一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法

摘要

本发明提供一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法，其特征在于，包含如下步骤：1)非靶向代谢组检测待测银杏的叶片中的代谢物；2)对非靶向代谢组数据进行定量校准；3)基于步骤2)中代谢组数据的差异鉴定待测银杏的性别。本发明基于银杏叶片的非靶向代谢组数据，利用系统聚类分析得到全局性差异信息，通过与已知性别对照样品的差异比较，在银杏幼苗期即可判定出性别，具有结果稳定准确、重复性好的优点，对于指导银杏种苗分选、繁育和精细化开发等均具有重要应用价值。

权利要求

1.一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法，其特征在于，包含如下步骤：

1）非靶向代谢组检测待测银杏的叶片中的代谢物；

2）对非靶向代谢组数据进行定量校准；所述对非靶向代谢组数据进行定量校准包括采用基于内标校正的MRM监控技术对步骤1）检测出的非靶向代谢物进行基于离子对信息的靶向含量校准；

3）将步骤2）中的数据处理与已知性别银杏的非靶向代谢数据处理进行对比判定待测银杏的性别；

采用超高分辨质谱进行代谢物的检测；其中，提取溶剂为80%浓度甲醇；色谱质谱条件包括：BEH C18色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，所述流动相A和B的体积比从50:50逐步提升至95:5。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）包括：分别提取银杏树幼苗叶片和内参叶片的代谢物后进行代谢组非靶向检测。

3.如权利要求2中所述的方法，其特征在于，所述的内参叶片为与待测银杏属于同一品种的已经确定性别的银杏树的叶子。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中所述代谢组鉴定和数据处理包括：采用质谱分析软件抽提质谱信息，并建立检测到物质的定性和定量离子对。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱质谱条件为：采用型号为100×

2.1mm，1.7μm的BEH C18色谱柱进行分离；流速为0.3ml/min，进样量1μl，柱温45℃；HESI源在负离子模式下运行，碰撞气压力1.5 mTorr，喷雾电压2.8 kV，毛细管温度320℃，加热器温度300℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱质谱条件为：采用型号为100×

2.1mm，1.7μm的BEH C18色谱柱进行分离；流速为0.3ml/min，进样量1μl，柱温45℃；HESI源在负离子模式下运行，碰撞气压力1.5 mTorr，喷雾电压2.8 kV，毛细管温度320℃，加热器温度300℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的具体方法为：以已知雌雄性别的银杏叶代谢组检测数据作为参考，待检测的银杏样品中，其代谢组在统计学处理后，与雄性已知银杏样品经系统聚类分析划分在同一个分支下的则判定为雄性；与雌性已知银杏样品划分在同一个分支下的则判定为雌性。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述系统聚类分析采用Ward聚类算法。

9.权利要求1‑8任意一项所述的方法在银杏性别鉴定中的应用。

说明书

一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物性别的鉴定领域，特别涉及一种基于代谢组全局分析的银杏性别鉴定方法。

背景技术

[0002] 银杏是我国孓遗树种之一，有活化石的美誉。其不仅是我国北方最重要的绿化用树种，还是银杏内酯、银杏黄酮等心脑血管特效药物的重要提取来源，也是白果等重要药食
同源产品的生产来源。银杏作为雌雄异株的裸子植物，其雌雄树在树形、生物活性物质产量
等上面均存在一定的差异，以生产绿化行道树为目的，需尽可能选择培育雄性植株；而以白
果生产为目的的苗圃则需要雌性植株。银杏作为雌雄异株的裸子植物，其花器有着显著的
雌雄差异，但是银杏自发芽后需要约15年甚至更长时间才能开花，无法在树苗期通过该方
法进行雌雄鉴定。

