例可以由式3至式9表示。

[1252] 第一配对部分622可包含核酸的单位分子和/或核酸类似物的单位分子。第二配对部分623可包含核酸的单位分子和/或核酸类似物的单位分子。如上所述，核酸的单位分子的实例可以由式1和式2表示。核酸类似物的单位分子的实例可以由式3至式9表示。

[1253] 第一标记624可为能量供体。第一标记624可为发射能量的分子。能量供体的实例可为FAM、JOE、TET、HEX、VIC、Oregon TAMRA、ROX、花青-3、花青-3.5、花青-5、花青-5.5、水母发光蛋白或青色荧光蛋白(CFP)。

[1254] 第二标记625可为能量受体。第二标记625可为接受能量的分子。能量受体的实例可为黑洞淬灭剂(BHQ)、绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。

[1255] 第一探针类似物可以通过将决定子621和第一配对部分622连接来体现。根据本申请示例性实施方式的第一探针类似物可以通过将第一配对部分622结合至决定子621来体现。

[1256] 第二探针类似物可以通过将第二配对部分623、第一标记624和第二标记625连接来体现。根据本申请示例性实施方式的第二探针类似物可以通过将第一标记624和第二标记625结合至第二配对部分623来体现。

[1257] 决定子621可以包含与特定碱基序列互补结合的区域。决定子621可以包含与待检测的靶标核酸的至少部分互补结合的区域。语句“决定子621包含与靶标核酸的至少部分互补结合的区域”可以意指决定子621的至少部分区域对应于电性质、化学性质和物理性质中的至少一种性质，并且与待检测的靶标核酸的至少部分有关联。

[1258] 决定子621可以互补结合至探针结合区(PR)。决定子621可以特异性结合至探针结合区(PR)。此处，“探针结合区(PR)”可以意指与决定子621互补结合的特定碱基序列。

[1259] 当包含探针结合区(PR)的靶标核酸的扩增产物产生时，第一配对部分622可以与决定子621分开。当通过开始产生包含探针结合区(PR)的靶标核酸的扩增产物而在邻近探针结合区(PR)的区域进行扩增时，第一配对部分622可以与决定子621分开。

[1260] 第一配对部分622可通过DNA聚合酶的作用与决定子621分开。第一配对部分622可以通过DNA聚合酶的作用被切割并与决定子621分开。在一个实例中，第一配对部分622与决定子621的分开可能是由DNA聚合酶的核酸外切酶活性引起的。

[1261] 第一配对部分622可以互补结合至第二配对部分623。根据本申请的示例性实施方式的探针复合体620可以体现为使得第一配对部分622和第二配对部分623互补结合。第一配对部分622可以包含与第二配对部分623互补的碱基序列。第二配对部分623可以包含与第一配对部分622互补的碱基序列。

[1262] 第一配对部分622可以结合至第二配对部分623并因此充当引物。第一配对部分622可以结合至第二配对部分623并因此充当引物。换言之，当第一配对部分622结合至第二配对部分623的至少部分区域时，使用第一配对部分622作为起点，核苷酸可以在第二配对部分623的3'端延伸，以具有与第二配对部分623互补的碱基序列。

[1263] 第一标记624和第二标记625可以包含其中进行联接的区域。第一标记625可以包含提供能量的区域。第二标记625可以包含接受能量的区域。

[1264] 第一标记624和第二标记625之间的联接可以根据它们之间的距离而变化。与第一标记624和第二标记625联接之前相比，当第一标记624和第二标记625联接时，由光学装置检测到的单位单元的光学特性可改变。

[1265] 在具体实例中，当第一标记624和第二标记625联接时，从第一标记624发出的光可被第二标记625吸收。在另一具体实例中，当第一标记624和第二标记625联接时，从第一标记624发出的光的波长段和强度可由于第二标记625而变化。

[1266] 根据本申请的示例性实方式，第一标记624和第二标记625可以在自聚集的同时联接。

[1267] 根据本申请的示例性实施方式，当第一配对部分622与第二配对部分623互补结合时，由于第一标记624和第二标记625之间的距离长，可不进行联接。换言之，当第一配对部分622与第二配对部分623互补结合时，核苷酸结合至第一配对部分622不结合的部分区域，从而将第一标记624和第二标记625隔开。

[1268] 因此，可以根据在结合之后是否进行聚合步骤(S4000)，通过第一标记624和第二标记625之间的联接来确定第一配对部分622是否互补地结合至第二配对部分623。

[1269] 在获得解离曲线的步骤(S6000)中，特定温度下与(1)第二配对部分623和(2)第二配对部分623的碱基序列的至少部分互补的序列之间的结合可解离。包含(1)第二配对部分623和(2)第一配对部分622的单链之间的互补结合可以在特定温度下解离。

[1270] 在第二配对部分623热变性为单链的特定温度下，可以进行第一标记624和第二标记625之间的联接。当第二配对部分623热变性为单链时，第二配对部分623自聚集以使第一标记624和第二标记625变得更紧密，从而引发第一标记624和第二标记625之间的联接。

