一种拟除虫菊酯类杀虫剂残留降解菌株及其应用

摘要

本发明公开了一种拟除虫菊酯类杀虫剂残留降解菌株及其应用。所述菌株为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)菌株CW3，已于2019年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60893。该菌株具有显著的高效降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂的潜力，将该菌株制备成降解菌剂，具备生产成本低、安全高效、使用方便等特点，可用于修复被丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药污染的自然环境；直接施用处理7天后可使水体中的丙烯菊酯残留量降低93％以上，同时对土壤也具有高效的生物修复作用，为解决农业生产中拟除虫菊酯类杀虫剂残留超标及环境污染问题提供一种新思路，对生产无毒无公害的绿色农产品，具有重要的理论指导和实际应用价值。

权利要求

1.一株可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)菌株CW3，其特征在于，于2019年11月13日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60893，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)菌株CW3在降解拟除虫菊酯类杀虫剂或制备拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂中的应用，其特征在于，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为丙烯菊酯、右旋苯醚氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯或氯烯炔菊酯。

3.一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株CW3。

4.一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株CW3和菌株CW3发酵液。

5.根据权利要求4所述的降解菌剂，其特征在于，是由菌株CW3经过发酵所得培养液制成。

6.根据权利要求5所述的降解菌剂，其特征在于，由如下方法制备得到：S1.将菌株CW3培养至对数生长期，得菌种；

S2.将菌种按照体积比5％～10％的接种量接种入种子培养基培养得种子液；

S3.将种子液按照体积比5～10％的接种量接种入发酵培养基培养，发酵完成后培养液制成菌剂剂型。

7.权利要求3～6任一所述降解菌剂在降解拟除虫菊酯类杀虫剂方面的应用。

8.权利要求3～6任一所述降解菌剂在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤。

10.一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂或修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的方法，其特征在于，是将权利要求3～6任一所述降解菌剂稀释后喷洒到待处理对象中，稀释后的降解菌剂中菌体的数量不低于1.0×106CFU/mL。

说明书

一种拟除虫菊酯类杀虫剂残留降解菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种拟除虫菊酯类杀虫剂 残留降解菌株及其应用。

背景技术

[0002] 拟除虫菊酯杀虫剂在全球范围内被广泛地应用于作物增产和家庭卫生害虫 防治。然而，拟除虫菊酯的广泛应用会导致环境破坏，影响人类健康。施用过程 中农药会分散在空气、水和土壤环境中，会进入地下水，通过饮用水进入食物链， 从而影响非靶标生物的健康。拟除虫菊酯在环境中的残效期很长，但是利用物理 化学降解方法和微生物降解方法可以去除这些农药残留。天然除虫菊酯来源于植 物(除虫菊)，而拟除虫菊酯根据天然除虫菊酯研发而成，这两种农药均可用于昆 虫防治。美国环境保护署(USEPA)曾报道称大量使用拟除虫菊酯会伤害人体健 康。拟除虫菊酯在病虫害控制方面占据非常重要的地位，约占全球农药市场份额 的25％。根据拟除虫菊酯的化学结构和机理，拟除虫菊酯分为两大类(I型和II 型)。丙烯菊酯是一种I型拟除虫菊酯，因为它在α手性碳位置缺乏氰基基团。

[0003] 丙烯菊酯是拟除虫菊酯家族中的一种，常用于防控家庭中的苍蝇、蚊子、螨 虫、以及家庭宠物身上的跳蚤和虱子。在自然环境不同的分散体系中，丙烯菊酯 的半衰期从48小时到几个月不等。丙烯菊酯能够导致神经突触中毒，表现为抑 制钠离子通道的功能，最终导致昆虫的神经系统的过度活跃、瘫痪和死亡。丙烯 菊酯已在家庭和农业应用中的大量使用，其残留物会在环境中存留很长时间。在 哺乳动物体内，摄入的丙烯菊酯会降解产生自由基，从而破坏细胞DNA导致各 种健康问题。曾经有文章报道过丙烯菊酯对啮齿动物的神经毒性案例，以及对人 类外周血淋巴细胞和瑞士白化病小鼠的基因毒性的案例。丙烯菊酯进入人体后， 会通过线粒体介导的细胞凋亡对人角膜上皮细胞产生毒性，并改变人体血浆细胞 的生化特征。

