基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法

摘要

本发明涉及一种基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，先利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，再将内皮细胞接种至通道中培养一段时间后，对特定部位补充注射生长因子溶液后继续培养一段时间，得到特定生长的仿生毛细血管网，其中，三维立体通道为人体动脉或静脉血管网络状结构，由多个圆柱状通道组成，相邻两个圆柱状通道的中心距小于等于5mm，水凝胶为可被内皮细胞及其分化出的细胞侵入的水凝胶。本发明的一种基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，简单易行，成本低廉，具有环境普适性，可以根据需要实现对特定部位血管支路疏密程度的有效控制。

权利要求

1.基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征是：先利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，再将内皮细胞接种至通道中培养一段时间后，对特定部位补充注射生长因子溶液后继续培养一段时间，得到特定生长的仿生毛细血管网，其中，三维立体通道为人体动脉或静脉血管网络状结构，由多个圆柱状通道组成，相邻两个圆柱状通道的中心距小于等于5mm，水凝胶为可被内皮细胞及其分化出的细胞侵入的水凝胶。

2.根据权利要求1所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，水凝胶为丝素水凝胶。

3.根据权利要求2所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，内含三维立体通道和生长因子的水凝胶的制备步骤如下：(1)利用3D打印技术构建由多个圆柱体组成的人体动脉或静脉血管网络模型，圆柱体的材质为明胶、海藻酸钠或壳聚糖；

(2)将模型置于注模容器中；

(3)向注模容器中注入丝素蛋白、生长因子、催化剂和交联剂的混合溶液，丝素蛋白、生长因子、催化剂和交联剂的混合溶液由含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与生长因子溶液混合而成，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液由丝素蛋白溶液、催化剂和交联剂混合而成；

(4)固化；

(5)去除圆柱体，并用水冲洗通道。

4.根据权利要求3所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，圆柱体的直径为0.05～0.8mm；

人体动脉或静脉血管网络模型的构建过程为：首先将明胶、海藻酸钠或壳聚糖溶解配制成浓度为10～20％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构建好的模型进行线形逐层打印，最后对打印得到的产物进行冻干处理，其中，构建好的模型为圆柱体模型，冻干处理后将打印得到的3D圆柱体进行组装即得到人体动脉或静脉血管网络模型，或者构建好的模型为三维立体血管网模型，冻干处理后即得到人体动脉或静脉血管网络模型。

5.根据权利要求4所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，打印参数为：注射压力1.0～2.0bar，打印速度3.0～5.2mm/s，打印喷嘴直径0.26～

0.8mm。

6.根据权利要求3所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，注模容器的内表面涂有脱模剂，注模容器的材质为PDMS或PMMA。

7.根据权利要求3所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，丝素蛋白溶液的制备过程为：在温度为27～40℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为

9.0～9.3M的溴化锂溶液中溶解1～3h后在水中透析除盐并浓缩。

8.根据权利要求3所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，丝素蛋白溶液的浓度为5～15wt％，向注模容器中注入的生长因子溶液的浓度为50～100ng/ml，丝素蛋白溶液与向注模容器中注入的生长因子溶液的体积比为1～5:1。

9.根据权利要求1所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，接种过程为：将浓度为50～150cells/ml的内皮细胞分散液灌注到通道中，震荡5～

20min；培养一段时间是指培养7～14d；补充注射的生长因子溶液的浓度为50～100ng/ml，注射量为水凝胶体积的10～50％；继续培养一段时间是指培养7～14d。

10.根据权利要求1所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其特征在于，生长因子为VEGF、MCP‑1、bFGF、S1P和PMA中的一种以上，或者为HGF与VEGF、MCP‑1、bFGF、S1P和PMA中的一种以上的组合。

说明书

基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法

技术领域

[0001] 本发明属于水凝胶微流体血管网络技术领域，涉及一种基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法。