[1271] 2.6.3.2根据第二示例性实施方式的探针复合物620的操作

[1272] 根据本申请的第二示例性实施方式的探针复合物620可以用于PCR中以检测靶标核酸。

[1273] 具体而言，可将根据第二示例性实施方式的探针复合物620提供至单位单元(UC)。除探针复合物外，单位单元(UC)中可以进一步包含参与聚合的酶(例如聚合酶)、碱基片段(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、参与PCR的辅酶(例如MgCl2、MgSO4)和在PCR中提供最佳pH和/或盐浓度的缓冲液中的至少一种。

[1274] 通过调节单位单元(UC)的温度，可以对单位单元(UC)中的溶液顺序地进行热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)。

[1275] 当决定子621和第一配对部分622之间的联接在退火步骤(S3000)中解离时，第一配对部分622可以互补地结合至第二配对部分623。

[1276] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一配对部分622作为起点，核苷酸可以延伸以具有与第二配对部分623的至少部分区域中的碱基序列互补的碱基序列。

[1277] 稳定步骤(S5000)和获得解离曲线的步骤(S6000)可以在完成PCR的单位单元(UC)上进行。可以基于获得的解离曲线来获得荧光相对于温度的负变化率/温度的图表。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，可以确定解离峰值。

[1278] 解离峰值可能与结合至第二配对部分623的探针(即，包含第一配对部分622的DNA链)与第二配对部分623解离并因此第二配对部分623变为单链的温度有关。最大程度上，结合至第二配对部分623的探针(即，包含第一配对部分622的DNA链)可以对应于第二配对部分623与第二配对部分623解离从而变为单链的温度。

[1279] 在使用多种类型的探针复合物620检测多种类型的靶标核酸时，可以通过调节第二配对部分623的长度和碱基序列，将多种类型的探针复合物620设计为具有不同的解离峰值。

[1280] 样品中存在的靶标核酸的种类可以通过确定对应于解离峰值的探针复合物620的种类来鉴别，所述解离峰值通过分析在获得解离曲线的步骤(S6000)中获得的图表而确定。靶标核酸可为对应于探针结合区(PR)的序列。靶标核酸可为包含探针结合区(PR)的序列。

[1281] 简而言之，在使用探针复合物620检测靶标核酸的存在的方法中，当对单位单元(UC)检测根据温度的荧光值时，可以确定荧光值增加或减少的特定温度，并因此可以确定靶标核酸的存在。在使用探针复合物620检测靶标核酸的存在的方法中，基于根据单位单元(UC)的温度的荧光值，可以获得根据温度的荧光的负速率/温度的图表，并且可以基于解离峰值的存在来确认靶标核酸的存在。

[1282] 2.6.3.3使用根据第二示例性实施方式的探针复合物620和核酸复合物对10检测靶标核酸的方法

[1283] 为了使用根据本申请示例性实施方式的探针复合物620和核酸复合物对10检测靶标核酸，可以使单位单元(UC)经受热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)、聚合步骤(S4000)、稳定步骤(S5000)和获得解离曲线的步骤(S6000)。将热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)的序列设置为一个循环，并且可以重复进行多于一个循环。

[1284] 可以将至少一种核酸复合物对10和至少一种探针复合物620提供至单位单元(UC)。

[1285] 当根据本申请的示例性实施方式将多种类型的探针复合物620提供至单位单元(UC)时，可将多种类型的探针复合物620设计为每种探针复合物620的单链之间具有不同的结合力，所述单链各自包含第二配对部分623和第一配对部分622。在具体实例中，当将多种类型的探针复合体620提供至单位单元(UC)时，可将多种类型的探针复合物620设计为每种探针复合物620的单链之间的结合解离的温度不同，所述单链各自包含第二配对部分623和第一配对部分622。

[1286] 当根据本申请的示例性实施方式将多种类型的核酸复合物对10提供至单位单元(UC)时，可将多种类型的核酸复合物对10设计为具有不同的第一标签112和第二个标签122之间的结合解离力。在具体实例中，当将多种类型的核酸复合物对10提供至单位单元(UC)时，根据第一标签112和第二标签122之间的互补结合，可基于碱基的数量、碱基的种类和单位核酸的种类，将多种类型的核酸复合物对10设计为具有不同的解离峰值。

[1287] 可以进一步将PCR中使用的酶、碱基片段、辅酶和/或缓冲液提供至单位单元(UC)。可以提供给单位单元(UC)的PCR试剂盒可包含在PCR中使用的酶、碱基片段、辅酶和缓冲液中的至少一种，根据第一示例性实施方式的探针复合物620和核酸复合物对10。

[1288] 根据本申请的示例性实施方式的PCR试剂盒可以包含在PCR中使用的酶、碱基片段、辅酶和缓冲液中的至少一种，根据第一示例性实施方式的探针复合物610、根据第二示例性实施方式的探针复合物620和核酸复合物对10。

[1289] 在一个实例中，当光学装置能够检测共计六个解离峰值时，PCR试剂盒可包含分别对应于两个解离峰值的根据第一示例性实施方式的两种探针复合物610，分别对应于两个解离峰值的根据第二示例性实施方式的两种探针复合物620，以及分别对应于两个解离峰值的两种核酸复合物对10。