[0003] 国内外学者曾在其形态学、生理生化指标、同工酶谱、化学药剂处理和染色体核型等方面进行了研究。通过形态特征鉴定植物性别，比较简单直观，只需对植物的形态特征观
察对比即可，操作较为简单。观察树形、叶片分裂等方式虽然简便易行，但行质指标判断主
观因素影响较大，缺少数字化和图谱的明确标准，极易发生谬误。对器官的判断虽然兼具准
确以及简便，但是需要植物度过幼年期后才可观察到，因此，早期鉴定存在一定难度。有研
究表明银杏雌雄株在生理生化指标上存在差异，但此类差异会受到气候、生长环境、树龄等
多方面的影响。生理生化指标大多力求从不同侧面探寻对已知性别的成年植株之间进行测
定，表现出一定差异性，但能否用于苗木早期性别鉴定有待于进一步研究。目前，染色体形
态特征是进行银杏雌雄性别鉴定的重要方法之一，也是最直接的遗传证据。但根据核型观
察，对银杏性别决定机制属XY型还是ZW型并无定论，依靠核型观察确定植物性别没有实际
意义。精确雌雄鉴定方法的缺失，导致以生产行道树或者生产白果的银杏树农在种植过程
中无法在树苗期区分雌雄，带来了较高的时间和经济损失。

发明内容

[0004] 鉴于此，本申请提供了一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法，该方法通过银杏代谢组的全局性差异分析，使得在早期即可鉴定出银杏的雌雄株，且其操作简单，准
确率高。

[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 本发明一方面提供一种基于代谢组全局分析的植物性别鉴定方法，其包含如下步骤：

[0007] 1)非靶向代谢组检测待测银杏的叶片中的代谢物；

[0008] 2)对非靶向代谢组数据进行定量校准；

[0009] 3)基于步骤2)中代谢组数据的差异鉴定待测银杏的性别。

[0010] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤1)包括：分别提取银杏树幼苗叶片和内参叶片的代谢物后进行代谢组非靶向检测。

[0011] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的内参叶片为与待测银杏属于同一品种的已经确定性别的银杏树的叶子。例如，已经通过是否开花确定性别的银杏树的叶子。

[0012] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤1)中所述代谢组鉴定和数据处理包括：采用超高分辨质谱进行代谢物的检测，采用质谱分析软件抽提质谱信息，筛选定性和定
量离子对。

[0013] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤1)质谱条件为：采用BEH C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)进行分离；流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为
0.3ml/min，进样量1μl，柱温45℃；HESI源在负离子模式下运行，碰撞气压力1.5mTorr，喷雾
电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度300℃。

[0014] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤1)流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B，v/v)。

[0015] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤2)中所述对非靶向代谢组数据进行定量校准还包括采用基于内标校正的MRM监控技术对步骤1)检测出的非靶向代谢物进行基于
离子对信息的靶向含量校准。

[0016] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤2)质谱条件为：采用BEH C18色谱柱(100×2.1mm,1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为
0.3ml/min。进样量1μl，柱温45℃。HESI源在负离子模式下运行，碰撞气压力1.5mTorr，喷雾
电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度300℃。

[0017] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤2)流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B，v/v)。

[0018] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤3)中的具体方法为：将步骤2)中的数据处理与已知性别银杏的代谢数据处理进行对比判定待测银杏的性别。

[0019] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤3)中的具体方法为：以已知雌雄性别的银杏叶代谢组检测数据作为参考，待检测的银杏样品中，其代谢组在统计学处理后，与雄
性已知银杏样品经系统聚类(Hierarchical Clustering)分析(采用Ward聚类算法)划分在
同一个分支下的则判定为雄性；与雌性已知银杏样品划分在同一个分支下的则判定为雌
性。

[0020] 在本发明的一个具体实施方式中，具体包括如下步骤：

[0021] 1)选择待测银杏幼苗的叶片，加入80％浓度甲醇(V/V，甲醇：水＝80：20)震荡，放入功率为200w的超声清洗机中超声30min，离心取上清备用；采用装有BEH C18色谱柱的赛
TM
默飞UHPLC‑QExactive 组合型四极杆Orbitrap质谱仪对样品进行检测。液相条件为：BEH 
C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流
速为0.3ml/min。流动相从50：50逐步提升至95：5(A:B，/v)。进样量为1μl，柱温45℃。HESI源
在负离子模式下运行，碰撞气压力1.5mTorr，喷雾电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温
度300℃。对定性的物质进行浓度测定，获得对应代谢物的半定量浓度数据。检测结果采用
热电公司质谱配套的TraceFinder软件进行数据处理，并结合Compound Discoverer软件对
获得二级结构的代谢物进行注释，并抽提对应物质的定性母离子和定量子离子，建立监督
质谱MRM表格。

