一种生物化学芯片微球进入的方法

摘要

本发明公开了一种生物化学芯片微球进入的方法，利用起泡剂产生的气泡，规范已经进入生物化学芯片的微球的范围。其步骤主要包括取生物化学芯片，进入微球溶液，然后通过化学连接或者物理方式将微球固定在生物化学芯片的内表面；再通入有气泡的起泡剂溶液，使用气泡将靠近内表面的微球清除，保留生物化学芯片内表面上的预先加工好的微结构内部的微球。

权利要求

1.一种生物化学芯片微球进入的方法，其特征在于包括，将混有微球的溶液通入到生物化学芯片中；

密封生物化学芯片的入口和/或出口，使得混有微球的溶液保持在生物化学芯片的流体室中；

微球固定到生物化学芯片的内表面和/或内表面预先加工的微结构区域中；

起泡剂产生气泡，并将含有气泡的起泡剂通入生物化学芯片；

利用含有气泡的起泡剂限定微球的区域。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预先加工的微结构是阵列排布的微坑。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微球的表面有预先修饰的化学基团，并且通过芯片内表面预先修饰的化学基团连接到芯片的内表面。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述预先加工的微结构是阵列排布的微坑；芯片的内表面有预先修饰的化合物；微球的表面有预先修饰的化学基团；微球表面的化学基团同芯片内表面的化合物发生反应，连接在一起。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微球布满芯片的内表面，通过气泡的表面张力，将部分微结构区域的微球排出芯片，并且保留另外部分微结构区域的微球。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述起泡剂为表面活性剂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微球通入芯片以后，通过离心使得微球附着在芯片的内表面上。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物化学芯片具备流体入口、流体出口、内部流体室。

9.一种生物化学芯片中微球进入的方法，其特征在于包括，将混有微球的溶液通入到生物化学芯片中；

密封生物化学芯片的入口和/或出口，使得混有微球的溶液保持在生物化学芯片的流体室中；

微球固定到生物化学芯片的内表面和/或内表面预先加工的微结构区域中；

起泡剂产生气泡，并将含有气泡的起泡剂通入生物化学芯片；

利用含有气泡的起泡剂限定微球的区域；

再次固定微球。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述的固定指的是通过氢键、离子键、共价键中的至少一种连接到芯片的内表面或者微结构的内表面。

说明书

一种生物化学芯片微球进入的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物化学芯片微球进入的方法，属于生物化学领域。

背景技术

[0002] 生物化学芯片是常见的生物化学领域的实用工具。密封的生物化学芯片中，微结构加工属于常见的技术；例如常见的基因芯片等。在微结构中进入(loading)微球可以引入
微球的反应区域。芯片的微结构中进入微球属于符合一般泊松分布的过程。在这这个过程
中，微球随机进入预先加工好的微结构中，并不易人工的控制，因此微球的进入效率是有上
限的。微球进入微结构的效率符合泊松分布。因此，常规的微球进入方法存在多种缺点，例
如微球进入效率不高，微球不能准确进入微结构的内部。本发明公开一种利用气泡限定微
球区域的过程，通过气泡使得靠近或者在芯片内表面上的微球清除出芯片，并且保留微结
构内部的微球。

发明内容

[0003] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

[0004] 本发明提供一种生物化学芯片微球进入的方法，其特征在于包括，

[0005] 将混有微球的溶液通入到生物化学芯片中；

[0006] 密封生物化学芯片的入口和/或出口，使得混有微球的溶液保持在生物化学芯片的流体室中；

[0007] 微球固定到生物化学芯片的内表面和/或内表面预先加工的微结构区域中；

[0008] 起泡剂产生气泡，并将含有气泡的起泡剂通入生物化学芯片；

[0009] 利用含有气泡的起泡剂限定微球的区域。

[0010] 根据优选的实施方式，所述预先加工的微结构是阵列排布的微坑。

[0011] 根据优选的实施方式，所述微球的表面有预先修饰的化学基团，并且通过芯片内表面预先修饰的化学基团连接到芯片的内表面。

[0012] 根据优选的实施方式，所述预先加工的微结构是阵列排布的微坑；芯片的内表面有预先修饰的化合物；微球的表面有预先修饰的化学基团；微球表面的化学基团同芯片内
表面的化合物发生反应，连接在一起。