[1290] PCR试剂盒可以以如下的形式体现：其中，包含至少一种物质的组合物装在一个容器(例如，装有包含一种核酸复合物对10的组合物的容器)中，并且在一个包装中装有多个容器(例如，装有具有一种核酸复合物对10的组合物的容器和装有具有不同种类的核酸复合物对10的组合物的容器)。PCR试剂盒可以以包含至少一种物质的组合物并在一个容器中出售的形式体现。PCR试剂盒可以以其中至少一种物质为干燥的并在一个容器中出售的形式体现。

[1291] 图53和图54是说明了根据本申请的示例性实施方式，提供至包含探针复合物620和核酸复合物对10的单位单元(UC)的溶液的PCR的图。

[1292] 根据本申请的示例性实施方式，可以根据不对称或对称PCR方法进行使用探针复合物620和核酸复合物对10的PCR。

[1293] 下文中，将描述根据对称方法的PCR。在根据对称方法的PCR中，在单位单元(UC)中存在几乎相同量的第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。在根据对称方法的PCR中，在单位单元(UC)中，第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的比可以为1:1。

[1294] 在热变性步骤(S2000)中，可以通过调节单位单元(UC)的温度将双链DNA分开为单链DNA。在热变性步骤(S2000)中，可以将双链DNA分开为两条单链DNA，所述双链DNA包含与第一核酸复合物110的第一决定子111相对应的第一靶标碱基序列、与第二核酸复合物120的第二决定子121相对应的第二靶标碱基序列和/或探针结合区(PR)。

[1295] 在退火步骤(S3000)中，第一核酸复合物110、第二核酸复合物120和/或第一探针类似物可以结合至分开为单链DNA的DNA的至少部分区域。具体而言，第一核酸复合物110可以互补结合至第一靶标碱基序列。第二核酸复合物120可以互补结合至第二靶标碱基序列。第一探针类似物可以互补结合至探针结合区(PR)。

[1296] 在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生包含第一决定子111所结合的第一靶标碱基序列的第一链的扩增产物。在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生包含第二决定子121所结合的第二靶标碱基序列的第二链的扩增产物。

[1297] 根据本申请的示例性实施方式，当将第一决定子111或第二决定子121用作与探针复合物620有关的引物时，第一探针类似物的至少部分碱基序列可以与探针结合区(PR)分离。

[1298] 在具体实例中，在将第一决定子111或第二决定子121用作与探针复合物620有关的引物时，使用第一决定子111或第二决定子121作为起点，在引发第一链或第二链的扩增产物后，在产生与第一探针类似物所结合的区域相邻的碱基序列的扩增产物时，第一配对部分622可以与决定子621分开。

[1299] 根据本申请的示例性实施方式，即使当第一决定子111或第二决定子121不用作与探针复合物620有关的引物时，在探针结合区(PR)所结合的探针复合物620中，由于在聚合步骤(S4000)中与探针复合物620相邻的区域中的与探针复合物620有关的引物的引发而产生包含探针结合区域(PR)的核酸的扩增产物时，第一配对部分622可以与决定子621分开。

[1300] 在PCR的一个循环后，在热变性步骤(S2000)中，单位单元(UC)中的双链DNA可分开为单链DNA。此处，聚合步骤(S4000)中形成的包含至少一种核酸复合物1的双链DNA也可以分开为两条DNA单链。

[1301] 在PCR的一个循环后，在热变性步骤(S2000)中，第一配对部分622可在单位单元(UC)中流动。在PCR的一个循环后，在热变性步骤(S2000)中，与决定子621分开的第一配对部分622可在单位单元(UC)中流动。

[1302] 在PCR的一个循环后，在退火步骤(S3000)中，第一核酸复合物110或第二核酸复合物120可以结合至单位单元的单链的第一靶标碱基序列和/或第二靶标碱基序列。在一些情况下，第一核酸复合物110可以结合至包含第二核酸复合物120的单链DNA。第二核酸复合物120可以结合至包含第一核酸复合物110的单链DNA。

[1303] 在PCR的一个循环后，在退火步骤(S3000)中，第一配对部分622可以结合至单位单元(UC)中的探针复合物620的第二探针类似物。在单位单元(UC)中流动的第一配对部分622可以结合至探针复合体620的第二探针类似物的第二配对部分623。当第一配对部分622结合至第二配对部分623时，第一配对部分622可以充当引物。

[1304] 在PCR的一个循环后，在聚合步骤(S4000)中，使用第一决定子111作为起点，可以产生包含第二决定子121的核酸的扩增产物。在PCR的一个循环后，在聚合步骤(S4000)中，使用第二决定子121作为起点，可以产生包含第一决定子111的核酸的扩增产物[1305] 此外，在PCR的一个循环后，在聚合步骤(S4000)中，使用第一配对部分622作为起点，可以将核苷酸延伸为具有与第二配对部分623的至少部分碱基序列的互补的碱基序列。

