一种组织修复蛋白CHRD、其编码基因及其应用

摘要

本发明涉及生物医药和日用品领域，具体涉及一种组织修复蛋白CHRD、其编码基因及其应用。所述蛋白，是如下a1或a2的蛋白质：a1.氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；a2.将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的与皮肤创面修复相关的蛋白质。经实验证明，CHRD蛋白对单纯皮肤创面修复以及辐射伴皮肤损伤的创面都具有显著的修复效果，与无菌医用纱布相比，CHRD蛋白使辐射伴皮肤损伤的创面愈合速度提高了30％左右。

权利要求

1.一种蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、载体或重组菌。

5.权利要求1所述的蛋白在制备用于皮肤创面修复的外用制品中的用途。

6.用于皮肤创面修复的外用制品，其特征在于，包含权利要求1所述的蛋白。

7.根据权利要求6所述的外用制品，其特征在于，还包含可用于皮肤创面修复的赋形剂。

8.根据权利要求6所述的外用制品，其特征在于，所述外用制品的剂型为粉末、凝胶、乳膏或乳霜。

9.制备用于皮肤创面修复的外用制品的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求

2或3所述的编码基因导入表达宿主菌中，得到重组菌；培养重组菌，诱导蛋白表达，收集菌体，提取和纯化蛋白。

说明书

一种组织修复蛋白CHRD、其编码基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药和日用品领域，具体涉及一种用于皮肤创伤修复的重组蛋白CHRD、其编码基因及其应用。

背景技术

[0002] 皮肤是人体的重要屏障，各类手术、外伤、烧伤、皮炎等均会导致皮肤破坏和缺损，引起各种各样的创伤。创伤修复是指由于外伤或其他伤病的病变造成组织缺损(如伤口、创
面等)后，局部组织通过再生、修复、重建而进行修补的一系列病理生理过程，是医学发展的
重要领域，对于减轻病患痛苦，避免修复后留下疤痕有着重要的意义。

[0003] 创伤修复的过程需要借助于新型的医用材料，特别是生物医学材料，生物医用材料(biomaterials)是用于与生命系统接触和发生相互作用的，并能对其细胞、组织和器官
进行诊断治疗、替换修复或诱导再生的一类天然或人工合成的特殊功能材料，又称生物医
用材料。根据材质不同，生物医学材料可分为医用高分子材料，医用金属材料和民用非金属
材料等几大类。传统敷料主要是指医用脱脂棉纱布，虽然它有许多优点，但是其应用并不令
人满意。例如，其吸液量不够大，需要厚厚包扎并经常更换；敷料在吸液后易干燥，并与伤口
发生粘连而造成二次创伤，不便使用等缺点。蛋白质材料由于良好的生物相容性和生物降
解性，广泛用作生物医用材料。重组蛋白表达具有快速大规模生产、环境友好、质量易控制
等优点，是设计和生产蛋白生物材料的重要手段。

[0004] 因此，开发用于创伤修复的蛋白质敷料是很好的选择。

发明内容

[0005] 为满足上述领域的需求，本发明设计了一条全新的氨基酸序列，并运用重组蛋白表达方法获得了一种全新的蛋白质，命名为CHRD蛋白。经实验证明，CHRD蛋白与纱布相比，
对单纯皮肤创面修复以及辐射联合皮肤创面都具有显著的修复效果。

[0006] 本发明提供的蛋白，是如下a1或a2的蛋白质：

[0007] a1.氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；

[0008] a2.将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的与皮肤创面修复相关的蛋白质。

[0009] 本发明还提供所述蛋白的编码基因。

[0010] 所述编码基因为如下b1或b2的DNA分子：

[0011] b1.核苷酸序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

[0012] b2.在严格条件下与b1限定的DNA分子杂交的DNA分子。

[0013] 含有所述编码基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0014] 所述蛋白在制备用于皮肤创面修复的外用制品中的用途也属于本发明的保护范围。

[0015] 本发明还提供用于皮肤创面修复的外用制品，所述外用制品包含本发明所述的蛋白。

[0016] 在本发明的一些实施例中，所述外用制品还包含可用于皮肤创面修复的赋形剂。

[0017] 在本发明的一些实施例中，所述外用制品的剂型为粉末、凝胶、乳膏或乳霜。

[0018] 在本发明的一些实施例中，所述蛋白在所述外用制品中的质量分数为10％～100％。

[0019] 本发明还提供一种制备用于皮肤创面修复的外用制品的方法，包括如下步骤：将本发明所述的编码基因导入表达宿主菌中，得到重组菌；培养重组菌，诱导蛋白表达，收集
菌体，提取和纯化蛋白。