[0004] 为了去除环境中残留的拟除虫菊酯类农药，微生物降解被认为是一种环保有 效的方法。以前报道了在土壤和水中筛选出多株拟除虫菊酯降解菌，包括细菌和 真菌。这些微生物能够利用拟除虫菊酯作为碳和氮的唯一来源来生长。微生物通 常通过脂键水解的方式代谢拟除虫菊酯类农药，最终形成脂肪族短链烃类。在不 同的条件下，降解菌一般可以降解25-1200mg/L浓度范围的拟除虫菊酯。目前， 已经报道的可降解拟除虫菊酯的微生物包括：芽孢杆菌、假单胞菌、拉乌尔菌、 节杆菌、嗜铬菌、曲霉、念珠菌和木霉等。拟除虫菊酯降解菌一般含有拟除虫菊 酯水解酶，这种酶能使拟除虫菊酯得酯键裂解。

[0005] 如专利201710927602.5公开了一种复合菌剂及其在降解土壤中拟除虫菊酯 类农药残留的用途，利用驯化技术以鞘氨醇单胞菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单 胞菌、藤黄微球菌和阴沟肠杆菌复配，驯化制备得到一种复合菌剂，可以降解联 苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯；但是没有降解丙烯菊酯；而且，目前现有的降解 菌资源库远远不能满足化学农药残留污染生物降解的实际需求。特别是目前缺乏 专门针对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解制剂产品。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药残留降 解修复在技术上的短缺和不足，提供一种高效降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫 剂残留的菌株及其生产的菌剂和最优降解工艺条件。应用时，加入清水和菌剂配 成菌体数量不低于1.0×106CFU·mL-1的悬浮液，具备生产成本低、安全高效、使 用方便等特点。直接施用本菌剂短时间内可使水体中丙烯菊酯残留量降低93％ 以上，对被丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药污染的土壤也具有高效的生物修复效 果，可有效处理农业生产中拟除虫菊酯类杀虫剂残留超标及环境污染问题。

[0007] 本发明的目的是提供一株可降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂残留的鞘 氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)菌株CW3。

[0008] 本发明的另一目的是提供所述菌株CW3在制备拟除虫菊酯类杀虫剂的降解 菌剂中的应用。

[0009] 本发明的再一目的是提供菌株CW3制备的降解菌剂及其在降解拟除虫菊酯 类杀虫剂、修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体或土壤等自然环境方面的应用。

[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0011] 一株可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)菌 株CW3，已于2019年11月13日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为 GDMCC No:60893，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0012] 该菌株分离自采集于广西省某化工厂附近的活性污泥，经形态学特征、16S rRNA系统发育分析鉴定为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)。

[0013] 菌株CW3在LB固体平板上30℃培养3天后，菌落在中呈现黄色、圆形、 全缘、光滑、微凸起、有光泽。其主要生物学特性为：为革兰氏染色阴性菌，好 氧，菌体为杆状，不产芽孢，大小约长4.0～8.0μm，宽0.5～0.8μm，繁殖方式 为裂殖。

[0014] 该菌株CW3具有显著的降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂残留的能力。

[0015] 因此，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)，尤其是菌株CW3，在降解拟 除虫菊酯类杀虫剂或制备拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂中的应用，均应在本发明 保护范围之内。

[0016] 具体地，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为丙烯菊酯、右旋苯醚氰菊酯、氯菊酯、 胺菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯或氯烯炔菊酯。