[0013] 根据优选的实施方案，所述的气泡限定微球的区域指的是将部分区域的微球清除。

[0014] 根据优选的实施方式，微球布满芯片的内表面，通过气泡的表面张力，将部分微结构区域的微球排出芯片，并且保留另外部分微结构区域的微球。

[0015] 通过优选的实施方式，所述起泡剂为表面活性剂。

[0016] 根据优选的实施方式，所述微球通入芯片以后，通过离心使得微球附着在芯片的内表面上。

[0017] 根据优选的实施方式，所述生物化学芯片具备流体入口、流体出口、内部流体室。

[0018] 本发明公开一种生物化学芯片中微球进入的方法，其特征在于包括，

[0019] 将混有微球的溶液通入到生物化学芯片中；

[0020] 密封生物化学芯片的入口和/或出口，使得混有微球的溶液保持在生物化学芯片的流体室中；

[0021] 微球固定到生物化学芯片的内表面和/或内表面预先加工的微结构区域中；

[0022] 起泡剂产生气泡，并将含有气泡的起泡剂通入生物化学芯片；

[0023] 利用含有气泡的起泡剂限定微球的区域；

[0024] 再次固定微球。

[0025] 根据优选的实施方式，所述的固定指的是通过氢键、离子键、共价键中的至少一种连接到芯片的内表面或者微结构的内表面。

附图说明

[0026] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明
的限制。在附图中：

[0027] 图1.微球进入芯片示意图；

[0028] 图2.气泡溶液溶液通过以后示意图；

[0029] 图3.芯片内表面微坑的电镜扫描图；

[0030] 图4.微球通入芯片荧光质检；

[0031] 图5.比例设定2:1后进入芯片的图片；

[0032] 图6.用大倍率显微镜观察的微球状况图片；

[0033] 图7.气泡处理以后的微球在芯片上的状态图；

[0034] 图8.油封实验结果图片。

具体实施方式

[0035] 下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然描述了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式
所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范
围完整的传达给本领域的技术人员。

[0036] 根据本发明的实施方式，提出一种生物化学芯片微球进入的方法，其特征在于包括，

[0037] 将混有微球的溶液通入到生物化学芯片中；

[0038] 密封生物化学芯片的入口和/或出口，使得混有微球的溶液保持在生物化学芯片的流体室中；

[0039] 微球固定到生物化学芯片的内表面和/或内表面预先加工的微结构区域中；

[0040] 起泡剂产生气泡，并将含有气泡的起泡剂通入生物化学芯片；

[0041] 利用含有气泡的起泡剂限定微球的区域；

[0042] 其中，所述微球可以进入到微结构的内部。

[0043] 生物化学芯片是常见的生物化学中所涉及的流体功能芯片。常见的，生物化学芯片是由玻璃、硅片等制备的，具有多层结构的，内部有流体通入的空间。生物化学芯片有时
候也被称为微流体芯片或者微流控芯片。一般性的生物化学芯片，例如CN2017208542125，
CN2017208542017，CN2017105741742，CN2017105741441，可以由三层芯片结构组成，有预先
加工的出入口，内部有流体空间。所引用的部分专利，作为本发明所述芯片的一般性描述，
可以将其内容以引用的方式加入本发明。

[0044] 本发明所述的生物化学芯片指的是内表面具有预先加工的结构的芯片。一般的，当材质不同的时候可以使用不同的加工方法。微加工是常见的加工方法，使用曝光等手段，
在芯片的一个或者多个内表面形成特定的微结构。微结构的加工属于常规的知识。在芯片
的一个内表面上通过加工形成微结构属于常见的技术。常规的微流芯片，基因测序芯片都
利用了该技术。特殊的，所述微结构可以是阵列排布；特殊的所述微结构可以是微坑；特殊
的所述微结构是阵列排布的微坑；特殊的所述微结构是微流控通道。特殊的所述微结构的
尺寸为0.1‑100微米；优选的0.2‑50微米；更优选的0.3‑30微米；更优选的0.5‑5微米。所述
尺寸指的是微结构与内表面形成的开口图形中任意一个尺寸。

[0045] 一般的，本发明所述的微球(beads)指的是圆形或者类似圆形，或者非尖锐的多面体。Beads一词常见于各类科研或者实验中。一般指的是具有微米尺寸的类似球状物。

[0046] 一般的，本发明所述的微球的尺寸为0.05‑10微米，优选的0.1‑8微米，更优选的0.3‑5微米；更优选的0.5‑3微米。

[0047] 一般的，本发明所述的微球是水凝胶微球，聚苯乙烯微球，玻璃微球等。

[0048] 一般的本发明所述的微球是透明的或者不透明的微球。

[0049] 一般的，本发明所述的生物化学芯片的内部高度为10‑200微米，优选15‑100微米，更优选30‑80微米，或者其中任意两个数值组成的区间。

[0050] 一般的，本发明所述的生物化学芯片是基因测序芯片。

[0051] 一般的，预先的生物化学芯片的内表面进行化学修饰。可以多步骤化学修饰，可以理解的，首先进行疏水化学修饰，然后将于微球表面化合物匹配的相应修饰物修饰到内表
面。

