一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用

摘要

本发明公开了一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用，可通过调节该miRNA表达量以调控目的植物应答盐胁迫的能力。实验证明，300mM NaCl溶液浇灌营养土之后光照16h，黑暗8h，交替浸泡48h后，亚洲棉过表达植株CLCrV:miR172c的叶片出现萎蔫。进一步测量叶片电导率，结果显示亚洲棉过表达植株CLCrV:miR172c叶片相对电导率显著升高。说明miR172c负调节棉花对盐的胁迫应答，因此可以通过调控植株中miR172c的表达量，调控植株应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。本发明为调控目的植物应答盐胁迫的能力提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

权利要求

1.一种亚洲棉miR172c在负调节亚洲棉盐胁迫中的应用，其特征在于，所述亚洲棉miR172c的序列如SEQ ID NO.5所示，miR172c的前体序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种如权利要求1所述的亚洲棉miR172c在培育耐盐亚洲棉中的应用。

说明书

一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种miRNA的应用，具体涉及一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用。

背景技术

[0002] 棉花是重要的天然纤维作物和油料作物之一，属于非粮食作物，具有较高的经济价值，并具有一定的耐干旱盐碱的能力。亚洲棉是一种主要的栽培棉花和有用的育种资源，
具有很强的遗传稳定性和对一系列胁迫的良好抗性。但随着全球气候变化，许多环境因素
(如养分流失、土壤盐渍化和温室效应)严重制约农业产业的发展。其中，盐胁迫是植物生长
和发育的主要威胁。每年，它都会在世界范围内造成棉花纤维和种子产量的巨大损失。因此
包括棉花在内的部分植物已经进化出对应的反应和调节机制，以避免或抵抗外源胁迫。

[0003] miRNAs被转录并切割成一系列保守的小的非编码RNA，通常长度为18‑22个核苷酸(Nt)。它们可以结合到下游的靶基因的mRNA上，通过翻译抑制或切割来转录后调节它们的
表达。已有大量文献报道microRNA(miRNA)参与植株应答干旱、冷、热、ABA处理，紫外处理等
多种胁迫应答过程，例如miR319，miR396c，miR394参与植物应答盐胁迫。陆地棉中一个新发
现的miRNA，通过调控靶标CHR基因来响应盐胁迫。因此研究miRNAs调控植株耐盐将有助于
理解棉花中逆境响应miRNAs的动态特征和生物学功能，为棉花育种提供更多的数据。研究
植株耐盐相关的功能基因对于提高植物耐盐性，降低盐胁下的产量损失，对造福农业生产
有着重要的意义。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用，可通过调节该miRNA表达量以调控目的植物应答盐胁迫的能力。

[0005] 为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

[0006] 一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用。

[0007] 其中，亚洲棉miR172c负调节目的植物对盐的胁迫应答。

[0008] 目的植物为双子叶植物。

[0009] 双子叶植物为亚洲棉。

[0010] 亚洲棉miR172c的序列如SEQ ID NO.5所示，miR172c的前体序列如SEQ ID NO.6所示。

[0011] 一种亚洲棉miR172c在培育耐盐目的植物中的应用。

[0012] 一种亚洲棉miR172c的重组表达载体CLCrV:miR172c，由以下方法制备：

[0013] (1)合成SEQ ID NO.6所示miR172c前体序列的片段；

[0014] (2)得到的片段用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切，并连接到载体pCLCrVA中，得到重组载体CLCrV:miR172c。

[0015] 一种调控目的植物应答盐胁迫的方法，包括以下步骤：

[0016] (1)将重组载体CLCrV:miR172c转入农杆菌菌株GV3101感受态细胞中；

[0017] (2)农杆菌转化至目的植物。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 本发明提供一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用，实验证明，300mM NaCl溶液浇灌营养土之后光照16h，黑暗8h，交替浸泡48h后，亚洲棉过表达植株
CLCrV:miR172c的叶片出现萎蔫。进一步测量叶片电导率，结果显示亚洲棉过表达植株
CLCrV:miR172c叶片相对电导率显著升高。本发明为调控目的植物应答盐胁迫的能力提供
了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

[0020] 图1为150mM NaCl处理3h之后，miR172c在处理组和对照组根组织中的表达量。

[0021] 图2为棉花叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体的基因组结构示意图。棉花叶皱缩病毒是双组分的双生蛋白，pCLCrVA和pCLCrVB是该病毒的两个组分。其中，AC1、AC2、AC3和AC4都是
pCLCrVA的编码蛋白，pre‑miRNA代表插入的miRNA前体序列，AC1是外壳蛋白，AC2是转录激
活蛋白，AC3是复制增强蛋白，AC4功能不明确。BV1和BC1是pCLCrVB的编码蛋白，其中BV1是
核穿梭蛋白，BC1是编码运动蛋白。CR表示基因共同区域。LB和RB分别代表T‑DNA的左臂和右
臂，

[0022] 图3为300mM NaCl溶液处理48h后，感染空载体CLCrV:00和重组载体CLCrV:miR172c的植株叶片中miR172c表达情况的qRT‑PCR鉴定结果。