[1306] 当将核苷酸延伸以具有与第二配对部分623的至少部分碱基序列的互补的碱基序列时，延伸的多核苷酸可以与第二配对部分623形成双链构建体。当第二配对部分623为双链构建体时，第一标记624和第二标记625之间的联接可能无法进行。

[1307] 在经受至少两个PCR循环的单位单元(UC)所包含的溶液中，可流动着包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体、包含第一核酸复合物110的核酸构建体、包含第二核酸复合物120的核酸构建体以及不包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体。

[1308] 在PCR完成后，可以进行稳定步骤(S5000)。在稳定步骤(S5000)中，可以使包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120的核酸构建体的第一标签112和第二标签122之间进行互补结合。

[1309] 此外，在稳定步骤(S5000)中，可诱导延伸的多核苷酸与第二配对部分623之间的结合，以具有与第二配对部分623的至少部分碱基序列互补的碱基序列。在稳定步骤(S5000)中，可以诱导(1)聚合物核苷酸和(2)第二配对部分623之间的结合，所述(1)聚合物核苷酸被延伸以具有与第二配对部分623和第一配对部分622的至少部分碱基序列互补的碱基序列。

[1310] 参考图55，根据本申请的示例性实施方式，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，最大点可以以在温度T1和T2处示出。或者，根据本申请的示例性实施方式，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，最小点可以以在温度T1和T2处示出。或者，根据本申请的示例性实施方式，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，最小点可以以在温度T1示出，并最大点可以以在温度T2示出。

[1311] 在具体实例中，在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，示出最小点的T1可为与核酸复合物对10有关的解离峰值(参见图50(a))。此处，可以将核酸复合物对10设计为进行信号淬灭型联接。在荧光相对于温度的负变化率/温度的图表上，示出最小点的T2可为与探针复合物620有关的解离峰值(参见图50(b))。此处，可以将探针复合物620设计为进行信号淬灭型联接。

[1312] 3.核酸复合物对10的应用#3-PCR钳制和标签

[1313] 3.1核酸复合物对10的构造

[1314] 根据本申请的示例性实施方式，核酸复合物对10可包含第一核酸复合物110和第二核酸复合物120。

[1315] 根据本申请的示例性实施方式的第一核酸复合物110可至少包含第一决定子111和第一标签112。根据本申请的示例性实施方式的第一核酸复合物110可包含第一决定子111、第一标签112、第一标记113和第一接头114。

[1316] 根据本申请的示例性实施方式的第二核酸复合物120可至少包含第二决定子121和第二标签122。根据本申请的示例性实施方式的第二核酸复合物120可包含第二决定子121、第二标签122、第二标记123和第二接头124。

[1317] 第一决定子111可为启动PCR的正向引物或反向引物。当第一决定子111为正向引物时，第二决定子121可为反向引物。当第一决定子111为反向引物时，第二决定子121可为正向引物。

[1318] 第一决定子111和第二决定子121可以与相关的靶标核酸反应。作为更具体的实例，第一决定子111可以和与第一疾病有关的靶标核酸反应，第二决定子111可以和与第一疾病有关的靶标核酸反应。

[1319] 在1.1.1.3.2引物中已经描述了第一决定子111和第二决定子121的具体操作和组分，因此将省略重复的描述。

[1320] 第一标签112可为包含核酸和/或核酸类似物的单链物质。第一标签112可为用于PCR钳制的探针。

[1321] 第一标签112的碱基序列可以与第一决定子111的碱基序列具有至少一个差异。可以通过置换或删除第一决定子111的碱基序列的部分碱基序列来设计第一标签112的碱基序列。第一标签112的碱基序列可以与第二决定子121的碱基序列具有至少一个差异。可以通过置换或删除第二决定子121的碱基序列的部分碱基序列来设计第一标签112的碱基序列。

[1322] 在1.1.2.3.2用于PCR钳制的探针中已经提供了其详细描述，因此将省略重复的描述。

[1323] 第一标签112可以与第一决定子111的第一靶标碱基序列及其相似的碱基序列、或第二决定子121的第二靶标碱基序列及其相似的碱基序列反应。在一个实例中，第一标签112可以用作用于对第一决定子111的第一靶标碱基序列的相似碱基序列的PCR钳制的探针。在另一实例中，第一标签112可以用作用于对第二决定子121的第二靶标碱基序列的相似碱基序列的PCR钳制的探针。

[1324] 第二标签121可以互补结合至第一标签111。第二标签121可以互补结合至第一标签111，以使第一标记113和第二标记123变得更靠近。

[1325] 第一标记113和第二标记123可以进行联接动作。基于第一标签112是否结合至第二标签122，第一标记113和第二标记123可进行联接动作。

[1326] 接头400可为具有预定长度的化合物。接头400可为PCR的阻断剂。其详细描述已在3.1.1.3.1PCR的阻断剂中进行了描述，因此将省略重复的说明。

[1327] 3.1核酸复合物对10的操作

[1328] 可以使根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10经受PCR，以确定在单位单元(UC)中是否存在与核酸复合物对10有关的靶标核酸。