[0022] 2)基于UHPLC‑TSQ高灵敏质谱，基于非靶向代谢组数据建立的监督质谱MRM表格，采用Thermo公司配备HESI离子源的UHPLC‑TSQ Quantis串联质谱进行检测，采用BEH C18色
谱柱(100×2.1mm,1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为
0.3ml/min。流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B,v/v)。进样量1μl，柱温45℃。HESI源在负
离子模式下运行，碰撞气压力1.5mTorr，喷雾电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度300
℃。对定性的物质进行浓度测定，获得对应代谢物的半定量浓度数据。

[0023] 3)基于步骤2)中测定的数据，采用热电公司质谱配套的TraceFinder软件进行数据处理，采用R语言中MetaboAnalyst包进行系统聚类(Hierarchical Clustering)分析(采
用Ward聚类算法)获得分组，以已知雌雄性别的银杏叶代谢组检测数据作为参考，与雄性已
知银杏样品划分在同一个分支下的则判定为雄性；与雌性已知银杏样品划分在同一个分支
下的则判定为雌性。

[0024] 本发明另一方面提供非靶向代谢组学分析在银杏性别鉴定中的应用。

[0025] 示例性的，本发明至少具有以下优势之一：

[0026] 本发明基于银杏叶片的非靶向代谢组数据，利用系统聚类分析得到全局性差异信息，通过与已知性别对照样品的差异比较，在银杏幼苗期即可判定出性别，具有结果稳定准
确、重复性好的优点，对于指导银杏种苗分选、繁育和精细化开发等均具有重要应用价值。

附图说明

[0027] 图1所示为本发明实施例1提供的5株雄树和5株雌树叶片代谢物OPLS‑DA分析结果图。

[0028] 图2所示为本发明实施例2提供的待测银杏基于代谢组差异建立的亲缘性树。

[0029] 图3所示为本发明实施例2提供的待测银杏基于亲缘树建立的分组样的OPLS‑DA分析结果图。

具体实施方式

[0030] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本
发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实
施例，都属于本发明保护的范围。

[0031] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0032] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0033] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0034] 银杏树及树叶随机选自江苏省邳州市各大银杏种植基地。

[0035] 实施例1

[0036] 在银杏开花期，分别选取开花雄树和开花雌树各5棵，标号，采集开花枝条上的叶片各5‑10片。每棵树上采集的样品采用液氮速冻固定，之后在低温环境下充分混合，研磨粉
碎。

[0037] 每个样品称取100mg充分粉碎的叶片，加入1mL的80％浓度甲醇(V/V，甲醇：水＝80：20，0.1％甲酸)，旋涡震荡后置于功率不小于200w的超声清洗机中，超声30分钟。

[0038] 取出超声后的样品，14000g离心10分钟，取上清低温旋干，加入50微升的80％甲醇复溶。

[0039] 取复溶的样品，采用装有BEH C18色谱柱的赛默飞UHPLC‑Q ExactiveTM组合型四极杆Orbitrap质谱仪对样品进行检测。

[0040] 液相条件为：BEH C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为0.3ml/min。流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B,v/v)。进
样量1μL，柱温45℃。ESI源在负离子模式下运行，高纯氮气壳气流量35arb，辅助气15arb，高
纯氩碰撞气压力1.5mTorr。设置参数如下：喷雾电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度
300℃。

[0041] 检测结果采用热电公司质谱配套的TraceFinder软件进行数据处理并分析，建立定性检测出的全部非靶向代谢物的离子对表，进一步采用装有BEH C18色谱柱的赛默飞
UHPLC‑TSQ Quantis三重四极杆质谱仪对样品进行检测。