[0020] 通过动物实验发现，CHRD蛋白对单纯皮肤创面修复以及辐射联合皮肤创面都具有显著的修复效果。对于单纯大鼠皮肤创面，CHRD蛋白在创伤后第7天即可修复70.38％的皮
肤创面，第21天可完全修复皮肤创面。对于大鼠辐射联合皮肤创面，CHRD蛋白在创伤后第21
天可修复97.36％的皮肤创面。与纱布相比，CHRD蛋白使创面愈合速度提高了30％左右。本
发明提供的CHRD蛋白具有良好的生物相容性，使用时只需将CHRD蛋白敷在创面上，与纱布
相比，不会造成创口二次损伤，能够更加有效地对创伤性皮肤进行修复，减轻伤者痛苦。

附图说明

[0021] 图1.pET‑20b质粒图谱。

[0022] 图2.CHRD蛋白电泳图谱；其中，左侧泳道为蛋白分子标记，右侧泳道为纯化的CHRD蛋白。

[0023] 图3.CHRD蛋白对小鼠成纤维细胞L929存活率的影响；其中，横坐标为培养基中的CHRD蛋白浓度，纵坐标为细胞存活率(％)，以培养基中不加CHRD蛋白的对照组细胞的存活
率为100％。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例进一步阐述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

[0025] 材料与试剂

[0026] SD大鼠：雄性，体重为250‑300g，由重庆医科大学提供。

[0027] 小鼠成纤维细胞L929：购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号SCSP‑5039，细胞名称：NCTC clone 929[L cell,L‑929,derivative of Strain L]，动物种
别：小鼠，C3H/An品系。

[0028] pET‑20b，别名pET20b+，购自Novagen公司，货号69739‑3，规格为质粒干粉。pET‑20b质粒是一个大肠杆菌蛋白表达载体，质粒大小为3716bp，原核抗性为Amp，T7启动子，T7
终止子。

[0029] 5ml His Trap FF层析柱，购自博格隆(上海)生物技术有限公司，货号AH221311。

[0030] 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、Ampicillin(氨苄青霉素)、IPTG、DMEM培养基、二甲基亚砜(DMSO)、MTT均购自北京索莱宝科技有限公司。

[0031] 水合氯醛：别名三氯乙醛水合物，CAS号302‑17‑0，购自Sigma‑Aldrich，货号C8383。

[0032] MTT配制

[0033] 用PBS溶解MTT，60℃水浴助溶。PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO40.24g，溶于950ml ddH2O中，调pH 7.4，定容至1L。

[0034] LB培养基

[0035] 每100ml LB培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，pH 7.4。

[0036] 配制方法：在950ml ddH2O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH2O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压
蒸汽灭菌20min。

[0037] 本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例
如分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory 
manual，2001)，或制造厂商说明书。

[0038] 实施例1.CHRD基因设计及蛋白表达

[0039] 1.基因设计

[0040] 发明人设计了一个基因，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示，全长1719bp。该基因编码一种蛋白，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示，全长572个氨基酸，被命名为
CHRD蛋白。委托生工生物工程(上海)有限公司对该基因进行全基因合成并在基因的5’端和
3’端分别加上Ndel酶切位点(CATATG)和Xhol酶切位点(CTCGAG)。带有酶切位点的基因序列
如序列表中的序列3所示。对合成的基因进行测序验证，序列正确的基因用于后续的载体构
建。

[0041] CHRD的氨基酸序列(572aa)

[0042] MSSGVDLGTENLYFQSNAMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRKKMKGVQLKLEQGALEEQCATYEAGCYRNHVHLQLLEHQETEFSAKMISQLESRQKEQGLTDGELKEAQQT
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[0043] CHRD的核苷酸序列(1719bp)

[0044] atgagcagcggcgtggatctgggcaccgaaaacctgtattttcagagcaacgcgatgagcgatagcgaagtgaaccaggaagcgaaaccggaagtgaaaccggaagtgaaaccggaaacccatattaacctgaaagtgagcgat
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[0045] 带酶切位点的CHRD蛋白编码基因(1728bp)