[1329] 具体而言，当进行热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)的至少两个循环时，可以形成包含核酸复合物对10的核酸构建体。

[1330] 此后，当进行稳定步骤(S5000)时，包含核酸复合物对10的核酸构建体可以具有二级结构。当在核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间形成互补结合时，可以进行第一标记113和第二标记123之间的联接动作。

[1331] 然后，当在获得解离曲线(S6000)的步骤中通过改变单位单元(UC)的温度对单位单元(UC)的荧光值进行检测，并获得荧光根据温度的负变化率/温度的图表时，可以在与核酸复合物对10的解离峰值相对应的温度下确定最大点或最小点。单位单元(UC)中与核酸复合物对10有关的靶标核酸可以根据最大点或最小点是否确定在与解离峰值相对应的温度来确定。

[1332] 在这方面，可以通过1.3.2用于靶标检测的核酸复合物对10的操作中公开的PCR方法和在2.3核酸复合物对10的操作中公开的多重PCR方法来检测靶标核酸的存在。

[1333] 同时，在退火步骤(S3000)中，第一标签112可以互补结合至第一决定子111或第二决定子121的相似碱基序列。当第一标签112互补结合至第一决定子111或第二决定子121的相似碱基序列时，第一决定子111或第二决定子121可与相似碱基序列错配以防止非特异性结合。

[1334] 此外，在聚合步骤(S4000)中，与第一决定子111或第二决定子121的相似碱基序列互补结合的第一标签112可以防止相似碱基序列的扩增。在具体实例中，由于第一标签112可以互补结合至相似碱基序列，并且与第一标签112连接的第一接头114阻止核苷酸在第一标签的3'端的延伸，因此可以防止包含相似碱基序列的核酸的扩增产物的产生。

[1335] 这已经在1.2.2核酸复合物1的操作中详细描述，因此将省略重复的描述。

[1336] 因此，通过使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10，可以防止单位单元中包含相似碱基序列的核酸的扩增，可以形成包含相似碱基序列的核酸的扩增产物，并且可以确定样品中包含靶标碱基序列的核酸的存在。

[1337] 结果，通过使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10，可以检测到较高敏感性的靶标核酸。

[1338] 4.核酸复合物对10的应用#4-数字PCR

[1339] 4.1数字PCR概述

[1340] 根据本申请的示例性实施方式，核酸复合物对10可以用于数字PCR。通过在每个单位单元(UC)中对经受PCR的单位单元(UC)(例如管)中包含的事先划分为数百至数万个部分的溶液进行一般PCR，数字PCR可具有实现较灵敏和准确诊断的优势。

[1341] 4.2核酸复合物对10在提供引物对中的应用

[1342] 图56是说明了根据本申请的示例性实施方式，当核酸复合物对10用于数字PCR时制备样品的步骤的图。

[1343] 根据本申请的示例性实施方式，形成单位单元(UC)的步骤(S1500)可以以如下方式进行：对包含核酸复合物对10的溶液进行分配，以适于数字PCR。

[1344] 然而，由于包含核酸复合物对10的溶液随后被分配至适于数字PCR的单位单元(UC)中，因此第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可以均匀地分配在每个单元(UC)中。

[1345] 具体而言，与第二核酸复合物120相比，更多的第一核酸复合物110可以分配至第一单位单元(UC)；与第一核酸复合物110相比，更多的第二核酸复合物120可以分配至第二单位单元(UC)；或者第一核酸复合物110和第二核酸复合物120可都不分配至第三单位单元(UC)。此处，样品(例如PCR的引物)已被消耗或不能再利用，但是不能准确地确定靶标核酸的存在或不存在。

[1346] 为了解决该问题，在形成用于数字PCR的单位单元(UC)之前，可以进行对核酸复合物对10进行配对的步骤(S1000)。换言之，对于数字PCR，可以诱导核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间互补结合。

[1347] 在配对步骤(S1000)中，可以通过调节每个管中包含的溶液的温度来诱导核酸复合物对10的第一标签112和第二标签122之间互补结合。配对步骤(S1000)中溶液的温度可以小于40℃。配对步骤(S1000)的详细描述已经在1.1核酸复合物对10用于提供引物对的应用中提供。

[1348] 在具体示例性实施方式中，第一核酸复合物110可以至少包含正向引物和第一配对部分112，第二核酸复合物120可以至少包含反向引物和第二配对部分122。

[1349] 包含核酸复合物对10的溶液可以在形成单位单元(UC)(S1500)之前经受配对步骤(S1000)，所述配对步骤诱导第一标签112和第二配对部分122之间的互补结合。

[1350] 结果，可以防止正向引物或反向引物之一相对于一个单位单元(UC)的比例相对较高的分配。最终，当其中第一标签112和第二标签122互补结合以形成配对的核酸复合物对10被分配至单位单元(UC)时，可以进行使每单位单元(UC)的正向引物和反向引物具有1:1的比率的分配。