[0017] 优选地，所述拟除虫菊酯类杀虫剂为丙烯菊酯。

[0018] 进一步地，还提供一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂，含有上述菌 株CW3和/或菌株CW3发酵液。

[0019] 所述发酵液是由菌株CW3经过发酵所得培养液制成。

[0020] 具体地，所述降解菌剂由如下方法制备得到：

[0021] S1.将菌株CW3培养至对数生长期，得菌种；

[0022] S2.将菌种按照体积比5％～10％的接种量接种入种子培养基培养得种子液；

[0023] S3.将种子液按照体积比5～10％的接种量接种入发酵培养基培养，发酵完成 后培养液制成菌剂剂型。

[0024] 其中，优选地，步骤S1所述培养所用培养基为LB培养基。

[0025] 优选地，步骤S2和步骤S3培养过程中通入无菌空气，无菌空气的通气量为 0.45～1.0m3/min(优选为0.6～1.0m3/min)，搅拌速度为180～240r/min，培养 温度30℃，全流程培养时间为24～48h，发酵结束后菌体数量≥1.0×109CFU/mL。

[0026] 作为一种可优选的实施方案，所述的降解菌剂是通过以下方法生产而成：

[0027] S1.将所述菌株CW3种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期，获得菌种；

[0028] S2.将S1的菌种按体积比5％～10％的接种量接种入含有种子培养基的种子 罐，培养至对数生长期，获得种子液；

[0029] S3.将获得的种子液按照5～10％的接种量接种入含有发酵培养基的生产发 酵罐发酵培养，发酵完成后培养液出罐，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体 剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

[0030] 此外，所述降解菌剂在降解水体或土壤中拟除虫菊酯类杀虫剂残留中的应 用，以及在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的自然环境方面的应用，也都在本发明 的保护范围之内。

[0031] 优选地，所述自然环境为水体或土壤等。

[0032] 具体地，所述应用即为一种降解拟除虫菊酯类杀虫剂或修复拟除虫菊酯类杀 虫剂污染的方法，是将所述降解菌剂稀释后喷洒到待处理对象中，稀释后的降解 菌剂中菌体的数量不低于1.0×106CFU/mL。

[0033] 优选地，降解工艺条件为：降解温度25～35℃，pH 6.0～8.0,丙烯菊酯浓度 0～150mg/L或mg/Kg。

[0034] 更优选地，降解工艺条件为：降解温度30℃，pH 7.0，丙烯菊酯浓度100mg/L 或mg/Kg。

[0035] 本发明具有以下有益效果：

[0036] 本发明筛选获得一株农药残留高效降解菌株Sphingomonas trueperi CW3，该 菌株可以利用丙烯菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂作为唯一碳源生长，在短时间内可 有效降解拟除虫菊酯类杀虫剂，7天内对丙烯菊酯的降解率达到93.0％，具有良 好的生物降解效果。

[0037] 该菌株可用于修复丙烯菊酯污染的水体、土壤等自然环境，直接施用可使水 体中丙烯菊酯残留量降低93％以上，对土壤也具有高效的生物修复作用，可用于 处理农业生产中拟除虫菊酯类杀虫剂残留超标及环境污染问题，从而生产绿色无 公害的健康农产品，保护生态环境和人类健康。

[0038] 进一步地，本发明提供了一种使用菌株CW3生产制备得到的降解菌剂，具 有生产成本低、使用方便、安全高效等优点，适合治理水体或土壤等自然环境中 拟除虫菊酯类杀虫剂造成的残留污染。

[0039] 本发明进一步提供了该菌剂最优降解工艺条件，即采用响应曲面法 Box-Behnken设计获得，最优降解条件为：温度30℃，pH7.0和降解浓度为100 mg·L-1或mg·Kg-1，在此工艺条件下菌剂降解效果达到最佳，具有非常重要的理 论和应用价值。

