一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用转让专利
申请号 : CN202010139042.9
文献号 : CN111303267B
文献日 : 2021-09-24
发明人 : 杨兆勇 , 姬钰滢 , 金媛媛 , 陈静 , 邹森 , 樊帅 , 王忠博 , 石北辰 , 孙正阳
申请人 : 卓尔康(北京)生物科技有限公司
摘要 :
本发明提供了一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用，属于生命科学技术领域，所述具有增强NK细胞杀伤活性的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述多肽与NK细胞孵育后，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高NK细胞穿孔素和CD107a的表达量。
权利要求 :
1.一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的多肽在制备增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述NK细胞为脐血来源的NK细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脐血来源的NK细胞为脐血单个核细胞经体外诱导分化获得。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中多肽的使用浓度为20 30μmol/~
L。
6.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，将所述药物与NK细胞混合孵育获得对肿瘤细胞杀伤活性增强的NK细胞。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述混合孵育的时间为6 18h。
~
8.权利要求1所述的多肽在制备提高NK细胞穿孔素的表达量的试剂中的应用。
9.权利要求1所述的多肽在制备提高NK细胞CD107a的表达量的试剂中的应用。
10.权利要求1所述的多肽在制备阻滞肿瘤细胞细胞周期的药物中的应用。
说明书 :
一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生命科学技术领域，尤其涉及一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤的发病率逐年提高，已成为全球致死率较高的疾病之一，曾被人们视为不治之症。其中，肿瘤的复发和转移是恶性肿瘤较难治愈的根源之一。究其根本，在于肿瘤
细胞的免疫逃逸。自然杀伤(natural killer，NK)细胞属于固有免疫细胞的一员，在肿瘤的
免疫监视过程中发挥着极其重要的作用。NK细胞作为机体抗肿瘤及抗感染的第一道防线，
在杀伤肿瘤细胞的过程中，不需要肿瘤特异性抗原的识别便可以直接发挥杀伤效应，故NK
细胞对肿瘤细胞的杀伤作用比T淋巴细胞的作用要更直接、更迅速，是肿瘤免疫治疗的重要
效应细胞。
细胞的免疫逃逸。自然杀伤(natural killer，NK)细胞属于固有免疫细胞的一员，在肿瘤的
免疫监视过程中发挥着极其重要的作用。NK细胞作为机体抗肿瘤及抗感染的第一道防线，
在杀伤肿瘤细胞的过程中，不需要肿瘤特异性抗原的识别便可以直接发挥杀伤效应，故NK
细胞对肿瘤细胞的杀伤作用比T淋巴细胞的作用要更直接、更迅速，是肿瘤免疫治疗的重要
效应细胞。
[0003] NK细胞过继性免疫治疗是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。由于外周血中NK细胞含量少(约占淋巴细胞的5％～10％)，体外扩增高效的NK细胞则成为NK细胞治疗
的关键问题之一。NK细胞不是均质性群体，其膜表面分子在不同的NK细胞表面表达密度各
不相同，而表达不同膜表面分子的NK细胞在分泌细胞因子和杀伤活性等方面亦有所不同。
因此NK细胞在体外扩增过程中要考虑扩增的选择性。
的关键问题之一。NK细胞不是均质性群体，其膜表面分子在不同的NK细胞表面表达密度各
不相同，而表达不同膜表面分子的NK细胞在分泌细胞因子和杀伤活性等方面亦有所不同。
因此NK细胞在体外扩增过程中要考虑扩增的选择性。
[0004] 优化细胞因子组合能够诱导NK细胞向特定细胞毒性亚群扩增，如IL‑2、IL‑15和‑
IL‑21能够改变NK细胞特性，从而用于向特异的亚型发展。IL‑2和IL‑15能够诱导KIR的NK
细胞亚群表达KIR受体，诱导C凝集素受体NKG2D和自然杀伤毒性受体NKp44表达。而IL‑21的
加入能够改变KIR受体的组成，通过降低接头蛋白DAP‑12的表达抑制NKp44的表达。IL‑21能
维持IFN‑γ的产生，增强NK细胞毒性。Takahashi等(Takahashi E，Kuranaga N，Satoh K，et
+ bright
al.Induction of CD16 CD56 NK cells with antitumour cytotoxicity not only