[0052] 常见的，微球上面连接一种化学基团，芯片的表面连接另外一种化学基团，两种化学基团在加热或者光照等条件下，可以连接在一起。可以想到的利用氢键连接或者通过共
价键连接等方式。这属于微球的固定过程。

[0053] 一般的，当生物化学芯片的表面可以有阵列排布的微坑。生物化学芯片可以看做是有两块基板加上中间的空间组成的。微坑可以区分为内表面和外表面。所述内表面指的
是微坑加工以后，深入微坑所在基板的部分。所述外表面是微坑加工以后，所在基板的表
面。使用的微球的尺寸小于微坑的直径以及深度，那么微球可以进入到微坑的内表面。

[0054] 一般的，当生物化学芯片的至少一个内表面有阵列排布的微坑的时候，微球进入以后，会同时分布在微坑的内表面与外表面。一般的离心或者其它物理方式都不足以使得
微球限定在微坑的内部。

[0055] 特殊的，也可以仅在微坑的内部修饰与微球相匹配的化学基团，可以使得微球只同微坑内部的化学基团发生反应，然后在用流体冲洗外表面的微球，可以使得微球局限在
微坑的内部。但是这种方法工艺比较复杂，失败率也比较高。

[0056] 另外的，使用气泡去除内表面比较大的区域的微球的时候，由于气泡相对比较大，可以是几十微米或者几百微米，甚至几个毫米的大小；一般远比微结构的尺寸大的多，所以
并不会进行微结构的内部。这种擦除(polish)表面微球的方法可以将比较大的表面的微球
全部清除掉。一般的，微球表面即使同芯片的内表面进行了化学连接，其化学键并不会很
多，或者说连接并不会很结实，在微球的表面张力的作用下，都可以被擦除下来。这种方式
只需要多清洗几次，可以比较容易的将部分结构内的微球清除掉。

[0057] 特殊的，生物化学芯片是基因测序芯片。芯片的内表面有阵列排布的，2‑5微米直径的微坑，微坑的深度也在2‑5微米。使用1微米的微球，然后可以通过离心等方式，使得微
球进入微坑的内部。同时，微球也会在微坑的外表面有大量的残留。然后通过起泡剂产生大
量的气泡，再通入芯片中去，可以发现，外表面残留的大量微球都会被清除掉。

[0058] 本发明中，微坑作为微结构的典型代表。微结构并不局限于微坑。容易获得的，例如长条状的微结构，曲线构成的微结构，或者其它复杂结构的微结构都可以获得类似的效
果。

[0059] 本发明中，微结构或者微坑的作用在于容纳微球。气泡形成的过程中，其直径越小可以计算的表面张力越大，因此，形成十分微小的气泡是不易的。本发明中所述的气泡是大
量的气泡。单一的气泡并不容易达到效果。所述的大量并不需要计算，只需要在制作气泡的
过程中，利用反复的吹打、搅拌等手段，形成尽可能多的气泡即可。气泡形成过程中，随着气
泡增多，必然会形成很多比较小的直径的气泡，实验观察到的，例如1mm直径左右的气泡。实
验观察到的，直径小的气泡，例如1mm左右的气泡，比更大的气泡对于表面的微球有这更多
的作用。

[0060] 本发明所述的微结构指的是具有微米尺度的结构。由在芯片的内表面凹凸结构形成。

[0061] 本发明所述的微结构指的是微结构的三维尺寸中的一个剖面中，长、宽、高中至少有一个尺寸小于100微米，更优选小于50微米，更优选小于30微米。所述的剖面指的是垂直
于芯片的表面的剖面。例如当微结构指的是圆柱形微坑的时候，底面直径满足上述尺寸要
求。例如当微结构是长条形微坑的时候，最小方向的剖面中，长度、宽度都需要满足上述的
尺寸要求。

[0062] 微球进入微结构以后，由于气泡表面张力的存在，一般比微结构尺寸大，因此会阻挡气泡进入微结构的内部，从而形成保护。利用这种简单性质，可以使得微结构外表面的微
球被流体带走，但是并不会带走微结构内部的微球。