[0023] 图4为300mM NaCl溶液处理48h后，感染空载体CLCrV:00和重组载体CLCrV:miR172c的植株表型照片。

[0024] 图5为300mM NaCl溶液处理48h后，感染空载体CLCrV:00和重组载体CLCrV:miR172c的植株离体叶片中相对电导率的检测结果。

具体实施方式

[0025] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0028] 实施例1、miR172c响应棉花应答盐胁迫

[0029] 1、植株培养及胁迫处理

[0030] 将亚洲棉Shixiya1(SXY1)品种的种子在3％(v/v)双氧水中浸泡2h，然后转移至培养皿发芽(1d)；培养至芽露白，移入40目石英砂中培养(约5d)；待苗长到6‑10cm高，两片子
叶完全展开后，转移至营养液中进行水培(约18d)，营养液配方见表1和表2；当棉花幼苗长
出3‑5片真叶，将棉花幼苗随机分为两组，即处理组和对照组，处理组将棉花幼苗根浸没在
150mM NaCl溶液中，对照组将棉花幼苗根浸没在蒸馏水中，浸没3h之后对根组织进行取材。

[0031] 表1.棉花幼苗水培营养液的微量元素配方

[0032]

[0033] 表2.棉花幼苗水培营养液的大量元素配方

[0034]

[0035] 2、植株RNA提取、反转录及定量鉴定

[0036] (1)RNA提取

[0037] 利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取上述样品的总RNA，本发明具体操作如下：

[0038] a.取处理组和对照组植株根组织新鲜样品放置于研钵中，加入适量液氮研磨至粉末状。

[0039] b.将粉末转移至2ml的RNase‑Free离心管中，用移液枪加入含5％的β‑巯基乙醇的裂解液SL500μl，涡旋振荡使样品充分裂解。

[0040] c.离心2min(12000rpm，室温)后将上清液转移至过滤柱CS中(放置于收集管)，离心2min(12000rpm，室温)，收集液体。

[0041] d.用移液枪将收集管中的液体转移至新的RNase‑Free离心管中，加入收集管中的液体体积的0.4倍体积的无水乙醇。轻轻混匀后转移至吸附柱CR3中(放置在收集管中)，离
心30s(12000rpm，室温)，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱放回收集管。

[0042] e.加350μl去蛋白液RW1到吸附柱中，离心30s(12000rpm，室温)，然后倒掉收集管里废液，再将吸附柱放回收集管。重复两次。

[0043] f.在吸附柱中加入80μl RDD和DNaseⅠ储存液(体积比7：1)的混合液，室温静置15min。

[0044] g.加入500μl漂洗液RW(RW在使用前已按比例加入无水乙醇)，离心30s(12000rpm，室温)，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管。重复两次。

[0045] h.空离心2min(12000rpm，室温)后将吸附柱放入新的RNase‑Free离心管中，并加入40μl RNase‑Free ddH2O，室温静置2min，离心1min(12000rpm，室温)得到RNA溶液。

[0046] i.取1μl RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察确认RNA的完整性。确认后将样品储存于‑70℃冰箱备用。

[0047] j.用分光光度计测定提取的RNA在260nm(OD260)和280nm(OD280)波长下的吸收光值及浓度。

[0048] (2)RNA的反转录

[0049] 采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)试剂盒合成cDNA，具体操作按照说明书进行。

[0050] (3)茎环引物RT‑PCR法对miRNA进行定量分析

[0051] a.引物设计

[0052] miR172c的特异引物序列如下：

[0053] 正向引物：5'‑CACGATGGAGAAGCAGGGCA‑3'(SEQ ID NO.1)；

[0054] 反向引物(茎环RT引物)：5'‑GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCAT‑3'(SEQ ID NO.2)；

[0055] U6 snRNA基因(内参)的特异引物序列如下：

[0056] 正向引物：5'‑GGGGACATCCGATAAAATTGG‑3'(SEQ ID NO.3)；

[0057] 反向引物(茎环RT引物)：5'‑ACCATTTCTCGATTTGTGCGT‑3'(SEQ ID NO.4)。

[0058] b.qRT‑PCR反应体系如下：

[0059]

[0060] c.qRT‑PCR扩增反应条件：

[0061] (1)在16℃孵育30min；(2)分别在30℃和42℃下保温30s；(3)在50℃下1s并返回步骤(2)60个循环；(4)在85℃下5min。

[0062] 结果计算：计算每个样品的平均Ct值，使用公式2‑ΔΔCT计算出相对表达值，并进行作图分析。利用Livak KJ和Schmittgen TD报道的方法(Analysis of Relative Gene 
‑ΔΔCT
Expression Data Using Real‑Time Quantitative PCR and the 2  Method.Methods 
‑ΔΔCT
25:402–408)，即2 计算相对表达量。

[0063] ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Actin)Time x－(CT.Target－CT.Actin)Time 0