[0046] catatgagcagcggcgtggatctgggcaccgaaaacctgtattttcagagcaacgcgatgagcgatagcgaagtgaaccaggaagcgaaaccggaagtgaaaccggaagtgaaaccggaaacccatattaacctgaaagtgagc
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[0047] 2.载体构建

[0048] 采用pET‑20b质粒作为表达载体，用限制性内切酶Ndel和Xhol分别对pET‑20b质粒和目的基因(序列3)进行双酶切反应，然后通过连接反应将目的基因连接到pET‑20b载体
中。载体构建委托生工生物工程(上海)有限公司进行。

[0049] 3.转化

[0050] (1)从‑80℃冰箱中取出大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴5min。

[0051] (2)待保存细胞的甘油融化后，将感受态细胞加入连接产物中，枪头吸放3次混匀，冰浴静置30min。

[0052] (3)用吸水纸迅速擦干管壁的水分，然后42℃热激90s，立即冰浴2‑3min。

[0053] (4)在无菌条件下加入800μl的LB液体培养基，37℃，150rpm培养45min。

[0054] (5)5000rpm离心5min收集菌体，弃大部分上清，留下100μl左右的上清重悬大肠杆菌，然后均匀地涂布于含有100μg/ml Ampicillin(氨苄青霉素)的LB固体培养基上(简称为
LB+Amp)，放入37℃恒温箱中，倒置培养12h～16h。

[0055] (6)挑取单克隆接种于LB+Amp培养基中，37℃培养12h～16h后，将菌液送生工生物工程(上海)有限公司，利用T7通用引物进行PCR反应，对PCR产物进行测序，鉴定阳性克隆。

[0056] 4.蛋白表达和纯化

[0057] (1)大量培养

[0058] 将测序正确的阳性克隆接于1L含50μg/ml抗生素(Ampicillin)的LB培养基，37℃110rpm培养，待OD600＝0.6时加0.5mM IPTG诱导剂，37℃继续培养4h，离心收集菌体。

[0059] (2)蛋白纯化

[0060] 平衡层析柱：将注射器用蒸馏水装满。移除5ml His Trap FF层析柱(上海博格隆)的塞子，把柱子连接到注射器上。保持连接处一直有液体，避免向系统中引入气泡。除掉柱
子底部的密封。用3‑5倍柱体积的去离子水洗去乙醇。用至少5个柱体积的结合Buffer平衡
柱子，流速5ml/min。结合buffer的配方为：0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH 7.0。

[0061] 上样：取大量培养获得的菌体20g，用100ml细胞裂解液(B‑Per裂解液，购自Thermo Fisher公司)重悬菌体，使用均质机破碎细胞后，10000rpm离心30分钟，取上清10ml，用注射
器加入5ml His Trap FF层析柱(经结合Buffer平衡)中，流速5ml/min。

[0062] 洗涤：用结合buffer冲洗层析柱5‑10个柱体积，直到流出物中没有物质流出，流速5ml/min。

[0063] 洗脱：用含不同浓度咪唑(0mM，10mM，30mM，500mM)的结合buffer洗脱层析柱，流速5ml/min，收集洗脱蛋白。

[0064] 其中，500mM咪唑洗脱液为目的蛋白，蛋白大小为64.9kDa。将纯化的CHRD蛋白经过冷冻干燥后研磨碎，进行后续试验。

[0065] 实施例2.CHRD蛋白的创面愈合性能评价

[0066] 1.单纯皮肤创面愈合效果评价

[0067] 选用体重为250‑300g的雄性SD大鼠创建背部全真皮创伤模型。将9只SD大鼠随机分为3组，每组3只，其中2组作为实验组，1组作为对照组，通过腹腔注射水合氯醛(10wt％)
进行麻醉(0.5mL/100g)。在无菌条件下，背部剃毛并进行常规消毒后，以脊柱为中线创建
2
1.0×1.0cm大小的皮肤切除创面。2个实验组分别用纱布和CHRD粉末进行修复治疗，其中
纱布组用无菌纱布包扎伤口(纱布每3天更换一次)，CHRD组用CHRD粉末均匀地敷在伤口上
(敷料每3天更换一次)。对照组用无菌纱布止血后暴露伤口，无菌环境中饲养，观察创面的
愈合过程。实验组和对照组的SD大鼠均饲养在22℃温度，50‑60％湿度的环境中，正常饮食。
创伤后第7、10、14、和21天拍照记录创口修复情况并计算皮肤创面愈合率。皮肤创面愈合率
(％)＝(皮肤愈合面积/皮肤创面总面积)×100％。每组的皮肤创面愈合率为该组3只大鼠
的皮肤创面愈合率的平均值。