[1351] 4.3核酸复合物对10在检测靶标核酸中的应用

[1352] 4.3.1核酸复合物对10的结构

[1353] 用于数字PCR的至少一种核酸复合物对10可以与上述用于一般PCR的至少一种核酸复合物对10类似。换言之，对于数字PCR，可以使用根据本申请中公开的一些示例性实施方式的核酸复合物对10。

[1354] 已经详细描述了根据说明书的一些示例性实施方式的核酸复合物对10的构造、材料、实例和操作。因此，已清楚地表明，关于数字PCR可以使用已经公开的核酸复合物对10，并且将省略重复的描述。

[1355] 另外，当在将核酸复合物对10用于数字PCR和/或其它示例性实施方式时存在改变的构造或操作时，将详细描述在相应的示例性实施方式中改变的构造或操作。

[1356] 4.3.2核酸复合物对10的操作

[1357] 当在数字PCR中使用根据本申请的示例性实施方式的核酸复合物对10确定靶标核酸在单位单元(UC)中的存在时，可以在PCR之前进行使用包含核酸复合物对10的溶液形成单位单元(UC)的步骤(S1500)。

[1358] 图57是说明了根据本申请的示例性实施方式的数字PCR中的单位单元(UC)的一组图。

[1359] 使用包含核酸复合物对10的溶液形成单位单元(UC)的具体方面可根据进行数字PCR的方法是孔型还是液滴型而变化。

[1360] 根据本申请的示例性实施方式，对于数字PCR，单位单元(UC)可以以使得包含核酸复合物对10的溶液分布在具有多个孔的板中的方式形成(参见图57(a))。在包含核酸复合物对10的溶液中，可以进一步包含参与聚合的酶(例如聚合酶)、碱基片段(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、参与PCR的辅酶(例如MgCl2或MgSO4)、用于为PCR提供最佳pH和/或盐浓度的缓冲液中的至少一种。

[1361] 根据本申请的示例性实施方式，可以将包含核酸复合物对10的溶液依次地分配至孔中。在一个实例中，可以以如下方式形成单位单元(UC)：首先将样品分配至孔中，将核酸复合物对10依次分配至孔中，最后将PCR中使用的酶分配至孔中。

[1362] 根据本申请的另一示例性实施方式，可以将包含核酸复合物对10的溶液同时分配到孔中。在一个实例中，可以以如下方式形成单位单元(UC)：将含有样品、核酸复合物对10和用于PCR的酶的混合溶液分配至孔中。

[1363] 将溶液分部至孔的方法可不同。在一个实例中，可通过使用微流体通道的方法将溶液等分配至孔中。在另一实例中，溶液等可以以将溶液铺在孔顶部具有开口形式的板上的方式被分配至孔中。

[1364] 根据本申请的示例性实施方式，对于数字PCR，可以以使包含核酸复合物对10的溶液形成液滴的方式形成单位单元(UC)(参见图57(b))。在包含核酸复合物对10的溶液中，可以进一步包含参与聚合的酶(例如聚合酶)、碱基片段(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、参与PCR的辅酶(例如MgCl2或MgSO4)、用于为PCR提供最佳pH和/或盐浓度的缓冲液中的至少一种。

[1365] 根据本申请的示例性实施方式，通过将包含样品的溶液分配为大小为数十nL至数十pL的液滴中来形成第一液滴，通过将包含核酸复合物对10的溶液分配为大小为数十nL至数十pL的液滴中来形成第二液滴，通过将包含PCR所需酶的溶液分配为大小为数十nL至数十pL的液滴中来形成第三液滴，然后可以通过合并至少第一液滴、第二液滴和第三液滴来形成单位单元(UC)。

[1366] 或者，可以通过将包含核酸复合物对10的第一溶液分配为大小为数十nL至数十pL的液滴中来形成第一液滴，可以通过将包含核酸复合物对10的第二溶液分配为大小为数十nL到数十pL的液滴中来形成第二液滴，因而可以通过合并至少第一液滴和第二液滴来形成单位单元(UC)。

[1367] 或者，可以将包含样品、核酸复合物对10和PCR所需的酶的溶液分配为大小为数十nL至数十pL的液滴中，从而形成单位单元(UC)。

[1368] 对于根据本申请示例性实施方式的使用核酸复合物对10的数字PCR，可以对单位单元(UC)中包含的溶液进行PCR。对于根据本申请示例性实施方式的使用核酸复合物对10的数字PCR，可以对单位单元(UC)中包含的溶液进行热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)。

[1369] 对于根据本申请的示例性实施方式的使用核酸复合物对10的数字PCR，将对于单位单元(UC)中包含的溶液的热变性步骤(S2000)、退火步骤(S3000)和聚合步骤(S4000)的序列设置为一个循环，并且可以重复进行多于一次的循环。

[1370] 对于单位单元(UC)中包含的溶液可以进行稳定步骤(S5000)和获得解离曲线的步骤(S6000)。上述所述的S2000至S6000可以与上述的一般(或实时)PCR中的S2000至S6000相似。