[0042] 液相条件为：BEH C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为0.3ml/min。流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B,v/v)。进
样量1μL，柱温45℃。ESI源在负离子模式下运行，高纯氮气壳气流量35arb，辅助气15arb，高
纯氩碰撞气压力1.5mTorr。设置参数如下：喷雾电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度
300℃。

[0043] 检测结果采用热电公司质谱配套的TraceFinder软件进行数据处理并分析，获得对应代谢物的精确含量数据。

[0044] 采用OPLS‑DA对测得得样品进行代谢组分析，结果如图1所示。结果显示，雄性叶片样品和雌性叶片样品在分布上出现了显著分离，说明雌性和雄性在代谢物上存在显著的性
别差异。

[0045] 实施例2

[0046] 选取待测性别的银杏树20棵，标号，分别采集银杏树的叶片各5‑10片；同时采集与待测性别同品种的、已知道性别的银杏树雌雄各5棵，分别采集叶片各5‑10片。每棵树上采
集的样品采用液氮速冻固定，之后在低温环境下充分混合，研磨粉碎。

[0047] 每个样品称取100mg充分粉碎的叶片，加入1mL的80％浓度甲醇(V/V，甲醇：水＝80：20，0.1％甲酸)，旋涡震荡后置于功率不小于200w的超声清洗机中，超声30分钟。

[0048] 取出超声后的样品，14000g离心10分钟，取上清低温旋干，加入100微升的80％甲醇复溶。

[0049] 取复溶的样品，采用装有BEH C18色谱柱的赛默飞UHPLC‑QExactiveTM组合型四极杆Orbitrap质谱仪对样品进行检测。

[0050] 液相条件为：BEH C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为0.3ml/min。流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B,v/v)。进
样量1μL，柱温45℃。ESI源在负离子模式下运行，高纯氮气壳气流量35arb，辅助气15arb，高
纯氩碰撞气压力1.5mTorr。设置参数如下：喷雾电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度
300℃。

[0051] 检测结果采用热电公司质谱配套的TraceFinder软件进行数据处理并分析，建立定性检测出的全部非靶向代谢物的离子对表，进一步采用装有BEH C18色谱柱的赛默飞
UHPLC‑TSQ Quantis三重四极杆质谱仪对样品进行检测。

[0052] 液相条件为：BEH C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)进行分离。流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L的乙酸铵，流速为0.3ml/min。流动相从50:50逐步提升至95:5(A:B,v/v)。进
样量1μL，柱温45℃。ESI源在负离子模式下运行，高纯氮气壳气流量35arb，辅助气15arb，高
纯氩碰撞气压力1.5mTorr。设置参数如下：喷雾电压2.8kV，毛细管温度320℃，加热器温度
300℃。

[0053] 检测结果采用热电公司质谱配套的TraceFinder软件进行数据处理并分析，获得对应代谢物的精确含量数据。

[0054] 将其所得的结果进行系统聚类(Hierarchical Clustering)，基于Heatmap分析数据进行分组，实验结果如图2所示。从图2中可以看出，30个样品亲缘树在根部分为两个大分
支，其中左侧分支包含14个样品，右侧分支包含16个样品；基于亲缘树分支，将样品分为两
组，其中，已知为雄性的5棵所在的分组含有的14棵树均为雄性；已知为雌性的5棵所在的分
组含有的16棵树均为雌性。

[0055] 采用OPLS‑DA对分组样品进行代谢组差异分析，实验结果如图3所示。图3结果显示，基于亲缘树分支建立的分组，其在OPLS‑DA图上的分布出现了显著地分离，分布在Y轴的
两侧，OPLS‑DA评估指标Q2＝0.844，证明两组样品的分组是可信的，即对30棵树基于代谢组
进行的雌雄的分组是可靠的。

[0056] 本发明可以在种苗早期直接鉴定出银杏的雌雄株，解决了长期以来银杏幼苗无法进行准确鉴定的问题，有利于对银杏雌雄株资源进行优化配置及其合理利用的进程。对银
杏的实生苗进行早期性别鉴定，使银杏的雌雄鉴定不再受时空条件限制，对引导利用银杏
进行城市绿化及经济林的培植具有重要的使用价值和经济价值。

[0057] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。