一种自体脂肪胶及其来源的间充质干细胞的制备方法及用途

摘要

本发明提供一种自体脂肪胶的制备方法，其制备过程简单、快速、经济，无需借助外源性酶消化，通过简单的机械分离、脂肪乳化和离心即可制备。同时提供该自体脂肪胶来源的间充质干细胞（ADSCs）的制备方法，以及所述自体脂肪胶用于修复软骨缺损和治疗骨关节炎等运动损伤疾病的用途。与临床上常用的微骨折术相比，本发明的自体脂肪胶可以显著促进关节软骨的再生，为修复软骨损伤提供了一种简单、经济、有效的新策略。

权利要求

1.一种自体脂肪胶在制备用于治疗运动损伤的药物中的用途，其特征在于：所述自体脂肪胶由下述步骤制备获得：（1）取自体脂肪组织于无菌烧杯中，充分剪碎后转移到10ml注射器中，所述自体脂肪组织的来源选自手术关节部位就近的大腿内侧脂肪组织；

（2）使用内径为2.5mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器90次获得乳化的脂肪；

（3）采用2000g/分的转速离心3分钟，获得分为3层的脂肪组织，取中间层即为自体脂肪胶；所述运动损伤选自软骨缺损。

说明书

一种自体脂肪胶及其来源的间充质干细胞的制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种自体脂肪胶的制备方法，特别是涉及一种自体脂肪胶来源的间充质干细胞（ADSCs）的制备方法。本发明还涉及所述自体脂肪胶用于修复软骨缺损和治疗骨关节炎等运动损伤疾病。

背景技术

[0002] 关节软骨缺损是是一种临床常见的软骨损伤，可能引起严重的疼痛、关节肿胀、活动受限甚至发展为骨关节炎，严重影响患者生存质量。由于软骨内无血管和神经，软骨细胞数少且增殖能力有限，较大的关节软骨缺损往往难以自愈。目前临床治疗软骨缺损的方式主要包括微骨折术、自体软骨细胞移植、自体自体软骨块移植、干细胞疗法、同种异体软骨移植等。其中，临床应用最广泛的是微骨折术，但是微骨折术对较大的缺损修复效果有限，并且主要为纤维软骨而不是天然的透明软骨。脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）由于低免疫原性、多向分化潜能（包括向软骨分化）等优势被认为是最有潜力的方法之一。但是由于ADSCs的体外分离需要外源性酶消化，并且需要在体外进行二次扩增达到足够的细胞数量。这个过程耗时、花费较大，同时也加大了污染和干细胞去分化的的可能性，因此临床转化受到限制。为此，有必要开发一种无需借助外源性酶消化分离细胞和体外扩增技术，在保留脂肪组织中ADSCs活力的同时，可以快速稳定制备用于软骨的修复。

[0003] 使用抽脂手术来源的脂肪吸出物经过Lipogems商品化设备制备微小片段脂肪组织（Micro-fragmented adipose tissue, MFAT）。该技术使用一个密闭的容器对抽脂提取物进行洗涤、机械分离等操作去除脂肪组织中的油脂，获得有用的其他成分比如细胞、细胞因子等成分。但是MFAT脂肪制备需要较大的脂肪体积（往往需要几十毫升），因此需要结合额外的抽脂手术来获得脂肪提取物，增加患者的创伤。此外，MFAT脂肪制备需要使用商品化的一次性设备，费用较大。

发明内容

[0004] 本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种无需外源性酶消化、简单、快速、经济的自体脂肪胶的制备方法，并利用获得的自体脂肪胶修复软骨损伤，包括软骨缺损和骨关节炎等。

[0005] 本发明的目的之一还在于提供一种来源于上述自体脂肪胶的脂肪间充质干细胞的制备方法。

[0006] 本发明提供的脂肪胶制备过程简单、快速、经济，无需借助外源性酶消化，通过简单的机械分离、脂肪乳化和离心便可以制备。该脂肪胶保留了脂肪组织中的间充质干细胞ADSCs的活力和多向分化潜能，同时保留并浓缩细胞外基质成分，为细胞存活和分化提供微环境。本发明脂肪胶的制备对脂肪体积要求不高，可以适用于少量脂肪来源，如利用来源于关节镜手术过程清创得到的脂肪垫来制备并用于关节损伤修复。由于这种脂肪胶无需借助复杂的制造工艺和昂贵的医疗耗材，可以在手术过程中同步制备。

[0007] 本发明采用如下技术方案实现其发明目的，提供一种自体脂肪胶的制备方法，包括下述步骤：

[0008] （1）取自体脂肪组织于无菌烧杯中，充分剪碎后转移到10ml注射器中；

[0009] （2）使用内径为1.5mm-2.5mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器30-200次获得乳化的脂肪；