‑ bright ‑ dim
from CD16 CD56 NK Cells but also from CD16 CD56 NK cells.Scand J
‑
Immunol，2007；65(2):126－138)考查了细胞因子对NK细胞亚型的影响，特别是对CD16
dim ‑ bright
CD56 和CD16CD56 NK细胞的影响。当IL‑2、IL‑12和IL‑15对外周血单核细胞联合培养
bright
几天后，CD56 NK细胞亚群能扩增到15％，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性。细胞因子能够
‑ dim ‑ bright
刺激在外周血中含量较少的CD16CD56 和CD16 CD56 NK细胞大量扩增，而在外周血中
+ dim ‑ bright
含量较多的CD16CD56 扩增能力较弱。而且，很多静止的CD16 CD56 NK细胞会诱导成
+ bright ‑ dim ‑ bright
CD16CD56 细胞，而CD16CD56 NK细胞在诱导成为CD16CD56 细胞，又进一步诱导
+ bright ‑ dim ‑ bright
为CD16 CD56 细胞。CD16CD56 和CD16 CD56 NK细胞能够产生大量的IFN‑γ和Fas
+ bright
配体。CD16CD56 NK细胞对表达或不表达MHC‑I类分子的肿瘤细胞均有很强的杀伤活
性。IL‑21与IL‑2在维持人NK细胞存活的能力是相同的。在没有其他细胞因子的作用下，IL‑
21对NK细胞受体的表达几乎没有影响。然而，IL‑21和IL‑2协同可上调NK细胞表面多种受体
+ + bright
的表达，包括NKG2A、CD25、CD86和CD69。CD25CD86NK细胞属于CD56 NK细胞亚群，含有大
颗粒。IL‑21能在mRNA和蛋白水平上上调穿孔素和颗粒酶A/B的表达。另外，IL‑21能增强NK
细胞对K562靶细胞的毒性。以上研究表明IL‑21通过诱导效应分子和调节表面受体表达来
调节NK细胞活性。
IL‑21能够改变NK细胞特性，从而用于向特异的亚型发展。IL‑2和IL‑15能够诱导KIR的NK
细胞亚群表达KIR受体，诱导C凝集素受体NKG2D和自然杀伤毒性受体NKp44表达。而IL‑21的
加入能够改变KIR受体的组成，通过降低接头蛋白DAP‑12的表达抑制NKp44的表达。IL‑21能
维持IFN‑γ的产生，增强NK细胞毒性。Takahashi等(Takahashi E，Kuranaga N，Satoh K，et
+ bright
al.Induction of CD16 CD56 NK cells with antitumour cytotoxicity not only
‑ bright ‑ dim
from CD16 CD56 NK Cells but also from CD16 CD56 NK cells.Scand J
‑
Immunol，2007；65(2):126－138)考查了细胞因子对NK细胞亚型的影响，特别是对CD16
dim ‑ bright
CD56 和CD16CD56 NK细胞的影响。当IL‑2、IL‑12和IL‑15对外周血单核细胞联合培养
bright
几天后，CD56 NK细胞亚群能扩增到15％，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性。细胞因子能够
‑ dim ‑ bright
刺激在外周血中含量较少的CD16CD56 和CD16 CD56 NK细胞大量扩增，而在外周血中
+ dim ‑ bright
含量较多的CD16CD56 扩增能力较弱。而且，很多静止的CD16 CD56 NK细胞会诱导成
+ bright ‑ dim ‑ bright
CD16CD56 细胞，而CD16CD56 NK细胞在诱导成为CD16CD56 细胞，又进一步诱导
+ bright ‑ dim ‑ bright
为CD16 CD56 细胞。CD16CD56 和CD16 CD56 NK细胞能够产生大量的IFN‑γ和Fas
+ bright
配体。CD16CD56 NK细胞对表达或不表达MHC‑I类分子的肿瘤细胞均有很强的杀伤活
性。IL‑21与IL‑2在维持人NK细胞存活的能力是相同的。在没有其他细胞因子的作用下，IL‑
21对NK细胞受体的表达几乎没有影响。然而，IL‑21和IL‑2协同可上调NK细胞表面多种受体
+ + bright
的表达，包括NKG2A、CD25、CD86和CD69。CD25CD86NK细胞属于CD56 NK细胞亚群，含有大
颗粒。IL‑21能在mRNA和蛋白水平上上调穿孔素和颗粒酶A/B的表达。另外，IL‑21能增强NK
细胞对K562靶细胞的毒性。以上研究表明IL‑21通过诱导效应分子和调节表面受体表达来
调节NK细胞活性。
[0005] 有研究发现，细胞因子IL‑12、IL‑15和IL‑18能够激活NK细功能，然而共培养48h+
后，细胞发生明显凋亡。CD56细胞用IL‑15/IL‑12或IL‑15/IL‑18孵育18h后，洗涤，进一步
