一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法

摘要

本发明提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法，制备方法包括以下步骤：将经戊二醛交联的生物瓣膜材料浸入重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液中，调节溶液pH为3‑8，控制浸泡时间为1‑24h，然后取出，用去离子水清洗，制得。本发明制得的瓣膜材料可有效降低现有戊二醛交联的生物瓣膜材料的毒副作用，有效解决其容易发生凝血的问题。

权利要求

1.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经戊二醛交联的生物瓣膜材料浸入重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液中，控制浸泡时间为

1‑24h，然后取出，用去离子水清洗，制得；

其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白一级结构为不含羟脯氨酸，并且兼顾细胞黏附特性的胶原蛋白；

经戊二醛交联的生物瓣膜材料通过以下方法制得：将动物源心包生物材料浸入体积浓度为0.1‑10%的戊二醛水溶液或PBS缓冲溶液中反应4‑38h，制得；

动物源心包生物材料为牛心包，猪心包或羊心包；

重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列中包含GER片段，但不含GFOGER片段，核心序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。

2.根据权利要求1所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液的浓度为1‑30mg/mL。

3.根据权利要求1所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，还包括将用去离子水清洗后的材料浸没在还原剂溶液中反应0.1‑24h，再取出，用去离子水清洗干净。

4.根据权利要求3所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾或氰基硼氢化钠。

5.采用权利要求1‑4任一项所述的方法制备得到的重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料。

说明书

一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备

方法

技术领域

[0001] 本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法。

背景技术

[0002] 心脏瓣膜疾病是一种常见的瓣膜衰退疾病，在解剖学上表现为血液通路变窄或瓣膜关闭不全。心脏瓣膜疾病的治疗包括开胸瓣膜置换手术以及经皮心脏瓣膜置换手术。开
胸手术对病人创伤大、风险高、恢复慢、需体外循环支持，很多患者无法接受。经皮心脏瓣膜
置换手术因为对病人创伤小、风险低，成为未来瓣膜手术的主要趋势。

[0003] 生物心脏瓣膜是指一类用于替换人体病变心脏瓣膜的生物医学材料。生物心脏瓣膜一般由猪心包膜、牛心包膜等通过戊二醛交联制备而成。戊二醛交联处理具有操作简单，
成本低以及胶原蛋白交联程度高的特点，是目前生物心脏瓣膜化学交联的行业首选。然而，
对于戊二醛交联的生物心脏瓣膜由于瓣膜上残留醛基的存在，具有一定毒性以及钙化的问
题从而导致生物心脏瓣膜只有10年左右的有效使用年限。同时瓣膜材料用于肺动脉瓣、静
脉瓣时，由于血液流动较慢容易发生凝血，十分不利于其长效安全服役。

发明内容

[0004] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法，可有效降低现有戊二醛交联的生物瓣膜材料的毒副作用，有
效解决其容易发生凝血的问题。

[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0006] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0007] 将经戊二醛交联的生物瓣膜材料浸入重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液中，控制浸泡时间为1‑24h，然后取出，用去离子水清洗，制得。

[0008] 进一步地，生物瓣膜材料为主动脉瓣膜、肺动脉瓣膜、静脉瓣、三尖瓣、二尖瓣或人工心肌补片。

[0009] 进一步地，经戊二醛交联的生物瓣膜材料通过以下方法获制得：将动物源心包生物材料浸入体积浓度为0.1‑10％的戊二醛水溶液或PBS缓冲溶液(称为戊二醛溶液)中反应
4‑38h，制得；优选戊二醛溶液体积浓度为0.6％，浸泡时间为24h。

[0010] 进一步地，动物源心包生物材料为牛心包，猪心包或羊心包。

[0011] 进一步地，重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液的浓度为1‑30mg/mL，优选浓度为30mg/mL，在重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液中的浸泡时间为24h。

[0012] 进一步地，重组人源Ⅲ型胶原蛋白一级结构为不含O(羟脯氨酸)，并且兼顾细胞黏附特性，优选为包含细胞黏附功能的GER片段，但不含与血小板表面α2β1整合素特异性结合
的GFOGER片段。

[0013] 进一步地 ，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列的核心序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP，还可以对核心序列进行修饰，修饰位置及基团包括但
不限于巯基末端、双键末端、甲基丙烯酸酯。

[0014] 进一步地，制备方法还包括将用去离子水清洗后的材料浸没在还原剂溶液中反应0.1‑24h，再取出，用去离子水清洗干净。

[0015] 进一步地，还原剂溶液浓度为20‑100mg/mL，优选浓度为50mmol/L，浸泡时间优选为24h。

[0016] 进一步地，还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾或氰基硼氢化钠。

[0017] 本发明提供的重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料及其制备方法，具有以下有益效果：

[0018] 本发明通过采用重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰戊二醛交联的生物瓣膜材料，利用重组人源Ⅲ型胶原蛋白中的氨基与戊二醛交联的生物材料中残留的醛基反应将重组人源Ⅲ
型胶原蛋白通过碳氮双键和单键连接在戊二醛交联的生物材料上。一方面通过对残留醛基
的修饰，减少其带来的毒性以及避免与醛基相关的生物材料钙化问题的出现；另一方面，由
于重组人源Ⅲ型胶原蛋白具备与人体完全相同的结构，具有低免疫原性等特征，利用重组
人源胶原修饰方法将提升动物源生物心脏瓣膜的生物相容性。