背景技术

[0002] 微流体目前已经实现了精确的流体操作和极小体积控制，以应对高通量生物分子分析、疾病诊断和综合细胞研究领域的挑战。以往的微流体系统以聚二甲基硅氧烷(PDMS)
作为细胞间融合、交融的媒介，由于其光学透明性、低毒性、生物惰性，使其在微流体凝胶系
统中得到广泛的生物和化学应用。但是，PDMS微流体装置存在如下缺点：

[0003] (1)PDMS微流体装置由有机硅预聚物制成，在其制备过程中受高温加工影响使得具有生物功能的组件失效；

[0004] (2)PDMS不支持细胞直接表面附着，需要进行物理和化学手段修饰，如利用细胞外基质(EMC，纤维连接蛋白、胶原蛋白等)将PDMS包被后再让细胞附着在其表面；

[0005] (3)PDMS微流体水凝胶装置通常不能进行含水试剂或细胞渗透的实验，且质量传递和功能化仅限于微通道的表面；

[0006] (4)PDMS在生物体内不可降解，因此在临床试验中PDMS不能做到与生物体相融合。

[0007] 现如今，更多的生物相关的天然水凝胶材料已用于微流体制造。然而，现有的3D微流体网络水凝胶采取多层组装，导致水凝胶内部网络单一，制造过程复杂，还不具备环境普
适性，且最终的水凝胶还存有尺寸变化的现象，同时制备得到的微流体血管网络只含有通
道主干，无血管支干，进而无法形象地模拟生物体内血液流动；此外，当前多层组装的水凝
胶微流体的相邻层之间的强度及整体水凝胶的刚度也亟待解决。

[0008] 此外，目前制备的水凝胶微流体血管网络中的毛细管是以一种自由生长的方式成型，无法人为的控制其生长疏密程度和生长方向。

[0009] 因此，研究一种网络管路形态多样、机械强度优异的水凝胶微流体血管网络的简单且能人为控制其生长的制备方法，具有十分重要的意义。

发明内容

[0010] 本发明的目的是解决现有技术中水凝胶微流体血管网络制造过程复杂、不能人为控制其生长以及制得的微流体血管网络组成简单、机械强度差的问题，提供一种基于3D打
印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法。

[0011] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0012] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，先利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，再将内皮细胞(具体为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或
人微血管内皮细胞(HMVEC))接种至通道中培养一段时间后，对特定部位补充注射生长因子
溶液后继续培养一段时间，得到特定生长的仿生毛细血管网，其中，三维立体通道为人体动
脉或静脉血管网络状结构，由多个圆柱状通道组成，相邻两个圆柱状通道的中心距小于等
于5mm(具体为0.3～5mm)，水凝胶为可被内皮细胞及其分化出的细胞侵入的水凝胶。相邻两
个圆柱通道的中心距是受生长因子浓度的影响，当两个相邻的圆柱通道过近，会导致中间
水凝胶厚度很薄，在给与较高压力促使血液在微流体水凝胶中流动，存在血管破裂的潜在
因素；当两个相邻的圆柱通道过远，会造成血管支路生长天数增长，在同样的细胞培养天数
下，增加通道距离，会使血管间可能并不互通，血管周围仅长有无数的毛细血管。

[0013] 正常情况下，丝素蛋白溶液中含有一定浓度的生长因子，但其是均匀分散在丝素蛋白溶液中的，这使得血管生长出的支路疏密程度是一致的，而本发明在特定位置补注生
长因子可以改变血管的疏密程度，以达到特定部位血管支路多、特定部位血管支路少的目
的。

[0014] 作为优选的技术方案：

[0015] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，水凝胶为丝素水凝胶，本发明水凝胶的种类包括但不仅限于此，其他种类的生物质水凝胶也在本发明的
保护范围。

[0016] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，内含三维立体通道和生长因子的水凝胶的制备步骤如下：

[0017] (1)利用3D打印技术构建由多个圆柱体组成的人体动脉或静脉血管网络模型，圆柱体的材质为明胶、海藻酸钠或壳聚糖；

[0018] (2)将模型置于注模容器中；

[0019] (3)向注模容器中注入丝素蛋白、生长因子、催化剂和交联剂的混合溶液(催化剂和交联剂为辣根过氧化物酶(HRP)与H2O2，或者为钌催化剂与过硫酸铵)，丝素蛋白、生长因
子、催化剂和交联剂的混合溶液由含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与生长因子溶液混
合而成，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液由丝素蛋白溶液、催化剂和交联剂混合而成；