+
在无细胞因子培养基中培养，凋亡较少。这种短期激活的CD56细胞对NK和LAK敏感的肿瘤
靶细胞有很高的杀伤活性。每隔8d，就与细胞因子作用6h，共培养18d。这种重复的短期与细
+ +
胞因子作用的培养方式够使CD56细胞长期存活，同时CD16的表达降低较慢，因此与CD56和
细胞因子的长期孵育相比表现出较强的ADCC作用。
后，细胞发生明显凋亡。CD56细胞用IL‑15/IL‑12或IL‑15/IL‑18孵育18h后，洗涤，进一步
+
在无细胞因子培养基中培养，凋亡较少。这种短期激活的CD56细胞对NK和LAK敏感的肿瘤
靶细胞有很高的杀伤活性。每隔8d，就与细胞因子作用6h，共培养18d。这种重复的短期与细
+ +
胞因子作用的培养方式够使CD56细胞长期存活，同时CD16的表达降低较慢，因此与CD56和
细胞因子的长期孵育相比表现出较强的ADCC作用。
[0006] 环孢菌素A(CsA)一般用于防止移植物抗宿主反应(GVHD)。在含IL‑2和IL‑15的NK+ + +
细胞培养基中加入或不加CsA1周后，与对照相比，CsA的加入使CD56CD16KIRNK细胞减少，
+ ‑ ‑ dim
而相应的CD56 CD16 KIR 细胞增多。这种改变主要是CD56 NK细胞扩增减少，而CSA对
bright 2+
CD56 细胞没有影响。同靶细胞K562共培养后，CSA作用的NK细胞Ca 流动减少，NFAT去磷
酸化。CsA增加NKp30的表达，降低NKp44和NKG2D的表达。随后IL‑12和IL‑18刺激后，CsA作用
的NK细胞分泌更多的IFN‑γ。因此CsA影响NK细胞的功能和表型，对GVL有重要作用。
细胞培养基中加入或不加CsA1周后，与对照相比，CsA的加入使CD56CD16KIRNK细胞减少，
+ ‑ ‑ dim
而相应的CD56 CD16 KIR 细胞增多。这种改变主要是CD56 NK细胞扩增减少，而CSA对
bright 2+
CD56 细胞没有影响。同靶细胞K562共培养后，CSA作用的NK细胞Ca 流动减少，NFAT去磷
酸化。CsA增加NKp30的表达，降低NKp44和NKG2D的表达。随后IL‑12和IL‑18刺激后，CsA作用
的NK细胞分泌更多的IFN‑γ。因此CsA影响NK细胞的功能和表型，对GVL有重要作用。
[0007] 然而上述方法往往需要多种细胞因子联合应用才能起到诱导扩增NK细胞的目的，不仅增加了成本，同时临床不确定的危害无法评估，无法在工业上大规模生产。因此亟需开
发能克服上述缺陷的NK细胞诱导扩增方法。
发能克服上述缺陷的NK细胞诱导扩增方法。
发明内容
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽及其应用；所述多肽与NK细胞孵育后，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011] 本发明提供了所述的多肽在制备增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物中的应用。
[0012] 优选的，所述NK细胞为脐血来源的NK细胞。
[0013] 优选的，所述脐血来源的NK细胞为脐血单个核细胞经体外诱导分化获得。
[0014] 优选的，所述药物中多肽的使用浓度为20～30μmol/L。
[0015] 优选的，将所述药物与NK细胞混合孵育获得对肿瘤细胞杀伤活性增强的NK细胞。
[0016] 优选的，所述混合孵育的时间为6～18h。
[0017] 本发明提供了所述的多肽在制备提高NK细胞穿孔素的表达量的试剂中的应用。
[0018] 本发明提供了所述的多肽在制备提高NK细胞CD107a的表达量的试剂中的应用。
[0019] 本发明提供了所述的多肽在制备阻滞肿瘤细胞细胞周期的药物中的应用。
[0020] 本发明的有益效果：本发明提供的具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高NK细胞穿孔素和CD107a的表达量；与所述多肽孵育
后的NK细胞能够使肿瘤细胞的细胞周期阻滞，并促使肿瘤细胞凋亡。
后的NK细胞能够使肿瘤细胞的细胞周期阻滞，并促使肿瘤细胞凋亡。
附图说明
[0021] 图1为本发明提供的多肽的质谱图；
[0022] 图2为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养20d后的流式细胞术检测结果；C为NKp30在NK细胞中表
达为97.6％；D为NKG2D在NK细胞中的表达为91％；
达为97.6％；D为NKG2D在NK细胞中的表达为91％；
[0023] 图3为通过流式分析NK细胞对K562细胞周期的阻滞作用；其中A为在多肽的参与下共同作用8h后，测K562的周期水平；B为在多肽的参与下共同作用16h后，测K562的周期水
平；C为对G2期细胞进行统计，表明细胞停止在G2期。
平；C为对G2期细胞进行统计，表明细胞停止在G2期。
[0024] 图4为荧光染色显示细胞的凋亡情况：其中A中的a、b表示共同作用8h的凋亡现象，a为对照，b为加入多肽D组；c、d表示共同作用16h的凋亡现象，c为对照，d为加入多肽D组；B