[0064] 其中，CT.Target表示目的基因CT值，CT.Actin表示内参基因CT值，Time x表示任意时间点，Time 0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

[0065] 结果如图1所示，从qRT‑PCR结果可以看出，150mM NaCl处理3h之后，亚洲棉根中miR172c的表达量下降，说明miR172c参与盐胁迫应答。

[0066] 实施例2、利用棉花miR172c调控目的植物应答盐胁迫的能力

[0067] 1、亚洲棉CLCrV:miR172c重组表达载体的构建

[0068] 通过miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)查找亚洲棉miR172c的前体序列，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，miR172c的成熟序列如SEQ ID NO.5，
miR172c的前体序列如SEQ ID NO.6。得到的前体片段用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切，
并连接到载体pCLCrVA中，产生重组载体(CLCrV:miR172c)，其载体图如图2所示，图中
pCLCrVA上标记pre‑miRNA的地方就是插入的miR172c前体片段的位置。

[0069] 2、重组载体和空载体转化农杆菌的制备

[0070] 将重组载体(CLCrV:miR172c)、空载体(CLCrV:00)和辅助质粒载体pCLCrVB转化到农杆菌菌株GV3101感受态细胞。然后将包含空载体(CLCrV:00)、重组载体(CLCrV:miR172c)
和pCLCrVB载体的农杆菌菌落分别在50ml培养基中培养，当OD值为1.2时，离心重悬，暗处静
置3‑6h后，将包含空载体的农杆菌菌液、包含重组载体的农杆菌菌液分别与包含pCLCrVB载
体的农杆菌菌液按体积比1:1的比例混合，得到混合菌液1和混合菌液2。

[0071] 3、植株培养及处理

[0072] 将亚洲棉Shixiya1(SXY1)品种的种子浸泡在3％(v/v)双氧水中1h，然后用ddH2O冲洗掉H2O2。种子在ddH2O中浸泡4‑6h之后除去软化的种皮。将裸露的种子随机分为两组，分
别浸泡在上一步得到的混合菌液1和混合菌液2中感染，暗处理90min，随后将种子分别放在
含有200μM AS(乙酰丁香酮)的MS液体培养基中暗处理培养，温度保持26℃。两天后，将种子
移到含有60‑100μg/mL利福平的MS固体培养基上。待种子发芽以后移至营养土中生长。约半
个月后停止浇水，待营养土中基本无水后，用300mM NaCl溶液浇灌营养土，光照16h/黑暗8h
交替，处理48h。其中，浸泡混合菌液1种子长成的植株为空载体材料(对照组)，浸泡混合菌
液2种子长成的植株为miR172c过表达材料(处理组)。

[0073] 4、RNA提取、反转录及定量鉴定

[0074] 取处理组和对照组植株叶片，进行RNA提取、反转录及定量鉴定(方法和引物同实施例1的步骤2)。

[0075] 结果如图3所示，从qRT‑PCR结果可以看出，miR172c的表达量在感染CLCrV:miR172c的棉花植株(处理组)中显著高于感染CLCrV:00的植株(对照组)，说明处理组中
miR172c确实过表达。

[0076] 5、表型鉴定

[0077] 对处理48h之后的植株观察表型，并进行拍照记录，结果如图4所示。从图4可以看到，与感染CLCrV:00的植株相比，感染CLCrV:miR172c的棉花在处理后48h叶片出现萎蔫。

[0078] 6、相对电导率检测

[0079] 相对电导率(REC,Relative Electric Conductivity)是衡量细胞膜透性的重要指标，植物在逆境中细胞膜容易破裂使细胞质外渗而使相对电导率增大。REC值越大，表示
电解质的渗漏量越多，细胞膜受损程度越重。进一步，对叶片电导率进行测量，测量方法如
下：

[0080] a.选择对照组和处理组的棉花植株，选择前三片真叶，每片叶子作为一个重复，每片叶子用内径为0.9cm的打孔器打4‑6个孔；

[0081] b.将叶片圆片放入15ml的离心管中，加入400mM甘露醇5ml，摇匀(注意要将叶片整个浸在溶液中，不要粘在壁上或盖子上)，将其放入摇床，70rpm室温下摇3h，对其初始电导
率(S1)进行测定；

[0082] c.把离心管放入水浴锅中，将溶液加热至100℃保持10min，冷却至室温，测得最终导电率(S2)。叶片的相对电导率的计算公式为：REC(％)＝(S1/S2)×100。

[0083] 结果如图5所示，与感染CLCrV:00的植株相比，感染CLCrV：miR172c(REC:71.16％)的棉花叶片的相对电导率明显高于对照(REC:22.55％)。

[0084] 综上所述，NaCl处理之后，与感染CLCrV:00的植株相比，感染CLCrV:miR172c的棉花中miR172c的表达水平升高，叶片出现萎蔫，并且叶片相对电导率显著升高，说明miR172c
负调节棉花对盐的胁迫应答，因此可以通过调控植株中miR172c的表达量，调控植株应答盐
胁迫的能力，从而提高植株抗性。