附图说明

[0040] 图1为菌株CW3的16S rRNA系统进化分析。

[0041] 图2为菌株CW3的扫描电镜图。

[0042] 图3为菌株CW3降解丙烯菊酯的响应曲面图。pH和温度交互影响菌株CW3 降解丙烯菊酯(A)，pH和降解浓度影响菌株CW3降解丙烯菊酯(B)，降解 浓度和温度交互影响菌株CW3降解丙烯菊酯(C)。

[0043] 图4为菌株CW3生长与降解丙烯菊酯的动态图。

[0044] 图5为菌株CW3对其他拟除虫菊酯类杀虫剂的降解。

[0045] 图6为菌株CW3降解丙烯菊酯的途径分析。

具体实施方式

[0046] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0047] 以下实施例中所述培养基配方如下：

[0048] 基础盐培养基(MSM，g/L)：(NH4)2SO4，2.0；CaCl2·2H2O，0.01；FeSO4·7H2O， 0.001；Na2HPO4·12H2O，1.5；MgSO4·7H2O，0.2；KH2PO4，1.5。

[0049] LB培养基(g/L)：酵母提取物，5.0；蛋白胨，10.0；氯化钠，10.0。

[0050] 种子培养基和发酵培养基的配方与LB培养基一致。

[0051] 以上培养基以蒸馏水配成，pH为7.2，于高压湿热灭菌锅121℃灭菌20分 钟。固体培养基：每1L培养基加入15g琼脂粉。

[0052] 实施例1菌株CW3的分离与鉴定

[0053] 1、菌株分离筛选

[0054] (1)样品：采集自广西省某化工厂附近的活性污泥。

[0055] (2)分离筛选方法采用富集培养法，具体如下：

[0056] 取活性污泥样品5g加入50mL基础培养基中，同时加入丙烯菊酯原药母液 (丙酮为溶剂)，使丙烯菊酯最终质量浓度为50mg/L，于30℃、200r/min摇床下 进行降解菌富集培养。培养7天后，按10％的接种量转接到第二批含100mg/L 丙烯菊酯的MSM培养基中。相同条件培养7天后，再按10％的接种量转接到含 丙烯菊酯为200mg/L的MSM中，继续培养7天。以此类推，不断成倍增加丙 烯菊酯的质量浓度，连续富集培至800mg/L。最后取20μL MSM富集培养液均 匀涂抹到含50mg/L丙烯菊酯的MSM固体平板中反复进行划线分离，直至得到 单菌落，把分离出来的耐受菌在LB固体培养基上反复划线3次以纯化菌株，最 终利用15％的甘油在-80℃条件下保存菌种。随后使用高效液相色谱法(HPLC)验 证其降解效果。

[0057] (3)采用上述方法从环境样品中成功分离获得一株丙烯菊酯高效降解菌株， 编号为CW3，该菌株可以利用丙烯菊酯作为唯一碳源生长，7天内对丙烯菊酯的 降解率达到93.0％。

[0058] 2、菌株鉴定

[0059] (1)菌株CW3在LB固体平板上30℃培养3天后，菌落在中呈现黄色、 圆形、全缘、光滑、微凸起、有光泽。其主要生物学特性为：为革兰氏染色阴性 菌，好氧，菌体为杆状，不产芽孢，大小约长4.0～8.0μm，宽0.5～0.8μm，繁 殖方式为裂殖。

[0060] (2)16S rDNA分子生物学鉴定提取菌株CW3基因组DNA，以提取的基 因组为模板，采用16S rDNA细菌通用引物(27F：5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 进行PCR扩增，PCR产物委托金唯智(广州)生物科技有限公司进行测序。测序 结果提交GenBank数据库并进行注册，其注册号为：MN473236。同时，将菌株 测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择 同源性较高的相关序列利用DNAMAN 6.0及MAGE 7.0软件构建系统进化树及 分析进化关系。16S rDNA的系统发育树如图1所示，本发明分离纯化得到的菌 株CW3与Sphingomonas trueperi的相似度达到90％以上，其培养特征与扫描电 镜观察特征与鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)也最为相似(图2)，因此本发 明筛选获得的降解菌鉴定为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)。并于2019年 11月13日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60893，保 藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0061] 实施例2菌株CW3降解菌剂的制备