为计算的凋亡率；
为计算的凋亡率；
[0025] 图5为流式细胞术分析实验组与对照组的K562细胞凋亡情况；其中A为对照组(不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵育8h)的凋亡率14.32％；B为实验组(25μM多肽作用下NK细
胞与K562细胞共孵育8h)的凋亡率18.07％；C为对照组(不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵
育16h)的凋亡率26.71％；D为实验组(25μmol/L多肽作用下NK细胞与K562细胞共同孵育
16h)的凋亡率30.74％；
胞与K562细胞共孵育8h)的凋亡率18.07％；C为对照组(不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵
育16h)的凋亡率26.71％；D为实验组(25μmol/L多肽作用下NK细胞与K562细胞共同孵育
16h)的凋亡率30.74％；
[0026] 图6为多肽对NK细胞中穿孔素和CD107a表达量的影响；其中A为在多肽分别作用8h和16h后穿孔素和CD107a蛋白表达情况；B为通过灰度值的计算得出在8h时，穿孔素蛋白较
对照组有明显增加且具有统计学意义；C为通过灰度值的计算得出在16h时，CD107a蛋白较
对照组有明显增加且具有统计学意义；D为qPCR方法检测PRF1、GZMB、LAMP1三个基因，观察
基因水平上的变化。
对照组有明显增加且具有统计学意义；C为通过灰度值的计算得出在16h时，CD107a蛋白较
对照组有明显增加且具有统计学意义；D为qPCR方法检测PRF1、GZMB、LAMP1三个基因，观察
基因水平上的变化。
具体实施方式
[0027] 本发明提供了一种具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：LDFEHFLPMLQTVAK。在本发明中，所述多肽也称为多肽D。
[0028] 在本发明中，所述多肽来源于山羊肌球蛋白轻链6(gMYL6)，本发明中所述多肽是根据所述山羊肌球蛋白轻链6的保守型及特异性空间位点分析，设计而成。在本发明中，对
所述多肽的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的多肽制备方法即可，在本发明具体
实施过程中，所述多肽优选的通过固相合成的方法制备获得。
所述多肽的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的多肽制备方法即可，在本发明具体
实施过程中，所述多肽优选的通过固相合成的方法制备获得。
[0029] 本发明还提供了所述的多肽在制备增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的药物中的应用。在本发明中，所述NK细胞优选为脐血来源的NK细胞；所述脐血来源的NK细胞优选为脐
血单个核细胞经体外诱导分化获得。在本发明中，所述体外诱导分化优选的包括：1)将所述
脐血单个核细胞、活化培养因子和重组人白介素‑2混合在X‑VIVO 15细胞培养基中培养1～
5d获得细胞液；2)收集所述细胞液中的细胞，将收集到的细胞、重组人白介素‑2在X‑VIVO
15细胞培养基中培养14～35d获得脐血来源的NK细胞。在本发明中，步骤1)中所述脐血单个
6
核细胞和步骤2)中所述细胞的初始浓度优选独立为1～5×10/mL；步骤1)和步骤2)中的培
养环境优选为37℃，5％CO2饱和湿度的环境；步骤1)和步骤2)中的重组人白介素‑2的浓度
独立优选为200～2000IU/mL。在本发明中，步骤2)所述培养过程中优选的每隔2～3天补充
6
新鲜培养基并调整细胞密度为1～5×10 /mL。在本发明中，所述活化培养因子优选的包括
重组人白介素‑15和重组人白介素‑18；所述活化培养因子中重组人白介素‑15的浓度优选
为8～12ng/mL，更优选为10ng/mL；所述活化培养因子中重组人白介素‑18的浓度优选为8～
12ng/mL，更优选为10ng/mL。
血单个核细胞经体外诱导分化获得。在本发明中，所述体外诱导分化优选的包括：1)将所述
脐血单个核细胞、活化培养因子和重组人白介素‑2混合在X‑VIVO 15细胞培养基中培养1～
5d获得细胞液；2)收集所述细胞液中的细胞，将收集到的细胞、重组人白介素‑2在X‑VIVO
15细胞培养基中培养14～35d获得脐血来源的NK细胞。在本发明中，步骤1)中所述脐血单个
6
核细胞和步骤2)中所述细胞的初始浓度优选独立为1～5×10/mL；步骤1)和步骤2)中的培
养环境优选为37℃，5％CO2饱和湿度的环境；步骤1)和步骤2)中的重组人白介素‑2的浓度
独立优选为200～2000IU/mL。在本发明中，步骤2)所述培养过程中优选的每隔2～3天补充
6
新鲜培养基并调整细胞密度为1～5×10 /mL。在本发明中，所述活化培养因子优选的包括
重组人白介素‑15和重组人白介素‑18；所述活化培养因子中重组人白介素‑15的浓度优选