[0063] 重要的，实验发现，气泡的边缘在推微球的过程中，会形成微球的密集区。气泡在推开微球的过程中，微球可以更进一步的填充到微结构中去。根据需要再次固定微球或者
不需要再次固定。发现的，微结构中的微球会进一步增多。这种情况下，微球的进入概率大
于了泊松分布。Poisson分布，是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布。一般的在微
球进入阵列的大量微坑的时候，是需要符合泊松分布的。然而气泡的作用使得微球的分布
超过了泊松分布的概率。这种情况属于外力的作用的结果。

[0064] 根据优选的技术方案，在气泡进入的过程中，微球更进步一进入到微坑中。

[0065] 根据优选的技术方案，在气泡进入以后，进一步对微球进行固定。

[0066] 本发明所述的生物化学芯片的内表面含有阵列排布的微坑。微坑的数量为104‑11 5 10
10 个；优选10‑10 个。

[0067] 本发明所述的限定微球的区域指的是，通过气泡将芯片内表面的微球清除或者擦除；并将芯片内表面上的凹陷结构内的微球保留。

[0068] 本发明所述的内表面的凹陷结构指的是在内表面所在基板上，通过预先加工形成的凸凹不平的结构。

[0069] 一般的，芯片的内表面可以不进行化学修饰，当使用离心等常规方法的时候，可以将微球靠近内表面，并且进入预先加工的结构的内部。当使用气泡驱赶或者擦除微球的时
候，内表面上的微球会被清除；由于气泡不能进入结构的内部，保留内部的微球。

[0070] 芯片的材质并不是关键，可以利用任何适合的材料，例如石英、普通玻璃、蓝宝石玻璃、硅片、金属片等。

[0071] 芯片的内部有密封的流体通过的区域，可以称为流体室。流体室一般的高度就是生物化学芯片的内部高度。芯片的出入口以及流体室属于生物化学芯片的常见结构。

[0072] 起泡剂的关键在于产生大量的较小的气泡。多种形式的起泡剂可以选择，例如离子型表面活性剂(包括阳离子表面活性剂与阴离子表面活性剂)、非离子型表面活性剂、两
性表面活性剂、复配表面活性剂。常见的SDS(十二烷基磺酸钠(Sodium 
laurylsulfonate))，吐温20，triton等。

[0073] 产生大量气泡的方法并不限制，人工的搅拌、扰动，机械的气体介入式，搅拌式等都是可以的。只需要产生大量的气泡即可。本发明中大量指的是难以计数的意思。当气泡形
成的过程中，不断的旧的气泡破碎，并且有新的气泡形成。气泡的大小也分布广泛。可以实
验的，当利用移液枪在离心管中反复吹打液体的时候，可以形成大量的气泡。可以试验的，
当一个密封的瓶子中，有起泡剂以及空气的时候，剧烈摇动瓶子可以产生大量的气泡。

[0074] 优选的，本发明所述的微结构是阵列的微结构。例如阵列排布的微坑，阵列排布的条状微管路，例如环装的管路。所述的微结构是在芯片的一个或者两个内表面上制备的。

[0075] 气泡的方法是具有一定的限制的。可以解释的，气泡并不能把任意区域的微球清除。气泡可以将“裸露”的微球清除。所述的裸露指的是气泡经过的时候，气泡接触到的微
球。气泡不能将任意内表面清除，并同时保持另外的任意表面。气泡的清除作用最多与气泡
流经芯片的区域有关。也就是说，符合简单的非牛顿流体理论。示意性的图片参见图1和图2
所示。当微球进入芯片的时候，微球可能处于微坑的内部或者外面。当使用气泡溶液进入芯
片的时候，附图2，气泡可以清除微坑外部的微球。

[0076] 气泡的方法将微球固定在预先加工好的微结构中的方法具备很多的优点(1)芯片并不需要提前的亲疏水修饰。例如首先在微坑的外部修饰不与微球反应的化学基团，然后
在微坑的内部修饰与微坑反应的化学基团，使得微球只能固定在微坑的内部。气泡的方法
更加简单。(2)超过了常规的泊松分布。这种结果是电磁场或者其它方法难以做到的。(3)充
分利用了芯片的结构特点与气泡结构特点的结合。气泡在芯片中的时候，处于更加扁平的
状态，在这种状态下，气泡边缘的表面张力更大，导致可以推开即使进行了与表面之间化学
连接的微球。未作区分修饰的芯片上，通过水凝胶等微球达成亲疏水巨大差别，并且用
foaming的方法达成超泊松进入率，且微球全部进微坑，没有坑外残留，保持seal之后微坑
间独立分开，不串扰，很大程度的提高了芯片的通量。