[0010] （3）采用500g/分-3200g/分的转速离心0.5-10分钟，获得分为3层的脂肪组织，取中间层即为自体脂肪胶。

[0011] 所述步骤(2)中，优选使用内径为1.5mm-2mm或内径为2mm-2.5mm的连通器连接两个注射器。

[0012] 所述步骤(2)中，优选来回推拉两个注射器90次获得乳化的脂肪。

[0013] 所述步骤(3)中，离心转速优选为500g/分-800g/分,800g/分-1600g/分,1600g/分-2500g/分或2500g/分-3200g/分, 更优选为2000g/分；离心时间优选为0.5分钟-1分钟，1分钟-2分钟，2分钟-3分钟，3分钟-5分钟或5分钟-10分钟，更优选为3分钟。

[0014] 所述步骤(1)中，自体脂肪组织的来源包括但不限于关节内髌下脂肪垫、手术关节部位就近的大腿内侧脂肪组织或腹部脂肪。

[0015] 本发明还提供一种自体脂肪胶来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）的制备方法，将采用前述制备方法获得的自体脂肪胶放入含有5% CO2的37℃细胞培养箱培养7-14天，即得脂肪间充质干细胞。

[0016] 本发明还提供一种采用前述制备方法获得的自体脂肪胶在制备用于治疗运动损伤的药物中的用途。

[0017] 优选地，所述运动损伤包括软骨缺损、骨关节炎、半月板损伤、交叉韧带损伤、肌腱损伤。

[0018] 优选地，所述用于治疗运动损伤的药物为修复软骨缺损或治疗骨关节炎的药物。

[0019] 进一步优选地，所述自体脂肪胶与玻璃酸钠、纤维蛋白胶、人富血小板血浆（PRP）、干细胞、外泌体、生长因子、其他用于关节内给药的药物中的一种或者多种组合使用。

[0020] 与现有技术相比，本发明提供的自体脂肪胶的制备方法具有以下有益效果：

[0021] 本发明制备的自体脂肪胶保留了细胞外基质和具有多向分化潜能（分化为软骨、骨、脂肪）的ADSCs细胞活力。采用的制备方法避免了传统干细胞疗法中使用外源性酶消化分离细胞和体外扩增细胞的过程，更简单、省时和安全。同时，本发明制备的脂肪胶不需要复杂的设备和耗材，可以对小体积的脂肪组织进行制备，也不需要额外的抽脂手术，避免二次伤害。动物实验研究结果表明，与临床上常用的微骨折术相比，自体脂肪胶可以显著促进关节软骨的再生。本发明为修复软骨损伤提供了一种简单、经济、有效的新策略。

附图说明

[0022] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

[0023] 图1. 脂肪胶的制备和特征。A.脂肪组织（左）、剪碎的脂肪组织（中）和脂肪胶（右）; B.脂肪胶质地更光滑，具有良好的可注射性质；C.扫描观察可见脂肪组织内的脂肪细胞，而脂肪胶内无脂肪细胞，呈现出较多疏松的细胞外基质纤维。

[0024] 图2. 脂肪胶来源的ADSCs具有多向分化潜能。A.脂肪胶来源ADSCs显微镜下呈长梭形状，细胞活力良好；B.成软骨诱导培养21天后，阿利新蓝染色证明ADSCs分化为软骨细胞；C. 成骨诱导培养21天后，茜素红染色证明ADSCs可以分化为成骨细胞；D. 成脂诱导培养21天后，油红O染色证明具可以分化为脂肪细胞。

[0025] 图3. MRI结果显示脂肪胶组修复效果好于MF组。

[0026] 图4. 大体观察和ICRS评分。

[0027] 图5. 组织学评价。A. HE染色；B.甲苯胺蓝染色；C.组织学评分；N，正常软骨；R，新生组织；箭头，缺损边缘。

[0028] 图6. 自体脂肪胶制备和临床应用的概览图。

具体实施方式

[0029] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0030] 实施例1：脂肪胶的制备

[0031] 兔麻醉后常规消毒腹股沟区域，取5ml脂肪组织于无菌烧杯。充分剪碎后转移到10ml注射器中。使用一个内径为 2.5mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器90次得到乳化的脂肪。使用2000g/分的转速离心3分钟，如图1所示，可以观察到脂肪组织分为
3层，取中间层为终产物脂肪胶。脂肪胶比脂肪组织更具有均一性，同时可注射行好。扫描电镜观察发现脂肪胶内不含脂肪细胞，同时可见疏松多孔的纤维结构富集。

[0032] 实施例2：脂肪胶的制备

[0033] 兔麻醉后常规消毒腹股沟区域，取5ml脂肪组织于无菌烧杯。充分剪碎后转移到10ml注射器中。使用一个内径为 1.5mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器30次得到乳化的脂肪。使用3200g/分的转速离心3分钟，可以观察到脂肪组织分为3层，取中间层为终产物脂肪胶。脂肪胶比脂肪组织更具有均一性，同时可注射行好。扫描电镜观察发现脂肪胶内不含脂肪细胞，同时可见疏松多孔的纤维结构富集。

[0034] 实施例3：脂肪胶的制备

[0035] 兔麻醉后常规消毒腹股沟区域，取5ml脂肪组织于无菌烧杯。充分剪碎后转移到10ml注射器中。使用一个内径为 2mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器200次得到乳化的脂肪。使用2000g/分的转速离心5分钟，可以观察到脂肪组织分为3层，取中间层为终产物脂肪胶。脂肪胶比脂肪组织更具有均一性，同时可注射行好。扫描电镜观察发现脂肪胶内不含脂肪细胞，同时可见疏松多孔的纤维结构富集。