为8～12ng/mL，更优选为10ng/mL；所述活化培养因子中重组人白介素‑18的浓度优选为8～
12ng/mL，更优选为10ng/mL。
[0030] 在本发明中，所述药物中多肽的使用浓度优选为20～30μmol/L，更优选为25μmol/L。本发明对所述药物的剂型以及辅料没有特殊限定，采用NK细胞能够接受的剂型以及辅料
即可。在本发明中，所述药物优选的液体制剂。
即可。在本发明中，所述药物优选的液体制剂。
[0031] 在本发明中，优选的通过将所述药物与NK细胞混合孵育获得对肿瘤细胞杀伤活性增强的NK细胞。在本发明中，所述混合孵育的时间优选为6～18h，更优选为8～16h。
[0032] 本发明还提供了所述的多肽在制备提高NK细胞穿孔素和NK细胞CD107a的表达量的试剂中的应用。本发明对所述试剂的剂型以及试剂中多肽的浓度没有特殊限定，采用本
领域常规的多肽试剂剂型即可。
领域常规的多肽试剂剂型即可。
[0033] 本发明还提供了所述的多肽在制备阻滞肿瘤细胞细胞周期的药物中的应用。在本发明中，所述多肽与NK细胞孵育后，能够显著提高所述NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，提高所
述NK细胞对肿瘤细胞细胞周期的阻滞，促进肿瘤细胞凋亡。在本发明中，所述肿瘤细胞优选
的以K562肿瘤细胞为例。
述NK细胞对肿瘤细胞细胞周期的阻滞，促进肿瘤细胞凋亡。在本发明中，所述肿瘤细胞优选
的以K562肿瘤细胞为例。
[0034] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0035] 实施例1
[0036] 多肽的设计与合成
[0037] 本发明所述多肽来源于gMYL6，结合gMYL6的保守型，截短设计获得共计包含15个氨基酸的小分子多肽，序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述多肽采用固相合成法合成，具
体合成方法参见参考文献Recent Reports of Solid‑Phase Cyclohexapeptide
Synthesis and Applications.Molecules.2018Jun；23(6):1475，最终产物经过ESI‑MS方
法鉴定。纯化的多肽质谱图见图1。质谱分析表明，纯化多肽的分子量为1789Da，其分子量与
计算值相符。
体合成方法参见参考文献Recent Reports of Solid‑Phase Cyclohexapeptide
Synthesis and Applications.Molecules.2018Jun；23(6):1475，最终产物经过ESI‑MS方
法鉴定。纯化的多肽质谱图见图1。质谱分析表明，纯化多肽的分子量为1789Da，其分子量与
计算值相符。
[0038] 实施例2
[0039] 人脐血来源的NK细胞的培养和表型鉴定
[0040] 1)NK细胞活化
[0041] 活化培养脐血NK细胞:用淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为1～5×106/mL，再添加1mL活化培养因子和1000IU/mL重组人白介素‑2，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中
培养3天，收集细胞液。
培养3天，收集细胞液。
[0042] 2)NK细胞增殖
[0043] 从活化的细胞液中获取细胞，用X‑VIVO 15细胞培养基(美国LONZA)调整细胞密度6
为1～5×10/mL，再添加1000IU/mL重组人白介素‑2，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养，
6
每隔3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为1～5×10 /mL，培养25天，收获得到脐血NK细
胞。
为1～5×10/mL，再添加1000IU/mL重组人白介素‑2，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养，
6
每隔3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为1～5×10 /mL，培养25天，收获得到脐血NK细
胞。
[0044] 3)表型鉴定
[0045] 计数NK细胞密度，取1×106个细胞1000rpm离心2min，弃上清，用2mL的PBS重悬细胞，离心弃上清。用PBS重悬细胞，设置对照管和试验管，分别加入CD56抗体、CD3抗体、NKG2D
和NKp30抗体。4℃避光孵育30min，分别加入2mL的PBS洗涤细胞，洗去多余的抗体。最后用
200μL的PBS重悬细胞，用流式细胞仪上机检测。
和NKp30抗体。4℃避光孵育30min，分别加入2mL的PBS洗涤细胞，洗去多余的抗体。最后用
200μL的PBS重悬细胞，用流式细胞仪上机检测。
[0046] NK细胞表型为CD3‑CD56+，单个核细胞经诱导培养后，CD3‑CD56+细胞由培养前的2.24％增加到培养后的85.67％，如图1所示，图1中A为培养前单个核细胞的流式细胞术检