[1371] 图58是说明了根据本申请的示例性实施方式的使用核酸复合物对10的数字PCR中的操作的图。

[1372] 根据本申请的示例性实施方式，可以进行重新排列其中已完成PCR的多个单位单元(UC)的步骤(S5500)。

[1373] 具体而言，在孔型数字PCR中，可以通过调节具有多个孔的板的温度来调节单位单元(UC)中包含的溶液(至少包含样品和核酸复合物对10)的温度。可以通过调节在设置板的区域中实现的热循环仪的温度来调节板的温度。

[1374] 然而，在液滴型数字PCR中，可能难以在当前的数字PCR仪器中进行获得解离曲线的步骤(S6000)，以检测通过微流体通道移动的单位单元(UC)的荧光值。

[1375] 为了解决该问题，在液滴型PCR中，可以以如下的方法进行重新排列单位单元(UC)的步骤(S5500)：使用其中形成微流道(LN)的板，将多个单位单元(UC)均匀地分至微流道(LN)。

[1376] 图59是说明了根据本申请的示例性实施方式的在数字PCR中进行获得解离曲线(S6000)的步骤的方法的一组图。

[1377] 在根据本申请的示例性实施方式的用于获得解离曲线的板中，可以形成多个微流道(LN)(参见图59(a))。可以将多个单位单元(UC)均匀地分至具有多个道(LN)的板的微流道(LN)。根据本申请的示例性实施方式的用于获得解离曲线的板可以具有一个微流道(LN)(参见图59(b))。多个单位单元(UC)可以在具有一个微流道(LN)的板上排列成一列。

[1378] 根据本申请的示例性实施方式的用于获得解离曲线的板可以具有微流道(LN)，所述微流道的尺寸足够大以容纳第一单位单元(UC)的液滴。可以基于第一单位单元(UC)的液滴的半径来确定至少一个微流道(LN)的尺寸。此外，当确定至少一个微流道(LN)的尺寸时，可以认为液滴的半径可根据体积、温度或压力而改变。

[1379] 结果，根据本申请的示例性实施方式，在使用核酸复合物对10的数字PCR中，可以获得每个单位单元(UC)的解离曲线，并且可以基于获得的解离曲线上的信息确定解离峰值。

[1380] 因此，根据本申请中公开的核酸复合物对10和使用该核酸复合物对10的数字PCR中的操作，也可以在数字PCR方法中确定靶标核酸的存在。

[1381] 此外，当将本申请中公开的使用多种核酸复合物对10检测多个靶标核酸的方法应用于数字PCR时，也可以通过数字PCR方法确定单位单元(UC)中多种靶标核酸的存在。

[1382] 换言之，即使使用包含以相同荧光(或相同信号)检测的标记的多种核酸复合物对10，也可以在数字PCR法中确定每个荧光通道中是否存在多种靶标核酸。

[1383]

[1384] 根据本申请的示例性实施方式，PCR仪器2000可以用于对装载的板中的至少一个单位单元(UC)进行PCR。根据本申请的示例性实施方式，通过使用PCR仪器2000，可以获得装载的板上的至少一个单位单元(UC)的根据温度的荧光的图表。根据本申请的示例性实施方式，通过使用PCR仪器2000，可获得装载的板中至少一个单位单元(UC)的荧光根据温度的负变化率/温度的图表，并可以确定解离峰值。根据本申请的示例性实施方式，通过使用PCR仪器2000，可以确定装载的板中至少一个单位单元(UC)的解离峰值，并且可以确定在单位单元(UC)中包含的至少一种靶标核酸的存在。

[1385] 图60是根据本申请的示例性实施方式的PCR仪器2000的框图。

[1386] PCR仪器2000可以包含通信部2100、温度调节部2200、传感器2300、存储器2400和控制部2500。

[1387] 通信部2100可以用于使PCR仪器2000能够与外部设备发送/接收必要的数据。

[1388] 通信部2100可以执行无线通信。通信部2100可以通过Wifi、蓝牙、ZigBee、WiGig、RFID、射频识别、红外数据协会(IrDA)、超宽带(UWB)和WiHD中的至少一种无线通信方法来发送/接收数据。

[1389] 通信部2100可以包含有线通信模块。例如，通信部2100可以通过USB方法、串行方法和并行方法中的至少一种通信方法来发送/接收数据。

[1390] 温度调节部2200可以用于调节装载在PCR仪器2000中的PCR板的温度。

[1391] 根据本申请的示例性实施方式，温度调节部2200可以包含加热剂和/或冷却剂。在具体实例中，温度调节部2200可以包含能够进行加热和冷却二者的热电元件。

[1392] 传感器2300可以用于检测装载在PCR仪器2000中的PCR板的至少一个单位单元(UC)的荧光。根据本申请的示例性实施方式，传感器2300可以包含转换光的波长段的滤光器和当具有特定波长的光入射时检测发出的光的特性的光检测器。