[0020] (4)固化；

[0021] (5)去除圆柱体，并用水冲洗通道，圆柱体的材质为明胶时，采用加热至30℃以上后倾倒的方式去除，明胶的熔点约在30℃左右，加热后可熔化；圆柱体的材质为壳聚糖时，
采用浓度为2～5wt％的冰乙酸溶液溶解的方式去除；圆柱体的材质为海藻酸钠时，采用浓
度为2～5wt％的碳酸钠溶液溶解的方式去除。

[0022] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，圆柱体的直径为0.05～0.8mm；

[0023] 人体动脉或静脉血管网络模型的构建过程为：

[0024] 首先将明胶、海藻酸钠或壳聚糖溶解配制成浓度为10～20％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构建好的模型进行线形逐层
打印，最后对打印得到的产物进行冻干处理(打印产物类似于果冻，如过没有经过冻干处
理，在后续浇注过程中容易变形)，其中，构建好的模型为圆柱体模型，冻干处理后将打印得
到的3D圆柱体进行组装即得到人体动脉或静脉血管网络模型，或者构建好的模型为三维立
体血管网模型，冻干处理后即得到人体动脉或静脉血管网络模型。

[0025] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，打印参数为：注射压力1.0～2.0bar，打印速度3.0～5.2mm/s，打印喷嘴直径0.26～0.8mm。

[0026] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，注模容器的内表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS或PMMA(聚甲基丙烯
酸甲酯，俗称有机玻璃)，注模容器的要求为具有光学透明性且疏水，具有光学透明性便于
在制备血管网络过程中观察制备情况，疏水便于脱模。

[0027] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，丝素蛋白溶液的制备过程为：在温度为27～40℃的条件下，将蚕丝纤维(配制丝素蛋白溶液前，先将蚕丝
在浓度为0.5wt％的碳酸钠溶液中煮沸两次以除去丝胶，再在去离子水中漂洗并通过强制
空气流干燥)在浓度为9.0～9.3M的溴化锂溶液中溶解1～3h后在水中透析除盐并浓缩。

[0028] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，丝素蛋白溶液的浓度为5～15wt％，向注模容器中注入的生长因子溶液的浓度为50～100ng/ml，丝素蛋白
溶液与向注模容器中注入的生长因子溶液的体积比为1～5:1，由于圆柱通道的中心距不
同，在同样的圆柱通道中心距和培养天数下，过低的生长因子浓度会使血管间可能并不互
通，血管周围仅长有无数的毛细血管，生长因子浓度过高，相邻近的通道则存在融合为一个
血管通道的潜在影响。此外，不同的生长因子对内皮细胞入侵水凝胶的作用强度大小不同。

[0029] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，接种过程为：将浓度为50～150cells/ml的内皮细胞分散液灌注到通道中，震荡5～20min，以使内皮细胞
紧贴血管通道内壁(内皮细胞会受生长因子的浓度梯度的影响，内皮细胞会在培养过程中
分化出侵入丝素水凝胶的尖端细胞，尖端细胞首先侵入水凝胶主体，并会伴随由内皮细胞
分化出的茎细胞的迁移，然后逐渐形成丝状伪足和管腔以及继续向梯度方向生长，最终形
成人体的小动脉或小静脉以及毛细血管网)；培养一段时间是指培养7～14d；补充注射的生
长因子溶液的浓度为50～100ng/ml，注射量为水凝胶体积的10～50％；继续培养一段时间
是指培养7～14d。

[0030] 如上所述的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，生长因子为VEGF(血管内皮生长因子)、MCP‑1(单核细胞趋化蛋白‑1)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因
子)、PMA(佛波醇12‑肉豆蔻酸酯13‑乙酸酯)和S1P(1‑磷酸鞘氨醇)中的一种以上，或者为
HGF(肝细胞生长因子)与VEGF、MCP‑1、bFGF、S1P和PMA中的一种以上的组合；在同样的浓度
条件下，使用不同生长因子时作用强度大小关系为：S1P>PMA>VEGF>＝MCP‑1>bFGF>HGF＝0
(肝细胞生长因子不能单独使用，需要配合其他生长因子使用)，上述生长因子混合使用，作
用效果会增强。