测结果，B为单个核细胞培养20d后的流式细胞术检测结果。该结果表明，单个核细胞已基本
诱导成NK细胞。并且几乎所有NK细胞都表达活化性NKp30和NKG2D(图1中的C和D)。
测结果，B为单个核细胞培养20d后的流式细胞术检测结果。该结果表明，单个核细胞已基本
诱导成NK细胞。并且几乎所有NK细胞都表达活化性NKp30和NKG2D(图1中的C和D)。
[0047] 图2为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养20d后的流式细胞术检测结果；C为NKp30在NK细胞中表
达为97.6％；D为NKG2D在NK细胞中的表达为91％。
达为97.6％；D为NKG2D在NK细胞中的表达为91％。
[0048] 实施例3
[0049] CCK‑8法检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
[0050] 取培养20d的NK细胞，分别用含有0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL本发明所4
述多肽的培养基培养8h，PBS充分洗涤3次去除多肽，配成6×10 /mL的细胞悬液，作为效应
4
细胞；将对数生长期的K562人慢性髓原白血病细胞配成3×10 /mL的细胞悬液，作为靶细
胞。将效应细胞悬液和靶细胞悬液等体积(即效靶比2:1)接种于96孔培养板，同时设单独效
应细胞孔、单独靶细胞孔和空白孔，每组5个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养8h；加入
CCK‑8试剂10μL，孵育4h后，在450nm波长酶标仪上测定各孔吸光值(OD)，求其平均值，扣除
空白孔本底OD值按下式计算杀伤活性。
述多肽的培养基培养8h，PBS充分洗涤3次去除多肽，配成6×10 /mL的细胞悬液，作为效应
4
细胞；将对数生长期的K562人慢性髓原白血病细胞配成3×10 /mL的细胞悬液，作为靶细
胞。将效应细胞悬液和靶细胞悬液等体积(即效靶比2:1)接种于96孔培养板，同时设单独效
应细胞孔、单独靶细胞孔和空白孔，每组5个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养8h；加入
CCK‑8试剂10μL，孵育4h后，在450nm波长酶标仪上测定各孔吸光值(OD)，求其平均值，扣除
空白孔本底OD值按下式计算杀伤活性。
[0051] 杀伤率(％)＝[1‑(实验组OD值‑单独效应细胞组O D值)/单独靶细胞OD值]×100％。
[0052] 表1为多肽分别在25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三个浓度时与NK细胞共孵育8h后对K562细胞的杀伤率，可见25μmol/L提高杀伤率效果最好。
[0053] 表1 NK细胞与不同浓度多肽共孵育后对K562肿瘤细胞的杀伤活性
[0054]
[0055] 实施例4
[0056] 流式细胞术检测肿瘤细胞周期和细胞凋亡
[0057] K562细胞以2×106接种到六孔板中，加入NK细胞为每孔4×106个，并加入多肽5μL，设置对照孔，每孔体系为2mL。37℃、5％CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞，用PBS洗涤
细胞1次，弃上清。70％酒精2mL，逐滴加入，边加边摇匀，4℃过夜固定细胞。用PBS洗涤细胞1
次，弃上清，加入500μLPI(含RNaseA)，37℃避光室温孵育30min。用PBS洗涤细胞1次，弃上
清。200μL的PBS重悬细胞，细胞过尼龙网，用流式细胞仪检测分析细胞周期变化。实验结果
见图3，图3为通过流式分析NK细胞对K562细胞周期的阻滞作用。其中A为在多肽的参与下共
同作用8h后，测K562的周期水平；B为在D肽的参与下共同作用16h后，测K562的周期水平；C
为对G2期细胞进行统计；在多肽的作用下共同孵育8h和16h后K562细胞周期的各个阶段都
有变化，K562细胞明显被阻滞在G2期。表明多肽D能够辅助NK细胞抑制肿瘤细胞的生长。
细胞1次，弃上清。70％酒精2mL，逐滴加入，边加边摇匀，4℃过夜固定细胞。用PBS洗涤细胞1
次，弃上清，加入500μLPI(含RNaseA)，37℃避光室温孵育30min。用PBS洗涤细胞1次，弃上
清。200μL的PBS重悬细胞，细胞过尼龙网，用流式细胞仪检测分析细胞周期变化。实验结果
见图3，图3为通过流式分析NK细胞对K562细胞周期的阻滞作用。其中A为在多肽的参与下共
同作用8h后，测K562的周期水平；B为在D肽的参与下共同作用16h后，测K562的周期水平；C
为对G2期细胞进行统计；在多肽的作用下共同孵育8h和16h后K562细胞周期的各个阶段都
有变化，K562细胞明显被阻滞在G2期。表明多肽D能够辅助NK细胞抑制肿瘤细胞的生长。