[0036] 实施例4：脂肪胶的制备

[0037] 兔麻醉后常规消毒腹股沟区域，取5ml脂肪组织于无菌烧杯。充分剪碎后转移到10ml注射器中。使用一个内径为 2.5mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器150次得到乳化的脂肪。使用1000g/分的转速离心10分钟，可以观察到脂肪组织分为3层，取中间层为终产物脂肪胶。脂肪胶比脂肪组织更具有均一性，同时可注射行好。扫描电镜观察发现脂肪胶内不含脂肪细胞，同时可见疏松多孔的纤维结构富集。

[0038] 实施例5：脂肪胶的制备

[0039] 兔麻醉后常规消毒腹股沟区域，取5ml脂肪组织于无菌烧杯。充分剪碎后转移到10ml注射器中。使用一个内径为 2.5mm的连通器连接两个注射器，来回推拉两个注射器90次得到乳化的脂肪。使用3200g/分的转速离心1分钟，可以观察到脂肪组织分为3层，取中间层为终产物脂肪胶。脂肪胶比脂肪组织更具有均一性，同时可注射行好。扫描电镜观察发现脂肪胶内不含脂肪细胞，同时可见疏松多孔的纤维结构富集。

[0040] 实施例6：脂肪胶来源的间充质干细胞ADSCs的制备、特征和多向分化能力鉴定[0041] 将实施例1中制备的脂肪胶放入含有5% CO2的37℃细胞培养箱培养14天，如图2所示，可观察到梭形的细胞爬出。通过成软骨、成骨和成脂诱导培养3周，使用阿利新蓝、茜素红、油红O分别染色出现阳性，说明脂肪胶内的ADSCs具有向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞多向分化的潜能。

[0042] 效果例：

[0043] 为了说明本发明的自体脂肪胶对软骨损伤的修复效果，本发明进行了下列效果试验。

[0044] 1、 脂肪胶对关节软骨损伤修复的研究手术方法

[0045] 每只兔随机取左侧或者右侧膝关节进行手术。兔常规麻醉后消毒膝关节区域，逐层打开关节腔，使用4mm的角膜环钻在股骨远端滑车部位钻1.5mm深的圆形缺损。对缺损处进行单纯微骨折处理，或者注射0.1 mL自体脂肪胶（制备方法见实施例1）。其中单纯微骨折作为对照组（MF组），注射自体脂肪胶（具体方法见实施例1）作为实验组（脂肪胶组）。观察6周和12周的修复效果。

[0046] 2、磁共振成像（MRI）结果

[0047] 如图3提供的MRI图像显示，在术后6周，MF组缺损仍然较大，脂肪胶组的缺损几乎被新生软骨填满，但是厚度不及正常软骨。在第12周时，MF组的缺损新生组织不规则伴有粗糙的表面。相反，脂肪胶组中观察到软骨修复更均匀并且缺损被完全填充。此外，脂肪胶组中修复组织的信号强度与相邻正常软骨的信号强度相似。MRI结果表明，与临床上广泛使用的单纯MF治疗相比，脂肪胶组具有更好的软骨修复效果。

[0048] 3、大体观察和ICRS评分

[0049] 在任何动物中均未观察到并发症。术后6周，MF组的缺损处有一些血块样组织，而脂肪胶组的缺损处新生组织更完整和更均匀。两组在6周时修复部位的边界仍然很明显（图4A）。在12周时，MF组的再生组织表面比较粗糙，和周围正常软骨界限仍明显。然而，在脂肪胶组中，新生组织具有光滑表面，与周围区域融合，并且具有与正常软骨相似的颜色和质地，表明形成了透明软骨样组织（图4B）。这些发现表明，脂肪胶可有效促进软骨缺损的填充并促进新软骨的再生。此外，脂肪胶组的ICRS评分显著高于MF组，提示脂肪胶的修复效果可能较MF更好。

[0050] 4、HE染色和甲苯胺蓝染色结果

[0051] 如图5所示，HE结果显示，在6周和12周时，MF组新生组织和旁边的正常软骨组织仍然有明显的分界线，伴有较多的纤维状组织产生。而脂肪胶组在12周时新生组织与周围正常软骨基本完全融合，并且组织结构和正常软骨贴近。6周时，MF组甲苯安蓝染色很弱，而脂肪胶组染色较深；到12周时，MF组染色仍然较弱，而脂肪胶组染色较深和周围正常软骨相似。同时，脂肪胶组的组织学评分显著高于MF组，提示脂肪胶修复效果更好。

[0052] 应用例：本发明临床应用场景

[0053] 如图6所示，本发明的技术方案可以应用于关节镜手术中，收集遮挡术野的髌下脂肪垫组织，充分剪碎后来回推拉数次以乳化脂肪，过滤或不过滤直接离心后得到分层结构。脂肪胶位于中间层，取出后去除最下层的液体和最上层油层后，获得的脂肪胶可以用于软骨损伤的治疗。

[0054] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。