[0062] 1、使用上述菌株CW3制备降解菌剂的生产工艺流程为：斜面菌种——摇瓶 种子液——种子罐培养——生产罐发酵——产品(剂型可为悬浮剂或粉剂)。

[0063] 2、具体方法如下：

[0064] (1)将菌株CW3菌种在LB固体平板上活化，接种于LB试管斜面上备用。

[0065] (2)将菌株CW3的试管种接种于含250mL LB培养基的1000mL摇瓶中， 30℃恒温振荡至对数期，获得的菌液接种于种子罐，种子罐中装有灭好菌的种子 培养基，装液量为70％。将培养好的摇瓶菌液按10％的接种量接种于装液量为 70％的种子罐，无菌空气的通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为180～240 rpm/min，培养至对数生长期备用。

[0066] (3)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产 发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1Kg/cm3的压力下、 121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.6～1.0 m3/min，搅拌速度为180～240r/min，培养温度控制为30℃，整个工艺培养流程 时间为24～48小时，发酵结束后菌体数量≥1.0×109CFU/mL，发酵完成后培养液 出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装 成固体菌剂剂型。

[0067] 实施例3CW3菌剂最优降解工艺条件

[0068] 1、将CW3菌剂进行单因素降解试验，通过依次改变影响生长和降解的因素， 如温度、pH值、降解浓度、接种量、装液量、振荡速率等，测定CW3菌剂的降 解率，确定影响CW3菌剂降解率的关键因素。

[0069] 利用Design Expert 12.0软件根据响应曲面法Box-Behnken设计原则进行试 验设计(表1)，以影响菌株CW3生长与降解的关键因子pH值(X1)、温度(X2) 和降解浓度(X3)为自变量，以丙烯菊酯残留量为响应值(Y1)，建立多元二次回归 方程。

[0070] 根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图。最后对 多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即CW3菌剂 最优降解工艺条件。

[0071] 通过Design Expert 12.0软件分析，获得CW3菌剂降解的多元二次回归方程 如下：

[0072] Y1＝92.10-0.750X1+3.12X2+2.05X3-2.50X1X2-1.50X1X3+6.25X2X3- 11.0X12-5.10X22-7.25X32

[0073] 表1响应曲面Box-Behnken设计试验结果

[0074]

[0075]

[0076] 2、统计分析结果表明(表2)，pH值(X1)、温度(X2)和降解浓度(X3)对菌株 CW3降解效果的一次效应均达到显著水平(P<0.05)；其二次效应X12、X22和X32对菌株CW3降解效果也达到显著水平(P<0.05)。

[0077] 表2菌株CW3降解丙烯菊酯的多元二次回归方程拟合模型的方差分析

[0078]

[0079]

[0080] 为了能更直观的反映出各因素及其交互效应，利用Design Expert 12.0软件 程序绘制响应曲面图，见图3。图3中，左图表示pH和温度交互影响菌剂降解 丙烯菊酯，中间图表示pH和丙烯菊酯浓度交互影响菌菌剂降解丙烯菊酯，右图 表示丙烯菊酯浓度和温度交互影响菌剂降解丙烯菊酯。

[0081] 为了获得CW3菌剂降解工艺条件的最佳组合，对所得的多元二次回归模型 方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的临界值，即菌剂最优降解条件：温度 30℃，pH 7.0和丙烯菊酯浓度100mg/L或mg/Kg。

[0082] 实施例4菌株CW3对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解效果实验

[0083] 1、实验方法

[0084] (1)种子液制备：将纯化后的菌株CW3接入含有5mL的LB液体培养基 过夜活化培养至对数期，4000rpm离心后，菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)冲 洗两次，所得菌体作为接种体。