[0031] 本发明的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，在现有技术的制备方法的基础上进行如下改进：

[0032] (1)采取3D打印血管网络主体后利用浇注一次成形，从而解决了多层网络制备过程中涉及上下层通道衔接不良或繁琐的问题，且所形成的血管转角处不存在形态尺寸与设
计不一致的现象；同时，采取浇注一次成形避免了相邻层水凝胶粘合不牢的现象，提升了整
体水凝胶微流体机械性能，还避免了多层制备后水凝胶存在漏浆的现象；

[0033] (2)水凝胶搭载生长因子，利用水凝胶的多孔性和控制生长因子的浓度使血管网络主干长出支干，最终可形成三维立体交叉网络，本发明的方法所做到的支干的精度也远
高于多层组装方法；

[0034] (3)丝素水凝胶微流体仿生血管化网络制造成品无PDMS作外围支撑边界，成品可以直接植入生物体内；

[0035] (4)在特定位置补注生长因子可以改变血管的疏密程度，从而达到特定部位血管支路多、特定部位血管支路少的目的。

[0036] 有益效果：

[0037] (1)本发明的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，简单易行，成本低廉，具有环境普适性；

[0038] (2)本发明的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，可以通过利用水凝胶的多孔性和控制生长因子的浓度使血管网络主干长出支干，从而更形象地模拟生
物体内血液流动；

[0039] (3)本发明的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，有效提高了整体水凝胶微流体的机械性能；

[0040] (4)本发明的基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，可以根据需要实现对特定部位血管支路疏密程度和生长方向的有效控制。

附图说明

[0041] 图1为实施例1的人体静脉血管网络模型的结构三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图；

[0042] 图2为实施例1水凝胶解剖注射三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图；

[0043] 图3为注射部位的象限图；

[0044] 图4为实施例3的人体静脉血管网络模型的结构三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图；

[0045] 图5为实施例8构建的三维立体血管网模型三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图。

具体实施方式

[0046] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术
人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围。

[0047] 实施例1

[0048] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤如下：

[0049] (1)利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0050] (1.1)构建如图1所示的由多个圆柱体组成的人体静脉血管网络模型，具体过程为：首先将明胶溶解在去离子水中配制成浓度为10％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶
液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对圆柱体模型进行线形逐层打印，最后对打印
得到的产物进行冻干处理，然后将打印得到的3D圆柱体进行组装即得到人体静脉血管网络
模型；其中，圆柱体的直径为0.05mm；打印参数为：注射压力1bar，打印速度3mm/s，打印喷嘴
直径0.26mm；

[0051] (1.2)将步骤(1.1)中得到的模型置于注模容器中；其中，注模容器的内表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0052] (1.3)含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液的制备：先将蚕丝在浓度为0.5wt％的碳酸钠溶液中煮沸两次以除去丝胶，再在去离子水中漂洗并通过强制空气流干燥，然后，在
温度为27℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9M的溴化锂溶液中溶解1h后在水中透析除盐并
浓缩，得到浓度为5wt％的丝素蛋白溶液，再向5wt％的丝素蛋白溶液中加入HRP以及H2O2得
到含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液，其中，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液中HRP的
浓度为20unit/ml，H2O2的浓度为0.01wt％；

[0053] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与VEGF溶液；其中，VEGF溶液的浓度为50ng/ml，步骤(1.3)中的丝素蛋白溶液
与VEGF溶液的体积比为1:1；