[0058] K562细胞以2×106接种到六孔板中，加入NK细胞为每孔4×106个，并加入多肽5μL，设置对照孔，每孔体系为2mL。37℃、5％CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞，用PBS洗涤
细胞两次，用1mL的PBS重悬细胞，加入20μL预先配好的染液(AO/EB各含100μg/mL)，AO/EB
1:1配置。染色2min后，PBS洗涤2遍，以200μLPBS重悬细胞，取100μL细胞悬液滴到载玻片上，
用盖玻片压片。在荧光显微镜下观察细胞染色情况如图4中的A所示，其中活细胞：核染色质
着绿色并结构正常；早期凋亡：核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡：核染色质为
橘红色并固缩状或圆珠状；非凋亡性死亡：核染色质为橘红色并正常结构。
细胞两次，用1mL的PBS重悬细胞，加入20μL预先配好的染液(AO/EB各含100μg/mL)，AO/EB
1:1配置。染色2min后，PBS洗涤2遍，以200μLPBS重悬细胞，取100μL细胞悬液滴到载玻片上，
用盖玻片压片。在荧光显微镜下观察细胞染色情况如图4中的A所示，其中活细胞：核染色质
着绿色并结构正常；早期凋亡：核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡：核染色质为
橘红色并固缩状或圆珠状；非凋亡性死亡：核染色质为橘红色并正常结构。
[0059] 计数了活细胞和凋亡细胞的比例，每张载玻片分别取三个视野对细胞进行计数，重复三次实验，最后计算出细胞的凋亡率(如图4中的B所示)。
[0060] K562细胞以2×106接种到六孔板中，加入NK细胞为每孔4×106个，并加入多肽5μL，设置对照孔，每孔体系为2mL。37℃、5％CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞，用冷PBS洗
6
涤细胞2次，将细胞以1×10/mL的浓度重悬到1×的缓冲液中(10×Annexin V结合缓冲液
5
用蒸馏水稀释成1×)。将100ul溶液(1×10个)转移到5mL离心管中。加入FITCAnnexin V和
PI各5μL。轻轻涡旋细胞，在室温下避光孵育15min。用PBS洗涤细胞，用1×的缓冲液重悬细
胞，上机检测。重复三次实验，并对结果进行统计学分析。实验结果见图5，其中A：对照组为
不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵育8h的凋亡率14.32％；B：实验组为25μmol/L多肽作用
下NK细胞与K562细胞共孵育8h的凋亡率18.07％，实验组较对照组的凋亡率明显有提高，提
高率为3.8％；C：对照组为不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵育16h的凋亡率26.71％；D：实
验组为25μmol/L多肽作用下NK细胞与K562细胞共同孵育16h的凋亡率30.74％，实验组较对
照组的凋亡率明显有提高，提高率为4.0％实验结果表明25μmol/L的多肽可以通过凋亡途
径促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，促进K562细胞的凋亡。
6
涤细胞2次，将细胞以1×10/mL的浓度重悬到1×的缓冲液中(10×Annexin V结合缓冲液
5
用蒸馏水稀释成1×)。将100ul溶液(1×10个)转移到5mL离心管中。加入FITCAnnexin V和
PI各5μL。轻轻涡旋细胞，在室温下避光孵育15min。用PBS洗涤细胞，用1×的缓冲液重悬细
胞，上机检测。重复三次实验，并对结果进行统计学分析。实验结果见图5，其中A：对照组为
不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵育8h的凋亡率14.32％；B：实验组为25μmol/L多肽作用
下NK细胞与K562细胞共孵育8h的凋亡率18.07％，实验组较对照组的凋亡率明显有提高，提
高率为3.8％；C：对照组为不加多肽NK细胞与K562细胞共同孵育16h的凋亡率26.71％；D：实
验组为25μmol/L多肽作用下NK细胞与K562细胞共同孵育16h的凋亡率30.74％，实验组较对
照组的凋亡率明显有提高，提高率为4.0％实验结果表明25μmol/L的多肽可以通过凋亡途
径促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，促进K562细胞的凋亡。
[0061] 实施例5
[0062] WesternBlot检测NK细胞相关蛋白的表达及基因水平检测
[0063] 分别计数K562细胞和NK细胞，分别取K562细胞6×106个NK细胞12×106个，PBS洗涤一次，并用无血清培养基重悬加入到平皿中，之后加入多肽25μL，总体积为10mL。37℃、5％
CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞悬液1000rpm离心5min，收集上清。沉淀细胞用预冷
的PBS洗涤两次，尽量吸干上清备用。每1mL的RIPA裂解液加入2μL的蛋白酶抑制剂，充分混