[1393] 或者，传感器2300可以用于检测全波长光学特性，并在每个对应的波长段输出光学特性。

[1394] 根据本申请的示例性实施方式的光学仪器可以是包含传感器2300的PCR仪器2000。

[1395] 存储器2400可存储PCR仪器2000所需的各种数据。

[1396] 存储器可以包括闪存类型、硬盘类型、多媒体卡微型类型和卡类型存储器(例如，SD或XD存储器等)，随机存取存储器(RAM)，静态随机存取存储器(SRAM)，只读存储器(ROM)，电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)，可编程只读存储器(PROM)，磁存储器，磁盘和光盘中的至少一种类型的存储介质。

[1397] 控制部2500可以控制PCR仪器2000的整体操作。控制部2500可以进行各种信息的计算和处理，并且控制PCR仪器2000的组件的操作。

[1398] 根据硬件、软件或它们的组合，可以将控制部2500实现为计算机或其类似设备。在一个实例中，控制部2400可以以如下方式提供：将通过处理电信号来发挥控制功能的电子电路(如CPU芯片)作为硬件的形式，以及将驱动硬件控制部的程序作为软件的形式。

[1399] 图61是说明了根据本申请的示例性实施方式的PCR仪器2000的操作(S7000)的流程图。

[1400] PCR仪器2000可以经受装载板的步骤(S7100)、接收温度数据的步骤(S7200)、控温步骤(S7300)、检测荧光值的步骤(S7400)和分析检测值的步骤(S7500)。可以省略或重复上述各个步骤，并且可以进行其它额外的操作。

[1401] 装载板的步骤(S7100)可以以如下方式进行：将提供至PCR仪器2000的板装载部的PCR板引入PCR仪器2000中的反应区域。

[1402] 根据本申请的示例性实施方式，当将板装载到PCR仪器2000中时，板和温度调节部2200可以彼此物理接触，并且PCR仪器2000可以调节板的反应环境。

[1403] 接收温度数据的步骤(S7200)可以以如下方式进行：输入关于热变性温度、退火温度、聚合温度、稳定步骤中的温度和获得解离曲线的步骤中的温度的至少一条数据。

[1404] 根据本申请的示例性实施方式，PCR仪器2000可以接收每个步骤的温度和温度保持时间的数据以进行PCR。PCR仪器2000可以使用在PCR仪器2000外部形成的输入界面来接收用每个步骤的温度和温度保持时间的数据以进行PCR。或者，可以使用PCR仪器2000的通信部2100来输入每个步骤的温度和温度保持时间的数据以进行PCR。

[1405] 根据本申请的另一示例性实施方式，PCR仪器2000可以在存储器2400存储每个步骤中的温度和温度保持时间的数据以进行PCR。

[1406] PCR仪器2000的温度调节部2200可以控制装载的板的至少一个单位单元(UC)的温度。当通过控制温度进行PCR时，PCR仪器2000可以检测荧光值(S7400)。在检测荧光值的步骤中，为了根据温度获得装载的板的至少一个单位单元(UC)的荧光值，可以同时调节至少一个单位单元(UC)的温度。

[1407] 根据本申请的示例性实施方式，PCR仪器2000的控制部2500可以分析在S7400中获得的检测值。PCR仪器2000的控制部2500可以根据在S7400中获得的温度来分析荧光值。

[1408] 分析检测值的步骤(S7500)可以包括将根据温度的荧光的图表转换为荧光根据温度的负变化率/温度的图表的步骤。分析检测值的步骤(S7500)可以包括在经转换的荧光根据温度的负变化率/温度的图表上确定解离峰值的步骤。分析检测值的步骤(S7500)可以包括输出对应于解离峰值的靶标核酸的步骤，所述解离峰值在经转换的荧光根据温度的负变化率/温度的图表上确认。

[1409] 如上所述，已经参考根据本申请的示例性实施方式对根据本申请的构造和特征进行了描述。然而，本申请不限于此，并且对于本领域普通技术人员显而易见的是，在本申请的精神和范围内可以容易地将实施方式改变以及修改为各种形式，因此，这些改变或修改包括在所附权利要求中。

[1410] 序列表自由文本

[1411] SEQ ID NO:1为人工序列。

[1412] SEQ ID NO:2为淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的引物序列。

[1413] SEQ ID NO:3为人工序列。

[1414] SEQ ID NO:4为淋病奈瑟氏菌的引物序列。

[1415] SEQ ID NO:5为人工序列。

[1416] SEQ ID NO:6为沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的引物序列。

[1417] SEQ ID NO:7为人工序列。

[1418] SEQ ID NO:8沙眼衣原体的引物序列。

[1419] SEQ ID NO:9为人工序列。

[1420] SEQ ID NO:10为人型支原体(Mycoplasma hominis)的引物序列。

[1421] SEQ ID NO:11为人工序列。

[1422] SEQ ID NO:12为人型支原体的引物序列。

[1423] SEQ ID NO:13为人工序列。

[1424] SEQ ID NO:14为人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型的引物序列。

[1425] SEQ ID NO:15为人工序列。

[1426] SEQ ID NO:16为人乳头瘤病毒16型的引物序列。

[1427] SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:26为人工序列。

[1428] SEQ ID NO:27为人型支原体的引物序列。

[1429] SEQ ID NO:28为人型支原体的引物序列。