[0054] (1.5)在37℃下加热固化20min；

[0055] (1.6)采用倾倒的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0056] (2)将HUVEC接种至通道中，接种过程为：将浓度为50cells/ml的HUVEC分散液灌注到通道中，震荡5min，以使内皮细胞紧贴血管通道内壁，培养7d后，如图2所示，对水凝胶第
二和第三象限的交线(注射部位的象限图如图3所示)补充注射浓度为50ng/ml的生长因子
溶液后继续培养7d，得到特定生长的仿生毛细血管网，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距
为0.3mm，生长因子溶液的注射量为水凝胶体积的10％。

[0057] 实施例2

[0058] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤如下：

[0059] (1)利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0060] (1.1)构建由多个圆柱体组成的人体静脉血管网络模型，具体过程为：首先将海藻酸钠溶解在去离子水中配制成浓度为14％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D
打印装置的料管中，由3D打印装置对三维立体血管网模型进行线形逐层打印，冻干处理后
即得到人体静脉血管网络模型；其中，圆柱体的直径为0.3mm；打印参数为：注射压力
1.3bar，打印速度3.7mm/s，打印喷嘴直径0.45mm；

[0061] (1.2)将步骤(1.2)中得到的模型置于注模容器中；其中，注模容器的内表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0062] (1.3)含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液的制备：先将蚕丝在浓度为0.5wt％的碳酸钠溶液中煮沸两次以除去丝胶，再在去离子水中漂洗并通过强制空气流干燥，然后，在
温度为35℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.1M的溴化锂溶液中溶解1.5h后在水中透析除
盐并浓缩，得到浓度为10wt％的丝素蛋白溶液，再向10wt％的丝素蛋白溶液中加入氯化三
(2,2'‑联吡啶)钌(II)六水合物和过硫酸铵得到含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液，其
中，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液中氯化三(2,2'‑联吡啶)钌(II)六水合物的浓度为
10mM，过硫酸铵的浓度为20mM；

[0063] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与MCP‑1溶液；其中，MCP‑1溶液的浓度为65ng/ml，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液
与MCP‑1溶液的体积比为3:1；

[0064] (1.5)四周在250W的光源下10min，确保丝素水凝胶完全固化；

[0065] (1.6)采用浓度为5wt％的碳酸钠溶液溶解的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0066] (2)将HUVEC接种至通道中，接种过程为：将浓度为80cells/ml的HUVEC分散液灌注到通道中，震荡10min，以使内皮细胞紧贴血管通道内壁，培养9d后，对水凝胶第三象限(注
射部位的象限图如图3所示)补充注射浓度为80ng/ml的生长因子溶液后继续培养10d，得到
特定生长的仿生毛细血管网，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为0.4mm，生长因子溶液
的注射量为水凝胶体积的25％。

[0067] 实施例3

[0068] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤如下：

[0069] (1)利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0070] (1.1)构建如图4所示的由多个圆柱体组成的人体静脉血管网络模型，具体过程为：首先将壳聚糖溶解在2％(w/w)的冰乙酸中配制成浓度为17％(w/v)的3D打印溶液，然后
将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对三维立体血管网模型进行线形逐
层打印，冻干处理后即得到人体静脉血管网络模型；其中，圆柱体的直径为0.7mm；打印参数
为：注射压力1.6bar，打印速度4.5mm/s，打印喷嘴直径0.67mm；

[0071] (1.2)将步骤(1.2)中得到的模型置于注模容器中；其中，注模容器的内表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0072] (1.3)含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液的制备：先将蚕丝在浓度为0.5wt％的碳酸钠溶液中煮沸两次以除去丝胶，再在去离子水中漂洗并通过强制空气流干燥，然后，在
温度为37℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.2M的溴化锂溶液中溶解2.5h后在水中透析除
盐并浓缩，得到浓度为13wt％的丝素蛋白溶液，再向13wt％的丝素蛋白溶液中加入HRP以及
H2O2得到含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液，其中，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液中
HRP的浓度为50unit/ml，H2O2的浓度为0.01wt％；

[0073] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与bFGF溶液；其中，bFGF溶液的浓度为85ng/ml，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液与
bFGF溶液的体积比为4:1；