6
匀置冰上备用。每5×10个细胞中加入500μL冷的裂解液，混匀，4℃下振荡15min。在4℃，
12000g条件下离心15min。小心取出上清放置干净管中备用。
CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞悬液1000rpm离心5min，收集上清。沉淀细胞用预冷
的PBS洗涤两次，尽量吸干上清备用。每1mL的RIPA裂解液加入2μL的蛋白酶抑制剂，充分混
6
匀置冰上备用。每5×10个细胞中加入500μL冷的裂解液，混匀，4℃下振荡15min。在4℃，
12000g条件下离心15min。小心取出上清放置干净管中备用。
[0064] 用BCA试剂盒将样品的浓度进行定量，调整好统一浓度。加入Loading Buffer后分装备用，样品在‑80℃低温冰箱保存。样品水浴煮沸5min，在冷却后上样。跑胶条件为80V，
20min跑过浓缩胶后调整电压为120V，50min。转膜条件为：300毫安45min。然后放入到5％的
脱脂牛奶中封闭2h，TBST洗涤4次，每次10min。放到抗体孵育盒中，每格加入4mL用抗体稀释
液稀释好的一抗，摇床4℃过夜。TBST洗涤4次，每次10min。抗体孵育盒每格加入4mL用抗体
稀释液稀释好的二抗，室温孵育2h。TBST洗涤4次，每次10min。最后用显影仪曝光。在多肽的
作用下测穿孔素和CD107a的表达情况见图6中的A；实验结果表明多肽有助于NK细胞穿孔素
和CD107a的表达，蛋白表达量有明显提高。
20min跑过浓缩胶后调整电压为120V，50min。转膜条件为：300毫安45min。然后放入到5％的
脱脂牛奶中封闭2h，TBST洗涤4次，每次10min。放到抗体孵育盒中，每格加入4mL用抗体稀释
液稀释好的一抗，摇床4℃过夜。TBST洗涤4次，每次10min。抗体孵育盒每格加入4mL用抗体
稀释液稀释好的二抗，室温孵育2h。TBST洗涤4次，每次10min。最后用显影仪曝光。在多肽的
作用下测穿孔素和CD107a的表达情况见图6中的A；实验结果表明多肽有助于NK细胞穿孔素
和CD107a的表达，蛋白表达量有明显提高。
[0065] 分别计数K562细胞和NK细胞，分别取K562细胞6×106个NK细胞12×106个，PBS洗涤一次，并用无血清培养基重悬加入到平皿中，之后加入多肽25μL，总体积为10mL。37℃、5％
CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞。以下提
取RNA的步骤全程在冰上操作。根据FOREGENE试剂盒说明书提取RNA。测出RNA的浓度，并跑
核酸胶检测RNA是否降解。取500ngRNA用作逆转录的模板根据庄盟逆转录试剂盒要求加入
RTEnzymeMix和RTReactionMix。反应条件为45℃15min，85℃5min，得到cDNA。将得到的cDNA
作为qPCR反应的模板，根据SYBR酶说明添加引物和ddH2O，共20μL体系，结果见图6中的D，结
果表明在8h时，PRF1基因高表达且具有统计学意义。
CO2培养箱中共孵育8h、16h后，收集细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞。以下提
取RNA的步骤全程在冰上操作。根据FOREGENE试剂盒说明书提取RNA。测出RNA的浓度，并跑
核酸胶检测RNA是否降解。取500ngRNA用作逆转录的模板根据庄盟逆转录试剂盒要求加入
RTEnzymeMix和RTReactionMix。反应条件为45℃15min，85℃5min，得到cDNA。将得到的cDNA
作为qPCR反应的模板，根据SYBR酶说明添加引物和ddH2O，共20μL体系，结果见图6中的D，结
果表明在8h时，PRF1基因高表达且具有统计学意义。
[0066] PRF1基因的上游引物5′‑tgatgccaccattccaggag‑3′(SEQ ID NO.2)；下游引物为5′‑cagagacagggggcacttg‑3′(SEQ ID NO.3)。
[0067] GZMB基因的上游引物为5′‑ccttcctgagaagatgcaaccaa‑3′(SEQ ID NO.4)，下游引物为5′‑aaggaaaagtctgcatctgccct‑3′(SEQ ID NO.5)。
[0068] LAMP1基因的上游引物为5′‑cacgtaggacgcatgaaggt‑3′(SEQ ID NO.6)，下游引物为5′‑caggatcaccccgaatgtca‑3′(SEQ ID NO.7)。
[0069] 由上述实施例可知，本发明提供的具有增强NK细胞杀伤活性的多肽，能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高NK细胞穿孔素和CD107a的表达量；与所述多肽孵育
后的NK细胞能够使肿瘤细胞的细胞周期阻滞，并促使肿瘤细胞凋亡。
后的NK细胞能够使肿瘤细胞的细胞周期阻滞，并促使肿瘤细胞凋亡。
[0070] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。
视为本发明的保护范围。