[0019] 本发明中的重组人源Ⅲ型胶原蛋白是经筛选后通过生物合成手段获得的具备与人Ⅲ型胶原蛋白相同结构的胶原功能区，无显著细胞毒性，人体内免疫排异低；由于其具备
羧基、氨基和胍基等官能团，其结构中正负电荷集中，具有较高的水溶性及细胞黏附活性。
不同于传统胶原蛋白，本发明设计了具有抗凝血性能的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，具有高内
皮细胞亲和力，其序列设计避开了血小板结合位点的新型胶原蛋白结构，是一种可用于心
血管材料改性的定制化胶原材料，其意义体现在重组人源Ⅲ型胶原蛋白不仅免疫排异极
低，抗凝血性能也非常显著。传统的胶原蛋白是多种类型胶原的混合物，难以去除结构中含
O的残基，导致血小板凝结DNA片段进而导致免疫反应的动物氨基酸基团难以完全切除。本
发明设计的重组人源Ⅲ型胶原蛋白一级结构中就不含O，不会出现上述问题。

[0020] 本发明中设计的重组人源Ⅲ型胶原蛋白具有显著的抗凝血效果，且对比动物胶原，其既可以降低动物源组织的免疫原性，又可增强细胞黏附性及抗凝血性，利于心血管植
入器械表面内皮化。

[0021] 重组人源Ⅲ型胶原蛋白以共价结合的方式引入到瓣膜材料中，活性得以较好的保持，通过还原剂的后处理即还原剂通过与重组人源胶原蛋白修饰的生物材料中的碳氮双键
及修饰过程中未反应的醛基反应，将其还原为更稳定的单键，从而提高重组人源胶原蛋白
与生物材料键合的稳定性得到进一步的提高，有利于维持其胶原蛋白的长效性。

附图说明

[0022] 图1为重组III型人源胶原蛋白与动物胶原的血小板黏附实验SEM图；左图为动物胶原的血小板黏附实验SEM图，右图为重组III型人源胶原蛋白血小板黏附实验SEM图。

[0023] 图2为戊二醛交联生物瓣膜对照组的血小板黏附实验SEM图；其中右图为左图的放大图。

[0024] 图3为实施例1中实验组的血小板黏附实验SEM图；其中右图为左图的放大图。

具体实施方式

[0025] 实施例1

[0026] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0027] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.6％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0028] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于30mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白
的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。

[0029] 实施例2

[0030] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0031] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.6％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0032] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于15mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白
的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。

[0033] 实施例3

[0034] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0035] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.6％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0036] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于30mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡1h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的
氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0037] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于50mmol/L的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)的PBS溶液，浸泡12h，再用蒸馏水清洗干净。

[0038] 实施例4

[0039] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0040] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.6％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0041] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于1mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的
氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0042] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于50mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)的PBS溶液，浸泡24h，再用蒸馏水清洗干净。

[0043] 实施例5

[0044] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0045] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.6％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0046] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于5mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡5h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨
基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0047] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于100mmol/L的硼氢化钾(KBH4)的PBS溶液，浸泡1h，再用蒸馏水清洗干净。

[0048] 实施例6

[0049] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0050] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为2％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0051] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于2mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡12h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的
氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0052] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于20mmol/L氰基硼氢化钠(NaCNBH3)的PBS溶液，浸泡5h，再用蒸馏水清洗干净。

[0053] 实施例7

[0054] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0055] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为2％的戊二醛水溶液中浸泡12h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0056] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于10mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡5h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白的
氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0057] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于50mmol/L的硼氢化钾(KBH4)的PBS溶液，浸泡1h，再用蒸馏水清洗干净。

[0058] 实施例8

[0059] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0060] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.5％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0061] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于20mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡10h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白
的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0062] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于20mmol/L的硼氢化钾(KBH4)的PBS溶液，浸泡24h，再用蒸馏水清洗干净。

[0063] 实施例9

[0064] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0065] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为1％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0066] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于25mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡15h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白
的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0067] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于60mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)的PBS溶液，浸泡12h，再用蒸馏水清洗干净。

[0068] 实施例10

[0069] 一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白修饰的生物瓣膜材料的制备方法，包括以下步骤：

[0070] (1)采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为2％的戊二醛水溶液中浸泡24h，得经戊二醛交联的动物源心包生物材料；

[0071] (2)将经戊二醛交联的动物源心包生物材料清洗后浸泡于10mg/ml重组人源Ⅲ型胶原蛋白水溶液中，浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净；其中，重组人源Ⅲ型胶原蛋白
的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；

[0072] (3)将步骤(2)所得材料浸泡于80mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)的PBS溶液，浸泡16h，再用蒸馏水清洗干净。

[0073] 对比例

[0074] 戊二醛交联生物瓣膜的制备：采集新鲜的猪心包，对其进行清洁处理，然后在体积浓度为0.6％的戊二醛水溶液中浸泡24h，然后取出，用蒸馏水清洗干净。

[0075] 实验例 血小板黏附实验

[0076] 将实施例1制得的材料剪成合适大小，与富含血小板的血浆孵育1h，通过扫面电镜观察血小板在材料上的黏附情况。通过扫描电镜观察，动物胶原的血小板黏附实验SEM图中
血小板黏附非常多(图1左图)，而重组型人源胶原蛋白血小板黏附实验SEM图，几乎无血小
板黏附(图1右图)。其中，图1左图和右图每幅图右上角的小图均是大图中的一部分图形的
放大图。

[0077] 用重组人源胶原蛋白修饰的生物瓣膜表面吸附的血小板(图3)比用0.6％的戊二醛处理的对照组生物膜表面吸附的血小板(图2)明显减少，表明重组人源胶原蛋白修饰的
生物瓣膜较单独用戊二醛处理的生物瓣膜具备更好的抗凝血性能，潜在地解决由于凝血而
导致生物瓣膜使用寿命较短等凝血相关的问题。