[0074] (1.5)在37℃下加热固化20min；

[0075] (1.6)采用浓度为2wt％的冰乙酸溶液溶解的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0076] (2)将HMVEC接种至通道中，接种过程为：将浓度为120cells/ml的HMVEC分散液灌注到通道中，震荡15min，以使内皮细胞紧贴血管通道内壁；培养12d后，对水凝胶第一象限
(注射部位的象限图如图3所示)补充注射浓度为100ng/ml的生长因子溶液后继续培养14d，
得到特定生长的仿生毛细血管网，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为0.35mm，生长因子
溶液的注射量为水凝胶体积的50％。

[0077] 实施例4

[0078] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于将VEGF溶液替换为HGF和PMA的混合溶液。

[0079] 实施例5

[0080] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例2基本相同，不同之处在于将MCP‑1溶液替换为PMA溶液。

[0081] 实施例6

[0082] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P溶液。

[0083] 实施例7

[0084] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于将注模容器的材质PDMS替换为PMMA。

[0085] 实施例8

[0086] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤如下：

[0087] (1)利用3D打印技术制备内含三维立体通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0088] (1.1)构建由多个圆柱体组成的人体静脉血管网络模型，具体过程为：首先将明胶溶解在去离子水中配制成浓度为20％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印
装置的料管中，由3D打印装置对圆柱体模型进行线形逐层打印，最后对打印得到的产物进
行冻干处理，然后将打印得到的3D圆柱体进行组装即得到人体静脉血管网络模型；其中，圆
柱体的直径为0.8mm；打印参数为：注射压力2bar，打印速度5.2mm/s，打印喷嘴直径0.8mm；

[0089] (1.2)将步骤(1.1)中得到的模型置于注模容器中；其中，注模容器的内表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0090] (1.3)含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液的制备：先将蚕丝在浓度为0.5wt％的碳酸钠溶液中煮沸两次以除去丝胶，再在去离子水中漂洗并通过强制空气流干燥，然后，在
温度为40℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.3M的溴化锂溶液中溶解3h后在水中透析除盐
并浓缩，得到浓度为15wt％的丝素蛋白溶液，再向15wt％的丝素蛋白溶液中加入氯化三(2,
2'‑联吡啶)钌(II)六水合物和过硫酸铵得到含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液，其中，含
丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液中氯化三(2,2'‑联吡啶)钌(II)六水合物的浓度为10mM，
过硫酸铵的浓度为20mM；

[0091] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与VEGF和MCP‑1的混合溶液；其中，混合溶液的浓度为100ng/ml，VEGF和MCP‑1
的体积比为1:1，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液与VEGF和MCP‑1的混合溶液的体积比为5:1；

[0092] (1.5)在250W的光源下放置10min，确保丝素水凝胶完全固化；

[0093] (1.6)采用加热至37℃后倾倒的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0094] (2)将HUVEC接种至通道中，接种过程为：将浓度为150cells/ml的HUVEC分散液灌注到通道中，震荡20min，以使内皮细胞紧贴血管通道内壁，培养14d后，对水凝胶第六象限
(注射部位的象限图如图3所示)补充注射浓度为85ng/ml的生长因子溶液后继续培养11d，
得到如图5所示特定生长的仿生毛细血管网，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为0.5mm，
生长因子溶液的注射量为水凝胶体积的20％。

[0095] 实施例9

[0096] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为bFGF和PMA的混合溶液。

[0097] 实施例10

[0098] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为MCP‑1和PMA的混合溶液。

[0099] 实施例11

[0100] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和VEGF的混合溶液。

[0101] 实施例12

[0102] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和MCP‑1的混合溶液。

[0103] 实施例13

[0104] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和bFGF的混合溶液。

[0105] 实施例14

[0106] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和HGF的混合溶液。

[0107] 实施例15

[0108] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和PMA的混合溶液。

[0109] 实施例16

[0110] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为生长因子的混合溶液；其中，生长因子包含HGF、
VEGF、MCP‑1、bFGF和S1P。

[0111] 实施例17

[0112] 基于3D打印技术的特定生长的仿生毛细血管网的制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为生长因子的混合溶液；其中，生长因子包含VEGF、
MCP‑1、PMA和S1P。