[0068] 结果如表1所示，对于单纯大鼠皮肤创面，CHRD组的修复效果>纱布组>空白组。CHRD组在创伤后第7天皮肤创面就愈合了70.38％，第21天皮肤创面完全愈合。与纱布组相
比，CHRD组的创面愈合速度提高了30％左右。

[0069] 表1.CHRD蛋白用于单纯大鼠皮肤创面愈合的效果

[0070]

[0071] 2.辐射联合皮肤创面愈合效果评价

[0072] 选用体重为250‑300g的雄性SD大鼠进行实验。将9只SD大鼠随机分为3组，每组3只，其中2组作为实验组，1组作为对照组，通过腹腔注射水合氯醛(10wt％)进行麻醉
(0.5mL/100g)。在无菌条件下，背部剃毛并进行常规消毒后，以脊柱为中线创建1.0×
2
1.0cm大小的皮肤切除创面，创建背部全真皮创伤模型。然后使用β射线对皮肤切除创面进
行照射(1.5Gy)，建立辐射复合创伤模型。2个实验组分别用纱布和CHRD粉末进行修复治疗，
其中纱布组用无菌纱布包扎伤口(纱布每3天更换一次)，CHRD组用CHRD粉末均匀地敷在伤
口上(敷料每3天更换一次)。对照组用无菌纱布止血后暴露伤口，无菌环境中饲养，观察创
面的愈合过程。实验组和对照组的SD大鼠均饲养在22℃温度，50‑60％湿度的环境中，正常
饮食。创伤后第7、10、14、和21天拍照记录创口修复情况。皮肤创面愈合率(％)＝(皮肤愈合
面积/皮肤创面总面积)×100％。每组的皮肤创面愈合率为该组3只大鼠的皮肤创面愈合率
的平均值。

[0073] 结果如表2所示，大鼠皮肤创面经辐射后其修复速度减慢，CHRD蛋白对于促进辐射联合皮肤创面愈合同样具有显著效果，CHRD组的修复效果>纱布组>空白组。CHRD组在创伤
后第21天皮肤创面愈合97.36％，与纱布组相比，创面愈合速度提高了30％左右。

[0074] 表2.CHRD蛋白用于大鼠辐射联合皮肤创面愈合的效果

[0075] 组别 7天 14天 21天对照组 15.99％ 35.03％ 55.17％
纱布组 30.09％ 45.14％ 67.34％
CHRD组 55.18％ 79.98％ 97.36％

[0076] 实施例3.CHRD蛋白的生物安全性评价

[0077] 使用MTT法研究CHRD蛋白对小鼠成纤维细胞L929(中国科学院典型培养物保藏委4
员会细胞库)的毒性以评价CHRD蛋白的生物安全性。将小鼠成纤维细胞L929以1×10浓度/
孔接种到96孔板中的DMEM培养基(北京索莱宝)中。设置五个实验组和一个对照组，每组设
置三个复孔。37℃培养细胞24h后，向实验组的孔中加入CHRD蛋白，使五个实验组的CHRD蛋
白终浓度分别为50mg/L，100mg/L，200mg/L，400mg/L，800mg/L。对照组不加CHRD蛋白。37℃
继续培养24h，然后使用MTT法检测活细胞数量，步骤如下：每孔加入10μl MTT溶液(5mg/
ml)，37℃继续培养4h。1000rpm离心10min，小心吸掉上清，每孔加入100μl二甲基亚砜(北京
索莱宝)，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。然后在酶联免疫检测仪OD570nm
(630nm校准)测量各孔的吸光值。

[0078] 利用测量的吸光值计算细胞存活率。计算方法：处理组吸光值/对照组吸光值×100％。每组的细胞存活率为该组三个复孔的细胞存活率的平均值。以对照组的细胞存活率
为100％作图，结果如图3所示，细胞在添加50‑800mg/L浓度范围的CHRD蛋白后表现出较高
的存活率，证明CHRD蛋白具有良好的生物相容性。