[0085] (2)降解性能测定：将100mg/L的菌体接种至50mL含有丙烯菊酯等拟 除虫菊酯类农药(100mg/L)的MSM培养液中，以不接菌作为对照，每组三个重 复。在30℃，200rpm恒温摇床培养7天，每1d取样一次，测定菌株CW3的 生长情况，并采用高效液相色谱仪(HPLC)测定其对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农 药的降解情况。

[0086] (3)色谱条件：

[0087] HPLC型号：2690型(Waters,USA)；色谱柱：C18反相柱(Phenomenex,250 nm×4.60mm,5μm)；流速：1mL/min；柱温：常温(30±1℃)；流动相：乙腈:水 ＝65:35；流速：
0.7mL/min；检测波长：250nm；进样量：20μL；运行时间： 34min。在上述条件下，丙烯菊酯的保留时间为28min。

[0088] 按照下式计算丙烯菊酯降解率：降解率(％)＝(1-A1/A0)×100，

[0089] 其中，A1为降解菌处理后丙烯菊酯残留浓度，A0为对照处理后的丙烯菊酯 残留浓度。

[0090] 质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。

[0091] 2、结果如图4所示，菌株CW3能高效降解丙烯菊酯，并可利用其作为生长 的唯一碳源。且丙烯菊酯降解与菌株CW3生长呈正相关。在丙烯菊酯作为唯一 碳源条件下，菌株CW3生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期， 1～3天为菌株的生长对数期，此时该菌株对丙烯菊酯的降解最快；随着菌株生长 达到稳定期，此时丙烯菊酯的降解曲线趋于平缓；培养4天后，菌株开始进入衰 亡期。培养7天后，降解菌株CW3对丙烯菊酯的降解率达到93.0％，而对照组 (自然降解率)为9.4％。表明该菌株具有高效快速降解丙烯菊酯的能力。

[0092] 图5和表3显示了菌株CW3降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解效果 和动力学参数，其揭示了丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解过程遵循一阶动力 学模型。丙烯菊酯、右旋苯醚氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、氯烯炔 菊酯和联苯菊酯的降解常数(k)分别为0.331、0.240、0.116、0.112、0.206、0.321 和0.135。并计算了丙烯菊酯、右旋苯醚氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊 酯、氯烯炔菊酯和联苯菊酯的理论半衰期(t1/2)值和降解系数(R2)，理论半衰期(t1/2) 值分别为2.05、2.88、5.94、6.18、3.35、2.15和5.10，降解系数(R2)分别为0.8737、 0.9391、0.9038、0.9517、0.9186、0.9590和0.8742，这表明实际降解数据与一阶 动力学模型吻合良好。这些结果进一步说明了菌株CW3具有高效降解拟除虫菊 酯类农药的潜力。

[0093] 表3菌株CW3降解丙烯菊酯的动力学参数

[0094]

[0095] 注：k表示降解常数；R2是相关系数；t1/2是指理论半衰期(天)。

[0096] 实施例5降解产物实验

[0097] 1、在含有50mL MSM培养基的锥形瓶中加入丙烯菊酯，使其终浓度为100 mg/L。接入菌株CW3，以未接菌的为对照，置于30℃恒温摇床中200rpm连续 培养7天，每天定期取样，使用乙酸乙酯萃取培养液，应用气相色谱-质谱联用 仪(GC-MS)检测丙烯菊酯的降解产物，并根据降解产物化学结构分析降解途径。

[0098] GC-MS测定条件如下：GC-MS型号：6890N/5975型(Agilent,USA)；HP-5MS 石英毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)；载气：氦气，纯度≥99.999％；流量 1.2mL·min-1，不分流进样，进样量均为1μL；电离电压：70eV，选择离子监测 (SIM)模式；离子源温度：200℃；四级杆温度：150℃；MS传输线温度：280℃； 进样口温度：250℃；检测器温度：320℃；升温程序：初温100℃(2分钟)，16℃ 每分钟升温至200℃(1分钟)，8℃每分钟升温至300℃(5分钟)。