[0077] 本发明中所涉及的词语除特殊说明外，均属于本领域的常见词语。、

[0078] 本发明中所涉及的词语“可以”“大量”等都属于常规的用语。常规的含义，例如微球可以进入微结构指的是微球进入微结构，符合一般的物理化学常识；例如大量的气泡指
的是不易计算的数量，并不是1个或者2个等明显可见的数量，指的是肉眼或者仪器并不易
计算清楚的数量，可以理解的大于1000个每立方厘米，可以理解的大于10000个每立方厘
米。

[0079] 实施例1

[0080] 第一部分：芯片的疏水修饰

[0081] 1.微坑原材料的确认

[0082] 将微坑芯片用扫描电镜表征，得到结果如图3所示。每个微坑的直径是3微米，微坑的深度(高度)为3微米,间隔1.5微米。

[0083] 2)(3‑巯基丙基)三甲氧基硅烷修饰

[0084] 在通风橱内吸取20ul巯基硅烷溶液至2ml的玻璃小瓶内，放在巯基加热干燥箱的中抽真空压力到100Pa；芯片预先放置在干燥箱中。150摄氏度处理30min。

[0085] 第二部分：芯片的封装

[0086] 用打孔的玻璃底板用双面胶与微坑芯片封装出流道。芯片结构参见专利CN201710574174.2。所述专利内容可以在必要的时候以引用的方式加入本专利。

[0087] 第三部分：微球进入率达到超泊松

[0088] 将带有biotin基团的水凝胶微球作为亲水物质，加入到流道中。

[0089] 石英面的坑个数约1.6x1010个，流道体积为500ul。按照微球个数比微坑个数1：1比例进行反应时每张芯片加入300ul带有微球的反应液。1000g离心10min，后用1ml纯水把微
球反应液冲走。

[0090] 微球进入结果用荧光探针进行质检。反应结束后，用1ml纯水将荧光探针冲走，用荧光显微镜拍照看结果，质检结果如图4所示。需要说明的是，这个时候，并不能区分微坑内
部的微球以及表面的微球。结果可以看到，有很多微球进入芯片中。

[0091] 微球个数与坑面个数为1：1时，进入率约在50％‑60％，符合泊松分布的预期。

[0092] 将微球个数与坑面个数设为1.5：1时，进入率约在65％‑70％，增加为2：1时，进入率约80％，之后的3：1，4：1均没有增加过多的进入率。

[0093] 将进入率设为2：1，微球终浓度为2.67M/ul，进行进入微球的流程，同1：1进入流程，结果如图5所示：

[0094] 从结果可以看到，2：1进入时，会有部份微球粘合在一起，并明显挂在坑外，会使一个坑和另一个坑中微球联合，用更大倍率的显微镜观察，则如图6所示。

[0095] 有多个坑联合在一起，每一个坑是一个独立的反应体系，没法达到。需要进行说明的是，通过经验证实，图片5中明显连成片的微球，其必然有部分微球会处于微坑外面。这个
同图片3的结果相互印证。

[0096] 需进一步验证解决多个微球联合在一起的问题。我们使用了气泡辅助微球进入的方法。

[0097] 第四部分：气泡溶液的配制

[0098] 在15ml离心管中加入50ml纯水中加入2ml 25％sds，用力摇晃，形成大量密集的小泡，之后用1ml移液枪在液体与气泡交界处的上方2‑3mm处，沿着15ml离心管内壁，快速吹吸
20‑30下，形成更密集的小泡，吸出密集的小泡1ml，加入芯片内，后用纯水将小泡冲走。

[0099] 以上述的方法，将进入过程中，坑外的微球带走，使得进入结果更好。本实验所使用的芯片为图5中所述的芯片。在通入气泡之前，微球成片出现。通过上述气泡后得进入结
果如图7所示。

[0100] 快速、密集的小泡冲洗芯片，小泡的冲力可带走坑外联合在一起的微球。使进入结果较好。

[0101] 验证是否微球分散在微坑中：

[0102] 如果微坑外面出现微球，那么必然导致油封的时候，部分微坑中液体连成片。也就是说，会导致油封失败。油封的方式在之前的专利中也有说明，例如CN2017211569462，或者
CN2017209299516，或者CN201710630287X，或者201910601480.X，必要的时候，上述专利中
部分内容可以以应用的方式加入本专利。

[0103] 进入后seal test结果如下：芯片无残水，每个微坑都是独立的反应体系。需要说明的是，进行油封实验的芯片需要预先在芯片的内表面进行三甲基氯硅烷整体处理。然后
在进行修饰其它连接。油封实验结果图片参见附图8。可以看到，油封以后的芯片，并没有连
成片状的区域，这证明了微球已经分布到微坑中了。

[0104] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，
都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范
围为准。