[0099] 2、基于GC-MS结果，提出了丙烯菊酯的微生物降解途径(图6)。首先通过 裂解羧酸酯键将丙烯菊酯水解，得到1,4,4-三甲基-环己-2-烯基乙醇和2,2-二甲基 -3-丙烯基-环丙酸。随后1,4,4-三甲基-环己-2-烯基乙醇被氧化为1,4,4-三甲基环 己-2-烯羧酸。与此同时，2,2-二甲基-3-丙烯基-环丙酸被氧化为2,2-二甲基-3-丙 烯基-环丙醇。2,2-二甲基-3-丙烯基-环丙醇进一步转化为1,3-环戊二烯,5,5-二甲基 -2-乙基，然后再转化为1,5-己二烯,2,5-二甲基-3-亚甲基，最后代谢为丙烷。

[0100] 实施例6土壤修复实验

[0101] 1、供试土样

[0102] 森林表层土(5～20cm)，取自广州市华南农业大学树木园，属红壤土，5年 内未有施用丙烯菊酯和其他农药的记录。土壤的理化参数表征为(g/kg,干重)：有 机物，10.5；总氮，0.5；总磷，0.4；总钾，18.2；pH值为6.9。土壤由65.0％沙子， 28.0％淤泥和7.0％黏土组成。

[0103] 土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过10目筛(2 mm)，随后一部分土壤拿去121℃高温湿热灭菌1小时。分别取一定量的丙烯菊 酯溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使右丙烯菊酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置 于通风橱中风干，将其拌入灭菌和未灭菌的土壤中，使土壤中丙烯菊酯的终浓度 为100mg/kg，然后置于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按100mg/Kg的接种量接 入CW 3菌体，以加蒸馏水(即未加菌)的作为对照，土壤的持水量保持在40％。 在30℃和避光条件下连续培养40天，并定期取样，HPLC法测定丙烯菊酯残留 量并计算降解率。降解率计算方法如实施例4。

[0104] 2、实验结果

[0105] 还在灭菌和未灭菌土壤中研究了菌株CW3降解丙烯菊酯的能力，以探索其 在自然条件下的功效。动力学数据表明(表4)，丙烯菊酯降解过程遵循一阶动 力学模型，其k值范围为0.0072至0.0889。丙烯菊酯降解的回归系数(0.913至 0.980)表明降解数据与模型具有很好的相关性。在灭菌和未灭菌土壤中，丙烯 菊酯降解的t1/2值分别为96.27天和40.06天。在未灭菌和灭菌土壤中加入100 mg/Kg菌株CW3，丙烯菊酯降解的t1/2值显着降低至7.79和11.14天。结果证实， 菌株CW3在灭菌和未灭菌土壤中均影响了丙烯菊酯的残留量。

[0106] 通过加入菌株CW3，在未灭菌的土壤中观察到最大的丙烯菊酯降解效果， 这可能是由于存在多种微生物群落所致。同样，与未加菌株CW3的对照相比， 在灭菌土壤中也观察到良好的降解效果。在灭菌和未灭菌的土壤中，对照的t1/2分别为96.27和40.06天，而在用菌株CW3处理的同一土壤中，t1/2分别显着降 低至11.14和7.79天。我们的结果表明，菌株CW3在土壤中也能发挥高效的降 解潜力，可用于大规模污染土壤或地下水的处理。

[0107] 表4菌株CW 3在土壤中降解丙烯菊酯的动力学参数

[0108]

[0109] CW3降解菌剂在直接施入土壤中后，没有出现不降解或降解滞后效应现象， 其降解性能稳定，这就为菌株CW3对丙烯菊酯的土壤修复提供了科学依据。

[0110] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。